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¾ 37 73

A 3
M 7 ¾ 3/7 7/3
O
R
¾ 37 73
Friedrich Miescher (1844-1895)
nel 1869
isolò la nucleina

Ludwig Karl Martin Leonhard Albrecht Kossel


(1853 1927)
(1853-1927)
nel 1903 dimostrò che la nucleina era DNA
Erwin Chargaff (1905-2002)
Determina la composizione delle basi del
DNA ed enuncia la sua regola:
Le basi puriniche e pirimidiniche sono
p s nti nnell DNA nnell rapporto
presenti pp t 1:1
James Dewy Watson ( 1928)
Francis Harry Compton Crick
(1916) premi Nobel nel 1962 per
(1916),
la fisiologia, nell’aprile del 1953
descrivono la doppia elica
Gli acidi nucleici hanno peso molecolare elevato (a volte
anche
h 109Da)
D ) ma una struttura
t tt f d
fondamentale
t l relativamente
l ti t
semplice in quanto derivano dalla condensazione in sequenza
lineare di un elevato numero di unità elementari,
elementari i
nucleotidi, il cui peso molecolare varia tra 323 e 363.

Per idrolisi enzimatica gli acidi nucleici possono essere scissi


nei nucleotidi che a loro volta sono formati da nucleosidi
(b
(basi puriniche
h o pirimidiniche
d h legate
l ad
d un carboidrato)
b d ) ed
d
acido fosforico.

Il carboidrato che caratterizza gli acidi nucleici è un


pentoso: il 2-deossi-D-ribosio
2 deossi D ribosio per ll’acido
acido
deossiribonucleico, o DNA, ed il D-ribosio per l’acido
ribonucleico, o RNA; in entrambi i casi gli zuccheri sono
nella forma furanosidica.
HOCH2 OH
O
H H
H H
OH OH
Ribosio
HOCH
5 2 OH
O 1
H H
H 3 H
OH H
Deossiribosio
NH2 O
N HN N
N 1 5 7

N
3 9
H2N N N
N H
H
G
Guanina
i
Adenina
Le basi p puriniche del DNA e dell’RNA sono le
stesse:
l’l’adenina
adenina ((6-ammino p
purina))
la guanina (2-ammino-6-ossi purina)
O O O
N 3 1NH HN NH HN NH
5
H2 N O O
Citosina
Uracile
U c e
Timina
Le basi pirimidiniche sono:
la citosina (2
(2-ossi-4-ammino
ossi 4 ammino pirimidina)
la timina (2,4-diossi-5-metil pirimidina) per il DNA,

la citosina e l’uracile (2,4-diossi pirimidina) per l’RNA


Legame? legame β-glicosidico

Adenosina,, un nucleoside
Adenosina
O NH2
N 3 1NH N1 5
N
7

9
H2 N
5
N N
3

H
Citosina
Le basi
L b i sono legate l allo
ll Adenina
zucchero con un legame β-
glicosidico
li idi t
tra b i 1'
il carbonio
HOCH2 OH
O 1’
dello zucchero e l’azoto nella H H
posizione 9 dell
dell’adenina
adenina o della
guanina o l’azoto nella
H H
OH H
posizione 1 delle basi
pirimidiniche. Deossiribosio
NH2
6 N
N1 5 7
8
Adenina, una base
2 4 9
3
N N
H

NH2 Figura 8
8. 1 - Un
N
nucleotide, unità
6
N1 5 7
8

g acidi
strutturale degli
2 4 9
3
N N

5' CH
Adenosina, un
nucleoside
nucleici, è formato da
2OH O
H
3'
H 1' tre subunità: una base
H
OH OH
H azotata, uno zucchero
h
a cinque atomi di
NH2
6 N
carbonio ed un gruppo
N1
2
5

4
7
8 fosfato
3 9
N N
O AMP, Adenosin
AMP
OP O mononucleoside
O fosfato, un nucleotide
5' CH
2
O
H H 1'
3'
H H
OH OH
L unione di una base
L’unione
con lo zucchero è
detta nucleoside.

Per esterificazione del


5’ gruppo –OH sull
carbonio 5' dello
zucchero con acido
fosforico si ottengono
i 5
5' nucleotidi,
precursori naturali
degli
g acidi nucleici,
detti semplicemente
nucleotidi.
3’
3 Negli
N li acidi
cidi nucl
nucleici
ici i nucleotidi
nucl tidi
sono uniti da un legame
fosfodiestereo tra il carbonio
5' di un nucleotide ed il
3'
carbonio 3' di un altro
nucleotide.
5'

3'
Possiamo dire,, q
quindi,, che la
catena nucleotidica si accresce
5' con legami nucleotidici nella
direzione 5'→3'
5
5’
DNA RNA Figura 8. 2-
I costituenti di DNA e
NH2
N HN
O
N N
NH2
N HN
O
N
RNA
Adenina, guanina e
N
N N H2N N N N H2N N
N
H H H H

citosina sono presenti


Adenina Guanina Adenina Guanina
B
PURINE PURINE

NH2 O
A
NH2 O
sia nel DNA sia
nell’RNA.
ll’ La timina
ti i ,
CH3 S
N HN N HN
O
presente nel DNA,
O N O N I O N N
H H
Citosina Citosina Uracile
Timina

PIRIMIDINE PIRIMIDINE
manca nell nell’RNA
RNA ove
l’altra base pirimidinica
HOCH2
O OH P
E
HOCH2
O OH è ll’uracile
uracile.
H H H H
H H N H H
OH H T OH OH
Deossiribosio
O
S
Ribosio Le subunità di
zucchero nei nucleotidi
O

sono il deossiribosio
OH

O P OH

OH
per il DNA ed d il
Fosfato ribosio per l’RNA.
Gli acidi nucleici
NH2

3’
3
O O
N O
O P O- N
N
O P O- NH
O N N

sono costituiti da
5'CH
Adenina O N N NH2 Guanina
5'5'CH2
2 O
H H O
H 3' H H H

catene lineari di
OH
O NH2
3'
H 3'
H
H

O NH2
O P O-
N
O P O-
Citosina

nucleotidi uniti
O Citosina N
N O O
5' CH2
5'5' CH2 N O
O

con legami
g
H H O
H 3' H H H
OH
H 3' H
O 3' H

fosfodiesterici
O O
O P O- NH2
N O P O-
O NH
N
Guanina O NH
Adenina
N NH2
5' CH2 N

5’
5 Æ 3’
O
5'5' CH2 N N

H H O
H H H H
3' OH
H H
3' 3' H

Legame
fosfodiestereo 3'-5' O
O
P O- O
O
O-
Il polinucleotide
risultante ha una
O P
O
NH O O
H3C
5' CH2 N O NH Timina
Uracile
5'5'CH2
direzionalità
O N O
H H O
H H H H
3' OH
3'3'
H H

intrinseca
intrinseca, con
H
O
O O
O P O- Legame NH2
N fosfodiestereo 3'-5' O P O-

un’estremità 5’
O NH Guanina N
O NH Adenina
N NH2
5' CH2 N
N
5' CH2 N
O

ed un un’estremità
estremità
H H O

5’
H H H H
3' OH
O H H
3' H
O

Pezzo di filamento di RNA Pezzo di filamento di DNA


3’.
Il fosfato in posizione 5’ del nucleotide in basso reagisce con il
gruppo alcolico in posizione 3’ del nucleotide in alto e, con
l’eliminazione di una molecola di H2O, si forma il legame
fosfoestereo 5’ 3’.
Figura 8. 4 La doppia elica
del D
DNA

La struttura
elicoidale
l l dell DNA
fu proposta nel
1953 da Watson e
Crick e somiglia ad
una scala a
chiocciola i cui
gradini sono
costituiti dad coppie
di basi azotate ed i
cui corrimani sono
costituiti da residui
di deossiribosio
alternati con gruppi
fosfato.
E s tre m ità 5 ' E s tre m ità 3 '

5'

4'
O OH
1' 2'
3' A T 1' 3'
2'
4'
P O

5'
Figura
g 8.4 - La direzione
delle basi da 5’ → 3’ in
O
P

T A

P O un filamento ne determina
una polarità che è inversa
nel filamento opposto e
P
O

t t i due filamenti
G

pertanto
C

P O

risultano antiparalleli.
O P

C G

HO O

E stre m ità 3 ' E s tre m ità 5 '


Nel DNA i due
filamenti hanno
andamento
d t
antiparallelo
p

L’elica di sinistra è
disposta dall’alto in
basso in direzione
5’  3’, quella di
destra è in
direzione 3’  5’.
™ i nucleotidi adiacenti
di ciascuna catena sono
ruotatii di 34,6°
34 6° l’uno
l’
rispetto all’altro;

™ il diametro della
doppia
pp elica è di 2,37
, nm;

™ l’aggiunta di una
coppia
i di basi
b i allunga
ll l
la
doppia elica di 0,33 nm;

™ ogni 10,4 coppie di


basi si ha un giro g
completo della doppia
elica, pertanto il passo
d ll doppia
della d i elica
li è di 3,4
34
nm.
I valori della distanza tra le basi (0,34
m) e del p
nm) passo dell’elica ((3,4
, nm)m)
furono calcolati utilizzando fotografie
di diffrazione dei raggi X.
L struttura dell’elica
La d ll’ l è stabilizzata
bl d
da
legami di idrogeno
H CH3
N H -------O
N Adenina e timina
N-------H N N
N Z sono connesse da
d
Z N O due legamig di
Adenina Timina idrogeno.
H
Citosina e guanina
NH-------O N
N sono connesse da
N-------H N Z tre legami di
N
Z O ----H N
N idrogeno.
H
Citosina Guanina
Questi accoppiamenti
d
danno l
luogo alla
ll
cosiddetta
“complementarietà
l t i tà
delle basi”
NH2 Figura 8.7 - Gli studi con i
raggi X mostrano che la doppia
H
C1'
N
H N N

elica ha un diametro uniforme


N N
A G

di circa 2,37 nm.


