CAP.

LA CELLULA E LA MEMBRANA CELLULARE IN ECOTOSSICOLOGIA E TOSSICOLOGIA UMANA

Disclaimer: nello sviluppo del presente capitolo ci si avvalsi, in parte, dei principi ottimamente sviluppati dalle Prof.sse Giuliana Fassina e Paola Dorigo nel loro testo di Farmacologia Generale adattati e modificati nel contesto del presente Corso di Ambiente e Salute per gli studenti della Laurea in Scienze Ambientali.

1.0.0.0.- Premesse

Un tossico xenobiotico, perch esplichi la sua azione sulla cellula, deve, prima di tutto passare una barriera fondamentale che rappresentata dalla membrana cellulare. Non , quindi inopportuna una revisione dei concetti relativi alla struttura della cellula e della membrana citoplasmatica, in particolare. Vi sono, indubbiamente anche azioni esterne alla membrana (azioni caustiche ecc.) ma, come concetto generale diremo che un tossico tale quando riesce a passare la membrana cellulare ed agire, successivamente sul materiale endocellulare con inibizione di enzimi, alterazione di equilibri e/o, pi drammaticamente, incidere sul bagaglio genetico a livello del DNA. Ne abbiamo gi parlato in merito soprattutto al flusso di composti chimici attraverso la membrana e alle leggi che governano tale flusso. quindi importante esaminare un p pi il dettaglio il ruolo e la struttura della membrana che riteniamo il punto cardine della tossicodinamica di tutti i composti che agiscono sul citoplasma cellulare. Il passaggio degli xenobiotici attraverso le membrane biologiche funzione delle loro caratteristiche chimico-fisiche, (dimensioni molecolari del xenobiotico, dalla sua solubilit in acqua e nei lipidi, dal grado di ionizzazione e dalla relativa solubilit nei lipidi sia della forma ionizzata che della forma non ionizzata) della dose di xenobiotico somministrato iIn larga misura,poi, dipende dal grado e dalla velocit con cui lo xenobiotico viene assorbito e poi distribuito ai tessuti, dal grado di legame con le proteine ematiche e tessutali, dalla localizzazione dello xenobiotico a livello tessutale, dal grado e dalla velocit con cui lo xenobiotico viene metabolizzato ed escreto. Ora, assorbimento, distribuzione, biotrasformazione ed eliminazione degli xenobiotici implicano il loro passaggio attraverso le membrane cellulari poich gli xenobiotici generalmente superano le diverse barriere organiche passando attraverso le cellule e non tra le cellule. Cos, in definitiva, la membrana cellulare resta l'ostacolo comune a tutti i compartimenti che lo xenobiotico attraversa nella sua distribuzione all'interno dell'organismo. Pi facile il superamento della membrana cellulare, pi completo l'assorbimento e ampia la distribuzione nell'organismo e viceversa. Certamente non tutti gli xenobiotici superano le membrane cellulari con la stessa velocit o con le stesse modalit. Ecco quindi l'importanza di conoscere il meccanismo con cui lo xenobiotico le attraversa, poich questo meccanismo condiziona la quantit di xenobiotico che viene assorbita e distribuita.

Fig. 1.1 Cellula animale e cellula vegetale

1.1.0.0.- La membrana cellulare Le membrane biologiche delineano una frontiera, un confine tra organuli intracellulari e citoplasma, tra cellula e cellula, tra cellula ed lambiente esterno. Assicurano inoltre il mantenimento del contenuto intracellulare compatibile con le esigenze di lavoro e di vita della cellula stessa o dei suoi costituenti grazie a precise e spesso specifiche propriet di permeabilit e capacit di trasporto di ioni e sostanze nutritive. Queste ultime propriet influenzano anche la distribuzione dei composti chimici fra lo spazio extra ed intracellulare e tra citoplasma e strutture intracellulari. Le membrane biologiche, quindi, non assolvono alla sola funzione meccanica di protezione della cellula o di imitazione degli organuli subcellulari, ma sono implicate in molteplici attivit fondamentali per la cellula stessa come, ad esempio, il riconoscimento di materiale estraneo che un fenomeno dei processi immunitari. La struttura delle membrane rappresenta il marchio didentificazione della cellula, la sua carta di identit. Membrane di cellule diverse posseggono strutture che le caratterizzano. Grazie alla presenza di queste strutture specifiche, disposte alla superficie delle membrane, ogni cellula viene riconosciuta dall'organismo o come propria, ed allora accettata, o come estranea, ed allora essa determina la messa in opera di quei meccanismi di difesa di cui l'organismo dispone. Trattasi di meccanismi immunitari che, grazie a quella che viene chiamata risposta immunitaria, assolvono il compito di neutralizzare ed eliminare tutto ci che estraneo all'organismo ed, in quanto tale, possibilmente pericoloso, dannoso.

La formazione e la conseguente specializzazione della membrana plasmatica sono stati eventi determinanti per levoluzione della vita sulla Terra; infatti grazie alla sua comparsa cominciata la vera e propria costituzione di entit separate (cellule primordiali senza alcuna organizzazione interna), capaci di operare una selezione altamente specifica grazie alla funzione filtrante della membrana stessa. Tutte le membrane hanno la stessa costituzione di base: un doppio strato lipidico (bilayer) in cui sono immerse molecole proteiche, quasi sempre glicosilate, pi o meno complesse e voluminose che danno le caratteristiche di specificit funzionale alla membrana stessa e alla quale sono legate tramite legami non covalenti. Una struttura siffatta risulta intuitivamente ben definita dalla classica definizione di mosaico fluido che ben rende conto delle fondamentali caratteristiche di dinamicit e asimmetria di qualsiasi membrana. Vediamo quindi di analizzare in dettaglio, seppur brevemente, le varie componenti e di descrivere poi a sommi capi i meccanismi di trasporto attraverso la membrana per molecole di piccole e grandi dimensioni.

1.1.1.0.- Struttura delle membrane biologiche. Le membrane biologiche hanno di solito uno spessore variabile tra i 4.0 ed i 10.0 nm. Sono composte essenzialmente da lipidi e proteine disposti in un modello estremamente semplificato a formare una struttura trilaminare: una fascia esterna di natura proteica, una fascia intermedia formata da uno strato lipidico bimolecolare ed una terza fascia, orientata verso l'interno dell'ambiente cellulare, costituita ancora da materiale proteico. Su questa distribuzione dei componenti sono stati elaborati diversi modelli di struttura delle membrane cellulari di cui il pi attuale quello a mosaico fluido. In questo modello la continuit della membrana data da uno strato bimolecolare di fosfolipidi disposti in modo da orientare la parte apolare, (le catene idrocarboniose degli acidi grassi che li costituiscono), verso la zona pi interna della membrana (strato idrofobico) e la parte polare, (le teste dei fosfolipidi costituite da glicerolo e basi organiche), verso l'ambiente acquoso rispettivamente all'esterno e all'interno della membrana stessa.

