Le proteine-G: trasduttori di segnale Esiste una famiglia assai numerosa di proteine, le proteine-G (G perch legano GTP oppure GDP),

che svolgono una funzione trasduttiva. Tale funzione apparve una novit nel campo delle proteine. In effetti la trasduzione (da non confondere con traduzione) un processo biologico che, paradossalmente, potrebbe apparire non-necessario. Infatti una proteina-G trasferisce un cambio di conformazione: da una proteina che riceve un segnale (per esempio un recettore -adrenergico inserito nella membrana plasmatica di una cellula che avverte la presenza dellormone, legandosi ad esso quando la concentrazione dellormone aumenta, in ossequio alla legge di azione di massa), alla proteina enzimatica che, grazie a questo cambio di conformazione che riceve dalla proteinaG, cambia essa stessa conformazione e si attiva: per esempio la ben nota adenilato ciclasi, che sintetizza AMPciclico. In definitiva la proteina-G trasferisce un cambio di conformazione, nellesempio classico ora citato, da una macromolecola recettore alla macromolecola enzimatica. Per assurdo, potremmo porci la seguente domanda: Questo cambio di conformazione non potrebbe avvenire direttamente, senza richiedere linterposizione della proteina-G? In realt linterposta proteina-G svolge diversi compiti importanti: amplifica il segnale, partecipando ad un processo a cascata. Quindi un recettore pu interagire con molte proteine-G, che a loro volta possono interagire (nellesempio sopra citato) con molte macromolecole di adenilato ciclasi. assicura la transitoriet del segnale stesso. Infatti la proteina-G idrolizza il GTP ad essa legato, che diventa GDP, e la proteina-G diventa inattiva nella sua capacit trasduttiva (non usiamo il termine trasduzionale, perch esso, di norma, indica la sintesi proteica); pu rendere adattabile ad altri segnali lo stesso processo trasduttivo: infatti molte proteine-G possono attivarsi o disattivarsi in seguito allazione di altre entit molecolari. Abbiamo gi visto che la proteina SOS attiva la proteina RAS, che una proteina-G. Scoperta delle proteine-G (da Le Scienze, sett. 92, pag.40) Visto che le proteine-G svolgono una funzione che, a prima vista, sembrerebbe non-essenziale, risulta interessante comprendere come e quando furono scoperte. Intorno al 1975 risult cruciale (per arrivare alla scoperta delle proteine-G) la disponibilit di cellule mutanti, che non sintetizzano AMPcicl, che per tale propriet sono state siglate cyc-. Si riteneva, erroneamente (e vediamo ora perch), che non sintetizzassero AMP-cicl in quanto prive dellenzima adenilato ciclasi. Elliot M. Ross, che lavorava nel laboratorio di Alfred G. Gilman (il padre delle proteine-G), condusse alcuni esperimenti classici con lobiettivo di dimostrare leffettiva assenza di adenilato ciclasi nelle cellule cyc-. Ross si proponeva di aggiungere lenzima ritenuto mancante alle cellule cyc- (ladenilato ciclasi) per verificare la ripristinata capacit a sintetizzare AMPcicl. Si tenga presente che ladenilato ciclasi un enzima di membrana (vedi pag.171), e in quegli anni non erano ancora state messe a punto in maniera soddisfacente le tecniche sofisticate di laboratorio per la purificazione di proteine di membrana. Pertanto Ross non aveva la disponibilit di adenilato ciclasi pura, che avrebbe consentito lesecuzione del seguente esperimento pulito: aggiunta diretta e della sola adenilato ciclasi alle cellule cyc- , con verifica della riacquistata capacit sintetica per lAMPcicl. Pertanto, non essendo disponibile ladenilato ciclasi pura, Ross esegui un esperimento (che denominiamo Prova, vedi figura della pagina seguente), aggiungendo alle cellule cyc - altre membrane ottenute da cellule normali che, in quanto tali, contengono ladenilato ciclasi che, di norma, presente. Lesperimento riusc, ma non poteva essere considerato conclusivo: infatti, le cellule cyc acquistarono la capacit sintetica per lAMPcicl, ma occorre tener presente che aggiungendo membrane di cellule normali era stato introdotto, di fatto, tutto il patrimonio di proteine presenti nella membrana, quindi il ripristino della capacit sintetica per lAMPcicl poteva anche dipendere da altre proteine, diverse dalladenilato ciclasi.