N HN
N
N
C1'
O
H

O H N
Una coppia purina-purina (A-
H3C
NH N N G) mostra una larghezza che
è quasi il doppio di una
T C C1'

N O

coppia pirimidina-pirimidina
O

C1' 2,37 nm

(C T) per cuii una purina si


(C-T)
H

appaia sempre ad una


O H N

pirimidina
pirimidina.
N H N N
G C C1'

N
N N H O

C1'
H

CH3
La formazione dei legami di
idrogeno nell'appaiamento
H

N H O

A T N
H N N
delle basi comporta
p che
l'appaiamento deve essere
N
C1'

A-T e G-C.
N O
N

C1'
La struttura a doppia elica, infine, conferisce
alla
ll molecola
l l dell DNA una modesta
flessibilità e p
per q
questo motivo le soluzioni di
DNA, anche se molto diluite, hanno un’elevata
viscosità.
viscosità

La determinazione della viscosità delle


soluzioni di DNA è un utile mezzo per seguire
la denaturazione
d del DNA, cioè l’apertura
della dopp
doppiaa el
elica
ca e la success
successiva
va separaz
separazione
one
delle eliche, processo che comporta una netta
diminuzione della viscosità.
viscosità
La denaturazione può essere ottenuta
portando all’ebollizione
ll una soluzione
l di DNA
e raffreddandola p
rapidamente oppure
pp
trattando il DNA con soluzioni a pH maggiore
di 11 o a pH minore di 3 o con soluzioni di
urea ad elevata concentrazione.

Oltre che nel nucleo il DNA è presente,


sebbene
bb in quantità
à piccolissime
l (0 1 0 2%
(0,1-0,2%
del DNA totale della cellula)) e con una
composizione di basi diversa da quella del
DNA nucleare,
nucleare anche nei mitocondri e nei
cloroplasti.
La quantità di DNA di ogni cellula è costante e
non può essere alterata né da fattori ambientali
né da fattori nutrizionali né dal metabolismo
cellulare.

La qquantità di DNA contenuta in una cellula è


funzione della complessità della cellula
cellula, e quindi delle
informazioni genetiche che essa contiene: una cellula
batterica ha un contenuto di DNA nettamente inferiore a
quello di una cellula di un tessuto specializzato.

1944, studiando il Diplococcus pneumoniae


Arvey, nel 1944
Weichs., il Gram
Gram-positivo
positivo noto come pneumococco concluse
che il DNA può portare informazioni genetiche.

Il materiale genetico è in grado di fornire copie esatte di


se stesso ed il DNA è dotato di tale caratteristica.
La duplicazione
p di una molecola di DNA è un
fenomeno di tipo semiconservativo
semiconservativo.. Alla fine del
processo le nuove molecole risultano costituite da una catena
che ha funzionato da stampo e da una catena che è stata
neosintetizzata.
Che la sintesi fosse
semiconservativa
m fu
f
dimostrato nel 1957
da Meselson e
Stahl con studi su
E. coli fatta
crescere in ambiente
b
contenente 15 N.
Se la duplicazione
Molecola parentale originale f
fosse d
di tipo
conservativo, dal
Schema filamento di
dell’esperimento
dell esperimento partenza
t sii
di Meselson e dovrebbe ottenere
Stahl la generazione
filiale F1 in cui una
doppia elica ha i
due filamenti tutti
nuovi mentre
F1 nell’altra i due
filamenti sono tutti
vecchi
vecchi. Nella
generazione filiale
F2, tre doppie
eliche dovrebbero
avere filamenti
F2 tutti nuovi ed una
filamenti tutti
(1) vecchi (1).
Poichè la duplicazione
p
è di tipo Molecola parentale originale

semiconservativo, nella
generazione
i fili l F1 si
filiale Figura 8. 9
avranno due doppie
eliche ognuna con un
eliche,
filamento nuovo ed un
filamento vecchio, F1 F1
mentre nella
generazione filiale F2 si
avrann quattro
avranno quattr doppie
d ppie
eliche, due con un
filamento nuovo ed un
F2 F2
filamento vecchio e due
con entrambi i filamenti (2) (1)
nuovi (2).
Se la duplicazione
p fosse
di tipo conservativo, dal
filamento di p partenza si
Figura 8.
Fi 8 9
Pg. 126 dovrebbe ottenere la
generazione filiale F1 in cui
g
una doppia elica ha i due
filamenti tutti nuovi
mentre nell’altra i due
filamenti sono tutti vecchi.
Nella generazione filiale
F2, tre doppie pp eliche
dovrebbero avere
filamenti tutti nuovi ed una
filamenti tutti vecchi (1).
Schema dell’esperimento
dell esperimento
di Meselson e Stahl
effettuato con 14N e 15N.

La replicazione
produce due bande
Risultati dell’esperimento
p
di Meselson e Stahl sul
DNA estratto e
centrifugato in gradiente
di CsCl.
Nella generazione filiale
F2 si ottengono
g quattro
q
doppie eliche:
• due con un filamento
nuovo (14N) ed un
filamento vecchio (15N))
• due con entrambi i
filamenti nuovi ( 14N).
)
La stratificazione delle molecole di DNA nei tubi da
centrifuga è stabilita mediante misure UV a λ 260 nm.
Perché la duplicazione del DNA possa avere inizio occorre
che entrino in azione dei pparticolari enzimi,
m , le DDNA elicasi,
elicasi,
che riconoscono specifiche sequenze di nucleotidi, i punti
di origine della duplicazione, spezzano i legami di idrogeno
cheh tengono accoppiate le l basi
b azotate complementari
l
aprendo in tal modo la doppia elica.
Contemporaneamente altri enzimi, enzimi le topoisomerasi
topoisomerasi,
operano in modo che la doppia elica non si attorcigli
formando dei “nodi” che,, di fatto,, arresterebbero la
duplicazione. Successivamente altre proteine, le proteine
destabilizzatrici dell’elica, si legano ai singoli filamenti di
DNA impedendo
i d d loro
l di riformare
if l doppia
la d i elica
li originaria
i i i
o di avvolgersi su se stessi.
L’intervento
L intervento delle DNA polimerasi
polimerasi, enzimi che catalizzano
la formazione dei legami tra i nucleotidi, consente
allungamento della catena per aggiunta di nucleotidi
ll’allungamento
all’estremità 3’ della catena polinucleotidica.
La duplicazione inizia in un punto preciso
della molecola di DNA, il punto di d origine
della replicazione, ed entrambi i filamenti
vengono replicati nell’ambito di una struttura
che
h hah una f m di Y chiamata
n forma hi m t forcella di
replicazione
p .

Nei cromosomi delle cellule procariote


vi è un solo punto di origine della
duplicazione nelle cellule degli eucarioti i
duplicazione,
punti di origine della duplicazione sono
molteplici.
lt li i
Perché possa iniziare la sintesi del DNA occorre
che vi sia una catena polinucleotidica sulla quale
legare le basi nella direzione 3’→5’ e che funzioni
sintesi Questo innesco, o
da innesco per la sintesi.
primer, della sintesi è costituito da un breve
filamento di RNA (RNA RN i
innesco o RNA
RN
iniziatore) con una diecina di nucleotidi che è
portato sul DNA da un enzima, la RNARNA- -primasi
primasi; le
basi dell’RNA si appaiano
pp con le basi del DNA a
singolo filamento che funge da stampo nel sito di
inizio della duplicazione
p ed il p
processo p
può avere
inizio con le DNA polimerasi che sintetizzano i
filamenti complementari
f p aggiungendo
gg g i nucleotidi
all’estremità 3’ del primer
primer..
A...U

