Enzimi

Gli enzimi sono dei catalizzatori biologici che velocizzano

la reazione. Gli enzimi accelerano la reazione abbassando
l'energia di attivazione, e quindi stabilizzando lo stato di
transizione. Se non ci fossero gli enzimi la maggior parte
delle reazioni dei sistemi biologici procederebbe a
velocità non apprezzabili. In particolare, gli enzimi nella
cellula catalizzano tutti i processi di degradazione, sintesi,
trasformazione e conservazione dell'energia nella
formazione ed evoluzione della materia vivente. Sono
perciò coinvolti in quasi tutti i processi metabolici.
Gli enzimi sono dotati di elevata specificità, sono cioè capaci di catalizzare solo un tipo
particolare di reazione, interagendo con particolari reagenti, chiamati substrati, legandosi ad essi
formando quello che verrà chiamato complesso enzima - substrato. La regione dell'enzima a cui
si lega il substrato viene chiamata sito attivo ed è costituito da una tasca o fenditura
tridimensionale formata da gruppi che derivano da parti diverse della sequenza amminoacidica
della proteina. Il sito attivo occupa una parte relativamente piccola del volume totale di un
enzima.
● Inizialmente i biologi, quando hanno studiato l'interazione enzima-substrato, per
giustificare l'estrema specificità tra i due hanno utilizzato un modello chiamato
"chiave-serratura", che considerava l'interazione tra enzima e substrato come un gioco ad
incastro. Questo perché il substrato si lega all'enzima nel sito attivo, la cui conformazione
permette appunto un aggancio. Oggi, questo modello è stato superato da un sistema
meno rigido: quello dell'adattamento indotto. Degli studi hanno dimostrato che l'enzima
non è una molecola rigida, bensì dinamica, che si può adattare alla forma del substrato.
Quando il substrato penetra nel sito attivo, l'enzima cambia forma a causa di interazioni
chimiche tra i gruppi atomici del substrato e le catene laterali R degli amminoacidi presenti
nel sito attivo. Questo cambiamento di forma fa sì che il sito attivo si adatti meglio al
substrato.

L'attività catalitica di molti enzimi dipende dalla presenza di piccole

molecole, chiamate cofattori (parte non proteica), il cui ruolo può
essere diverso da enzima ad enzima, infatti gli enzimi sono altamente
specifici sia nei riguardi della reazione sia nei riguardi dei substrati. I
cofattori servono per la catalisi enzimatica, e permettono all'enzima di
funzionare efficacemente. La proteina enzimatica senza il suo
cofattore è detta apoenzima (parte proteica), mentre la sua forma
completa e cataliticamente attiva (cofattore + enzima) è detta
oloenzima. I cofattori possono essere suddivisi in due
gruppi:
● cofattori metallici: ioni metallici
● coenzimi: piccole molecole organiche: coenzimi
importanti nel metabolismo cellulare sono NAD,
NADP (NAD fosfato) FAD e l'acetil-coenzima A:
○ NAD e NADP sono coenzimi nucleotidici
piridinici che catalizzano il trasferimento di
 coppie di elettroni nelle reazioni redox intracellulari. NAD+ viene anche chiamato
nicotinammideadenindinucleotide. "Dinucleotide" perché è formato da due
nucleotidi uniti insieme attraverso un legame anidridico (sono due anidridi
fosforiche legate insieme). In generale il NAD è formato da adenina + zucchero
(ribosio) + gruppo fosfato e un altro (quello sopra) è composto da una base azotata
modificata (nicotinammide) + ribosio + gruppo fosfato.
Per esempio nella respirazione cellulare il glucosio viene ossidato con una serie di
reazioni che liberano elettroni e che quindi accumulano NADH in forma ridotta, che
poi passerà alla forma ossidata.
Da forma ossidata NAD+ a forma ridotta (NADH) cosa
succede? alla nicotinammide vengono aggiunti 2 e- e
un H+. L'H si va a legare al carbonio che ne ha già uno,
portandosi dietro due elettroni. L'H, attaccandosi al
carbonio, causa lo spostamento del doppio legame e
i 2 e- di prima vanno a compensare la carica positiva
dell'azoto.

○ FAD: il termine sta per Flavin Adenin Dinucleotide. È

formato da uno zucchero lineare, quindi non
ciclizzato, + un nucleotide ciclizzato. Lo zucchero e il
nucleotide sono condensati tra di loro come nel
NAD.

