Sintesi chimica di oligonucleotidi

S. Masiero
masiero@alma.unibo.it
Struttura del DNA

DNA B:
•struttura predominante in
condizioni fisiologiche
•destrogiro
•distanza tra basi contigue:
3.4 Å
•angolo tra basi contigue: 36°
•passo: 10 coppie di basi = 34
Å
•diametro = 20 Å
•ribosio C2’ endo
•anti

Il DNA è una supramolecola !!!

Struttura del DNA

Oligonucleotide (ON): frammento/tratto di DNA a singolo filamento

oligo = fino a ~150 basi di lunghezza
Il “motore” della biologia molecolare
 Acidi nucleici, nucleosidi e nucleotidi

5’
DNA = Deoxyribo Nucleic Acid
RNA = Ribo Nucleic Acid

Copolimeri tra 2-desossi-D-ribosio

(DNA) o D-ribosio (RNA) ed acido
fosforico, in cui ciscun atomo di P è
legato ad uno zucchero attraverso
l’OH 5’ ed all’altro attraverso l’OH
3’.

Al carbonio 1’ (anomerico) di ogni

zucchero è legata, in configurazione
β, una delle quattro basi eterocicliche
azotate 3’
Acidi nucleici, nucleosidi e nucleotidi

Z base

P P

idrolisi idrolisi P + Z base

Z base n Z base

nucleoside
P nucleotide

Z base idrolisi

Z + base

DNA o RNA

Z = zucchero P = fosfato base = base eterociclica

Basi eterocicliche
N
N
purine o pirimidine funzionalizzate N
N N
N
H

purina pirimidina

• basi puriniche: NH2 O

7 6 7 6
N 5 N 5 1
N 1 NH
8 8
2
2
9 N 4 N 9 N 4 N NH2
H 3 H 3

adenina guanina

• basi pirimidiniche:
O O
NH2
4 3 3
4 CH3
5 3
5 NH NH
N
2
2 6
6 N1 O N1 O
N O
1
H H
H
timina uracile
citosina
(nel DNA) (nell'RNA)
 Nucleosidi (N-glicosidi):
glicosidi da fonti naturali o sintetici

5' B
• 2’-desossi ribonucleosidi: HO O Base
HO OH dBASE (p.es. dG, dT,...)
4' 1'

3' 2'
OH (Fischer) (lineare alfabetica)

5'
• ribonucleosidi: HO O Base B
4' 1' OH BASE (p.es. A, G,..)
3' 2' OH
HO
OH OH
 Nucleotidi: esteri fosfato dei nucleosidi (sia ribo che desossi)

O
O P O
O
- B
O Base B
O
O P O OH dpBase
P OH
5'-nucleotide O
-

OH

HO O Base -
B O B

HO O P O P
-
HO
3'-nucleotide O
O

O P O
O
rappresentazioni degli oligonucleotidi

T O G
G O C O
A O O P O OH
O O P O
- O P O O P O -
O P O - O
- O
- O
- O
O
 Caratteristiche acido-base

• Ribosio e desossiribosio: vengono deprotonati a pH>12 e pH>15, rispettivamente.

• Diesteri fosfato:

RO O RO O
P P + H
R'O R'O pKa = 1.5
OH O

in forma ionizzata a pH>2 => solubili in H2O

• Basi azotate:
N
pirimidina ƒ pKa=1.3
N ƒ molto meno basica della piridina (pKa 5)

N
purina N ƒ pKa=2.3
N ƒ imidazolo “con due NO2” (meno basico)
N
H
Caratteristiche acido-base

• si protona un N del ciclo

• a pH fisiologico sono in forma neutra

• il gruppo fosfato:
aumenta la basicità degli N dell’anello
aumenta l’acidità degli NH esociclici
Caratteristiche acido-base
tautomeria

le basi esistono per il 99.99% nella forma cheto ed ammino

tautomeria
 Esteri del fosforo (V)

triesteri diesteri monoesteri

- non ionici - pK = 1.5 - pK1 = 1.6

- solubili in solventi organici - solubili in H2O - pK2 = 6.6
- chirali - prochirali

• piuttosto inerti all’idrolisi (k ≤ 10-6 a 100°C) (per fortuna !)