L'intelaiatura delle membrane cellulari costituita da un doppio strato di lipidi le cui teste idrofile formano le superfici interna ed esterna e le code idrofobe si uniscono al centro della membrana; il doppio strato ha uno spessore di circa 4,5 nanometri. Le proteine, che costituiscono gli altri componenti della membrana, possono essere di due tipi. Alcune dette periferiche (a) sono disposte su entrambe le facce della membrana. Le altre, dette integrali, penetrano nella membrana per un breve tratto (b) o, l'attraversano completamente da sole o a coppie (e).

1.1.1.1.- Il doppio strato lipidico Come si ricava dal nome, una doppia sequenza in parallelo di molecole lipidiche direzionate in modo preciso. Esso la matrice di base della membrana oltre che la struttura portante delle molecole proteiche, il cui buon funzionamento dipende in grandissima parte dal mantenimento nel tempo e nello spazio delle caratteristiche proprie dei lipidi componenti.

Fig. 1.2 Il doppio strato lipidico della membrana cellulare.

La particolarit del doppio strato lipidico che subito risalta il carattere anfipatico: i lipidi sono costretti quindi a disporsi sempre e soltanto secondo una certa direzione, luno rispetto allaltro sia nello stesso monostrato, sia nel bilayer, il che ha una ragione dessere in quanto rende conto di una struttura avente il minor contenuto in energia libera tra le possibili. Ne deriva che la membrana grazie ai propri lipidi possiede le fondamentali propriet di autoaggregazione e autosigillazione. I lipidi che si rintracciano normalmente in una membrana cellulare sono riconducibili a tre tipi: i fosfolipidi, il colesterolo ed i glicolipidi.

Fig. 1.3 - Rappresentazione schematica della struttura di una membrana biologica.

Nella fig.1.3 sono indicate con GP le glicoproteine nella superficie esterna della membrana; catene disaccaridiche e oligosaccaridi che con residui terminali di acido sialico si proiettano nello spazio intercellulare. G: gangliosidi sulla superficie esterna che proiettano nello strato lipidico della membrana una catena a due atomi di carbonio e nello spazio intercellulare danno origine a una porzione idrofilica contenente residui di acido sialico. MP" monostrato proteico nella superficie esterna ed interna della membrana. Le catene polipeptidiche si arrotolano in una caratteristica formazione ad elica. Gli aminoacidi polari si trovano in superficie mentre gli aminoacidi idrofobici penetrano la regione non-polare dello strato lipidico. Si possono vedere proteine che penetrano parzialmente nella compagine lipidica e in un punto (al centro) vi una proteina che attraversa in linea retta l'intera zona lipidica. T: teste polari dei fosfolipidi. GL: glicerolo.CI: code idrocarburiche dei fosfolipidi. Le code idrocarburiche possono essere costituite da acidi grassi saturi o insaturi; queste ultime, pi mobili, possono perdere il loro allineamento ordinato in seno alla compagine lipidica. LL: strato lipidico bimolecolare costituito da fosfolipidi e colesterolo (il nucleo steroidico raffigurato in seno alla matrice lipidica). Il monostrato proteico (MP) e il doppio strato lipidico (LL) costituiscono l'unit strutturale della membrana.

I fosfolipidi sono molecole lipidiche caratterizzate dalla presenza di un gruppo fosfato variamente sostituito (residui tipici sono: la colina e la serina- presenti rispettivamente sempre e solo sulla faccia esterna ed interna della membrana -, letanolammina, linosotolo). Tale fosfato esterificato ad una molecola di glicerolo, a sua volta portante, sempre in legame estereo, due molecole di acido grasso, in catena carboniosa da 14 a 24 atomi, di cui uno saturo ed uno insaturo (in conformazione cis), che porta alla formazione di una tipica piega nella struttura complessiva, avente funzione di ostacolarne limpacchettamento. I doppi legami sono importanti perch esaltano la fluidit del doppio strato lipidico, oltre al fatto di contribuire ad abbassare la temperatura di congelamento della struttura. Il residuo, il fosfato ed il glicerolo formano la cosiddetta testa idrofila (polare) del fosfolipide, posizionata sempre verso lesterno del bilayer, cio esposta verso la faccia esterna o interna della membrana, ma mai nellinterno del doppio strato lipidico. I due acidi grassi formano invece la coda idrofoba (apolare) del fosfolipide, racchiusa sempre nella parte interna della membrana. Stando ferme queste condizioni, i fosfolipidi sono comunque in grado di subire dei cambiamenti di posizione (movimenti accessibili), quali la diffusione laterale su di uno stesso monostrato (circa 10 volte al secondo), la rotazione rispetto al gruppo fosfato, la flessione delle code idrocarburiche e pi raramente (allincirca 1 volta ogni due settimane) il cosiddetto flip-flop, cio il passaggio da un monostrato allaltro. importante valutare appieno questi eventi per capire pienamente la definizione che si d alla membrana di mosaico fluido. Il colesterolo, molecola caratterizzata dalla struttura ciclica centrale dello steroide, piana e rigida, nella quale si individuano da un alto un gruppo di testa polare (residuo idrossilico) e dallaltro un gruppo di coda idrocarburico apolare si inserisce tra i fosfolipidi (in genere secondo un rapporto di circa 1 a 1) in modo direzionato ed esalta la stabilit meccanica della membrana, regolandone al tempo stesso la fluidit. I glicolipidi sono molecole composte da due acidi grassi esterificati ad una catena variamente diramantesi (in toto da 1 a 15 zuccheri) di gruppi glucidici di diverso tipo. Sono presenti soltanto sulla faccia esterna (circa il 5% dei lipidi totali) della membrana e quindi contribuiscono in modo precipuo alla sua asimmetria. Si distinguono in neutri e aventi carica: i primi, detti anche glicosfingolipidi, codificano le differenze fra specie, fra individui della stessa specie e tra cellule dello stesso organismo, fungendo quindi da marcatori cellulari; gli altri, detti gangliosidi, recano residui di acido sialico (che carico negativamente) e sono presenti in particolare a livello di neuroni (ne costituiscono il 6% in massa). Se genericamente si dice che il doppio strato lipidico un solvente per le molecole proteiche, risulta anche vero dalla breve descrizione delle caratteristiche proprie dei suoi componenti che esso forma per le stesse lambiente funzionale pi appropriato.

Il bilayer lipidico che compone la membrana per sua natura idrofobo: le sue caratteristiche chimico-fisiche quindi, da sole, contribuiscono ad una selezione di base nei confronti di tutte le molecole polari, anche se piccole. Certo il fatto di avere piccole dimensioni favorisce il passaggio attraverso il doppio strato, ma sono le caratteristiche di idrofobicit(filia) che fanno la differenza.