288

Linadeguatezza del preparato aggiunto (membrane di cellule normali) era ben nota a Ross, che esegu parallelamente anche un esperimento Controllo che, nelle intenzioni di Ross, avrebbe dovuto essere negativo. Per eseguire lesperimento Controllo indusse preventivamente linattivazione dellenzima adenilato ciclasi (mediante trattamenti chimici specifici) in un campione di membrane ottenute da cellule normali, che aggiunse poi alle cellule cyc-. In tale esperimento di controllo era previsto il non-ripristino della capacit sintetizzante per AMPcicl, congruente con la ipotizzata aggiunta di adenilato ciclasi alla Prova. Con gran sorpresa di Ross anche C produsse AMPcicl. CONCLUSIONE DELLESPERIMENTO DI ROSS: le cellule cyc- non sintetizzano AMPcicl non per lassenza delladenilato ciclasi, ma perch tali cellule cyc- risultano effettivamente mancanti di un componente, che allora era incognito. Tale componente andava ricercato (presumibilmente) tra le proteine di membrana presenti normalmente nelle cellule in grado di sintetizzare lAMPcicl. Quindi con lesperimento Prova era stata ottenuta la produzione di AMPcicl perch laggiunta di membrane ottenute da cellule normali alle cellule cyc- forniva alle cellule cyc- un componente di cui le cellule cyc- erano effettivamente prive, ma che non era (come inizialmente ipotizzato), ladenilato ciclasi. Esperimenti successivi portarono alla dimostrazione che le cellule cyc- erano, in realt, deficienti di una proteina allora ignota, una proteina-G. Nello schema seguente sono illustrate in forma schematica le prove di laboratorio di Ross: Esperimento Prova Esperimento Controllo

Schema degli esperimenti di Elliot M. Ross. Nella Prova alle cellule cyc- era aggiunta (senza esserne a conoscenza) la proteina-G, di cui le cellule cyc- erano prive. Si riteneva di aver rimpiazzato la adenilato ciclasi. Le membrane ricostruite producevano AMP-cicl per aggiunta di adrenalina. Nel Controllo era inattivata ladenilato ciclasi nelle membrane aggiunte ma, di fatto, era aggiunta la proteina-G in cyc-, componente di cui le cellule cyc- erano realmente mancanti. Per dimostrare leffettiva mancanza dellAdenilato Ciclasi il Controllo non avrebbe dovuto produrre AMP-cicl per aggiunta di adrenalina alle membrane ricostruite. 289

Negli anni 1980-85 due ricercatori del gruppo di Gilman riuscirono a dimostrare leffettiva esistenza della proteina-G, che svolgeva un ruolo essenziale nel trasferimento dellattivazione innescata dalladrenalina. Per individuarla risult cruciale la sua propriet di attivarsi in presenza di GTP. La superfamiglia delle proteine-G Le proteine-G furono studiate dal gruppo di Gilman. Erano caratterizzate dal possedere una struttura eterotrimerica, essendo formate da tre diverse subunit: , e . La subunit pi caratterizzante la , che scambia il GDP con GTP e che in grado di idrolizzarlo a GDP. La struttura eterotrimerica propria della proteina-G che lega GDP. Quando lega GTP, le subunit e si dissociano dalla , che nella forma attiva interagisce con le molecole bersaglio, per esempio lAdenilato Ciclasi. Contemporaneamente alle scoperte del gruppo di Gilman, intorno alla met degli anni 80, furono scoperti i meccanismi della fotorecezione nella retina dei vertebrati (vedi inserto di pag.292). In breve si scopr che il GMPciclico teneva aperti i canali per il sodio nei segmenti esterni dei bastoncelli. La luce (anche un singolo fotone) colpisce la molecola cromoforo retinale, che inserita nella macromolecola recettoriale rodopsina. Il retinale cambia configurazione: da 11-cis diventa alltrans e si verifica un cambio conformazionale del recettore stesso. Per inciso la rodopsina ha una buona omologia strutturale con i recettori adrenergici. Quindi esiste un buon parallelismo tra segnale scatenato dalladrenalina e segnale scatenato dalla luce. Nei fotorecettori il cambiamento conformazionale della rodopsina induce un cambio di conformazione in una molecole trasduttrice del segnale specifica dei fotorecettori, denominata trasducina, che una importante proteina-G. Infatti questa si attiva legando GTP (attenzione: il ruolo svolto dal GTP nella trasducina del tutto indipendente dal ruolo svolto dal GMP-ciclico sui canali; ambedue le macromolecole -trasducina e canali sensibili al GMPciclico- sono dipendenti ambedue in forma casuale da nucleotidi della base purinica azotata Guanina). La trasducina, nella forma attiva, trasmette un cambio di conformazione (attivandolo) allenzima fosfodiesterasi del GMP-ciclico, che idrolizza il GMP-cicl, rimuovendolo dal segmento esterno. I canali per il sodio si chiudono (restano aperti solo se presente GMPcicl), determinando un segnale elettrico (iperpolarizzazione).La scoperta della trasducina si rivel della massima importanza per lo studio delle proteine-G in generale. Il motivo semplice. Le membrane dei segmenti esterni dei bastoncelli contengono grandi quantit di trasducina, direttamente evidenziabile con una semplice elettroforesi, mentre in altre cellule le proteine-G sono presenti a livelli di gran lunga inferiori. Molti studi sulle proteine-G in generale furono pertanto condotti sulla trasducina. Oltre allimportantissima trasducina esistono altre proteine-G.