• gli ariltriesteri idrolizzano con (leggermente) maggiore facilità
• sensibili a processi di β-eliminazione:

la velocità di idrolisi degli esteri di 1,2-

dioli (Î cicli a 5 termini) è 107 volte più
alta dei corrispondenti derivati aciclici
(c.f.r. RNA).
 Oligonucleotidi sintetici

utilizzi:
•“primers” per la sequenziazione del DNA
• preparazione di “sonde” per la individuazione di geni o mRNA
• diagnosi di malattie genetiche
• studi strutturali
• terapia genica / farmaci antisenso
• introduzione di mutazioni specifiche nel DNA
• produzione di geni
• altre applicazioni tecnologiche

mercato:
mercato
x usi di ricerca: DNA >100M$/a
RNA ~ 60M$/a (in crescita)
farmaceutico: 2 farmaci approvati dall’FDA
3 dozzine in trials clinici
potenziale 103M$/a
 Sintesi di oligodesossiribonucleotidi: note generali

• proprietà del polimero Ù struttura primaria

⇒ sintesi attraverso l’addizione sequenziale dei singoli monomeri all’oligomero in crescita
⇒ custom synthesis

• caratteristiche fisiche: scarsa solubilità di monomeri e polimeri in solventi organici

• necessità di condizioni di reazione estermamente efficienti
• necessità di controllo della selettività dei singoli passaggi
• finalità della sintesi
• interesse per oligo modificati

Building blocks:
 Sintesi di oligodesossiribonucleotidi: note generali

Gli acidi nucleici sono sensibili a molte reazioni chimiche: solo condizioni di reazione
molto blande possono essere utilizzate per assemblare la catena.

• Basi eterocicliche: sensibili ad alchilazione/acilazione, ossidazione e riduzione

• Scheletro fosfodiesterico: “sensibile” all’idrolisi (soprattutto acida)
• Legame glicosidico: sensibile all’idrolisi acida (depurinazione)
H(+) O
O H (+) H
H N N
:N N O (+)
O
.. O O OH
O N N NH2 - base H2O
O N N NH2 O: H
:O:
O O
O desossi > ribo
O
purine > pirimidine
adenosina > guanosina
soprattutto quando protette
Le reazioni utilizzabili sono limitate a :
• idrolisi acide molto blande
• alchilazioni blande
• acilazioni
• idrolisi alcaline blande
• eliminazioni base-catalizzate
• reazioni redox blande
 Sintesi di oligodesossiribonucleotidi: note generali

key step:
step FORMAZIONE SPECIFICA E SEQUENZIALE DEL LEGAME
INTERNUCLEOSIDICO 3’-5’ FOSFODIESTEREO.
FOSFODIESTEREO

poiché 5’-OH è più nucleofilo di 3’-OH, normalmente il passaggio si realizza attraverso un

attacco nucleofilo da parte dell’ O5’ terminale dell’oligomero in crescita sul P (III o V) legato
all’O3’ del nucleotide monomero
N NHR2

O R1O N N
N NHR2 N O
N
R1O N N HO N NH O
N
O
N
+ O
N O
R5O
NHR4 P O N NH
O
LG P(III/V)-O R3O O N
NHR4
R3O

Principali centri nucleofili: 5’-OH, 3’-OH, -NH2 esociclici, ossianioni fosfato.

fosfato
I centri nucleofili non coinvolti DEVONO ESSERE PROTETTI
¾ R1, R2, R3, R4 possono essere i tipici gruppi protettori (SINTESI IN SOLUZIONE)
SOLUZIONE
¾ R1 o R3 (tipicamente R3) può essere un polimero insolubile (SINTESI IN FASE SOLIDA)
SOLIDA
 Sintesi di oligodesossiribonucleotidi: protezione dei nucleosidi