1.1.1.2.- Le proteine La qualit e la quantit di molecole proteiche presenti in un doppio strato lipidico determinano in modo univoco la funzionalit della membrana stessa. Esse genericamente si suddividono in proteine periferiche, quando sono posizionate in uno dei monostrati, e transmembrana, quando invece estrudono da una parte allaltra del bilayer lipidico. Interessanti sono soprattutto queste ultime. Nelle proteine transmembrana si individuano (prendendo come riferimento il bilayer) una parte idrofila rivolta verso lesterno ed una parte idrofoba verso linterno, in modo da assicurare la massima interazione con la componente lipidica della membrana stessa e quindi la massima stabilit alla molecola, il che risulta naturalmente in una migliore funzionalit (si ricordi infatti che una membrana il cui assetto lipidico sia alterato, funzioner pure in modo anomalo o parziale!). Per lo stesso motivo, poi, si tratta in genere di strutture peptidiche ad -elica o a foglietto, proprio perch queste sono le strutture secondarie che assicurano il maggior numero di legami idrogeno tra peptidi. Una ulteriore suddivisione che si tende a fare tra le transmembrana quella basata sulla forma, per cui si riconoscono proteine bastoncellari, che sono in genere recettori e marcatori cellulari, e proteine globulari, che fungono in genere da canali proteici. Laver posto lattenzione sulla necessit di mantenere una buona stabilit del materiale proteico allinterno del bilayer lipidico, non deve creare confusione rispetto ad un altro concetto fondamentale: la capacit cio delle molecole proteiche di muoversi nello stesso. Si pensi ad esempio per assurdo che cosa potrebbe significare per un sistema enzimatico funzionante a cascata la non-fluidit della membrana. Lipidi e proteine hanno una notevole libert di movimento per quanto riguarda la diffusione laterale in seno al doppio strato fosfolipidico. Un preciso grado di fluidit molto importante per il corretto funzionamento della membrana e per la sopravvivenza della cellula. Infatti, stato dimostrato che una membrana non assolve pi alle sue funzioni biologiche quando i lipidi sono presenti in forma rigida e compatta, come succede per l'esposizione delle membrane alle basse temperature. D'altro canto un'eccessiva fluidit, quale quella che si pu avere alle alte temperature, comporta drammatici cambiamenti nella permeabilit della membrana, che perde cos ogni sua selettivit, comportandosi come un sistema instabile in

cui la funzionalit di gran parte delle proteine viene certamente compromessa. Un opportuno grado di fluidit pertanto indispensabile affinch, a livello delle membrane biologiche, si possano attuare importantissimi processi biochimici essenziali per la vita, quali reazioni enzimatiche, processi di trasporto e la respirazione cellulare. Le proteine inglobate meno profondamente nel doppio foglietto lipidico possono servire alle interazioni delle membrane con l'esterno: con gli ormoni, con i neurotrasmettitori, con gli autacoidi o con altre sostanze presenti in circolo (ad es. gli xenobiotici) che, combinandosi con queste proteine pi superficiali, meno profondamente inglobate nella struttura membranosa, danno origine al trasferimento dinformazioni all'interno dell'ambiente cellulare.

Fig.1.4 Dislocazione delle proteine sulla membrana

L'interazione dell'agente esterno con il proprio recettore conduce ad alterazioni della componente proteica o lipidica della membrana (o di entrambe) che possono ripercuotersi in variazioni di attivit di enzimi o di trasportatori o di altro. Tutti questi fenomeni sono resi possibili dalla fluidit della componente lipidica della membrana. Le proteine che invece attraversano l'intera compagine della membrana servono a fare da ponte attraverso lo strato lipidico e possono permettere il passaggio di molecole che altrimenti non varcherebbero la barriera idrofobica della membrana stessa. Alcune proteine delimitano delle zone idrofile, dei canali attraverso cui fluiscono acqua, ioni e molecole idrofile di piccole dimensioni come l'urea e l'alcool. La rigidit e la perviet del canale dipendono dalla fluidit della componente lipidica della membrana. Altre proteine esplicano la funzione di trasportatori. I trasportatori possono oscillare dall'esterno all'interno.

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1.1.1.3.- I carboidrati I glucidi presenti si trovano soltanto sul monostrato lipidico esterno della membrana contribuendo alle caratteristiche di asimmetria. Si individuano come catene laterali attaccate ai protidi o ai lipidi e si differenziano perci in: - glicoproteine (che sono la quasi totale maggioranza delle proteine totali di membrana), caratterizzate dalla presenza di pi catene glucidiche variamente differenziate per qualit e quantit, - glicolipidi (che sono circa 1 su 10 dei lipidi totali esterni), caratterizzati dalla presenza di una sola catena glucidica. Nel loro complesso i carboidrati formano uno strato esterno alla membrana (ed alla cellula in toto) che viene chiamato in vario modo (rivestimento, mantello cellulare, glicocalice; ben evidenziabile con una colorazione al rosso rutenio). Le funzioni di tali catene glucidiche sono molteplici: ancorare le proteine e orientarle nella membrana; stabilizzarle, soprattutto se di tipo periferico; svolgere funzione di riconoscimento inter/intracellulare, funzionando da veri e propri marker. Per il riconoscimento e, quindi, lautorizzazione allentrata dello xenobiotico, alla superficie della membrana sono dislocati dei recettori specifici atti a riconoscere e ad

interagire con determinati ormoni o neurotrasmettitori presenti nei liquidi biologici e che rappresentano per la cellula dei messaggeri dell'ambiente esterno.

Fig.1.5 A sx: una proteina parzialmente immersa nel doppio strato lipidico recepisce i messaggi dallesterno, portati da ormoni e li trasmette a proteine messaggeri allinterno. A dx; un dimero glicoproteico si proietta allesterno della membrana; nello stesso tempo una proteina cilindrica penetra allinterno della membrana e si espande nello spazio intracellulare. La proteina esterna riconosce il messaggero ed attiva la funzione catalitica dellenzima di riferimento per lo xenobiotico della parte interna. A seconda del tessuto considerato, il messaggio ormonale o neuroumorale trasmesso in sede intracellulare con la formazione di AMP ciclico si concreter poi nella

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risposta biologica finale che sar di natura fisiologica o metabolica in funzione delle proteine. Grazie ai movimenti doscillazione o di rotazione della proteina, resi possibile dalla fluidit della membrana, la sostanza da trasportare, captata da uno specifico sito di legame, viene trasferita dalla parte opposta della membrana e qui rilasciata. Tali trasportatori sono deputati a trasferire molecole che da sole non potrebbero attraversare la membrana stessa. Ne esempio il glucosio, molecola estremamente idrofila che difficilmente potrebbe allontanarsi dal solvente acquoso dell'ambiente extracellulare per entrare in una fase lipidica. Le membrane biologiche costituiscono una barriera che non superabile da tutti gli xenobiotici. Essa ha una parte proteica ed una parte lipidica, in cui prevale la presenza di fosfolipidi. Ai fini del trasferimento di materiale dall'esterno all'interno e viceversa si comporta essenzialmente come una barriera lipidica. Uno xenobiotico liposolubile superer la barriera in grado proporzionale alla sua affinit per i lipidi. Uno xenobiotico idrosolubile verr respinto, a meno che non abbia un diametro molecolare cos ridotto (non superiore ai 4 A) da riuscire a passare sfruttando zone idrofile della membrana. In ogni caso la struttura della membrana tale che la sua permeabilit differisce nei confronti di diversi ioni e molecole. Per ogni data membrana ci sono sostanze che non passano affatto, altre che passano con un preciso meccanismo ed in genere tanto pi rapidamente quanto pi sono liposolubili.