In realt sottrae la subunit dalla PDE (fosfodiesterasi), che si attiva idrolizzando velocemente il GMPciclico.

290

Furono infatti scoperte le proteine-G cosiddette monomeriche, che appartengono ad una famiglia numerosa. Ne vedremo alcune. La prototipo la RAS-p21, formata da una unica subunit di peso molecolare 21.000 Da. Di essa abbiamo gi parlato, essendo attivata (incorporando GTP) per azione della proteina SOS. Altre proteine-G monomeriche sono le Rho, le Rab, le Arf, le Ran. Ciascuna di esse forma una subfamiglia. Per esempio H-Ras. K-Ras e N-Ras appartengono alla subfamiglia Ras. Occorre ricordare che una proteina-G era nota ancor prima delle scoperte di Gilman e collaboratori, solo che possedeva una funzione assai specializzata. Si tratta del Fattore di allungamento Tu (EF-Tu), che partecipa alla sintesi proteica ribosomiale. Ricordiamo brevemente che EF-Tu si attiva legando GTP che sposta il GDP, legato, di norma, ad EF-Tu non attivo. EF-Tu (GTP) lega lamminoacil-tRNA e ne favorisce linserimento nel sito A ribosomiale. Tale inserimento comporta lidrolisi del GTP di EF-Tu che ritorna, pertanto, nella forma quiescente, con GDP legato. Ricordiamo che anche le tubuline, che formano i microtubuli (questi sono strutture cilindriche e cave del diametro di circa 30 nm formate da tubulina e ), consumano GTP per la reazione di polimerizzazione, ovvero per la formazione dei microtubuli. Invece lactina, che forma i microfilmanti (del diametro di 7 nm) consuma ATP per la reazione di polimerizzazione. Quindi le proteine-G formano una super-famiglia di proteine, tutte caratterizzate dal legame al GTP e dalla capacit intrinseca di idrolizzarlo (formando GDP). In definitiva le proteine -G sono cos classificabili: super-famiglia, formata da (almeno 5), famiglie ciascuna delle quali formata da Famiglie di proteine-G: le eterotrimeriche G, le trasducine, le monomeriche, forma-te, a loro volta, da diverse subfamiglie: i fattori di allungamento EFTu, le tubuline

Le proteine-G, nel loro insieme, formano una super-famiglia

sub-famiglie Le pi note sono le subfamiglie della famiglia delle proteine-G monomeriche: Sub-famiglia Ras Sub-famiglia Rho Sub-famiglia Rab Sub-famiglia Arf, Sar Sub-famiglia Ran

Schematizziamo il ciclo di attivazione che caratterizza le proteine-G:

Occorre tener presente che tale schema generalmente valido per tutta la super-famiglia delle proteine-G, ad esclusione di quelle monomeriche, prive di subunit e . 291

