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Polimeri costituiti da amminoacidi legati tra loro da legami ammidici (legame petidico). Si
definiscono come di, tri, tetra….oligopeptidi….proteine (con PM >10000). Convenzionalmente
vengono scritti con l’amminoacido N-terminale a sinistra.
Peptidi
Il legame ammidico è planare con una rotazione parzialmente ristretta attorno al legame CO-N.
w N N
H
O R' O
N N
COOH
O O
Peptidi
a-elica b-foglietto
R H O R H O R
N N
N N N
H O R H O R H O
antiparallelo
O H R O H R O H
N N N
N N
R O H R O H R
R H O R H O R H
N N N
N N N
H O R H O R H O
parallelo R H O R H O R H
N N N
N N N
H O R H O R H O
Passo 3,6 residui
Peptidi
b-turn
O
R R
H N H O
O H N
R R
N H O
Peptidi
Nei peptidi si trova un altro legame covalente che è il ponte disolfuro che si forma tra
due cisteine spesso in posizioni remote lungo la sequenza primaria del peptide. Il
ponte disolfuro stabilizza determinate conformazioni sia in piccoli peptidi che in
proteine.
S S S S
Cys-Tyr-Phe-Glu-Asn-Cys-Pro-Arg-Gly-NH2 Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2
Vasopressina Ossitocina
Analisi degli amminoacidi: il peptide viene idrolizzato completamente con HCl (6N, 24 h,
110 °C) e la miscela di amminoacidi viene separata per cromatografia a scambio ionico. Gli
amminoacidi vengono rilevati dopo reazione con ninidrina.
CO2H CO2H
+
Nel processo di idrolisi alcuni amminoacidi H3O
H2N H H2N H
vengono degradati: il triptofano, per la
presenza del nucleo indolico, sensibile NH
all'ambiente acido, decompone; l'arginina, 3 N
3 NH2
H
per la presenza del nucleo guanidinico, NH2
+
perde urea e si trasforma in ornitina, arginina
NH2CONH2
asparagina e glutammina subiscono
l'idrolisi del gruppo ammidico. ornitina
Peptidi: determinazione della sequenza primaria
Idrolisi parziale: il peptide viene idrolizzato in frammenti più piccoli che sono poì analizzati
separatamente. Normalmente si utilizzano enzimi capaci di idrolizzare il peptide in siti
specifici. Due tra quelli utilizzati comunemente sono la tripsina che idrolizza selettivamente
il legame peptidico al gruppo carbossilico della lisina o dell’arginina e la chimotripsina che
rompe selettivamente il legame peptidico del gruppo carbossilico degli ammino acidi con
catena laterale aromatica.
NO2
O2N O2N
R1 O O2N F R1 O R1
H H H3O+
N N
H2N N N COOH + AA
H H
O R2 NO2 O R2 NO2
2,4-DNP-a.a.
TLC, HPLC
NMe2 NMe2 NMe2
R1 O R1 O R1
H SO2Cl H H3O+
N O2S N O2S
H2N N N COOH + AA
H H
O R2 O R2
dansyl-a.a.