1.2.0.0.- Il passaggio degli xenobiotici attraverso le membrane biologiche. Il motivo fondamentale per la necessit di studiare accuratamente la membrana cellulare in ecotossicologia e tossicologia umana che la membrana il porto dingresso nel sistema biologico animale ed umano per cui, se non si verifica il passaggio di membrana, non ha senso parlare di tossicit. Conoscendo il comportamento della membrana nei confronti di vari composti chimici, possibile prevedere il destino di uno stressore chimico che arrivi a contatto con essa. Come prima indicazione orientativa si pu dire che i requisiti fondamentali affinch un xenobiotico venga ripartito a livello della membrana sono la sua idrosolubilit che consente ch'esso sia in soluzione nei liquidi biologici, le sue dimensioni molecolari che ne

condizionano il passaggio mediante particolari meccanismi di trasporto presenti nelle membrane, ed infine la sua liposolubilit, che ne consente l'assorbimento per diffusione. Gli xenobiotici non ionizzati sono liposolubili e diffusibili. Gli xenobiotici ionizzati sono insolubili nei lipidi e non diffusibili meno che non possano usufruire di particolari meccanismi di trasporto. Il grado di ionizzazione dipende dal pH, perci, modificando il pH possiamo influenzare l'assorbimento o l'eliminazione di un dato xenobiotico.

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Analizziamo, ora, con maggior dettaglio i principali processi mediante i quali i composti xenobiotici passano la membrana cellulare. chiaro che i processi si riferiscono a qualunque composto chimico che si presenti con un certo gradiente di concentrazione a livello della membrana cellulare e che venga riconosciuto, in ogni caso, come composto ricco di legami energetici riutilizzabili e di atomi adatti ad un uso plastico (costruzione delle unit cellulari). Nel nostro caso, trattando dambiente e salute, la considerazione sar fatta per gli xenobiotici ma la trattazione , chiaramente, identica nel caso di un farmaco, di un nutriente o, infine, di qualsiasi composto chimico.

1.2.1.0.- Fenomeni di trasporto Il trasporto di uno xenobiotico atrraverso la membrana cellulare deve essere sempre riferito allenergia. Questo vuol dire che anche il passaggio di materia transmembrana si realizzer solo se il livello energetico per il composto che trasmigra sar, allesterno della membrana, superiore a quello che lo stesso composto ha nel citosol ossia allinterno della cellula. La fugacit del composto o dei composti nel liquido che permea la membrana allesterno sar superiore a quella interna (sommata alle resistenze di membrana). Per raggiungere le condizioni di minima energia del sistema il composto passer allinterno fino a che le energie si bilanceranno (energia esterna = energia interna+ resistenze). Ci si trova, quindi, anche nel caso del sistema fluido esterno-membrana strato lipidico esterno- membrana strato lipidico interno-fluido interno di fronte ad un processi di ripartizione tra due fasi: fluido esterno (comparto A) e fluido interno (comparto B), separati da una interfaccia (attiva), la membrana cellulare. Se lo xenobiotico arriva alla membrana (interfaccia), con una certa concentrazione (fugacit), al tempo zero la massima possibile poich nellinterno della cellula lo xenobiotico non presente (f=0). La condizione, ora, energeticamente inaccettabile poich corrisponde a quella di uno squilibrio assai elevato. Per tentare di raggiungere lequilibrio, il sistema, deve assestarsi, spostando, in funzione delle due diverse fugacit, moli di xenobiotico dal comparto A al comparto B. In questa fase la massa del composto fluisce secondo un processo continuo. Poich, infatti, natura non facit saltus, il flusso di materia seguir criteri quantitativi continui definiti dalla differenza di fugacit e, in termini fenomenologici, dalla differenza in concentrazione tra i due comparti. Questo processo viene espresso dalla 1a legge di Fick. Per chiarire le idee, supponiamo di introdurre una goccia di arancio di metile allinizio di un tubo pieno di acqua. Losservazione dice che il colorante diffonde progressivamente fino a che tutta lacqua colorata. Peraltro, al tempo t = 0, la concentrazione del colorante nello strato infinitesimo iniziale del tubo dacqua uguale alla concentrazione totale del colorante stesso ossia C = C0; man

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mano che passa il tempo, la colorazione del resto del tubo dacqua assume progressivamente colore sempre pi intenso fino a che non si distingue differenza di colore tra le singole sezioni. In questo momento non vi , quindi, pi passaggio di colorante o flusso di colorante attraverso le sezioni del tubo dacqua: abbiamo raggiunto una condizione dequilibrio. Linterpretazione termodinamica dice che al tempo zero la fugacit del colorante nella goccia era elevatissima e zero nellacqua circostante. Per arrivare allequilibrio (Minima energia del sistema e fugacit eguale per ogni goccia di colorante), ogni molecola di colorante doveva diffondere fino a distanza infinita dalle proprie consorelle. La stessa cosa succede a livello dellinterfaccia di una membrana biologica. Se misuriamo, durante la fase dinamica, il flusso dello xenobiotico secondo lasse x (in unit di massa per unit darea e per unit di tempo), possiamo esprimere la relazione tra il flusso e la concentrazione esterna in:

Fx = D dC a dx
con dC/dx = al gradiente di concentrazione (fugacit) del composto in esame, D = coefficiente di diffusione molecolare e a la sezione attraverso cui si valuta il flusso. Di solito a considerata unitaria e quindi non compare nella relazione usuale di Fick. D tipico per lo xenobiotico considerato e per il comparto in cui il composto diffonde. D espresso in m2 s-1; poich la concentrazione C espressa in moli m-3, il flusso F espresso in moli m-2 s-1. La relazione che esprime il flusso F nota come la 1a legge di Fick ed una

espressione di leggi simili (conducibilit del calore, conducibilit elettrica ecc.) ove un gradiente (dC/dx) il motore che determina un flusso (F) di materia od energia attraverso una interfaccia che provoca una resistenza (in realt la somma di pi resistenze date dalle interazioni molecolari tra i vari composti in gioco) espressa globalmente dal coefficiente D. D, coefficiente di diffusione, misurato come rapporto tra superficie e tempo (m2 s1

) ed un parametro che varia in dipendenza del tipo specifico di matrice (non quindi un

parametro esportabile!), con la temperatura del mezzo e ovviamente con le caratteristiche chimico-fisiche e la concentrazione della sostanza di cui si sta valutando la mobilit; esso esprime in un certo senso la resistenza offerta dal mezzo o dalla matrice al passaggio e quindi al trasporto di quel determinato composto; C la concentrazione della specie diffondente, generalmente misurata in moli m-3; x rappresenta la distanza dalla sorgente o dal punto di massima concentrazione, normalmente misurata in metri lineari;