POTENZIALE
O GRUPPO FENOLICO
N (protezione permanente)

HO N N H
O
N AMMIDE
FUNZIONI NH2
ALCOLICHE HO GRUPPO AMMINICO
(protezione temporanea) PRIMARIO (protezione permanente)
LEGAME GLICOSSIDICO
(IDROLIZZABILE, EPIMERIZZABILE)

Scelta dei gruppi protettori:

- Chemo- e regioselettività di introduzione e rimozione
- Condizioni di deprotezione che evitino: - rottura della giunzione internucleotidica
- depurinazione
- Efficienza e rapidità

Protezione PERMANENTE: per i gruppi non interessati all’allungamento della catena

Protezione TEMPORANEA: per i gruppi coinvolti nell’allungamento (rimossa ad ogni ciclo)
Protezione TRANSIENTE
 Sintesi di oligodesossiribonucleotidi: protezione dei nucleosidi

- Protezione della BASE ETEROCICLICA: protezione permanente come ammide (base labile)
O
O
NH2 NHCR
B R C Cl B (B)
OH OH OH
HO HO HO

- Protezione della funzione ALCOLICA PRIMARIA: protezione temporanea come etere (acido labile)
(B) (B)
DMT-Cl
OH OH
HO DMT O

- Protezione della funzione ALCOLICA SECONDARIA: protezione permanente come estere (base labile)
O
(B) (B) O
R C Cl
OH O C R
DMT O DMT O

- Protezione del FOSFORO: protezione permanente o nessuna protezione a seconda del metodo di
sintesi impiegato (v. poi)
 Sintesi di oligodesossiribonucleotidi: step 1 - protezione della base eterociclica

a - Gruppi comunemente usati (protezione permanente)

O O O
HN C HN C H
N N
O CH3
N N N
N N NH C CH
N N CH3
N O

Abz C bz G iBu

(in alternativa CAc)

T e U non richiedono protezione

La scelta dei diversi gruppi è dovuta alla diversa reattività delle ammidi ottenute: devono rimanere stabili per un lungo
periodo in condizioni debolmente acide o basiche e durante la cromatografia

AUMENTA LA SOLUBILITA’ NEI SOLVENTI ORGANICI !!!

 Sintesi di oligodesossiribonucleotidi: step 1 - protezione della base eterociclica

b – Introduzione del gruppo acilico

1 – peracilazione / idrolisi selettiva (Khorana 1979)
O
O O
O R C
B NH2 N C R HN C R
R C Cl (eccesso) NaOH , alcol
OH B B
HO O
Pyr O C R Pyr OH
R C O HO
O
L’azoto esociclico non è sufficientemente nucleofilo da dare acilazione selettiva

2 – protezione transiente (Jones 1982)

R O O
O C O
HN C R
B NH2 Si Cl R C Cl N C R NH4OH B
OH B
HO OH
Pyr O Si O°C HO
Si O
One-pot !

c – Rimozione: con NH3 conc / 50°C (a fine sintesi)

 Sintesi di oligodesossiribonucleotidi: step 2 - protezione della funzione alcolica primaria

a - Gruppi comunemente usati (protezione temporanea)

R'

The triphenylmethyl group and its derivatives:

R' = R'' = H Triphenylmethyl (Trityl,Tr)

C
R' = H, R'' = OCH3 4-Methoxytriphenylmethyl (monomethoxytrityl,MMTr)

R' = R'' = OCH3 4,4'-Dimethoxytriphenylmethyl (dimethoxytrityl,DMTr)

R''

b – introduzione OCH3 OCH3

(B)
(B)
Pyr OH
OH + C Cl C O
HO

OCH3 OCH3 Regioselettivo !

