Lezione 13 – 11.11.

2022

Le cisterne, quindi, non sono tutte equivalenti tra di loro: possono essere cis, mediali e trans.
Esiste pertanto una polarizzazione strutturale biochimica e funzionale: i diversi compartimenti
non sono identici tra loro, poiché hanno una diversa composizione molecolare a seconda della
funzione che svolgono.
Ad esempio, gli enzimi all’interno delle cisterne sono diversi a seconda della posizione della cisterna,
in modo funzionale a catalizzare specifiche reazioni; l’enzima assolve quindi a funzioni diverse a
seconda della porzione della cisterna in cui si trova.

Funzioni

L’ADG svolge la funzione di modificazione e smistamento di proteine e lipidi che arrivano dal RE.

Alcuni di questi processi sono:

• Modificazione dei residui oligosaccaridici già associati alle proteine:
Nel RE avvengono diverse modificazioni delle proteine che vengono sintetizzate sulla membrana
del RER, tra cui quella che comporta l’aggancio di una catena di 14 oligosaccaridi.
Questa catena viene sintetizzata nella membrana del RE e poi viene agganciata – tramite una
transferasi – a una asparagina presente nella molecola che si sta formando nel RE.
Queste catene sono uguali per tutte le proteine sintetizzate nel RE, ma poi vengono modificate
per tagli e aggiunte di zuccheri nel ADG.

• Glicosilazione: aggiunta di zuccheri alle proteine e ai lipidi.

• Modificazione della struttura di alcune proteine:

o Fosforilazione – aggiunta di gruppi fosfato;

o Solvatazione – aggiunta di gruppi solfato;

o Parziale proteolisi – parziale taglio enzimatico che elimina alcune porzioni delle pre-

proteine (prodotte nella loro forma inattiva), in modo tale da renderle attive.

• Sintesi di catene di glicosamminoglicani associati a formare proteoglicani.

• Sintesi di sfingomielina e glicolipidi a partire da ceramide:

Si tratta di una molecola che si forma nel REL a partire da sfingosina e una catena di acido
grasso. La ceramide viene poi modificata nel ADG, dove si arriva alla sintesi della sfingomielina
e dei glicolipidi.

GLICOSILAZIONE

Si tratta di un’aggiunta di catene laterali di carboidrati, che vengono inserite in corrispondenza di

particolari residui amminoacidici presenti nella catena polipeptidica delle proteine.

Esistono due tipi di glicosilazione:

• N-glicosilazione: l’aggiunta di un oligosaccaride avviene in corrispondenza dell’atomo di azoto
di un gruppo -NH2 dei residui di asparagina. Questa modificazione inizia nel RE con l’aggiunta
della catena oligosaccaridica, poi questa catena entra nell’ADG e viene modificata. È quindi una
modificazione tipica del RE, che si completa nell’ADG.
Gli zuccheri vengono aggiunti come una catena pre-costituita.

Esempio di una possibile sequenza di eventi:

o Si parte da una proteina che lega un oligosaccaride che porta 2 N-Acetilglucosamina +
8 mannosi (prima erano 9, uno è già stato rimosso).
o Poi vengono rimossi 3 mannosi ad opera di enzima alfa-mannosidasi I in corrispondenza
del cis del ADG, in modo che in quello mediale si trovi la molecola senza 3 mannosi.
o Un altro enzima, la N-Acetilglucosamina-transferasi, carica sulla catena un’altra
molecola di N-Acetilglucosamina.
o Nel compartimento mediale, la presenza dell’enzima alfa-mannosidasi II promuove la
rimozione di altri 2 mannosi.
o Da qui, si forma una catena che accetta un’altra molecola N-Acetilglucosamina (quindi
ce ne sono 2 terminali).
o Ad opera di altre glicosil-transferasi specifiche (tra cui galatto-transferasi), avviene il
trasferimento di 2 galattosi a livello del trans del ADG
o La sialil-transferasi trasferisce acido sialico.
 Il prodotto finale di questo tipo di
glicosilazione corrisponde a catene di
N-oligosaccaridi, che possono essere:
o Oligosaccaridi complessi – la
catena oligosaccaridica complessa è
tipica delle proteine destinate alla
secrezione o ad entrare in
membrana;
o Oligosaccaridi ad alto mannosio, cioè con numerose unità ripetute di mannosio – sono
destinati alle componenti del lisosoma, quindi si tratta soprattutto di enzimi. Il lisosoma
è il centro di digestione della cellula, che pertanto demolisce le molecole in singoli
monomeri, per poterli riutilizzare. Vedi slide 11-13.