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dC/dx, quindi, quantifica il gradiente di concentrazione, ovvero la variazione della concentrazione C della specie diffondente nel mezzo lungo una prefissata direzione e secondo un determinato verso al variare della distanza x; viene posto per convenzione il segno meno per indicare che la diffusione netta avviene verso regioni del sistema a concentrazioni sempre minori (ricordare il principio della fugacit) F, con tali unit di misura, viene espresso in moli m-2s-1. chiaro, a questo punto, che la membrana plasmatica funge da barriera di delimitazione tra una qualsiasi cellula e tutto ci che sta al di fuori di essa. La sua specializzazione per non finisce qui; essa funge anche da filtro selettivo, nel senso che non si limita ad essere un ostacolo passivo, ma possiede per sue intrinseche caratteristiche la capacit di "lasciare passare" e/o trasportare le molecole necessarie alla cellula o, in direzione opposta, quelle di cui la cellula non necessita pi, o ne fa richiesta all'esterno. Genericamente, si possono riconoscere due diversi tipi di fenomeni di trasporto, quelli concernenti le molecole di piccole dimensioni e quelli che riguardano molecole di grossa mole o insiemi di piccole molecole che vengono rilasciate in grande quantit. Infine, considereremo un caso particolare, quello dei metalli pesanti, per limportanza sempre crescente del loro ruolo ecotossicologico ed ecologico nei fenomeni di tossicit ambientale ed umana. Potremo dividere i processi di trasporto in due blocchi: processi entropici e processi sintropici. I primi sono dovuti a differenze di fugacit ai due fronti della membrana ed i processi di trasporto si verificano senza apporto di energia dal sistema; nel secondo caso necessita energia prodotta attraverso il metabolismo cellulare.

1.2.1.1.0.- Trasporto di grandi molecole. 1.2.1.1.1.- Processi entropici: i processo passivi Il fenomeno del trasporto passivo viene, a sua volta, genericamente suddiviso in: - diffusione semplice (a cui si accennato sopra), che pu essere normale, cio nientaltro che una diffusione, oppure con proteina canale, nel caso in cui serva comunque creare un ambiente adatto per caratteristiche di polarit a che la molecola passi nello spessore della membrana; - diffusione facilitata, quando il passaggio favorito da proteine vettrici, che utilizzano a tale scopo il gradiente chimico, cio la differenza di concentrazione tra una faccia e l'altra della membrana della molecola da trasportare, e/o il gradiente elettrico, cio la differenza di carica elettrica esistente tra l'interno (negativo) e l'esterno (positivo) della membrana [si tenga comunque presente che anche questa situazione non casuale, ma deriva a sua volta, principalmente, dall'azione di due proteine di trasporto che continuamente

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"lavorano" affinch il gradiente elettrochimico non decada, in quanto verrebbe meno il cosiddetto potenziale di membrana assolutamente necessario alla vita della cellula].

Fig.1.6 Attivazione di un canale proteico da parte di uno xenobiotico che facilita, cos, il passaggio di ioni dallesterno allinterno della cellula.

Non a caso, quindi, la diffusione semplice attraverso la membrana, il pi immediato di tutti i tipi di scambio fra l'esterno e l'interno della cellula, chiama in causa soltanto molecole come l'ossigeno (O2), molecola piccola, simmetrica e idrofoba; l'anidride carbonica (CO2) che polare ma neutra; l'acqua (H2O) che con le sue caratteristiche di dipolo riesce ad "incunearsi" tra i lipidi sfruttando di volta in volta le regioni con minore o maggiore polarit. All'opposto, in tutti gli altri casi, si ha a che fare con una diffusione mediata, in cui lo scambio reso possibile solo grazie alla presenza di particolari componenti di membrana che fungono o da canale o da veri e propri vettori.

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Fig. 1.7 Schema di struttura di membrana e ipotetico meccanismo di trasporto. Si ritiene che esistano sulla membrana dei pori o degli equivalenti funzionali degli stessi. Il poro rappresentato da una cavit interna ad una proteina la quale si estende da parte a parte della membrana. Questo canale, di natura idrofilica, offrirebbe a molecole idrosolubili un ponte di passaggio attraverso lo strato fosfolipidico. forse quest'ultimo il caso pi interessante, in quanto chiama in causa le proteine vettrici che sono per la maggior parte degli enzimi associati alla membrana. Una molecola che deve essere introdotta nella cellula (o essere espulsa dalla stessa) pu compiere il passaggio come singola entit (uniporto) o insieme ad altre molecole (cotrasporto), che possono a loro volta procedere nella stessa direzione (simporto) o lungo la direttrice opposta (antiporto). Un esempio di cotrasporto come simporto quello che avviene nelle cellule batteriche, che introducono contemporaneamente una molecola di glucosio con uno ione idrogeno (H+); il cotrasporto come antiporto invece si osserva in tutte le cellule eucariotiche a livello della pompa Na+-K+ ATPasi, in cui per ogni tre ioni Na+ che escono, due di K+ entrano. La differenza sostanziale tra i vari sistemi di scambio consiste per nella necessit o meno che avvenga uno dispendio energetico perch lo scambio stesso abbia luogo. Si parla allora di trasporto passivo, quando non entrano in gioco meccanismi energetici; di trasporto attivo, nel caso contrario.

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Dobbiamo qui distinguere la diffusione per convezione (filtrazione), dalla diffusione semplice attraverso i lipidi (diffusione passiva).

1.2.1.1.2.- Processi entropici: diffusione per convezione

Avviene attraverso zone idrofile della membrana chiamate canali e viene chiamata anche filtrazione poich implica il passaggio di un notevole volume di acqua, come conseguenza di differenze di pressione idrostatica od osmotica attraverso la membrana. Il volume di acqua che fluisce attraverso il canale trascina con s qualunque molecola idrosolubile di dimensioni molecolari sufficientemente piccole da passare attraverso il canale stesso. La filtrazione regolata allora da differenze di pressione idrostatica od osmotica ed avviene secondo gradiente osmotico. La filtrazione il meccanismo che pi comunemente trasferisce molte sostanze idrosolubili polari e non polari, purch di piccole dimensioni. La grandezza dei canali differisce nelle varie parti dell'organismo. Le cellule endoteliali dei capillari hanno canali larghi (40 A) attraverso i quali possono passare molecole cos voluminose come l'albumina (PM = 67.000). Queste molecole possono cio trasferirsi, se pur in grado limitato, dal plasma ai fluidi extracellulari. Di contro, i canali delle membrane dei globuli rossi, dell'epitelio intestinale, e di molte altre membrane, non sono superiori ai 4 A di diametro e perci permettono il passaggio solo di acqua, di urea, alcool ed altre piccole molecole idrosolubili. Tali sostanze generalmente non attraversano i canali delle membrane cellulari se il loro peso molecolare superiore a 100-200. La membrana glomerulare un tipico esempio di membrana filtrante. Molti ioni inorganici sono sufficientemente piccoli da passare attraverso i canali delle membrane biologiche, ma il loro gradiente di concentrazione generalmente determinato dal potenziale di transmembrana (ad esempio per il Cl-) o dal trasporto attivo (ad esempio nel caso del Na+ e del K+). Bench non sia nota la natura dei componenti della membrana implicati in questo trasferimento, la perviet del canale e la velocit del passaggio dipende dalla quantit di acidi grassi insaturi e di colesterolo presenti entro la struttura della membrana.