Peptidi: determinazione della sequenza primaria
N-terminale: metodo di Edman
Ph
N C S O R3
H O H
R1 O R3 S R1 O S N
H H N
N Ph N N H
H2N N N N R2 O
H H H Ph N R1
O R2 O O R2 H
CF3COOH
S R1 SH R1 H3O+ O O R3
Ph S
Ph H2N
N N COOH N N COOH N + N
H H H N H
Ph R1 R2 O
H
Anilino tiazolinone
S
NH
Ph N N-feniltioidantoina (PTH)
R1
O
HOOC HOOC
H H2N COOMe H2N COOH
N COOMe OH
H2N H2N
O O Ph Ph
Ph
aspartame (AspPheOMe)
Non si può ottenere direttamente dai due amminoacidi per due motivi principali:
• si otterrebbe una miscela di prodotti: è necessario proteggere le funzioni che non devono reagire;
• per ottenere il legame ammidico bisogna attivare il gruppo carbossilico;
HOOC
POOC
H
H2N COOMe 1) agente condensante N COOMe
OH H2N
PHN 2) deprotezione O
O Ph Ph
aspartame (AspPheOMe)
O O
H2O - CO2
R R OH H2N
O N HO N
H H
carbammato
R1 H
R1 H O R1 H
R2 NH2 H
X -HX N N
HN O R N R
O H
O R O
R O ossazolone
R1
N
OH
O
R
forma enolica
(achirale)
Carbobenzilossi (Cbz, Z)
O O
R
Ph O N Ph O Cl R NH2
H
CBz, Z ZCl
O O O
HBr/HAc -
R R Br R - CO2
Ph O N Ph O N Ph Br O N R NH3 Br-
H H H
H H
O O
R H2/Pd/C CH3 R - CO2
Ph O N Ph O N R NH3 Br-
H H
H
t-butossicarbonil (Boc)
O O O O
R O Cl R NH2 o
O N O O O
H
BocCl (Boc)2O
Boc
O O O
TFA
R R - CO2
R
O N O N O N R NH3 TFA-
H H H
H H
9-fluorenilmetossicarbonil, FMOC
O O
R
CH2 O N CH2 O Cl R NH2
H
FMOC
stabile deprotezione
a) Estere metilico.
O O
Cl-
i) esterificazione di Fischer H2N HClgas / CH3OH
H3N CH3
OH O
R R
O O O
NaHCO3 H3C I
PHN PHN PHN + NaI
OH O- OCH3
R R R
Protezione del gruppo carbossilico
i) Reazione con il diazometano
Il diazometano è un forte agente alchilante. Può essere considerato come un sale di diazonio alifatico. E’
molto reattivo ma decompone facilmente in modo esplosivo. Viene preparato in bassa concentrazione e
utilizzato direttamente.
O O
NaNO2, H+ KOH, etere
CH3 CH3 CH2NH2 + NH3 + CO2
H2N N H2N N doppia fase
H
N O
Protezione del gruppo carbossilico
b) Estere t-butilico.
Può essere introdotto con metodi tradizionali (Fischer) ma si preferisce la reazione con l’isobutene.
O
NHP
HO O
+
H + R PHN
O
+
-H
R
c) Estere benzilico.
Viene introdotto utilizzando alcol benzilico su derivati attivati dell’acido carbossilico.
O O
BzOH PHN
PHN
X O
R R
stabile deprotezione
Per proteggere i gruppi in catena laterale si sfruttano la diversa reattività o proprietà particolari come la
capacità degli amminoacidi di formare complessi con ioni metallici che coinvolgono solo i gruppi in
amminico e carbossilico in a.
NH2 Ph O N Ph
O O
H3N H3N
O + basica e + nucleofila O
NH2 NHZ
O O
H2N H2N NHZ
O- ZCl EDTA
O- O
Cu2+ Cu2+ H3N
O- O-
NH2 O-
NH2
O O
NH2 NHZ
Protezione dei gruppi in catena laterale
Nel caso dell’acido aspartico a seconda della carica dell’amminoacido il gruppo carbossilico in catena
laterale è più o meno reattivo di quello in alfa.
COOH COOR
ROH
O O
H3N H3N
O O
Asp PI = 3 Asp
ROH
COOR COOR
LiOH
OR O-
H3N H3N
O O
+ reattivo
Formazione del legame peptidico
La formazione del legame peptidico richiede l’attivazione della funzione carbossilica. Questa può essere
ottenuta in diversi modi: acilcloruri, anidridi simmetriche o non, esteri attivati. Il metodo più comunemente
utilizzato sfrutta invece la reattività delle carbodiimidi, dette anche agenti condensanti.
N C N NH
N C N
Cl-
DCC EDC
Sintesi peptidica
La sintesi peptidica richiede una sequenza di steps di protezione/coupling/deprotezione che si ripetono.
Problemi che si incontrano sono:
1) Solubilità del peptide che diminuisce mano a mano che le sue dimensioni crescono.
2) Racemizzazione che può essere dovuta all’azione diretta di basi sul protone in alfa o alla formazione
dell’ossazolone. Per minimizzare questi rischi si evitano condizioni basiche forti e si procede alla sintesi dal
C-terminale verso il N-terminale.