• O-glicosilazione: è una modificazione tipica dell’ADG. Gli zuccheri vengono aggiunti in

corrispondenza dei gruppi -OH di alcuni amminoacidi. Gli zuccheri presenti nel lume del ADG
sono legati ai nucleotidi che, grazie agli enzimi glicosil-transferasi – che catalizzano il
trasferimento dei gruppi glucidici –, vengono trasferiti dal nucleotide all’amminoacido o alla
catena che si sta formando.
Gli zuccheri vengono aggiunti uno alla volta (non come una catena precostituita), e per prima
viene aggiunta la N-Acetilgalattosammina.
Avviene nel compartimento cis del ADG, e successivamente vengono inseriti altri zuccheri a
formare le catene oligosaccaridiche anche nella porzione trans.
In questo tipo di modificazione, le reazioni avvengono in modo sequenziale, ciascuna fase è pertanto
dipendente da quella precedente ed avviene ad opera di specifici enzimi compartimentalizzati –
ciascuno in una specifica componente del Golgi –, che assicurano la corretta sequenza di
maturazione della catena oligosaccaridica iniziale. Questo processo evidenzia ulteriormente
l’importanza della polarizzazione e della compartimentalizzazione dell’ADG.

Immagine slide 17: sistema di riconoscimento antigene-anticorpo in Microscopia Elettronica: la

marcatura compare come una regione più scura. Anticorpi marcati con oro foilidale (?) È possibile
mettere in rilievo presenza di marcature e poi localizzarle all’interno di un sistema.

SINTESI DI GLICOSAMMINOGLICANI /PROTEOGLICANI

La sintesi dei proteoglicani avviene a partire da un core proteico,

e consiste nell’aggiunta di zuccheri alla catena secondo la modalità
di O-glicosilazione.
Questa aggiunta può, ad esempio, avvenire in corrispondenza del gruppo idrossile di una serina.
Nel caso delle catene di polisaccaridi che costituiranno i proteoglicani, la sequenza di aggiunta
prevede l’aggancio di uno xiloso, a cui si agganciano poi due galattosi, a cui poi vengono attaccate
catene più o meno lunghe di unità disaccaridiche ripetute lineari e non ramificate.

SOLFATAZIONE

Si tratta di un’altra modificazione che avviene sulle catene polisaccaridiche: consiste nell’aggiunta di
gruppi solfato (SO2) alle catene polisaccaridiche. Questa modificazione avviene nella porzione trans
del ADG e porta alla formazione dei glicosamminoglicani solfati, tra cui Condroitinsolfato,
Eparansolfato e Cheratansolfato.
La solfatazione porta a cariche negative perché i gruppi tendono a caricarsi negativamente. Daranno
quindi una connotazione anionica alla molecola, grazie alla quale saranno in grado di legare molte
molecole di acqua attraverso legami ionici.
Per questo motivo, i glicosamminoglicani solfati si trovano soprattutto nella matrice extracellulare
dei tessuti connettivi e avranno un ruolo importante nella regolazione del turgore nella matrice e
nei tessuti.
Non tutti i glicosamminoglicani sono solfati: quelli che lo sono, ricevono i gruppi solfato nel ADG.

PROTEOLISI

La proteolisi consiste nel taglio enzimatico che elimina alcune porzioni della proteina. Questi enzimi
vengono sintetizzati in una forma indicata come pre/pro-enzima, che corrisponde alla loro forma
inattiva. Infatti, molti enzimi sono prodotti secondo una sequenza che dà origine a una proteina che
non è ancora attiva e che necessita del taglio proteolitico per essere attivata.

SEDE DI SINTESI DI SFINGOMIELINA E GLICOLIPIDI

La sfingomielina (fosfolipide con sfingosina al posto del glicerolo) e i glicolipidi si trovano nelle
membrane e si formano a partire dalla ceramide (sfingosina + catena di acido grasso).
Nell’ADG avvengono delle reazioni che portano all’aggiunta del gruppo di testa polare: in un caso,
viene aggiunto il gruppo di fosforilcolina a dare sfingomielina; nell’altro caso vengono aggiunte
catene più o meno brevi di zuccheri che porteranno alla formazione di glicolipidi semplici –
celebrosidi, uno o pochi residui di zuccheri attaccati alle catene –, o complessi – gangliosidi,
possono presentare molecole di acido sialico che portano cariche negative.
Le cariche negative sono importanti anche nella repulsione tra molecole. Ad esempio, negli eritrociti,
la presenza di gruppi di acido sialico impedisce l’adesione delle membrane, favorendo lo scorrimento
e impedendo la formazione di intasamenti.
I residui di acido sialico sono anche presenti sulla superficie delle cellule che migrano, essendo in
stretta associazione con altre cellule. I residui negativi sulla faccia di entrambe le cellule favorisce lo
scorrimento delle cellule e funziona come un sistema antiaderente.