1.2.1.1.1.1.- Processi entropici: diffusione attraverso i lipidi.

Il processo avviene attraverso la fase lipidica della membrana ove transitano solo sostanze liposolubili. Questo trasferimento direttamente proporzionale alla grandezza del gradiente di concentrazione attraverso la membrana e al coefficiente di ripartizione lipidiacqua del xenobiotico.

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Pi elevato il coefficiente di ripartizione, pi elevata la concentrazione di xenobiotico nella membrana e pi veloce la sua diffusione. Ad equilibrio raggiunto, la concentrazione di xenobiotico libero la stessa da entrambi i lati della membrana, qualora lo xenobiotico non sia un elettrolita. Per tutti i composti ionici, invece, le concentrazioni all'equilibrio dipenderanno dalla differenza di pH attraverso le membrane, che pu influenzare lo stato di ionizzazione della molecola da ciascun lato della stessa, dal gradiente elettrico per lo ione. In definitiva, per quanto concerne la diffusione semplice, la membrana si comporta come una lamina lipidica attorniata all'esterno e i all'interno dall'acqua, cosicch tre sono le barriere da superare: una lipidi-acqua all'esterno, una solo lipidica al centro e un'altra rivolta all'interno della cellula costituita ancora da lipidi-acqua. Sostanze polari, fortemente idrofile formano forti legami idrogeno con l'acqua e di conseguenza restano come imprigionate nella fase acquosa all'esterno della membrana. D'altra parte, sostanze contenenti principalmente gruppi non polari, si accumulano nella componente lipidica delle membrane. Sostanze invece capaci di diffondere rapidamente attraverso la membrana (etanolo) contengono sia raggruppamenti debolmente polari che gruppi non polari e la loro velocit di diffusione dipende soprattutto dal gradiente di concentrazione e dal coefficiente di ripartizione tra lipidi e fase acquosa. Molti xenobiotici sono elettroliti deboli, acidi o basi deboli che sono molto pi liposolubili che idrosolubili nella loro forma non ionizzata, ma molto pi idrosolubili della forma ionizzata. Di conseguenza, solo le molecole non ionizzate diffondono facilmente attraverso le membrane. La proporzione tra xenobiotico non ionizzato e xenobiotico ionizzato dipende dal pKa (grado di ionizzazione) di ogni dato composto e dal pH del medium ove viene a trovarsi lo xenobiotico. Cos l'assorbimento, la distribuzione e l'escrezione di tali xenobiotici influenzata dal pH dei liquidi organici a differenti livelli. Poich variando il pH varier anche la tendenza di un xenobiotico a ionizzarsi, modifiche di pH possono influenzare la possibilit o meno di un xenobiotico a superare le membrane cellulari.

1.2.1.2.1.- Processi entropici: trasporto facilitato.

Il termine descrive il trasporto tramite intervento di un trasportatore o carrier che opera senza dispendio di energia, cosicch i movimenti della sostanza trasportata avvengono solo secondo gradiente elettrochimico e non contro di questo. Tale meccanismo, che saturabile ed altamente selettivo per xenobiotici aventi precise conformazioni strutturali, indispensabile al trasporto di composti endogeni la cui velocit di movimento attraverso le membrane biologiche per semplice diffusione potrebbe essere nulla o troppo lenta. Il trasportatore incrementa, in questo caso, la velocit di movimento.

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Fig.1.8 Meccanismo di trasporto mediante proteina trasportatrice che, ruotando, si affaccia alternativamente allinterno od allesterno della cellula La combinazione tra la molecola trasportatrice e la sostanza che deve penetrare attraverso la membrana specifica, nel senso che ciascun trasportatore pu combinarsi solo con una sostanza o con un numero limitato di sostanze aventi comune struttura chimica. Il processo ping-pong raffigurato nel disegno rappresenta un ipotetico meccanismo di trasporto attraverso le membrane. Il trasportatore costituito da una proteina immersa nella matrice lipidica della membrana. Esso presenta una specifica affinit per la sostanza da trasportare (lesagono nero). Il processo di.trasporto implica una variazione della configurazione spaziale della struttura proteica del trasportatore, tale da permettere che il sito di legame con la sostanza da trasportare si trovi alternativamente dislocato all'esterno o all'interno della membrana. Cos, sulla superficie esterna della membrana si crea il complesso sostanza-proteina); all'interno della cellula, variazioni di affinit tra sito di legame e sostanza trasportata inducono il rilascio della sostanza stessa in sede citoplasmatica. La combinazione ricorda quella tra substrato ed enzima, o tra xenobiotico ed il suo recettore ed implica la formazione di un complesso intermedio, xenobiotico-trasportatore, diffusibile nella componente lipidica della membrana. La quantit di sostanza che si combina con il trasportatore dipende dalla sua concentrazione nella fase acquosa in contatto con la membrana e dal numero di siti di legame disponibili sul trasportatore, i quali saranno necessariamente limitati. Il complesso xenobiotico-trasportatore permette il trasferimento del xenobiotico dalla parte esterna a quella pi interna della membrana, ove lo xenobiotico viene rilasciato.

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Fig.1.9 Trasporto ping-pong

Poich la concentrazione del complesso pi alta nella parte della membrana ove avviene la sua formazione, esso chiaramente si muover secondo il suo gradiente di concentrazione e cio verso la parte interna della membrana. Il trasportatore libero, d'altra parte, pi concentrato nella parte della membrana ove avviene la cessione del xenobiotico trasportato, cosicch il trasportatore libero muover in senso inverso, nella direzione opposta a quella del complesso xenobiotico-trasportatore. In questo modo il trasportatore fa la spola da una parte e l'altra della membrana per semplice diffusione.

1.2.1.2.0.- Processi sintropici: trasporto attivo Si parla di trasporto attivo invece nel caso in cui sia necessaria la scissione di un legame ad alto contenuto energetico affinch il trasporto possa avvenire. Si ha che fare allora con una proteina vettrice di tipo enzimatico, capace di legare con altissima affinit in un sito specifico, nella maggior parte dei casi, una molecola di ATP (adenosintrifosfato), la cui perdita di un fosfato in legame estereo e conseguente trasformazione in ADP (adenosindifosfato) libera sufficiente energia da permettere una modifica conformazionale della proteina stessa che si traduce nel passaggio da una faccia all'altra della membrana della molecola da trasportare.