(DMTr-Cl) Aumenta la solubilità nei solventi organici
 Sintesi di oligodesossiribonucleotidi: step 2 - protezione della funzione alcolica primaria

c – Rimozione: con acidi in condizioni suff. blande da prevenire depurinazione

OCH3 OCH3 OCH3

(B) (B) (B)

H
OH HB OH
C O
(+)
C (+) + OH
C O HO

OCH3 OCH3 OCH3

HB = DCA, TCA, TsOH
Ac. Lewis in ambiente non acquoso COLORATO !!
 Sintesi di oligodesossiribonucleotidi: step 3 - protezione della funzione alcolica secondaria

a - Gruppi comunemente usati e introduzione (protezione permanente)

O (B) O
(B)
R C Cl OC R
DMTO OH DMTO

R = p-es. Me sintesi in soluzione

R = estere succinico sintesi in fase solida (v. poi)

b – Rimozione: con NH3 conc / 50°C (in concomitanza con deprotezione basi a fine sintesi)
Sintesi di oligodesossiribonucleotidi: step 4 – introduzione del fosforo

Vari metodi di sintesi di oligo differiscono in funzione del tipo di derivati fosforati utilizzati
come intermedi nei cicli di accoppiamento (v. poi):

1. FOSFATODIESTERI (storico): O
O
R' O P O
(-)
+ R'' OH R' O P O R''
O(-) O(-)

2. FOSFATOTRIESTERI :
O O O
R' O P O
(-)
+ R'' OH R' O P O R'' R' O P O R''
OX OX O(-)

3. FOSFORAMIDITI (FOSFITOTRIESTERI):
(N ) O O
.. .. O
R' O P Cl + R'' OH R' O P OR'' R' O P OR'' R' O P OR''
OX OX OX O(-)

4. H – FOSFONATI:
O O O
O
R' O P O
(-)
+ R'' OH R' O P O R'' R' O P O R''

H H O (-)
Sintesi di oligodesossiribonucleotidi: note generali

nucleoside

protezione

“nucleotide” protetto
nucleoside protetto introduzione P partner 3’-P
elettrofilo

partner 5’-OH
nucleofilo
coupling
N-mero
detritilazione formazione della
giunzione
internucleotidica

N+1 -mero

ON

eventuali trattamenti
/ trasformazioni deprotezione (e purificazione)
dell’oligomero
 Sintesi via fosfatodiestere (Khorana 1961)

coupling : condensazione di un fosfato monoestere con un alcol in presenza di condensante

O (B2) (B1) (B1) O (B2)

(-)
1) TPS o DCC / pyr OH
O P O OR + DMTrO OH O P O OR n-mero 3’ libero
DMTrO
2) H2O
O (-) O (-)

Ph O
N C N S Cl
R=Ac, R= t-Bu Si
O
Ph
(DCC) (TPS)
(TBDPS)

meccanismo con DCC:

O (B) O (B) O (B)
N (+) N
(-) H OR OR
O P O OR + C C O P O P O
N NH
O (-) O (-) O
estere metafosforico
“estere attivato”

La reazione (lenta) porta a un fosfatodiestere, che non reagisce ulteriormente con l’alcol
 Sintesi via fosfatodiestere

inconvenienti: - mancanza di protezione dei gruppi fosfodiesterici, che possono essere

fosforilati dall’estere attivato => anidridi
O B'

OR B' O B' O B'

B' O B'
P O

O
O P O O P O OR
O P O OH DMTO
DMTO O O
B' H2 O / Py
O(-) B' (-)
(-)
O P O OR O P O OR

O O O
B' O B' B'
O P O O P O OH
DMTO (-) (-)
O O

- necessità di rigenerare ad ogni ciclo i legami fosfodiesterei con H2O (da

rimuovere poi quantitativamente)
- forte eccesso di fosforilante
- scarsa solubilità nei solventi organici
- basse rese e lunghi tempi di reazione
 Sintesi via fosfatodiestere

Deprotezione dell’oligomero:

(1)