Trasporto di molecole

Come abbiamo visto, l’ADG è costituito da compartimenti che sono tra loro separati, e che
accolgono in modo sequenziale le molecole provenienti dal RE nel CGN. Queste molecole verranno
poi smistate dal TGN e indirizzate verso i vari destini possibili.

Il meccanismo che garantisce il trasferimento delle molecole da un compartimento all’altro è spiegato

da due possibili modelli:
• Trasporto mediato da vescicole: la proteina che è stata
tradotta al livello del RE dovrà essere inclusa in una vescicola che
gemma nel RE → si fonde nel CGN → vescicola gemma nel
CGN → si fonde nella cisterna mediale; ecc.
In sintesi, questo modello prevede che le vescicole vengano trasportate da un reparto all’altro
dell’ADG, in cui avvengono delle modificazioni e dei processi diversi. Le cisterne sono stabili.
• Maturazione delle cisterne: questo modello prevede un
sistema dinamico che riguarda la maturazione delle cisterne. Ad
esempio, la cisterna al tempo 0 è cis → al tempo 1 diventa
cisterna mediale → al tempo 2 diventa cisterna TGN. Il RE porta
costantemente nuove vescicole che vanno a fondersi nella CGN.
Ogni cisterna che sta in una certa posizione ha un corredo di enzimi che catalizzano determinate
reazioni. Si verifica pertanto una polarizzazione e una specificità delle reazioni che avvengono
in determinate porzioni dell’ADG. Pertanto, esistono delle vescicole che seguono il flusso
retrogrado e che in questo modo riportano gli enzimi che servono alle reazioni specifiche che
avvengono nei diversi compartimenti per far sì che agiscano in corrispondenza del reparto
 corretto. In altre parole, le cisterne che vanno incontro a maturazione vengono costantemente
modificate dalla fusione di nuove vescicole che, tornando indietro, portano al compartimento
corretto il repertorio di molecole che serve a svolgere quella funzione specifica.
Per decretare quale sia il modello più plausibile, sono stati usati specifici marcatori per identificare
specifiche componenti.
Due immagini di Microscopia Elettronica sono due esperimenti che supportano il modello della
maturazione delle cisterne: i pallini neri corrispondono alla presenza di anticorpi legati a specifiche
molecole.
In un caso, si tratta della Mannosidasi II (enzima associato al lume delle
cisterne mediali): le marcature si trovano associate al lume delle
cisterne e a quello delle vescicole ai lati delle cisterne → supporta il
modello di maturazione delle cisterne perché nelle vescicole ci sono le mannosidasi che vengono
ritrasportate in modo retrogrado per essere riportate alle cisterne che stanno diventando mediali.
Nell’altro caso, marcature legate a proteina la cui sintesi viene indotta
in seguito a un’infezione virale: virus entra nella cellula e sfrutta
l’apparato biosintetico della cellula per produrre le sue proteine.
Proteine virali riscontrate unicamente a livello delle cisterne, e non a livello delle vescicole → va a
supporto del modello di maturazione delle cisterne.
Il modello più accreditato è quindi quello della maturazione delle cisterne, ma ciò non esclude che
per alcune molecole possa funzionare anche l’altro modello.

“In biologia non è tutto o bianco o nero.”

Il trasferimento vescicolare avviene anche in direzione retrograda da ADG a RE per bilanciare alcune
proteine funzionali nel RE, che quindi devono tornare al RE perché in parte devono essere
modificate nel ADG per raggiungere la loro funzione nel ADG, mentre altre svolgono una funzione
nel riconoscimento di altre proteine che devono essere trasportate.

Riassumendo:
La via secretoria è stata dimostrata attraverso l’uso di amminoacidi marcati con elementi radioattivi,
che vengono inclusi nelle proteine da sintetizzare. Bloccando il sistema a tempi diversi si nota come
le marcature si trovano in compartimenti diversi. Slide 20.
 MICROTUBULI
Citoscheletro

Caratteristiche

I MT sono elementi del citoscheletro della cellula e sono dei polimeri di forma a tubo.

Nell’immagine sono rappresentati dalle linee gialle.