1.2.1.2.2.- Trasporto attivo. Il passaggio per diffusione passiva non spiega il passaggio di tutti gli xenobiotici attraverso le membrane cellulari. Alcune sostanze vengono trasportate attraverso la membrana contro il loro gradiente di concentrazione o contro il gradiente elettrico e, apparentemente, contro il gradiente di fugacit Ci significa che necessaria dellenergia metabolica per guidare tali movimenti ed il processo detto di trasporto attivo o processo di trasporto sintropico.

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Per trasporto attivo sintende, in pratica, il rapido trasferimento di molti acidi organici e di molte basi attraverso il tubulo renali, i plessi corioidei, la parete intestinale, la placenta e nelle cellule epatiche. Le caratteristiche di tale trasporto attivo sono: selettivit, saturabilit, richiesta denergia che proviene dal metabolismo cellulare, inibizione competitiva ad opera di sostanze strutturalmente correlabili a quelle normalmente trasportate e capacit di operare contro un gradiente elettrochimico. Tale meccanismo pu giocare un ruolo importante nel meccanismo d'azione gli xenobiotici che sono soggetti al trasporto attivo o che interferiscono con il trasporto attivo di metaboliti naturali o di neurotrasmettitori. Esempi di trasporto attivo sono la secrezione di H+ nel succo gastrico e nelle urine, la captazione di iodio da parte delle cellule nella tiroide, il riassorbimento del glucosio e degli aminoacidi dalle urine nel sangue e la pompa del Na+ che espelle attivamente gli ioni Na+ scambiandoli con il K+ nella maggior parte delle cellule eccitabili. La pompa del Na+ trasporta Na+ e K+ attraverso la membrana sia contro gradiente elettrico che chimico. Altri ioni, come il Ca2+, vengono attivamente espulsi dalle cellule con meccanismi di trasporto attivo. Alcuni xenobiotici attraversano le membrane solo grazie all'esistenza di un trasporto attivo. Esempio ne la secrezione di penicilline nei tubuli renali e nella bile. Molti xenobiotici lasciano il liquido cerebrospinale per immettersi nel torrente circolatorio grazie all'esistenza di sistemi di trasporto propri a cellule di speciali regioni del cervello. Il grado di specificit dei sistemi di trasporto suggerisce che essi sono molto probabilmente di natura proteica. stato infatti dimostrato che possono essere inibiti da xenobiotici che inibiscono la sintesi proteica o da composti che reagiscono con le proteine. Poich i trasportatori possiedono siti specifici con cui si combinano le sostanze che vengono trasportate, composti aventi configurazione chimica o carica ionica simile possono competere tra di loro per uno stesso trasportatore e l'uno pu inibire il trasporto dell'altro. Gli xenobiotici, oltre che competere tra di loro per uno stesso trasportatore, possono anche legarsi al trasportatore e bloccarlo, inibendo cos il trasferimento di substrati endogeni senza essere trasportati.

1.2.1.3.0.- Trasporto di grandi molecole

1.2.1.3.1.- Fagocitosi e Pinocitosi Quando la cellula ha la necessit di estrudere o includere grosse molecole o una quantit consistente di piccole molecole, mette in atto un sistema di trasporto diverso che risponda ai requisiti di facilit di gestione di ingombro nel primo caso e di velocit di passaggio da un compartimento all'altro, nel secondo caso. A seconda che la direzione del passaggio sia verso la cellula o verso l'esterno della stessa si parla rispettivamente di

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endocitosi e di esocitosi, fenomeni che hanno le stesse identiche basi biochimiche: le propriet autoaggreganti e autosigillanti del bilayer lipidico. L'endocitosi il processo che porta all'incameramento all'interno della cellula di una o pi sostanze. Essa comincia con l'invaginazione della membrana plasmatica in un punto particolare della superficie (spesso a livello delle cosiddette "fossette rivestite") che ha <<sentito>> la presenza della/e sostanza/e grazie ad un sistema di recettori-ligando. L'invaginazione procede fino al contatto fisico dei due poli opposti della membrana da cui il processo si innescato, con conseguente fusione, chiusura e distacco di una vescicola endocitotica portante all'interno il materiale. Se il processo interessa dei liquidi o dei soluti viene chiamato pinocitosi; se invece vengono incamerati detriti o microorganismi, si parla di fagocitosi. In ogni caso all'interno della cellula avviene la fusione di pi vescicole tra loro e la risultante si fonde con i lisosomi primari, con formazione di lisosomi secondari in cui avviene di norma la digestione (in senso lato) del materiale fagocitato, pronto a questo punto ad essere variamente utilizzato. L'esocitosi invece il processo per cui avviene l'apertura verso l'esterno della cellula di vescicole (vacuoli) con conseguente perdita del contenuto degli stessi. Grazie a questa operazione la cellula inoltre pu implementare il corredo lipidico e proteico della membrana, portare all'incorporazione di nuove sostanze nella matrice extracellulare, far diffondere nei fluidi interstiziali e/o nel sangue nutrimento e/o messaggeri cellulari. Deve essere chiaro che i due processi non devono essere interpretati come l'uno opposto all'altro. Nel caso dell'endocitosi la membrana quella esterna ed in effetti il contenuto della vescicola non entra mai a contatto con il citoplasma, nemmeno quando esso fisicamente all'interno della cellula. I vacuoli di esocitosi invece provengono dall'apparato di Golgi (per gemmazione controllata) con proteine appositamente sintetizzate e incorporate nel reticolo endoplasmatico, che subiscono modificazioni e smistamento. Ci permette con tutta probabilit che endocitosi ed esocitosi abbiano una regolazione distinta.

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Fig.1.10 Processo di fagocitosi (inglobamento di solido) e di pinocitosi (inglobamento di liquido e/o sospensioni colloidali) Tra le caratteristiche che permettono di distinguere le membrane biologiche dalle membrane inerti vi la capacit di fagocitosi e di pinocitosi. Dal greco, fagocitosi indica ingestione cellulare, mentre pinocitosi indica che la cellula beve; in entrambi i casi, cio, la parola indicativa del meccanismo cellulare cui si riferisce. Nella fagocitosi, estroflessioni del protoplasma si muovono a incapsulare materiale solido (ad esempio batteri) che si trova all'esterno della cellula. I fagosomi che cos si formano affondano nel citoplasma dove si fondono con i lisosomi: le membrane si rompono e gli enzimi lisosomiali digeriscono le particelle inglobate nel fagosoma. Nella pinocitosi la membrana cellulare forma un canale di entrata in cui piccole particelle in soluzione colloidale o fluidi extracellulari fluiscono verso l'interno della cellula. L'invaginazione della membrana si chiude e si formano vescicole isolate che possono fondersi a formare globuli di dimensioni pi vaste. Con questi meccanismi, molecole di grosse dimensioni, altrimenti incapaci di attraversare le membrane, possono essere assunte dalle cellule per pinocitosi o per fagocitosi.