○ Un coenzima molto importante, perché intermedio

in un sacco di reazioni metaboliche, è
l'acetil-coenzima A. L'acetil coenzima A si forma
attraverso l'unione del coenzima A al gruppo acetile.

Nonostante gli enzimi siano molto diversi tra di loro, possono essere classificati in base ad uno
stesso tipo di reazione catalizzata:
● ossidoreduttasi: quelli che catalizzano le ossidoriduzioni e si occupano del trasferimento di
elettroni
● transferasi: quelli che trasferiscono gruppi funzionali da una molecola all'altra
● idrolasi: catalizzano le reazioni di idrolisi, come per esempio la scissione dei polimeri in
monomeri
● liasi: formano o spezzano doppi legami, quindi sono responsabili della reazioni di addizione
o eliminazione
● isomerasi: creano degli isomeri, come il passaggio da cis a trans del retinale
● ligasi: formano legami a seconda del caso, quindi per esempio catalizzano le reazioni di
condensazione di un polimero. (C-N, C-C, C-S, C-O e C-N)
Nel suo complesso la reazione tra enzima e substrato si può riassumere con:

L'enzima E si lega al substrato S formando il complesso enzima substrato ES e

questo scindendosi dà origine ai prodotti P della reazioni; al termine della
reazione il prodotto che si è formato non è più affine al sito attivo, e perciò viene
spontaneamente liberato. Proprio per questo motivo l'enzima si trova inalterato
e quindi può essere riutilizzato. La maggior parte delle reazioni è reversibile, quindi un enzima
può catalizzare sia la reazione diretta che quella inversa. In base alle regole della termodinamica,
la direzione in cui procede la reazione dipende dalla variazione di energia libera (delta G). Nessun
enzima modifica mai il delta G della reazione, né aumenta solo la velocità abbassando l'energia di
attivazione, non quella liberata
l'energia libera G è una funzione termodinamica che rappresenta una misura dell'energia utile,
cioè dell'energia in grado di compiere un lavoro (Gprodotti - Greagenti)
○ delta G < 0: spontanea, liberazione di energia
○ delta G = 0: equilibrio. L'equilibrio per gli esseri viventi corrisponde alla morte
○ delta G > 0: non spontanea, assorbimento di energia
Essendo una funzione di stato, dipende unicamente dal livello energetico iniziale e finale, e non
dal percorso della reazione. Non influenzando il delta G, un enzima non influenza né la resa
energetica, e, se è ci troviamo in una reazione reversibile, nemmeno l'equilibrio.
Inoltre nessun enzima agisce sull'equilibrio della reazione perché un catalizzatore accelera allo
stesso modo sia la reazione diretta che quella inversa.
Una volta che il substrato è legato al sito attivo inizia la catalisi enzimatica. La catalisi enzimatica
è un processo in cui avviene una trasformazione quindi ci sono reagenti, prodotti e stato di
transizione. La componente che deve essere stabilizzata
maggiormente dall'enzima è lo stato di transizione
perché è l'unico tra i tre che deve essere influenzato
affinché venga accelerata la reazione.
● Se l'enzima stabilizzasse maggiormente il
substrato, il complesso enzima-substrato avrebbe
meno energia del substrato da solo e questo fa sì
che diventi ancora più alto il dislivello per arrivare
allo stato di transizione, aumentando così
l'energia di attivazione (differenza di livello tra il
punto di partenza della reazione e lo stato di
transizione). Perciò un enzima invece che per esempio ha la massima affinità con il
substrato non favorisce la trasformazione dal momento che sta stabilizzando il substrato
stesso.

Cinetica enzimatica
Due ricercatori svilupparono un'equazione cinetica che
metteva in relazione la concentrazione del substrato con la
velocità della reazione catalizzata, secondo un modello
tutt'ora valido.
Nel grafico, sull'asse delle ascisse è posto il quantitativo di
substrato (quindi la quantità di reagente che stiamo
usando) e sull'asse delle ordinate è posta la velocità della
reazione.
L'andamento di una reazione enzimatica ha una cinetica di
primo ordine e segue l'equazione V= K [S]. Con
un'equazione del genere ci si aspetterebbe una retta di
coefficiente angolare K, invece, inizialmente la velocità
segue l'andamento prevedibile dell'equazione, ma poi inizia
a crescere, tendendo a stabilizzarsi su un valore che rimane
costante, che è la velocità massima. In una reazione senza
catalizzatore posso aumentare la quantità di substrato,
aumentandone la velocità, invece in una reazione catalizzata, l'enzima che sta partecipando alla
catalisi enzimatica deve prima saturare tutto il substrato, perciò un'aggiunta di substrato non
aumenta la velocità.
Quando si stabilizza, la velocità inizia a diventare indipendente dalla concentrazione del substrato
e la reazione è in realtà di ordine zero rispetto al substrato.