Inserto: Biochimica della fototrasduzione nei Vertebrati

292

Relazioni struttura-funzione delle proteine-G (da Kaziro & Coll. Ann. Rev. Biochem. 60, 349, 1991) Confrontiamo le strutture primarie delle varie famiglie di proteine-G. In esse sono individuabili regioni che assolvono alle specifiche funzioni della proteine-G, che dovr: essere in grado di legare il GTP oppure il GDP; essere in grado di idrolizzare il GTP; possedere una zona di interazione con una molecola committente, per esempio il Recettore (R), che induce il cambio di conformazione sulla proteina-G stessa; possedere una zona di interazione con una molecola Effettore (E), per esempio lAdenilato Ciclasi, sulla quale la proteina-G induce il cambio di conformazione. Tenendo presenti queste necessit funzionali, possiamo ricercare le regioni associate alle funzioni sopra citate in alcune proteine-G. Con questo obiettivo occorre considerare le strutture primarie di alcune proteine-G. Nelle Figure 4 e 5 della pagina seguente sono confrontate le strutture di: EF-Tu, che interagisce con il sito A dei ribosomi; Gs - la subunit della proteina-Gs (s = stimolatoria delladenilato ciclasi). Gi2 - la subunit della proteina-Gi (i = inibitoria delladenilato ciclasi nelle cellule sensoriali olfattive). Go - la subunit della proteina-Go (o = others, altre). Gt - la subunit della proteina-Gt (t = trasducina), che interagisce con la fosfodiesterasi nei fotorecettori dei vertebrati. Ras 2- una proteina-G appartenente alla subfamiglia Ras delle proteine-G monomeriche. La Ras-2, insieme alla Ras-1, forma un gruppo di proteine-G del lievito che regola la progressione della fase G1. H-Ras - stata la prima proteina-G monomerica studiata. E il prototipo della famiglia delle monomeriche. Fu individuata da Harvey (H) in un retrovirus, dove esiste la forma virale che porta una singola mutazione rispetto alla controparte proto-oncogenica. Teniamo presente che le differenze pi salienti esistono tra le proteine-G eterotrimeriche e le monomeriche. La subunit delle eterotrimeriche presenta un peso molecolare tra 40 e 45.000 Da. Nel capitolo successivo analizzeremo pi a fondo la famiglia della proteine-G monomeriche, che non si legano a subunit , e che possiedono un peso molecolare che circa la met. Infatti la Ras nota anche come p21, ovvero proteina di peso molecolare 21.000 Da. Anche le altre proteine-G monomeriche presentano un peso molecolare intorno a tale valore, con qualche eccezione. Confrontiamo ora le strutture delle principali proteine-G che sono state allineate nella Figura 4 e schematizzate nella Figura 5. A partire dallN-terminale troviamo: regione P (G1) - (P = fosfato)..lega la catena polifosforica del nucleotide. Emerge lesistenza di una sequenza consenso -G-X-X-X-X-G-K-S/T-, che simile al Rossmann Motiv trovato nelle proteine cinasi. In esso prevista una G al posto di X in 3a posizione. Tuttavia, se si osserva la figura 4 (A), si pu constatare che ben 8 sequenze, tra le 10 prese in considerazione, presentano G nella 3a posizione, quindi lanalogia con il Rossmann motiv reale. Interessante constatare che proteine diverse ricorrono a sequenze analoghe per assolvere alle medesime funzioni. Infatti le proteine cinasi usano il Rossmann motiv per legare il trifosfato dellATP, mentre le proteiene-G usano un motivo assai simile per legare il trifosfato del GTP. Anche ladenilato ciclasi (vedi pag.175) presenta il Rossmann motiv nella regione che lega il polifosfato dellATP. regione E (G2) - (E = effettore). Questa regione, non indicata nelle figure, diversa nelle varie proteine-G. E leggermente conservata solo nellambito di una sub-famiglia. In Ras occupa 10 AA, tra il 32 ed il 42. Una mutazione di p21RAS in tale regione determina scomparsa delle capacit trasformanti. In H-Ras esiste la T-35, che conservata in tutte le Proteine-G. 293