T A
T...A

C G
C...G

G...C
Stampo Stampo

Le DNA polimerasi
L li i aggiungono
i un nucleotide
l tid alla
ll
volta all’estremità 3’ della catena nascente.
Successivamente
m il p primer
m
viene degradato ad opera di
enzimi
m specifici.
p f Il ffilamento
m
che si origina per l’aggiunta
di deossiribonucleotidi
all’estremità 3’ dell’RNA-
primer si allunga
p g sempre
p
verso la forcella di
duplicazione
p e la sua sintesi
avviene in modo continuo,
senza interruzioni e p perciò è
chiamato filamento guida
o “leading strand”.
L’altro filamento, detto filamento ritardo o “lagging
strand”,, si allunga
g nella direzione opposta
pp a qquella di
avanzamento della forcella di replicazione ed è sintetizzato
anch’esso grazie all’intervento di un RNA innesco ma la
sintesi avviene in modo d d
discontinuo, come se fosse
f
costituito da una serie di frammenti ognuno dei quali è
sintetizzato
i t ti t nellall direzione
di i 5’Æ3’
5 Æ3 . I frammenti
f ti che
h
costituiscono il filamento ritardo contengono un numero di
nucleotidi molto vario (da 100 a 200 nelle cellule eucariote e
da 1000 a 2000 nelle cellule procariote) e sono noti come
frammenti di Okazaki.
Il filamento guida è sintetizzato nella
direzione della forcella di replicazione mentre il
filamento ritardo è sintetizzati in direzione
opposta. Per ogni filamento vi è un DNA primer.
Il filamento ritardo è sintetizzato come una serie di corti
filamenti, i frammenti di Okazaki e la sintesi di ogni
frammento ha inizio con la sintesi di un primer a RNA.
Dopo che ogni frammento di Okazaki è stato allungato dalla
DNA polimerasi
DNA- li i, l’RNA-
l’RNA primer
i è degradato
d d t ed
d i frammenti
f ti
sono uniti da una DNA-ligasi.
Figura 8. 11 - Disegno
schematico del f filamento gguida
(leading strand) e del
filamento ritardo (lagging
strandd) in
i prossimità
i i à della
d ll
forcella di duplicazione.

Il processo di duplicazione
procede nella direzione da 5 5’
a 3’ ed è continuo per il
filamento gguida ((a sinistra)) e
discontinuo per il filamento
ritardo (a destra).

Nei procarioti il processo di duplicazione è catalizzato da vari


quali la DNA-polimerasi
enzimi tra i q p III interviene tanto nella
sintesi del filamento guida quanto nella sintesi dei frammenti
di Okazaki del filamento ritardo.
La sintesi, attivata da una
primasi, di un breve filamento di
RNA, le cui basi sono
complementari
m l m t i allall corrispondente
is d t
catena di DNA, detto RNA
primer, precede ll’assemblaggio
assemblaggio
dei monomeri del filamento guida
e dei frammenti di Okazaki.
Okazaki

Terminata la sintesi gli RNA


primer vengono rimossi con
l’intervento della DNA polimerasi
I che interviene anche nella
sintesi del DNA che occorre per
colmare il vuoto lasciato
dall’eliminazione del primer.
La saldatura tra un
gruppo 3 3’-OH,
OH situato
all’estremità 3’ di una
delle due catene,, ed il
gruppo 5’-fosfato,
situato all’estremità 5’
l
d ll’ l
dell’altra catena, è
operata dalla DNA
li i.
ligasi
S è la proteina
separatrice Y sono le
separatrice,
proteine che tengono
separati
p i due filamenti,,
PO sono le DNA
polimerasi, PR è la
primasi
i i, PM il promotore
mobile, L la ligasi.
Quando un frammento di Okazaki raggiunge un altro
frammento sintetizzato in p
precedenza, una subunità di DNA
polimerasi I degrada l’RNA primer di quest’ultimo mentre
un’altra DNA polimerasi ne sostituisce i nucleotidi con
nucleotidi
l tidi del
d l DNA.
DNA

Successivamente una DNA ligasi consente di riunire i due


frammenti catalizzando la formazione del legame
f f di t
fosfodiestereo t
tra l’ t
l’estremità
ità 3’ di un frammento
f t e
l’estremità 5’ dell’altro.

La sintesi del DNA può essere inibita da fattori fisici


gg X) o chimici (iprite,
(raggi p 6-mercaptopurina,
p p 5-
bromouracile, 5-fluorouracile ed altre sostanze).
La replicazione del DNA. La doppia elica è aperta dalle
elicasi
el cas e dalle topo
topoisomerasi.
someras . In segu
seguito
to una DN
DNA pol
polimerasi
meras
genera un filamento complementare sul filamento veloce.
Un'altra DNA polimerasi lega invece il filamento lento
generando
d segmenti discontinui
d (f
(frammenti d Okazaki)
di k k ) che
h
verranno uniti da una DNA ligasi
Figura 8.
8 10 - Rappresentazione schematica della duplicazione di una
molecola di DNA. I filamenti di DNA si aprono e si separano nel punto
di origine della duplicazione per l’azione delle elicasi (a). Una volta
f
formatesi
t i le
l forcelle
f ll di duplicazione
d li i sii allontanano
ll t d l punto
dal t di origine
i i
della duplicazione e determinano la formazione di una bolla di
duplicazione (b) che si propaga in continuazione (c). Al termine del
processo di duplicazione le due doppie catene formatesi si separano
e vanno a costituire le due nuove doppie eliche (d).
La bolla di duplicazione è
costituita da due forcelle
di replicazione che si
muovono in direzioni
opposte ma sempre
5’Æ3’.
In ogni forcella il leading
strand aggiunge nucleotidi
i modo
in d continuo
ti mentre
t
nel lagging strand sono
sono aggiunti i frammenti
di Okazaki
Okazaki, ognuno legato a
un RNA p primer, in modo
discontinuo.

I frammenti sono poi legati


da una DNA ligasi.
Micrografia elettronica della bolla di replicazione
Il cromosoma circolare dell’.E. coli ha un’unica origine di
replicazione

La sintesi del DNA inizia in un p


punto, l'elica viene letta
in senso 5'-3', e la sintesi procede in entrambe le
direzioni (duplicazione
p teta) finché le due forcelle
di replicazione si incontrano.
Il DNA di un cromosoma eucariotico contiene molte
origini di replicazione. La sintesi procede in
entrambe le direzioni da ogni origine fino a che le
bolle di replicazione adiacenti non si incontrano e si
fondono tra di loro.
Tabella 8. 1 - Alcuni enzimi coinvolti nella
replicazione del DNA.
DNA
Enzima Cellula Funzione

Proteina Procariota Si lega all’origine di


i i i t i
iniziatrice ed
d replicazione ed induce lo
svolgimento della doppia elica.
eucariota

Elicasi Procariota Svolge la doppia elica del


ed DNA.
eucariota
DNA polimerasi I Procariota Sintesi del DNA ed altre
funzioni.

DNA polimerasi
li i P
Procariota
i Sintesi
Si t i deld l DNA ed
d altre
lt
III funzioni.
Enzima Cellula Funzione
DNA polimerasi
li i α E
Eucariota
i t Sintesi
Si t i del
d l DNA;
DNA sintesi
i t i del
d l
filamento ritardato.

DNA polimerasi
li i δ E
Eucariota
i Sintesi
Si t i del
d l DNA;
DNA sintesi
i t i del
d l
filamento anticipato.

DNA girasi Procariota Funge da perno per il


rilassamento dei
superavvolgimenti che
precedono la forcella di
replicazione
p in E. coli.

DNA ligasi Procariota Formazione di legami covalenti per


unire filamenti di DNA adiacenti,
ed come i filamenti di Okazaki nel
eucariota filamento ritardato ed i segmenti
di DNA nuovi e vecchi nel
meccanismo di riparo del DNA per
excisione.
Enzima Cellula Funzione
DNA Procariota Introduce tagli nel DNA a
topoisomerasi
p (di ed filamento singolo (tipo I) o
doppio (tipo II); previene le
tipo I e II) eucariota torsioni che precedono la
forcella di replicazione del
DNA induce
DNA; i d e /o
/ elimina
li i il
superavvolgimento del DNA; può
separare i DNA circolari che
restano legati alla fine della
replicazione del DNA.