La velocità di una reazione catalizzata si misura con il numero di turnover, che rappresenta il
numero netto di molecole di substrato convertite in prodotto da una singola molecola enzimatica
nell'unità di tempo, quando l'enzima è totalmente saturato dal substrato.
La velocità massima della reazione (Vmax) si ha quando tutto l'enzima è presente sotto forma di
complesso ES, cioè tutto legato al substrato. Questa condizione però esiste solo quando ho
un'elevata concentrazione del substrato. L'effetto saturante del substrato è una proprietà
caratteristica degli enzimi responsabile dell'appiattimento della curva.

La velocità di catalisi (Vo) è definita come moli di prodotto formate al secondo. Viene determinata
dalla demolizione di ES per formare P. Infatti, il vero passaggio importante che determina la
velocità di reazione è lo stadio più lento, quindi la trasformazione del substrato nel prodotto.
Vo= K2 (costante cinetica in questa trasformazione) * [ES]. La reazione quindi dipende dalla
quantità di complesso ES che ho. Se la concentrazione si stabilizza, allora si stabilizza anche la
velocità, che diventa costante.

costanti cinetiche enzimatiche

Quando analizziamo le proprietà degli enzimi, prendiamo in considerazioni due grandezze dal
momento che gli enzimi non sono tutti uguali. Questo sia perché ognuno catalizza una propria
reazione, sia perché ci sono enzimi più efficienti degli altri. Si parla quindi di:
● velocità massima Vmax : esprime il numero di molecole di substrato convertite in prodotto
da una molecola enzimatica nell'unità di tempo quando l'enzima è totalmente saturato dal
substrato. Quindi, non è altro che la massima velocità che la reazione stessa può
raggiungere quando l'enzima è saturato di substrato ed è rappresentata dalla retta
parallela all'asse x a cui tende asintoticamente la velocità di reazione.
● costante di Michaelis Km : è un indicatore che fornisce una misura della concentrazione di
substrato richiesta affinché la catalisi abbia luogo ed è la concentrazione a cui l'enzima
lavora ad una velocità pari ad ½ della Vmax .É anche quella che viene chiamata "affinità tra
enzima e substrato". Anche se la Km è inversamente proporzionale all'affinità:
○ Km piccola: l'enzima è molto affine al suo substrato
○ Km grande: l'enzima è poco affine al suo substrato
Questo perché se aumenta la Km vuol dire che bisogna aumentare la quantità di substrato
da fornire, ma questo comporterebbe una maggiore fatica all'enzima che deve lavorarci
insieme.

fattori che influenzano la velocità di reazione

Visto che ci sono molti fattori che possono influenzare la velocità di reazione, per esempio negli
organismi viventi vengono tenuti costanti grazie all'omeostasi, che è l'insieme di alcuni
meccanismi che tendono a mantenere costanti alcuni fattori fisici.
● temperatura: esiste una temperatura ottimale per il funzionamento degli enzimi. Infatti,
essendo proteine tendono ad essere denaturati a temperature molto alte, perdendo così la
loro funzionalità, ma sono anche poco efficienti a basse temperature. Proprio per questo
 motivo ogni enzima ha la sua temperatura ottimale. Se immaginiamo un enzima che lavora
bene in un organismo umano che ha una temperatura intorno ai 37 gradi, significa che a
temperature più eccessivamente basse o eccessivamente alte lavora male.
● effetto del ph: la risposta dell'enzima ad una variazione di ph dipende molto dal l'enzima
stesso. Generalmente dipende da quanto il pH va a modificare il sito attivo dell'enzima.
○ ci sono enzimi che non risentono la variazione del pH e lavorano bene a ph basico,
neutro o acido perché hanno una combinazione di amminoacidi nella loro sequenza
che anche in presenza di pH differenti non vanno ad assumere disposizioni così
diversi da causare un'alterazione nel sito attivo.
○ enzimi che hanno intervalli di pH molto specifici:
■ Enzimi gastrici: che lavorano bene a pH acido, come quello dello stomaco che
è di 1.8
■ enzimi digestivi: che lavorano bene a pH basico, come quelli digestivi presenti
nell'intestino
○ enzimi con un pH tollera solo variazioni di 1-2 unità. Superato questo range, quindi a
pH più acidi o basici, l'enzima inizia a lavorare meglio.
● effetto della concentrazione del substrato: il substrato è
importante perché finché l'enzima non viene saturato del
tutto, un aggiunta di substrato può continuare a modificarlo.
Inoltre, in base alla teoria degli urti, se sono presenti più
molecole di substrato, aumenta il numero degli urti possibili.
Quindi inizialmente la velocità della reazione aumenta, fino a
raggiungere la velocità massima Vmax. Quando la
concentrazione del substrato è così alta che tutti i siti attivi
sono occupati, vuol dire che si è raggiunta la Vmax. Perciò
l'enzima è arrivato alla saturazione. Proprio per questo motivo si parla anche di cinetica di
saturazione, poiché i siti attivi dell'enzima vengono progressivamente tutti occupati dalle
molecole di substrato. Infatti, nel grafico si osserva l'andamento della velocità di una
reazione enzimatica al crescere della concentrazione del substrato.
● effetto della concentrazione dell'enzima: la relazione tra velocità di reazione e la quantità
di enzima è lineare. Se è presente un eccesso di substrato è meglio avere una quantità
maggiore di enzima.