Regione G (G3) - (G = GTP). Esprime funzione GTPasica. La sequenza consenso -D-X-X-G-Q- altamente conservata (vedi Figura 4B). Il primo Aspartico (D) probabilmente coordinato allo ione Mg2+. Mutazioni in questa regione generano, sovente, un fenotipo trasformato. v-Ras presenta in posizione 59 una treonina al posto della valina, che viene fosforilata. Regione G (G4) - (G = GTP). Questa regione interagisce direttamente con lanello purinico del nucleotide, cio con il residuo di guanina. In tale regione (vedi Figura 4-C) esiste la sequenza -NK-X-D- altamente conservata. Regione G (G5) - E unaltra regione strettamente legata allanello guanilico del GTP. Contiene la sequenza consenso conservata -E-T-S-A-K- in Ras. La struttura tridimensionale verr studiata in Ras (vedi pag.300).

294

Analoghi non-idrolizzabili del GTP Per lo studio delle proteine-G sono largamente impiegati in laboratorio analoghi del GTP non idroolizzabili. Sono composti preparati per sintesi chimica, che presentano una leggera modifica al fosfato del GTP. Pertanto una proteina-G pu legare il derivato al posto del normale GTP, ma non pu idrolizzarlo, per cui il composto resta permanentemente legato alla proteinaG. Se il composto radioattivo pu essere usato per rilevare le proteine-G.

295

Tossine batteriche Alcuni batteri producono esotossine che colpiscono le cellule vittime disarticolando alcuni centri di smistamento dei segnali chimici. Abbiamo gi visto che il batterio patogeno Bordetella Pertussis produce una proteina che adenilato ciclasi attivabile da calmodulina (vedi pag.176). Lo stesso batterio produce anche unaltra tossina che colpisce una proteina-G: si tratta della subunt della proteina-Gi (i = inibitoria dellenzima adenilato-ciclasi). Il Vibrio Cholerae produce una tossina (formata da 6 subunit: 1 A + 5 B). La A riconosce il ganglioside GM1 sulla membrana plasmatica ed introduce le subunit B nella cellula. Tale subunit B modifica covalentemente la subunit della proteina-Gs (s = stimolatoria dellenzima adenilato-ciclasi). La reazione di ADPribosilazione, portata avanti da tali tossine enzimatiche, consiste nel trasferimento del residuo adenosindifosfato-ribosio dal NAD (che rilascia Nicotinammide libera) ad un residuo di arginina delle rispettive subunit (vedi pag.193). In ambedue i casi la tossina un enzima che catalizza una reazione di ADPribosilazione delle rispettive subunit (vedi pag.193), che cos modificate subiscono la inattivazione della propria capacit idrolizzante nei confronti del GTP legato. Pertanto restano permanentemente attive, risultando compromessa la loro capacit di assicurare una transitoriet del segnale: la tossina del Vibrio Cholerae determiner uno stato permanentemente attivo nella -stimolatoria, che attiver in continuazione lenzima adenilato-ciclasi; la tossina del Bordetella Pertussis determiner uno stato permanentemente attivo della subunit -inibitoria, che inibir in continuazione lenzima adenilatociclasi.