I MT presentano una particolare organizzazione spaziale: emergono a raggiera a partire dal MTOC
– centro organizzatore dei microtubuli. L’MTOC si chiama anche centrosoma, ed è la regione da
cui si originano questi tubi che formano appunto microtubuli.

I MT sono strutture polarizzate: presentano una estremità - e una estremità +.

Questa caratteristica ha a che fare con la dinamicità di questi polimeri, che vengono montati e
smontati per associazione di singole unità: l’estremo +, quello più distante dall’MTOC, cresce più
velocemente; la polimerizzazione del MT avviene con una crescita netta della struttura.
Funzioni ed elementi

I MT sono fondamentali per la localizzazione dell’ADG e per permettere il trasferimento di vescicole.

SUBSTRATO PER IL TRASPORTO DI VESCICOLE

I MT sono il substrato che viene utilizzato per facilitare lo spostamento delle vescicole del RE e
dell’ADG. Infatti, quando il loro trasferimento è direzionato, le vescicole non “galleggiano” nel
citosol, ma sono veicolate lungo i binari formati dai microtubuli.
Tra le vescicole e i MT ci sono i motori molecolari: si tratta di proteine che si spostano lungo i
microtubuli, caricandosi i cargo rappresentati dalle vescicole. Queste proteine possono caricare
anche altri organuli, come i mitocondri.

Esistono anche due proteine motrici: la chinesina e la dineina. Queste due proteine differiscono
tra loro nella direzionalità del movimento:
• La chinesina consuma ATP spostandosi nella direzione verso l’estremo +, ed è quindi
responsabile del trasferimento di vescicole dal TGN verso la membrana o verso gli endosomi
(lisosomi) e dal CGN verso RE (flusso retrogrado). Trasferimenti in uscita dall’ADG.
• La dineina si sposta verso l’estremo -, ed è quindi responsabile del trasferimento di vescicole
dal RE all’ADG e dall’esterno della cellula all’ADG. Trasferimenti in entrata nell’ADG.

ORGANIZZAZIONE E LOCALIZZAZIONE

L’organizzazione e la localizzazione dell’ADG dipendono dall’interazione con il citoscheletro.

Le cisterne che lo compongono, infatti, sono localizzate in determinate porzioni della cellula.

Questa loro localizzazione è mantenuta grazie al fatto che le cisterne sono ancorate al citoscheletro
attraverso delle proteine di membrana che, sulla superficie citosolica, agganciano i MT o le proteine
ad essi associate. Queste proteine che mediano il legame con il citoscheletro e tra le membrane a
livello del ADG si chiamano golgine e GRASP: sono proteine di membrana che si trovano a livello
della membrana dell’ADG che, ribadiamo, hanno un ruolo importante nel garantire il
posizionamento dell’organulo all’interno della cellula e il fatto che le cisterne sono impilate tra loro
a formare il dittiosoma.

Le cisterne si disperdono quando la cellula va in mitosi. La dispersione di queste cisterne è mediata

da delle modifiche che avvengono a livello di queste proteine. In particolare, una modifica che incide
sul disassemblamento dell’ADG è la fosforilazione delle GRASP: quando vengono fosforilate, si
perdono i contatti, e viene così permessa la disaggregazione dell’ADG. Quando vengono
defosforilate, si riagganciano a formare la struttura.
In sintesi, le GRASP mediano la tenuta dell’ADG e sono regolate da un sistema di fosforilazione e
defosforilazione, mediante un funzionamento del tutto simile a quello delle lamine nucleari.

Le golgine invece mediano anche la fusione delle vescicole alla membrana del ADG.

Trasporto intracellulare

Il trasporto intracellulare mediato da vescicole si compone di più fasi successive:

• Selezione delle molecole da trasportare;
• Gemmazione della vescicola;
• Migrazione della vescicola dal donatore all’accettore;
• Ancoraggio e fusione della vescicola alla membrana bersaglio – accettore.

Due versanti affacciati: RE di uscita, da cui emergono le vescicole che gemmano, e CGN, dove
vanno a fondersi queste vescicole.
Verde: Proteina di membrana che ha un dominio luminale e un dominio citosolico.
A Y: Proteine transmembrana che funzionano da recettori. Legano le proteine solubili presenti nel
lume, in modo da impacchettarle in vescicole per poi essere trasportate all’ADG o al RE.
Rivestimento: complessi proteici che vanno ad addossarsi alla membrana del RE o dell’ADG durante
la formazione delle gemme.
COP

Le vescicole che mediano il trasporto tra RE e ADG sono rivestite dalle COP, cioè da delle proteine
di rivestimento.
Le COP sono dei complessi proteici (coatomeri) che si legano in modo selettivo ad una o all’altra
membrana – a seconda della loro natura –, e hanno una duplice funzione:
• Partecipano alla selettività del cargo – cioè a concentrare determinati cargo nelle vescicole che
si stanno formando;
• Contribuiscono alla curvatura della membrana – funzione strutturale nel favorire la curvatura
della membrana, che porta alla formazione della gemma, e quindi della vescicola.