O-
H R O
base
N C HN
N
H H R
H+ R
O
R1 H
R1 H O R1 H
R2 NH2 H
X -HX N N
HN O R N R
O H
O R O
R O ossazolone
R1
N
OH
O
R
forma enolica
(achirale)
Sintesi peptidica
La via di sintesi che allunga il peptide facendo il coupling sull’amminoacido C-terminale (da N-terminale a
C-terminale) genera un carbossile attivato in posizione n+1 rispetto ad un altro amminoacido favorendo
la formazione dell’ossazolone.
N-terminale C-terminale
R
OP
R O H2N
H
N O
PH2N X
C-deprot.
C-att. O R
R O
H
N racemizzazione!
PH2N OP'
R
O R
X
N-deprot. R O PHN
H
N O
H2N OP
O R
ok!
C-terminale N-terminale
Sintesi peptidica
3) Bisogna scegliere protezioni ortogonali dei gruppi in catena laterale e del carbossilato C-terminale.
Pp Pp Pp Pp
O O
coupling deprot. coupling deprot.
+ X NHPt NH2
PpOOC NH2 NHPt PpOOC N PpOOC N
H H
O
Pp Pp
Pp
A B C
H2 H2 H H2 H2
C C C C C C C C C
H H H H
H H2 H H2 H2 H H2 H
C C C C C C C C C
H
R
Cl O
BocHN
O
H2 H2 H H2 H2 R H2 H2 H H2 H2
C C C C C C C C C C C C C C C C C C
Cl OMe H H H H H H H H O
SnCl4 BocHN COO- TFA O
NH2
R
H H2 H H2 H2 H H2 H H H2 H H2 H2 H H2 H
C C C C C C C C C C C C C C C C C C
H H
SPS resina di Merrefield
2) La resina presenta un limitato spazio interno e questo può rendere difficile la crescita del peptide.
3) Quando il peptide cresce tende a strutturasi e questo limita l’accessibilità del gruppo N-terminale.
Questo è ancora più importante quando si usano solventi apolari come CH2Cl2 che si usa per la resina di
Merrefield. Per ovviare a questo sono state indrodotte altre resine come la resina di Sheppard a base di
poliacrylammide con le quali si usa DMF.
4) I gruppi BOC/Z non sono perfettamente ortogonali. Oggi si utilizza di più FMOC/BOC.
Le proteine sono biopolimeri con caratteristiche poliammidiche dove l'unità monomerica è l'a-
amminoacido della serie L.
Proteine fibrose: insolubili in acqua e in soluzione diluita di sali; sono solide. Sono costituite da catene
polipeptidiche disposte linearmente una a fianco dell’altra a formare fibre. Sono utilizzate in antura come
materiali strutturali. Esempio è il collagene.
Proteine globulari: solubili in acqua e in soluzioni diluite di sali; sono formate da catene
polipeptidiche, avvolte in forme compatte; sono approssimativamente sferiche. Appartengono a questa
classe la maggior parte degli enzimi.
a-elica b-foglietto
R H O R H O R
N N
N N N
H O R H O R H O
antiparallelo O H R O H R O H
N N N
N N
R O H R O H R
R H O R H O R H
N N N
N N N
H O R H O R H O
parallelo
R H O R H O R H
N N N
N N N
Nelle proteine la struttura secondaria è determinata dalle preferenze conformazionali degli AA costituenti e
viene stabilizzata da interazioni non covalenti come i legami ad idrogeno o covalenti come i ponti disolfuro
Proteine: struttura terziaria
porina
albumina
tripsina
La struttura terziaria della catena polipeptidica è determinato da interazioni di non legame (forze di v.d.W. e
legami idrogeno) e di legame (ponte disolfuro tra due residui cisteinici), come pure da attrazioni dì tipo
coulombiano tra gruppi portanti carica di segno opposto (gruppo ammonico e anione carbossilato). Molto
importanti sono le interazioni idrofobiche tendo a concentrare sulla superficie i residui polari e allinterno della
struttura globulare i residui idrofobici
Il processo di perdita della struttura terziaria va sotto il nome di denaturazione e può essere reversibile
(solventi organici, forza ionica) o irreversibile (temperatura elevata, acidi forti).
Proteine: struttura quaternaria
HIV-1 proteasi