296

Famiglia delle proteine-G monomeriche - Propriet generali Trattasi di una famiglia assai numerosa, composta da diverse sub-famiglie.Come si gi detto sono caratterizzate da: basso peso molecolare ( 21000 Da); struttura monomerica, sono cio prive di subunit , e la unica subunit presenta analogie, come abbiamo gi visto, con le delle eterotrimeriche. Le proteine-G di questa famiglia partecipano ad un ampio ventaglio di processi cellulari, che potremmo esemplificare in tre ambiti: trasmissione endocellulare del segnale: abbiamo gi visto la Ras che attivata da Sos e che attiva una MAPKKK (la Raf). ciclo e differenziazione cellulare: la Ras2 controlla la progressione in fase G1. organizzazione interna: le Rab controllano la maturazione del Golgi e la vescicolazione. Per riuscire a svolgere tale compito devono essere associate alle membrane. Infatti risultano cruciali le reazioni di miristoilazione (vedi pagg.23-24) che ancorano queste proteine-G alle membrane. Le proteine-G monomeriche richiedono un buon numero di altre proteine accessorie, che ne regolano lattivit. Questa necessit deriva anche dalla bassa capacit di idrolisi intrinseca a carico del GTP legato: trattasi di una reazione con una costante di velocit dellordine 0,01 min-1, mentre le eterotrimeriche idrolizzano GTP con una costante di velocit che 3-5 min-1, quindi ben 300-500 volte pi elevata. Per innalzare tale velocit di idrolisi esistono le proteine GAP (GTPasi Activating Protein, proteina di attivazione dellattivit GTPasica) che innalzano, appunto, la velocit di idrolisi del GTP legato. Esistono diverse GAP, ciascuna specifica di una determinata proteina G-monomerica. Sono state prese in considerazione alle pagg.217-218, dove evidenziata una omologia di sequenza tra alcune GAP e la inositolo-5-P-fosfatasi e, molto interessante, con la subunit p85, regolatoria dellenzima PI3Cinasi. Anche la reazione di scambio GTP-GDP lenta. Per innalzarla esistono le proteine GEP (Guanine nucleotide Excenge Protein) dette anche GEF(Guanine nucleotide Excenge Factor). Ne abbiamo parlato a pag.205, in fondo. Le GEP facilmente presentano uno o pi domini Plekstrin Homology (PH). Anche la PKB contiene nella subunit catalitica p110 un dominio PH che funziona da zipcode per destinare la PKB alla membrana (vedi pag.206) Esistono poi delle proteine specifiche inibitrici GDI (GDP Dissociation Inhibitor) che bloccano la forma inattiva che lega GDP, ostacolando lo scambio con il GTP. Vediamolo in forma schematica:

Ciclo delle proteine-G monomeriche con le proteine accessorie. 297

Sub famiglia delle proteine-G monomeriche di tipo Ras E gi stato accennato che i primi geni di tipo ras furono identificati in un virus, scoperto da Harvey nel topo. Le sue osservazioni risalgono al 1964 ma ovviamente in quegli anni non si sapeva ancora nulla delle proteine-G. Solo intorno alla met degli anni 80 fu scoperta la controporte cellulare di v-ras. Tale prodotto proteico fu denominato H-Ras (H da Harvey, Ras = Rat sarcoma). H-Ras praticamente il prototipo della famiglia delle proteine-G monomeriche. E una proteina studiata in dettaglio. E stata la prima proteina-G ad essere cristallizzata nel 1988. La forma virale presenta mutazione, che determina la sostituzione della Alanina-59 con Treonina. Lalanina si trova allinizio della regione G (vedi pag.294) che, come abbiamo visto, contribuisce allidrolisi del GTP legato. Nella forma virale tale T-59 fosforilata, per cui v-Ras non idrolizza GTP e resta, quindi, permanentemente attiva. E stata prodotta una v-H Ras modificata con Treonina59 sostituita da Valina (rendendo quindi impossibile la reazione di fosforilazione) ma non sono state rilevate alterazioni nella tumorigenit di tale v-Ras modificato. Ras ha grandissima importanza. Almeno il 50 % dei tumori umani presentano unalterazione di Ras (in particolare K-Ras). Nella Drosophila, stata identificata la proteina Ras che importante per garantire lo sviluppo della Retinula-7 (R7) mediante un segnale RTK ricevuto dal recettore Sev che interagisce con BOSS presente su R8 (vedi pag.264). E gi stata analizzata limportantissima via che collega un recettore RTK allattivazione della MAPK (vedi pag.151; 216; 234). Alla subfamiglia Ras appartengono almeno 4 proteine, con le prime 3 (vedi sotto) con elevatissima omologia di sequenza: H-Ras. Ne abbiamo gi parlato. K-Ras. E loncogene del virus del sarcoma di Kirsten. Pu essere di tipo A o di tipo B. La forma virale presenta la stessa sostituzione allAlanina-59 che diventa Treonina e che viene fosforilata (nel virus). Questa sostituzione, con conseguente fosforilazione, non avviene nella controparte cellulare K-Ras. N-Ras. (N = Neuroblastoma). E stata evidenziata come gene trasformante in una forma di Neuroblastoma. A differenza di H e K-Ras, non nota una sua controparte virale. N-Ras attivato per mutazione puntiforme in molti tipi di tumore. R-Ras. (R = Related). Ha solo un 55 % di omologia di sequenza con H-Ras, e la sua denominazione nasce proprio da questa caratteristica. Ovvero R-Ras collegabile alle altre 3 Ras (H, K ed N-Ras), ma se ne discosta. Al loro C-terminale presente il CAAX-box, ovvero tali proteine-G terminano con lamminoacido Cisteina in quartultima posizione, seguita per due volte da amminoacidi Alifatici (A) e dallultimo (X) che pu essere qualsiasi AA. Alla Cisteina aggiunto mediante legame covalente un residuo idrofobico di geranil-geranil fosfato, poi AAX staccato ed il carbossile di C metilato. Con H-Ras avviene unaddizionale palmitoilazione (legame tioetere, vedi pag.23), in quanto esiste unaltra cisteina due posizioni prima di quella del CAAX-box. Questa modifica post-traduzionale importante per ancorare la Ras alla membrana. Altre proteine-G appartengono a questa numerosa sub-famiglia (almeno 12). Sub famiglia delle proteine-G monomeriche di tipo Rho (Rho da Ras Homology). Presentano un 30 % di omologia con Ras. Sino al 1994 ne erano note 9 tipi distinti. Anche esse regolano vie di trasduzione del segnale, come Ras. Al C-terminale presentano il CAAX-box. Alla cisteina in esso contenuta aggiunto un residuo idrofobico di geranil-geranil fosfato, come nelle Ras. La prima Rho fu scoperta in seguito ad un artefatto in una procedura di clonazione da una libreriA cDNA di Aplysia. Le pi note sono 3: Rho A, Rho B, Rho C - Regolano una via di trasduzione del segnale che lega recettori di membrana allassemblaggio delle placche di adesione focale e di actina. Rho A termina con CLVL, ovvero un CAAX box, come molte Ras. Tutte e tre sono ADPribosilabili dalla tossina estratta dal Clostrium Botulinum.