Procariota Sintesi dell’RNA; sintesi di


Primasi oligonucleotidi di RNA da
ed
utilizzare come inneschi per la
eucariota
i t sintesi del DNA.
Si legano al DNA a filamento
Proteine che legano
Procariota
singolo;
i l ; stabilizzano
t bili il DNA
i filamenti singoli ed svolto e facilitano l’accesso di
eucariota altre proteine.
Schema della struttura presente a livello
della forcella di replicazione

Filamento anticipato
neosintetizzato
3’
5’
5’
3’
Filamento Elicasi
ritardato
Innesco o primer
3’
Innesco o primer
5’
Le elicasi riconoscono specifiche
p f sequenze
q di nucleotidi,, i
punti di origine della duplicazione, spezzano i legami di
idrogeno tra le basi ed aprono la doppia elica. Le topoisomerasi
impediscono
d che
h la
l doppia
d elica
l aperta si attorcigli,
l lel DNA-
DN
polimerasi consentono l’allungamento della catena per aggiunta
di nucleotidi allall’estremità
estremità 3 3’. L
L’innesco
innesco è una catena
polinucleotidica (RNA) su cui le basi si legano in direzione 3’Æ
5’.
La tecnica del DNA ricombinante
Endonucleasi di restrizione consente di isolare un ggene e
trasferirlo da un organismo ad
una altro (per esempio dall’uomo
ad un batterio) mantenendone la
capacità funzionale,

Inserimento nell plasmide


l d

Batterio ricombinante
La tecnologia del DNA ricombinante comprende le
metodiche che ppermettono di lavorare sul DNA tagliandone
g con
le endonucleasi di restrizione frammenti e inserendoli in
apposite strutture biologiche per ottenerne grandi quantità.
L’operazione fondamentale
dell’ingegneria
dell ngegner a genet
genetica
ca che sta alla
base della produzione di proteine
ricombinanti è la clonazione dei
geni che consiste essenzialmente
nell’introdurre un gene d’interesse,
per esempio un gene umano che h
codifica per un proteina che si vuole
produrre come farmaco,
farmaco in un
organismo ospite che viene
successivamente
m fatto crescere in
f
un fermentatore industriale per
produrre la proteina.
Le endonucleasi di restrizione riconoscono determinate
sequenze
q nucleotidiche, si legano
g ad esse e le tagliano,
g
formando molecole di DNA alle cui estremità si vengono a
trovare due sequenze complementari a singolo filamento.
Ott
Ottenutiti i frammenti
f ti di DNA provenienti i ti dad organismi
i i
diversi, è possibile ricombinarli grazie all’intervento di
enzimi le ligasi.
specifici enzimi, ligasi
La molecola di DNA ricombinante, costituita dal vettore e dal
gene p
g prelevato da un qqualsiasi organismo,
g viene inserita in una
cellula ospite che può facilmente replicarsi (un batterio)
producendo copie esatte (cloni) della molecola ibrida, in
grandi
di quantità.
tità Le
L cellule
ll l che
h ospitano
it l sequenza di DNA
la
estraneo clonata saranno in grado di produrre la proteina
da essa codificata,
codificata ottenendo il prodotto genico
desiderato.
Questa tecnica è stata applicata
pp con successo nella cura
di individui con alterazioni geniche, nella produzione di
insulina umana e dell’ormone della crescita.
NH2 O
N 1 5
N
7 HN N
9
N N
3
H2N N N
H H
Adenina Guanina
L basi
Le as puriniche
pur n ch dell’RNA
N sono:
n
l’l’adenina
adenina (6-ammino purina)
la guanina (2-ammino-6-ossi purina)
O O
HN NH
N 3 1 NH
5
O
H2N
Citosina Uracile

Le basi
L b i pirimidiniche
i i idi i h sono:
la citosina (2-ossi-4-ammino pirimidina)
l’
l’uracile
il (2,4-diossi
(2 4 di i pirimidina)
i i idi )
O NH2
N 3 1NH N1 5
N
7

5 9
H2 N N
3
N
Citosina H
Adenina
Le basi sono legate allo zucchero
con un legame
g β-gglicosidico tra HOCH2 OH
il carbonio 1' dello zucchero e O 1’
l’azoto nella posizione 9 H H
d ll’ d i
dell’adenina o della
d ll guanina i o H
l’azoto nella posizione 1 delle
H
basi pirimidiniche citosina ed
OH OH
uracile. Ribosio
NH2 O
N N N NH
N N H2 N
H
Citosina
Adenina
HOCH2 OH
O O
O H H
N
H H HN NH
HN OH OH
H 2N N N Ribosio O
H
G
Guanina
i U il
Uracile
L’ RNA è presente:
‰ nel nucleo ((nei nucleoli),
),
‰ nel citoplasma cellulare.
Mentre la
M l quantità
i à di DNA è lal stessa in i tutte le
l cellule
ll l
diploidi dello stesso organismo, la quantità di RNA nelle
cellule
ll l può ò essere varia i e le l cellule
ll l che
h sintetizzano
i t ti
proteine sono le più ricche di RNA.

Si possono distinguere tre diversi tipi di RNA, ognuno con un


compito
p specifico:
p
× RNA ribosomiale (r-RNA), ha la stessa struttura per
tutti i ribosomi di uno stesso organismo ed è composto
da subunità di lunghezza e sequenza di basi diverse
× RNA messaggero (m-RNA), che costituisce circa il 60 –
80 % dell’RNA
d ll’RNA cellulare,
ll l
× RNA transfer o di trasporto (t-RNA).
L’ RNA è formato da un singolo
filamento ma p possono formarsi
tratti di doppia elica
intramolecolare ed il numero di
anse a doppia
d i elica
li puòò essere
anche elevato.
Sintesi di RNA e trascrizione sono
sinonimi
i i i
Il processo di sintesi dell’RNA consiste nella
polimerizzazione di ribonucleotidi secondo un
ordine fissato dalla successione delle basi che
sono sul DNA e non fa altro che trascrivere
l’informazione che risiede nel DNA nella nuova
molecola
l l di RNA.
La trascrizione del DNA inizia con il
riconoscimento sul DNA, da parte di un enzima,
una RNA p polimerasi-DNA
polimerasi DNA dipendente
dipendente,
p di un sito,
detto sito promotore della
trascrizione, sul quale vi è una sequenza di
basi posta all’inizio del gene.
™ L’RNA
RNA--polimerasi legata allo specifico sito promotore
p
provoca l’apertura
p della doppia
pp elica; i filamenti
di DNA si svolgono ed ha inizio la trascrizione.

™ Sullo
S ll st
stampo
mp del
d l DNA che
h viene
i n trascritto
t s itt il filamento
fil m nt di
RNA in fase di accrescimento è legato con legami di idrogeno
che rispettano la complementarietà delle basi: G-C e A-U

™ In genere sullo stampo di DNA restano legati 10 – 12


ribonucleotidi.
ribonucleotidi

™ L’ RNA polimerasi legge le basi del DNA da


trascrivere nel senso 3’ → 5’ e l’RNA che si va
formando si accresce nella direzione 5’ → 3’.
™ A mano a mano che procede la trascrizione il filamento di
DNA si riavvolge.
L’ RNA polimerasi legge le basi del DNA da
L
trascrivere nel senso 3’→5’ perciò l’RNA
che
h sii va formando
f d sii accresce nella
ll direzione
di i
5’ → 3’.

3’→
3’ →5’

5’ → 3’.
Negli
g organismi
g procarioti esiste un solo tipo
p p
di RNA polimerasi che consente la sintesi dei
tre tipi di RNA mentre negli eucarioti sono tre i
tipi di RNA polimerasi esistenti ed ognuno di essi
sovraintende alla trascrizione di uno specifico tipo
di RNA.

Nella maggior parte dei geni eucariotici, inoltre,


n ll regione
nella i n d dell promotore,
p m t vi sono altre
sequenze di basi implicate nell’inizio della
trascrizione.
Negli organismi eucarioti pluricellulari l’RNA
polimerasi si lega ad una sequenza di basi (da sei ad
otto coppie di basi) collocata circa 30 paia di basi a
monte del sito di inizio della trascrizione e chiamata
TATA box perché ricca in timina (T) ed adenina
(A).
A distanza dal sito di legame per l’RNA polimerasi vi è una
sequenza
q di 8-12 basi detta elemento a monte del
promotore (UPE, upstream promoter element).
L’efficienza del sito p
promotore è funzione del numero di
UPE che esso contiene: un gene contenente un solo UPE
viene espresso in modo debole mentre un gene contenente più
UPE è maggiormente
m i m t espresso.
s ss
Elemento a monte del
promotore (UPE, upstream
promoter element).
Più a monte delle sequenze
q UPE, in pprossimità
dell’estremità 5’, si trova un'altra sequenza di basi,
detta elementi enhancer o intensificatori, la
quale, una volta che sia stato riconosciuto il sito di
inizio, aumenta la velocità di sintesi.
UPE

3’→
3’ →5’
5’ → 3’.
La struttura del sito promotore nelle cellule
procariote consiste di due sequenze di DNA,
DNA una detta
Pribnow box, posta circa 10 basi prima del sito
di inizio d
della
ll trascrizione
t i i e ricca
i di timina
ti i ed
d adenine,
d i
ed un’altra chiamata “-3535 box” perché collocata a 35
b i a monte
basi t del
d l sito
it di inizio
i i i ddella
ll trascrizione.
t i i

“-35
35 box
box”

Pribnow box
P r o m o to r e

F ila m e n to S e q u e n z a -3 5 1 6 -1 8 c o p p i e d i b a s i S e q u e n z a -1 0 S it o d 'in iz io
c o d if ic a n te +1

5 '.... TTGA CA TATAAT A ....3 '

3 '.... A A CTGC ATATTA T ....5 '

F ila m e n to
s ta m p o T r a s c r iz io n e
5' A 3'
RNA

Il punto
t d’inizio
d’i i i della
d ll trascrizione
t i i è generalmente
l t
una purina
purina, quasi sempre l’adenina
adenina. Per convenzione i
nucleotidi
l tidi vengono numerati ti a partire
ti d l sito
dal it d’inizio
d’i i i della
d ll
trascrizione (+1) con numeri positivi verso destra, negativi
verso sinistra.
sinistra Il nucleotide ((-1)
1) è a monte del sito di inizio
della trascrizione e circa 10 basi a monte del sito d’inizio della
trascrizione vi è la sequenza
q -10 ((TATAAT
TATAAT)) o Pribnow
box. Nella posizione (-35) c’è la sequenza TTGACA detta
sequenza -35.
sequenza -35 Pribnow box

UPE
l’ RNA polimerasi riconosciuto il sito promotore:
¾ forma dei legami specifici con il DNA,
DNA
¾ apre la doppia elica,
¾ riconosce il filamento che deve essere
trascritto.