Differenza tra i due rivestimenti:

• Rivestimento di COP2: si tratta di proteine associate alla membrana del RE
(membrana in uscita), che mediano il trasporto anterogrado (da RE ad ADG);
• Rivestimento di COP1: si tratta di proteine associate alla membrana del ADG, che
mediano il trasporto retrogrado (da ADG a RE).
Formazione

Analizziamo la sequenza di tappe che portano alla formazione dei rivestimenti di COP1 e il trasporto
delle vescicole.

• La vescicola con il suo rivestimento si trova sul lato citosolico.

• Si forma il coatomero: complesso multiproteico di rivestimento che si associa al lato citosolico
della membrana dell’ADG nella sua forma complessa.
• L’ancoraggio del coatomero alla superficie citosolica della membrana è reso possibile grazie alle
proteine ARF1-GDP (versione solubile citosolica), che vengono ancorate alla membrana sul
versante citosolico.

Ciò avviene quando:

o Le proteine ARF1-GDP vengono a contatto con i dimeri proteici p23 e p24 ancorati

alla membrana;
o I dimeri p23 e p24 interagiscono sul lato citosolico con ARF1-GDP, inducendone una

modificazione grazie alla presenza di una proteina GEF (trasferisce nucleotidi, già
incontrata nei pori nucleari), che scambia GDP con GTP.
o La proteina ARF1 viene così attivata nella sua forma ARF1-GTP;

o Nella forma solubile (ARF1-GDP), la codina è interna alla struttura globulare; quando

viene attivata in ARF1-GTP, la codina viene a presentarsi sulla superficie della molecola.
In altre parole, cambiando conformazione, la catena all’N-terminale si allunga.
o In questo modo, la codina – che ha caratteristiche anfipatiche – entra in contatto e si

lega alla membrana con la componente idrofobica.

In altre parole, l’inserimento in membrana del coatomero è mediato dal legame con il dimero
p23-p24 e dall’interazione con la proteina GEF1. Questa proteina attacca il GDP, liberando
la catena ARF1-GTP con la componente anfipatica, la quale, con la componente idrofobica,
va a inserirsi all’interno della membrana.
Questo inserimento in membrana della ARF1-GTP produce un reclutamento dei coatomeri
(complessi proteici che vanno a formare il rivestimento) dal lato citosolico e una concentrazione
del cargo, che si va a concentrare al di sotto dei coatomeri.
• Per aggiunta progressiva di complessi molecolari, la membrana cambia forma e si forma la
vescicola che, attraverso un processo di fissione, si stacca dalla membrana di origine e sarà libera
nel citosol.
• Nel citosol, i motori molecolari la catturano e la trasportano verso il RE.
• Quando si forma la vescicola, la gemma presenta un determinato rivestimento, poi quando si
fonde con membrana di destinazione il rivestimento non c’è più.
• Quando la vescicola si è formata e si è staccata dalla membrana di origine, entra in contatto
con ARF1-GAP123 che attiva ARF1, promuove l’idrolisi di GTP a GDP e un ulteriore cambio
conformazionale che riporta ARF1 nella sua forma solubile (citosolica) legata al GDP, e si stacca
dalla membrana. Questo era l’elemento collante attorno a cui si era formato il coatomero, quindi
tutto il complesso di proteine che formava il rivestimento si stacca. In questo modo, la vescicola
si libera dal rivestimento e può andare a fondersi con la membrana.

Il processo che porta alla formazione di queste vescicole e al trasferimento di materiale attraverso
le vescicole dal RE all’ADG e viceversa prevede diversi step, che riguardano la selezione delle
molecole da trasportare, la formazione della gemma e del suo rivestimento, la migrazione delle
vescicole grazie alle proteine motrici e al citoscheletro che fa da substrato, e infine la fusione delle
vescicole sulla membrana target.
Il sistema di smistamento è molto indirizzato, per cui nelle vescicole verranno racchiuse le molecole
che vanno a un determinato target. Ci sono quindi dei segnali di indirizzamento per le vescicole.