(2) (B)
(B) O
O P O O C R
DMTrO
(-)
O O

1. NH 4 OH, 50°C, 24 h
2. CH 3 COOH 80%
 Protezione del fosforo

Necessità di protezione al P:
• gli ossianioni fosfato sono nucleofili
• gli ossianioni fosfato impartiscono una scarsa solubilità in solventi organici

In ogni caso, dopo ogni ciclo di

assemblaggio, il P è in forma di
fosfatotriestere (fosfato
internucleosidico con gruppo
protettore)
 Sintesi via fosfatotriestere (Letsinger 1969)

Protezione del fosforo: con clorofenoli (R1, R2, R3 = Cl / H)

O H N O DMTrO B'
Cl N 1) O DMTrO B'
Cl P Cl N P N O
OH N
Cl P O N N N
R1 O O O
Cl N R1 OH
R1 O P O
Et3N
R3 2) Et3NHCO3 Et3NH O
R2 R3 R3 R1
R2 R2
R3
R2
coupling : utilizzo di condensanti più attivi di DCC – rese ~ 95% in 1.5-2h

O N N RO O
RO R''OH (-)
HN N
+ SO2 N P + SO3 +
P N
(-)
R'O OR'' N N
R'O O

R’’OH

RO O O
O RO
P
P
R'O O S R'O N N
O N N
adatta alla sintesi in fase solida
 Sintesi via fosfatotriestere
(2)

(B) (B) O
Deprotezione dell’oligomero:
DMTrO O P O O C R
O
(3)
Cl
(1)

1. deprotezione del fosforo:

CH3 CH3
CH3 N C N CH3 + CH N OH
NH
NO2
tetrametilguanidina (TMG) o-NO2-benzaldossima

(-)
N C N + Ar CH N OH N C N + Ar CH N O
(+)
NH NH2
O O
(-)
O P O + Ar CH N O O P O
O
O N CH Ar
Cl

2. NH4OH, 50°C
3. CH3COOH 80%
 Sintesi via fosforamiditi (fosfitotriesteri) (Caruthers & Beaucage 1981)

• Sfrutta la maggiore reattività del P(III) rispetto al P(V)

• Come agente fosfitilante si usa un fosforamidito (stabile, conservabile, commerciale)
• Non è necessario un agente condensante
• Il fosfitotriestere che si forma nell’accoppiamento è instabile e deve essere ossidato a fosfatotriestere

Protezione del fosforo: come metil o cianoetil (CE) estere

DMTrO (B)
DMTrO (B)
NH
2 eq. R-O Cl
R-OH P OH
PCl3 R-O-PCl2 N R-O O
1 eq. CH2Cl2 CH2Cl2 P
Et3N N

R-OH = Me-OH oppure HO-CH2CH2CN

fosforamidito
 Sintesi via fosforamiditi (fosfitotriesteri)

coupling : - attivazione in situ con tetrazolo (pK 6.5 - non provoca detritilazione).
- reazione veloce ( 1 min)
- seguito da step di ossidazione del P ( B) H
R1
DMTrO O P N
( B)
R1
H
OR2 R1

DMTrO O P N + N
OR 2 R1 N
N N

( B)
N
DMTrO O P N
N
OR2 N

( B')

HO OR3

( B') ( B')
( B) O ( B)
I2
OR3 O P O OR3
O P O DMTrO
DMTrO H2O / pyr
OR 2
OR2

Metodo principale di sintesi in fase solida: efficienza del ciclo di reazioni > 99% !!!
 Sintesi via fosforamiditi (fosfitotriesteri)

Metodo principale di sintesi in fase solida: efficienza del singolo ciclo di reazioni > 99% !

fosforamiditi
supportati
commerciali
 Sintesi via fosforamiditi (fosfitotriesteri)

Deprotezione dell’oligomero: (3)

( B) O ( B')
(1)
O P O OR3
DMTrO
OR2
(2)
1. TFA /CH2Cl2

2. deprotezione del fosforo: tiofenolo + TEA

O
R2 = - CH 3 O P O
O P O (-)
..
:S O(-)
O CH3 ..