I ribonucleosidi trifosfati (ATP, GTP, CTP, UTP) si


appaiano in modo complementare alle basi del DNA, si
legano tra loro con un ponte fosfoestereo 3'→ 5' e
liberano pirofosfato.
p

Così il primo nucleotide è incorporato nella catena con il


gruppo -OHOH del
d l carbonio
b i 5' esterificato
t ifi t con tret residui
id i
di acido fosforico e con il gruppo -OH del carbonio 3'
impegnato in un legame fosfoestereo con il nucleoside
successivo..
successivo
I meccanismi con i quali termina la trascrizione
sono molteplici e complessi ma in generale
possiamo dire che la trascrizione termina con
un segnale, dato da una particolare sequenza di
basi situate sul DNA, a seguito del quale il
c mpl ss DNA-
complesso DNA RNA polimerasi
p lim si - RNA si dissocia,
diss ci
il DNA si richiude e l’RNA viene liberato.
3’→
3’ →5’

5’ → 3’

Figura 8. 12 - Rappresentazione schematica del processo di


trascrizione La trascrizione ha inizio dopo che ll’RNA polimerasi ha
trascrizione.
individuato la particolare sequenza nucleotidica del promotore. Una volta
aperta la doppia elica uno dei filamenti del DNA funge da stampo su cui
sono assemblati
bl ti i nucleotidi
l tidi della
d ll molecola
l l di RNA.
RNA I legami
l i di idrogeno
id t
tra
le basi del DNA si riformano quando l’RNA polimerasi si sposta lungo il
filamento di DNA. Quando l’enzima raggiunge un particolare segnale
all’estremità del gene da trascrivere, si distacca dal DNA e rilascia la
catena di RNA formato.
RNA si accresce nella direzione 5’ → 3’

5’ DNA da trascrivere
Lettura: 3’→
3’→5’
3’

5’

3’

5’
Fig.19.9 – Il mondo della cellula, Becker et al, Edises
Lettura: 3’→
3’→5’

Trascrizione: 5’ → 3’
Trascrizione: 5’ → 3’

Trascrizione
Nelle cellule procariote l’RNA appena trascritto dal
gene già funziona da m-RNA.
m RNA

Nelle cellule eucariote,, invece,, p


prima di migrare
g nel
citoplasma subisce due trasformazioni:

™ all’inizio
ll’i i i edd alla
ll fi
fine della
d ll molecola
l l di RNA sono
introdotti un cappuccio ed una coda per
proteggere
prote ere la molecola da attacchi enzimatici
e favorirne il riconoscimento da parte dei
ribosomi,
ribosomi
™ con il processo di splicing sono eliminati gli introni
e ggli esoni sono riuniti in modo da formare la
molecola di m-RNA.
Splicing dell’mRNA

Nel gene sono regioni


contenute
codificanti (esoni) e regioni
g non
codificanti (introni). Il gene è
trascritto nella sua interezza e si
forma un h-RNA (RNA eterogeneo)
ma prima che tale molecola lasci il
nucleo come m-RNA gli introni vengono
escissi e gli esoni riuniti. All’estremità
dell’mRNA
dell mRNA restano sequenze non
In tal modo gli
codificanti.
i t
introni
i sono trascritti
t itti ma
non tradotti mentre gli
esoni sono trascritti e
tradotti.
" a m o n te " S e q u e n z a p e r s e g n a le d i p o li( A )
" a v a lle "

P r o m o to r e E so ne I n tr o n e E so n e I n tr o n e E sone
DNA

E le m n ti d i c o n tr o llo R e g io n e te r m in a le
T r a s c r iz io n e

E nhancer
S e g n a le d i p o li( A )
" a v a lle "

p re -m R N A
( T r a s c r itto p r im a r io E sone I n tr o n e E sone I n tr o n e E so ne
5' 3'
di R N A )

M a t u r a z io n e d e ll'R N A ; a g g iu n t a d i
c a p p u c c io
i , c o d a , p o li( A ) ;
I n tr o n i r im o s s i r im o z io n e d e g li in t r o n i e c u c it u r a d e g li e s o n i

C o d a d i p o li( A )
C a p p u c c io 5 '
5' 3'
mRNA G -P -P -P S e g m e n to c o d if ic
i a n te U TR 3' A A A ......A A A
U T R 5'

( R e g io n e n o n tr a d o tta ) ( R e g io n e
n o n tr a d o tta )
C o d o n e d i in iz io C o d o n e d i a r r e s to

Figura 8.14 - Un gene eucariotico è dotato di un sito promotore, una sequenza


di DNA alla q quale va a legarsi
g l’RNApolimerasi
p in modo che p
possa avere inizio la
trascrizione. Un sequenza di basi poste “a valle”, nella regione terminale, vicino
all’ultimo esone determina l’estremità 3’ dell’RNA trascritto. Contestualmente
all’estremità 5’ del trascritto primario appositi enzimi appongono un cappuccio
mentre nella parte terminale viene aggiunta una coda di poli(A);
contemporaneamente lo spliceosoma rimuove gli introni . L’mRNA così formato
può essere esportato nel citoplasma per essere tradotto.
A seguito della trascrizione le molecole di RNA sono in grado
di trasferire le informazioni contenute nel DNA nel processo
p
della sintesi delle proteine, la traduzione: in tal modo
l’informazione depositata nel DNA passa nelle proteine.

L’m-RNA all’estremità 5’ è dotato di una sequenza di basi,


detta sequenza leader, che contiene il segnale se nale di
riconoscimento del ribosoma che consente a quest’ultimo di
posizionarsi in modo esatto perché la traduzione abbia inizio.
inizio

Nei p
procarioti spesso
p la traduzione dell’mRNA inizia p prima che
esso sia stato completamente trascritto; negli eucarioti la
trascrizione e la traduzione si verificano in tempi e sedi
differenti: la
differenti l trascrizione
tr scrizi ne avviene
vviene all
ll’intern
interno del nucleo
nucle mentre
la traduzione avviene, in un secondo momento, all’interno del
citoplasma In entrambi i casi i ribosomi si legano ad
citoplasma.
un’estremità dell’m-RNA e permettono ai t-RNA di decifrare il
messaggio.
I t-RNA sono formati da circa 70 nucleotidi e sono
caratterizzati
tt i d due siti di attacco:
ti da

primo, detto anticodone, è formato da una tripletta


il primo
di basi complementari ad una tripletta di basi
costituente un codone sull
sull’m-RNA
m RNA così che possono
instaurarsi legami di complementarietà tra le basi
del codone e quelle dell’anticodone;

il secondo sito si trova all’ estremità 3’ del t-RNA e si


l
lega all particolare
i l i id che
amminoacido h è codificato
difi
dalla tripletta complementare a quella
dell anticodone.
dell’anticodone

Esistono molteplici tipi di tt-RNA


RNA ne che si differenziano
per la composizione e la sequenza delle basi.
Tutte le molecole di t-RNA hanno una caratteristica
configurazione
g a trifoglio,
g , dovuta all’appaiamento
pp delle
basi che forma tre anse, due laterali ed una centrale, che
ricordano le foglie del trifoglio.
L’anticodone è collocato
sull’ansa centrale.
Sull’estremità 3’ del
filamento, terminante
sempre con la sequenza
(5’)-CCA
CCA-(3’), si lega
l’amminoacido da trasportare.
L’RNA messaggero ha un
turnover molto
l elevato
l e ne
esistono tante specie per
quanti
ti sono i genii che
h
codificano le proteine
I nucleotidi modificati presenti nelle
anse sono caratteristici del t-RNA.. T
rappresenta la ribotimidina, analogo
della timosina con il ribosio invece che il
d
deossiribosio;
b un altro
l nucleotide
l d
modificato è la pseudouridina che si
indica con ψ mentre ll’inosina inosina è
frequentemente presente sull’ansa 2 del
tt-RNA
RNA O
O