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1.2.1.4.0.- Processi di trasporto di metalli Riportiamo, nella figura che segue, i quattro processi di trasporto prevalenti attraverso la membrana citoplasmatica dei metalli: 1. Processi di trasporto carrier-mediated. Sono quelli in cui alcune proteine (L) formano, con il metallo, un complesso solubile nei lipidi, ML; il complesso diffonde entro la membrana, ed il metallo pu essere rilasciato nel citosol (il contenuto acquoso della cellula vivente). La maggior parte dei metalli entra nella cellula attraverso questo percorso. 2. Processi di trasporto attraverso i canali proteici. Ioni del metallo possono essere trasportati fra le proteine che si estende attraverso la membrana e che presentano molti gruppi idrofilici. 3. Processi di trasporto per diffusione passiva. Specie del metallo che sono solubili nei lipidi (non polari) si possono dissolvere nella membrana e rapidamente attraversarla. Questo processo invocato spesso spiegare luptake rapido di metalli-alchili da organismi unicellulari. 4. Processi di trasporto per endocitosi.

Fig. 1.11 Processi di trasporto dei metalli attraverso la membrana

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1.2.3.0.0.- La ricezione dinformazioni o stimoli trasmessi dall'ambiente extracellulare Le membrane biologiche possono avere dei siti atti a recepire dei messaggi, delle informazioni provenienti dall'ambiente esterno. Questi siti sono particolari strutture chimiche, dette recettori atte a trasmettere all'interno della cellula i messaggi di ormoni, di neurotrasmettitori, di autacoidi presenti nell'ambiente extracellulare. Gli xenobiotici possono interferire nella trasmissione di messaggi fisiologici a livello di questi specifici siti recettoriali.) La conduzione dell'impulso nervoso un fenomeno strettamente legato alle membrane. Esso per si realizza soltanto nelle membrane di cellule eccitabili: nervosa o muscolare. A questo punto appare chiaro che le membrane biologiche, lungi dall'essere delle barriere rigide, statiche, immutabili nel tempo, assolvono invece svariati ed importanti compiti. Questi possono essere caratteristici per ogni tipo di cellula e possono variare per il sopraggiungere di influenze esterne (arrivo di ormoni, di neurotrasmettitori, gli xenobiotici) o comunque per il mutare delle condizioni ambientali. importante allora conoscere le propriet strutturali delle membrane dal punto di vista fisiologico, patologico e farmacologico. Sotto l'aspetto farmacologico, la comprensione dei fenomeni di membrana pu aiutare a rendere pi efficiente o pi selettivo l'assorbimento degli xenobiotici (i quali, prima di giungere alla loro sede d'azione, devono superare un gran numero di barriere, rappresentate appunto da membrane biologiche) oppure a ritardarne l'escrezione (a livello renale) cos da prolungarne la durata d'azione. La superficie esterna della cellula possiede una netta carica negativa (da non confondersi con la differenza di potenziale tra i due lati della membrana) che dovuta largamente alla presenza di residui di acido sialico delle glicoproteine. Tale acido sembra implicato in un numero importante di funzioni cellulari. La porzione glucidica della membrana (la parte esterna della membrana ricca in glicolipidi e glicoproteine) probabilmente importante nel conferire propriet antigeniche alla superficie cellulare stessa. Gli ioni Ca2+, infine, si legano alla membrana e giocano un ruolo determinante nel controllare la permeabilit della membrana e nell'aumentarne la resistenza meccanica favorendo, probabilmente, legami crociati nella parte proteica della membrana esterna. Tale ione forma inoltre legami con l'acido sialico e con i componenti fosfolipidici delle membrane, cosicch i complessi che ne derivano sembrano controllare la permeabilit della membrana ad altri ioni. In generale, minore la quota di Ca2+ legato alla membrana, maggiore la permeabilit della membrana agli altri ioni. Ci sono dati abbastanza significativi che dimostrano come, laddove le cellule sono in contatto tra di loro, vi sia un minor contenuto di Ca2+ legato alla membrana.

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Questa zona di aumentata permeabilit ionica crea aree di bassa resistenza che facilitano la comunicazione tra le cellule, comunicazione resa possibile dalla fluidit della componente lipidica della membrana. A conclusione di quanto detto risulta evidente che i rapporti chimico-fisici e spaziali tra le due componenti fondamentali delle membrane, fosfolipidi e proteine, sono non solo importanti per il normale espletamento di tutte le funzioni delle membrane biologiche, ma sono anche sensibili ad agenti esterni, siano essi ormoni, chemiotrasmettitori, tossine, antigeni o xenobiotici, capaci tutti di modificare l'ordinamento strutturale del mosaico fluido comunicando cos determinate informazioni alle cellule. La fluidit della membrana, e in particolare la libert di movimento delle proteine in seno al doppio foglietto lipidico, una sorta di organo di senso delle cellule, le quali recepiscono cos il linguaggio delle membrane. Ci permette alle membrane di svolgere un ruolo essenziale in quasi tutte le principali funzioni cellulari.

1.2.4.0.0.- Propriet chimico-fisiche degli xenobiotici e loro influenza sul passaggio attraverso le membrane Quanto finora esposto rappresenta una panoramica dei possibili meccanismi atti a consentire il trasferimento degli xenobiotici da una parte all'altra delle membrane cellulari. Resta tuttavia da sottolineare, come gi accennato in precedenza, che tale trasferimento condizionato dalle caratteristiche chimiche, strutturali e funzionali delle membrane (di cui abbiamo ampiamente discusso), ma anche determinato dalle propriet chimico-fisiche gli xenobiotici. Vediamo ora in quale modo tali propriet ne condizionano il passaggio attraverso le membrane biologiche. In generale, molti xenobiotici hanno molecole troppo ingombranti per poter passare attraverso i pori, i canali esistenti nelle membrane, e quindi essi devono pertanto superare la barriera costituita dalle membrane per diffusione attraverso la componente lipidica della membrana stessa. Nella grande maggioranza gli xenobiotici elettroliti deboli sono o acidi deboli o basi deboli, presenti in soluzione sia nella forma dissociata che in quella indissociata. Spesso al pH dei liquidi biologici sono solo parzialmente dissociati. La quota indissociata in genere liposolubile e soltanto questa pu attraversare le membrane biologiche per semplice diffusione attraverso i lipidi di membrana. Di contro, la frazione dissociata di solito incapace di penetrare la barriera lipidica a causa della sua bassa solubilit nei lipidi. Nel caso che la parte ionizzata di un elettrolita debole possa passare attraverso i canali di membrana, si distribuir dai due lati della membrana stessa in accordo al potenziale di transmembrana, esattamente come uno ione inorganico ed in accordo al gradiente di concentrazione

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La distribuzione di un elettrolita debole comunque determinata dal suo pKa e dal gradiente di pH attraverso la membrana. Dal momento che solo la forma indissociata della sostanza , come gi detto, liposolubile e lipodiffusibile, la capacit di un xenobiotico ad attraversare la membrana pi o meno rapidamente dipender in stretta misura dalla sua tendenza a ionizzarsi in soluzione acquosa ad un determinato pH. Questa capacit, cio il grado di ionizzazione di un composto ad un determinato pH, indicato dal pKa.

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