O O
R2 = O P O O P O + CN
CN (-)
O H O
CN

3.. NH4OH, 50°C

 Sintesi via H-fosfonati

• P(III) mascherato (tautomero di un fosfitomonoestere)

• H-fosfonatomonoesteri sono facili da preparare
• Non è necessaria protezione al fosforo
• coupling attivato da agenti condensanti stericamente impediti (=> anidridi miste)
• Efficienze di accoppiamento vicine a quelle dei fosforamiditi
• H-fosfonatodiesteri intermedi sono suff. stabili e vengono ossidati tutti contemporaneamente a fine
sintesi
• Adatta alla sintesi in fase solida

Preparazione di nucleosidi H-fosfonato protetti:

( B) ( B) O
PCl3 H 2O
OH DMTrO O P H
DMTrO imidazolo (ex.)
O(-)
Et3N
 Sintesi via H-fosfonati

coupling: in presenza di un attivante

( B) O ( B) O ( B)
( B)
attivante OR1
DMTrO O P H + OR1 O P O
HO DMTrO
O(-) H

attivanti: COCl
COCl

Conversione in fosfatodiesteri: effettuata con 1 solo passaggio di ossidazione sull’oligonucleotide

finale completamente protetto

( B) O ( B) ( B) O ( B)
1 I2
O P O OR O P O OR1
DMTrO H2O DMTrO
H O(-)

Deprotezione dell’oligomero: v. sintesi via fosfatodiesteri

 Sintesi in fase solida

Supporti: controlled pore glass (CPG) o silice CPG

- chimicamente inerti
- permeabili ai reagenti 2.5 10-10 cm

• l’ON cresce chimicamente ancorato alla superficie del supporto

• dopo ogni passaggio l’eccesso di reagenti viene lavato via
• il tutto può essere automatizzato e gestito da computer
• utilizza quasi esclusivamente la chimica dei fosforamiditi

Si OH Si O
EtO
Si OH + EtO Si (CH2)3 NH2 Si O Si (CH2)3 NH2 NH2
EtO
Si OH Si O

O
B' B' O B' O O
NH2
DMTO OH + O O C (CH2)2 CO2 H O C (CH2)2 C NH
DMTO DCC DMTO

O
 Sintesi in fase solida

FASE LIQUIDA FASE SOLIDA

ECCESSO DI REAGENTI 1.2 ÷ 1.5 eq. 5 ÷ 10 eq.
DURATA DI 1 CICLO > 1 GIORNO 10 ÷ 15 min:
PURIFICAZIONE DOPO OGNI CICLO ALLA FINE (desalting, PAGE, HPLC)
RESE DI ACCOPPIAMENTO ∼ 10% >99 %
LUNGHEZZA MAX 15 ÷ 20 basi 100 ÷ 150 basi
QUANTITA’ TEORICA > 100 μmol 0.1 ÷ 15 μmol
QUANTITA’ > 500 mg “puliti” 0.5 ÷ 80 mg “grezzi”
ATTREZZATURA LABORATORIO SINTETIZZATORE
CHIMICO AUTOMATICO
Sintesi in fase solida
conclusioni
Testi & materiale di riferimento

• Gait, M.J. (ed.) Oligonucleotide Synthesis a Practical Approach (1984) IRL

Press Oxford (UK).
• Blackburn G.M. e Gait, M.J. (eds.) Nucleic Acids in Chemistry and Biology
IIed., (1996) Oxford University Press (UK).
• Calladine C.L., Drew H.R. Understanding DNA (1992) Academic Press Ltd. (UK).
• Hecht S.M. (ed.) Bioorganic Chemistry Nuclei Acids (1996) Oxford University
Press (UK).
• Shabarova Z., Bogdanov A. Advanced Organic Chemistry of Nucleic Acids (1994)
VCH (D)
• Cantor C.R., Schimmel P.R. Biophysical Chemistry (1980) W.H. Freeman & Co
(USA)

• Nucleic Acids Res.