NH
NH

N O
N O
HO
HO
O
O H H
H H
H H
H H OH OH
OH H

Timosina Ribotimidina
O O

N N
NH NH

N N N N NH2
HO HO
O O
H H H H
H H H H
OH OH OH OH

Inosina O Guanosina O

NH HN NH

HO HO
N O O
O O
H H H H
H H H H
OH OH OH OH

Uracile Ψ-Uracile
La molecola di t-RNA è costituita da circa 75 75--90 nucleotidi legati
insieme in una singola catena. La catena termina sempre con la
sequenza (5’)
’)-
)-CCA
CCA--(3’)) ed a questa estremità ll’amminoacido
amminoacido può
legarsi al suo tRNA specifico. Le anse che conferiscono il tipico aspetto
“a trifoglio” al tRNA sono dovute all’autoappaiamento di basi
complementari; il numero di nucleotidi presenti nelle braccia e nelle
anse è di norma costante. La piccola ansa visibile a destra è presente
solo in alcuni casi e generalmente contiene 4-5 nucleotidi ma, a volte,
contiene anche 21 nucleotidi.
nucleotidi L
L’anticodone
anticodone è nell
nell’ansa
ansa centrale.
centrale Questo
raffigurato è uno dei sei tRNA che portano la leucina. leucina. Infatti
l’anticodone GAA riconosce il codone 3’-CUU-5’ che, normalmente è
scritto UUG. L’amminoacido da trasportare si connette all’estremità 3’
con l’intervento di un’amminoacil-tRNA-sintetasi.
Le regioni a doppia
elica sono stabilizzate
dai legami di idrogeno
che si instaurano tra
le basi complementari.
complementari.
Negli anni ‘50 del XX secolo, J. D.
Watson aveva definito il gene come
“una regione cromosomica discreta che
è responsabile
bil di un prodotto
d tt cellulare
ll l
specifico ed è formata da una serie
lineare di unità potenzialmente
mutabili (siti mutabili), ognuna delle
qquali ppuò esistere in p più forme
alternative e fra cui può avvenire lo
scambio genetico (crossing-over) ”.
Nello stesso periodo Beadle e Tatum, entrambi premio
Nobel 1958 p per la fisiologia
g e la medicina, con studi sulla
Neurospora crassa pervennero alla scoperta del
meccanismo secondo il quale i geni trasmettono le
caratteristiche
tt isti h ereditarie
dit i dim st nd
dimostrando come
m
l'ereditarietà
ereditarietà sia controllata da processi chimici
che intervengono nella cellula e formularono
formularono,
successivamente confermata, che un solo gene è
responsabile di un determinato enzima, vale a dire “un
gene - un enzima”.
Edward Lawrie Tatum (1909 - New 1975)

G. W.Beadle (1903 - 1989)


La molecola di DNA è un codice che contiene le istruzioni per
le strutture biologiche ma come la successione delle
basi determina la sequenza degli amminoacidi
nella proteina? La scoperta dell
dell’RNA
RNA diede la risposta a
questo quesito: le molecole di m-RNA sono copie di sequenze
di DNA e portano nel citoplasma le informazioni per la
produzione delle proteine.

Le proteine sono costituite dalla combinazione di venti


amminoacidi e le basi dei nucletidi sono solo quattro: se un
amminoacido fosse codificato da un solo nucleotide
potrebbero essere codificati solo quattro amminoacidi. Se
gli amminoacidi fossero codificati da due nucleotidi, sarebbe
possibile solo codificare sedici amminoacidi (42); la
combinazione di tre nucleotidi consente la codifica di 64
(43) amminoacidi e pertanto un codice
di a tret nucleotidi
l tidi,
codoni, consente la codifica dei venti amminoacidi.
L'interpretazione del codice genetico e della sua funzione
nella sintesi delle proteine è merito dell’équipe coordinata da
M W.
M. W Nirenberg
Ni b f resa possibile
fu ibil graziei a studi
t di condotti
d tti
sull’Escherichia coli con l’impiego di amminoacidi marcati
radioattivamente.
radioattivamente

Per i loro
P l st di in
studi i vitro
it questi
sti ricercatori
i t i ripartirono
i ti i venti
in ti
frazioni degli estratti cellulari di Escherichia coli ai quali
erano stati aggiunti ribosomi,
ribosomi ATP e tutti gli enzimi necessari
per la sintesi delle proteine nonchè tutti gli amminoacidi
occorrenti p per la sintesi marcando p però un solo
amminoacido per ogni differente frazione testata. A tutte
le venti frazioni aggiunsero poi un nucleotide preparato
artificialmente, il poliuracile (U-U-U-U-U-U-…-U) o
poli-U.
Dall’analisi delle venti frazioni emerse che i
polipeptidi formatisi erano costituiti soltanto da
fenilalanina (Phe) e quindi dedussero che il
messaggio:
uracile-uracile-uracile-....-uracile-......-uracile
era tradotto nel polipeptide:
Phe-Phe-Phe-......-Phe.

H
N H

U-U-U-U-U-U-....-U
H

O
COOH
N H

H H H
Un esperimento analogo con un polinucleotide
contenente due nucleotidi alternantisi mostrò che
si producevano catene polipeptidiche con
amminoacidi regolarmente alternantisi Così il
alternantisi.
adenina e guanina
polinucleotide contenente
regolarmente
l (A-G-A-G-A-G-A-
A G A G A G A
t alternantesi
lt t i
G-A-G-A-G-A-G-A-……G-A-G) fornì un
polipeptide contenente arginina ed acido
glutammico
g (Arg-Glu-Arg-Glu-…-Arg-Glu
g g g )
mentre il polinucleotide contenente uracile e
citosina regolarmente alternantisi (U
U-C-U-C-
C U C
U-C-U-C-U-C-U-C-..-U-C) produsse il
polipeptide
li tid contenente
t t serina i (Ser-Leu-
i e lleucina Ser Leu
Ser-Leu-Ser-Leu-…-Ser-Leu).
Un polinucleotide con tre differenti nucleotidi
regolarmente
g m alternantisi produceva
p una catena
polipeptidica con un unico amminoacido, ad esempio la
ripetizione di adenina, gguanina, uracile (A-G-U-A-G-
U-A-G-U-…....-A-G-U) portava alla sintesi di un polipeptide
contenente solo serina (Ser-Ser-Ser-…..…-Ser).

Questi risultati, quindi, confermarono che un


amminoacido
i id è codificato
difi t da d una tripletta
t i l tt
di basi, cioè da un codone, e mostrarono che alcuni
amminoacidi potevano essere codificati anche da due o
più differenti triplette.

A-G-U-; A
A--G-C-; U
U--C-U-; U
U--C-C-; U
U--C-A-; U
U--C-G-
codificano la Serina
(tab. 8.2, pg133)
Il dato sperimentale per il quale un amminoacido
puòò essere codificato
df d differenti
da d ff triplette
l
consente di affermare che il codice genetico è
ridondante o degenerato.
Il fatto poi che il codice genetico è quasi
identico, salvo rare eccezioni che sono ristrette
al DNA mitocondriale, in tutti gli organismi, da
quello più semplice a quello più complesso, ci
consente anche di affermare che esso è
universale.
Tab 8.2 pg 133
Rappresentazione delle due subunità dei ribosomi, accoppiate
ed isolate. 1: subunità accoppiate;
pp 2: subunità maggiore;
gg
3: subunità minore. Nei procarioti le subunità sono 30S (la
minore) e 50S (la maggiore), negli eucarioti sono 40S (la
minore)
i ) e 60S (la
(l maggiore).
i ) Nei
N i ribosomi
ib i di E.
E coli
li quando
d le
l
subunità si associano resta una sorta di scanalatura attraverso
la quale passa ll’m-RNA
m RNA, un canale dal quale emerge la
proteina in fase di sintesi ed un terzo canale attraverso il
quale entrano i trasportatori degli amminoacidi.
Cristallografia
ai raggi X
La traduzione, o sintesi proteica, è ll’altro altro processo
utilizzato per il trasferimento delle informazioni genetiche;
la decodificazione del messaggio genetico trasportato
dall’m-RNA, e quindi la sintesi delle proteine, avviene sui
ribosomi ad opera degli amminoacil-tRNA e richiede
ll’intervento
intervento coordinato di molteplici fattori.
fattori La sintesi
proteica, studiata in Escherichia coli, inizia con l’attacco
della subunità ribosomiale 30
30S S all’estremità
all estremità 5’ del
filamento di m-RNA che porta il codone d’inizio,
d’inizio
di solito 5’-AUG
AUG- -3’. In seguito un particolare t-RNA,
t RNA
detto t-RNA iniziatore, in grado di riconoscere con il suo
anticodone (3 3’-UAC
UAC- -5’) il codone iniziatore AUG che
codifica la metionina, differente dal t-RNA che è utilizzato
per il trasporto
p p della metionina nelle catene p
polipetidiche,
p si
va ad appaiare con il codone iniziatore dell’m-RNA.
Una volta che la metionina si è legata al t-RNA
iniziatore,, avviene la formilazione del g gruppo
pp
amminico con la formazione di N-formilmetionina
formilmetionina,
fMet,, il p primo amminoacido delle catene
polipeptidiche. L’appaiamento del codone AUG
dell’m-RNA con l’anticodone UAC del t-RNA
iniziatore-fMet, costituisce il complesso d’inizio
della sintesi proteica:
p
N-formilmetionina
formilmetionina-- tRNA
tRNA--mRNA-
mRNA-subunità 30S
Formazione della N-formilmetionina
formilmetionina--tRNAfmet