298

Occorre citare una proteina accessoria, che svolge la funzione di GEP per Rho A: trattasi della Dbl (Diffuse B-cell linphoma), di cui abbiamo gi parlato a pag.205. Costiuiscono una famiglia, con pi di 20 membri. Tutti contengono limportante Plekstrin Homologhy (PH).

Sub famiglia delle proteine-G monomeriche di tipo Rab (Rab da Rat brain). E la subfamiglia con maggior numero di membri. Le Rab controllano le comunicazioni tra organelli intracellulari. Ne abbiamo gi parlato alle pagg.145-146, per quanto riguarda la loro possibile fosforilazione da parte di Cdc2. Possono essere anche loro rese idrofobiche al C-terminale, i n quanto possono contenere dei residui di cisteina (che accetta geranil-geranil fosfato) con una sequenza diversa dal CAAXbox. Infatti Rab1 a e b termina con la sequenza GGCC. Qui a lato riprodotto uno schema di maturazione del reticolo endoplasmatico che controllato da proteine della famiglia Rab.

Sub famiglia delle proteine-G monomeriche di tipo Arf (Arf da ADP ribosylation factor). Controllano la vescicolazione. Sono quasi prive di attivit GTPasica intrinseca. Sono quindi indispensabili le proteine centaurion (che sono le GAP di Arf). Mentre le citoesine sono le GEP di Arf. Sub famiglia delle proteine-G monomeriche di tipo Ran (Ran da Ras nuclear). Presentano funzioni associate a processi nucleari. Struttura tridimensionale della p21-Ras La proteina-G monomerica di tipo p21-Ras stata cristallizzata e studiata con diffrazione a raggiX. Nella pagina seguente riportato lo schema di tale struttura, dove sono individuabili le regioni specifiche di una proteina-G. Ricordiamole brevemente: P (G1), E (G2), G (G3), G (G4), G (G5) (vedi pagg.293-294). Si pu osservare che esistono 6 filamenti-, che si dispongono antiparalleli solo ai lati, mentre al centro 4 di essi sono paralleli. Partendo dallN-terminale esiste: lansa P (G1) che lega il polifosfato. Poi esiste un-elica e lansa E (G2) che lega leffettore (per esempio Ras legher Raf). Poi esistono due filamenti- e la regione G (G3), che scinde il fosfato del GTP, cio assicura la funzione GTPasica. Segue quindi una -elica ed un filamento- e poi lansa con la regione G (G4) che lega lanello purinico della guanina. Infine abbiamo lansa G(G5), che lega anchessa lanello purinico.

299

300