inibizione
Le reazioni enzimatiche, specialmente quelle cellulari, vengono continuamente controllate in
modo da decidere dove e quando farle avvenire, perché sarebbe impensabile farle avvenire
contemporaneamente. Tutto ciò è possibile grazie all'intervento di attivatori, che aumentano
l'attività catalitica degli enzimi, o di inibitori, che la bloccano. Gli enzimi possono essere inibiti,
attraverso gli inibitori, diminuendone la velocità di reazione. Gli inibitori si legano all'enzima
mediante legami e possono essere agenti fisici o chimici. La maggior parte degli inibitori fisici
permettono di avere una reazione reversibile, cioè è possibile riportare l'enzima al suo stato
iniziale anche dopo l'intervento di un inibitore. Contrariamente, molti inibitori chimici favoriscono
reazioni irreversibili, perché modificano permanentemente l'enzima legandosi attraverso legami
covalenti e quindi, anche dopo l'intervento dell'inibitore, non è possibile riportare l'enzima alla
forma iniziale. Quindi gli inibitori possono distinguersi in:
 ● inibitori reversibili: il legame che si crea tra inibitore ed enzima non è permanente, o
covalente, ma è soggetto ad un equilibrio e quindi la reazione può essere riportato allo
stato iniziale. (monossido di carbonio)
● inibitori irreversibili: alterano permanentemente un gruppo funzionale del sito attivo
essenziale per l'attività catalitica. Alcuni inibitori irreversibili sono farmaci importanti o
veleni potenti:
○ penicillina: agisce modificando covalente mente l'enzima transpeptidasi e in questo
modo la sintesi della parete batterica viene bloccata e i batteri tendono a morire.
○ gas nervini: utilizzati nella guerra chimica
○ cianuro
○ ddt
○ neurotossine: sono stostanze che vanno a modificare in maniera permanente alcuni
enzimi del metabolismo.
Ci sono diversi tipi di inibizione attraverso la quale gli inibitori agiscono sugli enzimi:
● inibizione competitiva: nell'inibizione competitiva partecipa un inibitore che ha una forma
molto simile a quella del substrato dell'enzima, e quindi si crea una "competizione" tra il
substrato e l'inibitore per legarsi al sito attivo dell'enzima. La reazione inizia solo se è il
substrato a legarsi al sito attivo, mentre se arriva prima l'inibitore non accade nulla. Perciò, è
necessario rendere più probabile l'arrivo del substrato rispetto all'inibitore, e il modo più
semplice per farlo è aumentare la quantità di substrato.
esempi di inibitori competitivi:
○ farmaci sulfamidici, derivanti dalla sulfanilamide, che agisce come inibitore
competitivo di una sostanza chiamata acido-parammidobenzoico (PABA),
necessaria a dei batteri per la sintesi dell'acido folico.
○ statine, che vengono usate per chi ha il colesterolo troppo alto. Nel nostro organismo
il colesterolo viene prodotto autonomamente dalle cellule, aldilà dell'assunzione.
Quando l'eccesso di colesterolo nel sangue è legato ad una troppo elevata
produzione viene consigliata l'assunzione di questi farmaci, per rallentarne la
produzione.
la Vmax resta uguale, ma aumenta la Km
● inibizione non competitiva: l'inibitore non si lega al sito attivo, ma si lega ad un'altra zona
dell'enzima, quindi, a differenza di quella
competitiva, il substrato e l'inibitore non
competono per raggiungere lo stesso punto.
Visto che l'inibitore si lega in un'altra zona,
questo provoca una modifica della
conformazione dell'enzima. Questa modifica
fa sì che il substrato non venga più
trasformato, e quindi la catalisi viene bloccata,
senza la formazione del prodotto. Proprio per
questo motivo, nell'inibizione non competitiva
è inutile aumentare la concentrazione di
substrato.
Si abbassa la Vmax ma non si modifica la Km.
● inibizione incompetitiva: l'inibitore non riesce a legarsi all'enzima da solo, quindi non si
lega nemmeno al sito attivo. Quindi, come prima, anche in questo caso non si può
rimuovere l'effetto inibitorio con un eccesso di substrato, proprio perché l'inibitore si lega in
un altro punto. Nell'inibizione incompetitiva si forma prima il complesso ES e solo dopo
 l'inibitore può legarsi ALL'ENZIMA. Il complesso ESI non procede verso la formazione di
alcun prodotto.
Si modificano sia la Vmax che la Km perché:
○ L'enzima viene bloccato → abbassamento della Vmax
○ per avere una percentuale di complesso ES ancora funzionante bisogna
aumentare il substrato → abbassamento della Km