Per essere formilata la metionina deve essere legata


g al
tRNAfmet
f
Formatosi il complesso d’inizio, alla subunità 30S
30S
del ribosoma va ad attaccarsi la subunità 5050S
S.
Sul ribosoma sono presenti due siti di legame
legame, un
sito A ed un sito P. Il sito A è il sito per il
legame per il nuovo amminoacil-tRNA (sito
ili ) il sito
amminoacilico),
i i P è il sito
i che
h occupa il t-
RNA cui è legata la catena polipeptidica in via di
f
formazione
i ( i peptidilico).
(sito idili )
Il t-RNA iniziatore si lega al
sito P della subunità 50S 50S.
L’energia
L energia necessaria per questa
fase iniziale della sintesi
proteica è fornita dall
dall’idrolisi
idrolisi di
GTP.
Alla fase iniziale segue la fase di allungamento della catena
polipeptidica.
li tidi I questa
In t fase
f il secondo
d codone
d d ll’ RNA sii
dell’m-RNA
dispone di fronte al sito A della subunità maggiore ed un
amminoacil tRNA con anticodone complementare al secondo
amminoacil-tRNA
codone dell’m-RNA va a disporsi nel sito A in modo che
possa avvenire ll’appaiamento
appaiamento delle basi tra codone ed
anticodone; vengono così ad essere occupati sia il sito A sia
il sito P.
Quando entrambi i siti sono occupati, un enzima, la peptidil
transferasi
t f i, che
h sii trova
t nella
ll subunità
b ità maggiore
i d l
del
ribosoma, catalizza l’attacco nucleofilo del gruppo amminico
dell’amminoacido
dell amminoacido trasportato dal secondo amminoacil-tRNA al
carbonio carbossilico esterificato dell’N-formilMet-tRNA con
la formazione di un dipeptidil-tRNA
p p che resta legato
g
all’anticodone del secondo amminoacil tRNA e libera
contestualmente il tRNA iniziatore.
Il ribosoma, poi, si sposta di un codone sul
filamento di m-RNA,
m RNA in direzione 5’Æ 3’, il
secondo amminoacido è trasferito dal sito A al
sito P di modo che un terzo amminoacil-tRNA
amminoacil tRNA
potrà andare a collocarsi nel sito A, opposto al
terzo codone dell
dell’mRNA
mRNA ed il processo si ripete.
ripete
Quando il ribosoma giunge ad una tripletta di
terminazione della traduzione (UGA, G UAG,G
UAA):)
™ il sito A viene occupato da un fattore ρ,
fattore di rilascio,
™ si ha l’idrolisi del legame estereo tra la catena
peptidica e ll’ultimo
ultimo tt-RNA
RNA ad essa legato con
la formazione del peptide libero dal quale,
frequentemente, si stacca il gruppo
formilico che protegge la metionina oppure
ssi stacca la stessa met
metionina,
on na,
™ l’ultimo t-RNA viene rilasciato dal sito P e le
due
u subunità
u un tà del rribosoma ma ttornano
rnan a
separarsi.
Quando il ribosoma si sposta lungo il filamento di
m-RNA, l’estremità iniziale del filamento di m-RNA
viene liberata e può formarsi il complesso di inizio
con un altro t-RNA iniziatore di modo che sullo
steso filamento di m-RNA può avvenire più
volte la traduzione del messaggio. Il gruppo
di ribosomi
ib i che
h traducono
t d l stessa
la t molecola
l l di
DNA è definito polisoma o poliribosoma.
Figura 8.17

3’

5’

All’inizio la subunità 30
30SS del ribosoma si
lega all’estremità 5’ della molecola di mRNA.

Il primo tRNA,
che trasporta la
formilmetionina, si
inserisce con il suo
anticodone UAC
nel codone di inizio
AUG che h è sulla ll
molecola di mRNA.
La subunità 50
50SS del
3’
3 ribosoma
r bosoma va ad
incastrarsi sul tRNA
mediante il sito di
5’ l
legame P.

Il secondo amminoacido,
codificato dalla tripletta
AAA, la lisina, è
trasportato dal tRNA
che ha come anticodone 3’
la tripletta UUU; il
tRNA si incastra nel
sito A ed il suo
anticodone
ant codone ssi inserisce
nser sce
sul codone dell’mRNA.
Tra i due amminoacidi si forma il legame
peptidico
idi e contemporaneamente sii spezza il
legame del primo amminoacido con il suo tRNA.
A questo punto il
ribosoma si sposta
p
3’ lungo l’mRNA
l’mRNA in
direzione da 5’ a 3’ ed
il tRNA che
h h
ha
trasportato la Lys si
5’
5 sposta con il dipeptide
formato nel sito P
liberando il sito A

Nel sito A si
porterà il tRNA
con l’anticodon
AGU che
trasporta Ser
codificata dalla
tripletta
i l UC
UCA.
Tra il dipeptide e la
serina si forma un
legame peptidico e si
ripete il processo di
spostamento del
ribosoma.

Quando il ribosoma incontra il


codone
d di termine
i d ll
della
traduzione (in questo caso
UAG) il peptide si stacca
UAG),
dall’ultimo tRNA e quest’ultimo
si stacca dal sito P mentre il
sito A è occupato dal fattore
di rilascio, ρ, che induce la
di
dissociazione
i i d ll
delle d
due
subunità ribosomiali.
Figura 8.17

All’inizio la subunità 30
30S S del ribosoma si lega all’estremità 5’ della
molecola di mRNA. Il primo tRNA, che trasporta la formilmetionina, si
inserisce con il suo anticodone UAC nel codone di inizio AUG che è sulla
molecola di mRNA. La subunità 50S 50S del ribosoma va ad incastrarsi sul
tRNA mediante il sito di legame
g P. Il secondo amminoacido,, codificato dalla
tripletta AAA, la lisina, è trasportato dal tRNA che ha come anticodone la
tripletta UUU; il tRNA si incastra nel sito A ed il suo anticodone si
inserisce sul codone dell
dell’mRNA
mRNA. Tra i due amminoacidi si forma il legame
peptidico e contemporaneamente si spezza il legame del primo amminoacido
con il suo tRNA.
A qquesto p punto il ribosoma si sposta
p lungo
g l’mRNA
l’mRNA in direzione da 5’ a 3’
ed il tRNA che ha trasportato la Lys si sposta con il dipeptide formato nel
sito P liberando il sito A nel quale si porta il tRNA con l’anticodon AGU che
trasporta la serina,
serina codificata dalla tripletta UCA.
UCA Tra il dipeptide e la
serina si forma un legame peptidico e si ripete il processo di spostamento
del ribosoma. Quando il ribosoma incontra il codone di termine della
traduzione (in questo caso UAG),
UAG) il peptide si stacca dall
dall’ultimo
ultimo tRNA e
quest’ultimo si stacca dal sito P mentre il sito A è occupato dal fattore di
rilascio, ρ, che induce la dissociazione delle due subunità ribosomiali.
Figura 8.17
Formazione del
complesso di inizio
La subunità 30 30S S in
presenza di GTP ed
altri tre fattori di
inizio si lega all
all’mRNA
mRNA
ed al complesso
fMet-
fMet -tRNAfmet
formando il complesso
di inizio
inizio.

Si aggiunge poi la
subunità 5050S
S e si
forma il complesso di
inizio 70S.
Nella fase 1 un amminoacil-tRNA, in presenza di GTP e fattori
di allungamento, si lega al sito A del ribosoma
Complesso di inizio 70S

1
Nella fase 2 il fattore di allungamento è rilasciato dal
ribosoma e successivamente rigenerato.

2
3

N ll fase
Nella f 3 sii forma
f m il
legame peptidico lasciando
il tRNA scarico sul sito P
4

Nella fase 4, la fase di


traslocazione, è rilasciato il
tRNA scarico
s
scarico.
i . Il peptidil
peptidil-
tidil-
tRNA è traslocato al sito P
lasciando il sito A vuoto
vuoto..
Terminazione sintesi proteica
Terminazione sintesi proteica
UAA
UAG
UGA
Terminazione sintesi proteica
L’RNA trascritto migra nel
citoplasma e, in presenza dei
ribosomi partecipa al processo di
ribosomi,
traduzione con la formazione delle
proteine. Le proteine possono essere
sintetizzate su ribosomi
rib s mi liberi o
legati. Proteine secretrici, che
contengono una sequenza di segnale
idrofoba,
d f b si legano
l nell citoplasma
l alla
ll
particella di riconoscimento del
segnale
g (SRP
SRP). Il complesso p SRP-
ribosoma si sposta verso il reticolo
endoplasmatico dove si lega al
recettore SRP..
S La traduzione
traduz one
prosegue ed il peptide in fase di
crescita viene inserito nel lume del
reticolo endoplasmatico
endoplasmatico. Sulla
proteina, poi, sono aggiunti
zuccheri,, il peptide di segnale viene
zuccheri
staccato e la glicoproteina è veicolata
da vescicole verso l’apparato del
Golgi
Becker
Campbell
Le proteine sono formate da combinazioni di venti
amminoacidi
i idi legati
l ti da
d legami
l i peptidici
tidi i e, fatta
f tt eccezione
i
per la glicina, gli amminoacidi hanno tutti la
configurazione L - sul carbonio chirale α.

D-gliceraldeide L-gliceraldeide

La configurazione
L fi i assoluta
l t ddegli
li L-amminoacidi
L i idi è riferita
if it
alla configurazione assoluta della L-gliceraldeide
La sequenza degli
d l amminoacidi d in una proteina ne
caratterizza la struttura primaria che può essere
d
determinata
i con il processo di degradazione
d d i di Edman.
Ed
Struttura primaria di una proteina

NH2

aminoterminale

COOH carbossiterminale
La struttura secondaria di una
proteina indica la disposizione dei
gruppi della catena peptidica
che si ripetono periodicamente
(periodi
i di di identità
id tità o unità ità
ripetitive) in una dimensione dello
spazio.
spazio

A seconda di come ruotino i


radicali di ciascun amminoacido
rispetto al piano del legame
peptidico,
tidi l catena
la t peptidica
tidi può
ò
assumere configurazioni spaziali
diverse.
diverse
Sono possibili due tipi di struttura
s
secondaria: l struttura ad a-elica
d i : la a elica
e la struttura “a pieghe”
Le forze che influenzano il processo sono, per la
maggior parte dei casi, i legami di H2 che possono
instaurarsi tra l’ossigeno di un gruppo carbonilico
(di un legame peptidico) e l’idrogeno di un gruppo
amminico (di un altro legame peptidico).

Sono possibili due tipi di


struttura secondaria: la
struttura
t tt d a-elica
ad li e lal
struttura “a p
pieghe
g ”
Nell’α-elica il gruppo CO forma legami di
idrogeno con il gruppo NH del quarto
amminoacido che segue lungo l’elica.
Tra le strutture possibili per le proteine ad a-
elica, destrorsa e sinistrorsa,, nelle pproteine
naturali si riscontra esclusivamente quella
destrorsa, nella quale l’elica
l elica si avvolge in senso
antiorario.
antiorario

Nella struttura ad α-elica l’ossigeno di un gruppo


carbonilico instaura un legame di idrogeno con
l’idrogeno di un gruppo ammidico distante tre
residui amminoacidici ed i legami di idrogeno che
si formano sono all’incirca paralleli all’asse
dell elica
dell’elica
L’aggiunta di un residuo amminoacidico alla
catena peptidica fa avanzare ll’asse
asse dell
dell’elica
elica
di 0,15 nm e per ogni giro dell’a-elica si
i
incontrano 3 6 residui
3,6 id i amminoacidici.
i idi i Così
C ì in i
questa struttura le p
q posizioni equivalenti
q si
ripetono ogni 0,15 x 0,36 = 0,54 nm e
questo valore rappresenta il passo (o periodo
di identità) dell’ a-elica.

Un ggruppo
pp di pproteine contenenti p
per lo p
più
fibre ad a-elica sono le a-cheratine che, in
molti vertebrati,
vertebrati sono i maggiori costituenti
di peli, unghie, pelle.
La possibile configurazione della struttura secondaria di un
segmento di una proteina, α-elica. Le linee tratteggiate
indicano le interazioni che si stabiliscono all’interno della
catena tra gli atomi e che stabilizzano le strutture.
In altre proteine, come ad esempio nella fibroina della seta
seta Bombix mori, si ha la struttura
secreta dal baco da seta,
definita da Pauling β-pleated sheet (struttura a
pieghe): più che a spirale i componenti tendono a disporsi
distesi di modo che il legame di idrogeno anziché formarsi
all’interno della stessa catena p peptidica,
p si forma tra
l’ossigeno carbonilico e l’idrogeno ammidico di due o più
catene adiacenti; in questo tipo p di struttura i legami
g di
idrogeno che si formano sono quasi ortogonali all’asse
dell’elica.
La possibile configurazione della struttura secondaria di un
segmento
t di una proteina,
t i β o “a a pieghe”.” Le L linee
li
tratteggiate indicano le interazioni che si stabiliscono tra gli
atomi di catene adiacenti che stabilizzano le strutture.
strutture
Foglietto-β

Legami
idrogeno

Struttura a foglietto β con legami d


d’idrogeno
idrogeno intra
intra- e
inter-molecolari
Struttura di un pezzo di membrana con proteine di
transmembrana nelle configurazioni ad α-elica e β, a pieghe
La struttura terziaria
riguarda la disposizione
della catena peptidica
nello spazio
spazio, in modo da
formare una struttura
compatta.
compatta
S
Struttura terziaria
i i di proteine
i
Le parti ad α-elica sono raffigurate da spirali, quelle β
dalle frecce.
frecce Le palline grigie indicano la posizione di ioni
metallici, presenti in alcune proteine.
Struttura terziaria: i gruppi R influenzano l’avvolgimento
della catena interagendo tra loro (interazioni idrofobiche)
e con l’acqua
l’ (l
(localizzazione
li i superficiale
fi i l dei
d i gruppii R
idrofilici).
Interazioni che stabilizzano la struttura terziaria delle proteine
Interazioni e
legami coinvolti
nel ripiegamento
e nella stabilità
delle proteine
La struttura quaternaria è data dalla
combinazione di due o più catene
peptidiche, prende cioè in considerazione il modo
con cui le catene polipetidiche che formano una
proteina composta sono disposte l’una rispetto alle
altre.
altre
La sequenza degli amminoacidi nelle proteine è
di fondamentale importanza: la variazione di un
amminoacido nella molecola di emoglobina con la
sostituzione dell’acido g glutammico con la valina è la
causa dell’anemia falciforme. Infatti nell’emoglobina
emoglobina
normale il gene per la catena beta possiede, nella posizione
6 la l t i l tt
tripletta -G
G-A-C- che h codifica
difi Gl
Glu mentre
t
nell’emoglobina
emoglobina S, causa dell’anemia falciforme, il gene ha
nella posizione 6 la tripletta - G-C-C- che codifica Val
Val.

La variazione di q questo singolo


g amminoacido non
comporta differenti caratteristiche fisiologiche tra le
due molecole di emoglobina ma la sindrome anemica si
scatena
t perché
hé nell sangue venoso le
l molecole
l l di emoglobina
l bi
S si ordinano nei globuli rossi in modo da formare dei
cristalli aghiformi che distendono la membrana
dell’eritrocita e ne causano la lacerazione.
E oglobinaA
Em l bi A

Val His Leu Thr Pro Glu Glu Lys

Val His Leu Thr Pro Val Glu Lys


y

Emoglobina S

Figura 8. 22 - Parti
art della catena beta della molecola d di
emoglobina A (cellula normale) e dell’
dell’emoglobina
emoglobina S, (cellula
falciforme). La differenza strutturale tra le due molecole
consiste nella
ll variazione della
d ll sequenza in ogni catena beta:
la sostituzione di una molecola di acido glutammico (con
gruppo R idrofilo) con una molecola di valina (con gruppo R
idrofobico).
EmoglobinaA

Val His Leu Thr Pro Glu Glu Lys

Val His Leu Thr Pro Val Glu Lys

EmoglobinaS
Tabella 8.3 - Proteine e loro funzioni biologiche
Tipo di proteina Funzione svolta Esempio
Proteine contrattili Movimento Actina, miosina
Proteine di deposito Conservazione Caseina, ovalbumina, ferritina,
proteine dei swemi
Proteine di difesa Protezione in casi di stress Immunoglobuline (anticorpi),
ambientale fibrinogeno, lisozima
Proteine
P t i di R tt i antigeni,
Recettori, ti i proteine
t i di P
Pompe
membrana trasporto
Proteine di trasporto Trasporto di ioni e molecole Emoglobina, ferredoxina,
attraverso
tt lle membrane
b cellulari
ll l i li
lipoproteine
t i ematiche,
ti h
mioglobina plastocianina
Proteine enzimatiche Favorire selettivamente le reazioni RNA-polimerasi, aldolasi,
bi hi i h
biochimiche amilasi,
il i esochinasi,
hi i fosfatasi,
f f i
idrolisi, pepsina
Proteine ormonali Controllo dell'attività Insulina, paratormone, TRH,
dell'organismo TSH
Proteine recettoriali Risposta cellulare agli stimoli Tirosina chinasi
chimici
Proteine strutturali Funzione meccanica Cheratina, collagene, elastina,
involucri dei virus, seta,
tubulina