enzimi regolatori
Gli enzimi regolatori sono capaci di modulare la propria attività catalitica in risposta a segnali
biologici. Il fatto che gli enzimi possano essere inibiti o bloccati temporaneamente costituisce un
vantaggio per la cellula. la possibilità di poter controllare gli enzimi permette anche di controllare
la formazione del prodotto. Questo è molto importante perché studiando le patologie si è
scoperto che non è solo la presenza o meno di alcune sostanze a determinare una forma
patologica, ma è anche la quantità. Questo significa che bisogna garantire che questo prodotto
sia presente o meno solo quando serve, perché un eccesso di prodotto che di per sé sarebbe utile
può anche sbilanciare a livello metabolico l'equilibrio della cellula.
Ci sono diversi sistemi di controllo degli enzimi:
● controllo da feedback negativo: quando all'interno della cellula il prodotto finale inizia a
presentarsi in quantità elevate, è proprio quest'ultimo che agisce come inibitore su uno
degli enzimi che lo producono, come se fosse un autoregolamentazione.
● enzimi allosterici: sono proteine con struttura quaternaria che, oltre al sito attivo,
possiedono anche dei siti allosterici, ai quali si legano i modulatori, cioè inibitori o attivatori.
○ in una si trova il sito attivo
○ in un'altra subunità si trova il sito regolatore, al quale si lega l'inibitore o l'attivatore. Il
sito regolatore può essere nella configurazione attivata oppure in quella inattivata.
Un esempio è l'emoglobina. L'emoglobina è formata da 4 subunità, due alfa e due beta. In
ognuna delle subunità è presente il gruppo "eme", contenente il ferro, che è poi quello che
dovrà legare l'ossigeno, che può essere legato da ognuna delle quattro catene di
amminoacidi.
L'effetto cooperativo rappresenta un tipo di attivazione allosterica: la prima molecola di
ossigeno che si deve legare è quella che farà più fatica e quindi quella che troverà una
minore affinità. Una volta che si lega alla prima subunità, induce un adattamento generale
di tutto l'insieme che causa un aumento dell'affinità degli altri gruppi EME che ancora sono
liberi. Perciò, c'è una progressione nella funzionalità della proteina mano a mano che
ognuna della sue subunità inizia a funzionare.
Inoltre, questa regolazione è funzionale non solo all'acquisizione dell'ossigeno, ma
soprattutto al rilascio, infatti questo effetto facilita all'emoglobina il rilascio dell'ossigeno alle
cellule.
● fosforilazione o defosforilazione: questo meccanismo permette di attivare o disattivare gli
enzimi attraverso l'attacco o il distacco di gruppi fosforici per mezzo di altri enzimi come gli
enzimi della famiglia fosfatasi (defosforilano) e della chinasi (fosforilano) che trasforma
l'ATP in ADP. Nella maggior parte dei casi la fosforilazione per mezzo delle chinasi è
attivante nei confronti degli enzimi, ma non sempre è così, infatti un enzima può anche
essere attivo inizialmente e con l'intervento delle chinasi viene disattivato.