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CICLO DI KREBS E

FOSFORILAZIONE
OSSIDATIVA

E IL METABOLISMO DEL MUSCOLO


LEZIONE 8: CICLO DI KREBS E FOSFORILAZIONE OSSIDATIVA
Il complesso piruvato deidrogenasi
mitocondriale consente l’ingresso del piruvato
nel ciclo di Krebs

(2C)
(3C)
-8 kcal/mol
Reazione fortemente esoergonica, praticamente irreversibile in vivo
decarbossilazione

ossidazione

transesterificazione

Ripristino del FADH2


e NADH + H+
Il coenzima A (CoA-SH)
gruppo tiolico reattivo

-mercaptoetilammina Acido pantotenico


(derivato della cisteina) (vitamina B5)

A= acile
Ciclo di Krebs e fosforilazione ossidativa
(respirazione cellulare) avvengono nei mitocondri
La respirazione cellulare

• Sono i processi molecolari in cui è coinvolto


il consumo di O2 e la formazione di CO2 e
H2O da parte della cellula.

• E’ suddivisa in 3 fasi:
• Fase 1: Produzione di acetil-CoA da parte di
aminoacidi, acidi grassi e carboidrati
• Fase 2: Ossidazione dell’acetil-CoA (Ciclo
di Krebs)
• Fase 3: Trasferimento degli elettroni e
fosforilazione ossidativa (Catena
respiratoria)
Respirazione cellulare

8 elettroni Eletroni riducono ATP e’ sintetizzata


dall’ acetilCoA O2 e generano un Dal gradiente
gradiente protonico protonico
Dunque, la respirazione cellulare ha luogo in 3 fasi:

-nella prima fase, le molecole delle sostanze


nutrienti organiche (glucosio, acidi grassi, alcuni
amminoacidi) sono ossidate sino alla formazione dei
complessi a 2 atomi di carbonio, vale a dire il gruppo
acetilico dell’Acetil-CoA;

- nella seconda fase, tali gruppi acetilici entrano nel


ciclo dell’acido citrico, che provvede a ossidarli per via
enzimatica a CO2. In questo processo, l’energia
rilasciata dall’ossidazione viene conservata mediante
la riduzione contemporanea di due trasportatori di
elettroni, NAD+ e FAD, che divengono NADH + H+ e
FADH2;
- nella terza fase, i cofattori ridotti sono ossidati a
loro volta liberando protoni H+ ed elettroni. Gli
elettroni vengono trasferiti attraverso la catena
respiratoria sino all’ossigeno, che si riduce
formando acqua. Durante questo processo viene
rilasciata una notevole quantità di energia,
trasformata in ATP per mezzo della fosforilazione
ossidativa.
Mitocondri

Sono presenti in tutte le cellule procariote, > 2000


per ogni cellula, le cellule muscolari ne
contengono molti di più
Anatomia biochimica di un mitocondrio
Membrana esterna
permeabile a piccole molecole e ioni Matrice
Contiene:
Membrana interna
•Il complesso della piruvato deidrogenasi
impermeabile alla maggior parte delle
piccole molecole e degli ioni, copresi i •gli enzimi del ciclo dell’acido citrico
protoni. •gli enzimi della b ossidazione degli acidi
Contiene: grassi
•la catena respiratoria (complessi I-IV) •gli enzimi dell’ossidazione degli
amminoacidi
•l’ATP-ADP translocasi
•DNA, ribosomi
•l’ATP sintasi (F0F1)
•molti altri enzimi
•altri trasportatori di membrana
•ATP, ADP, Pi, Mg2+, Ca2+, K+

Canali di porina
ATP sintasi
(F0F1)

Ribosomi
Creste
Ciclo di Krebs, o dell'acido citrico, o
degli acidi tricarbossilici
• E’ la via metabolica finale dove convergono il metabolismo ossidativo dei carboidrati,
degli amminoacidi e degli acidi grassi
• E’ una via aerobica (richiede la presenza dell’ ossigeno come accettore finale di elettroni)

• Avviene interamente nei mitocondri

• In questo processo gli scheletri carboniosi delle sostanze nutrienti sono convertiti a CO2 e
H2O

• Questa ossidazione fornisce l’energia necessaria alla produzione di ATP


• Processo ossidativo centrale della respirazione attraverso cui tutti i combustibili
metabolici sono catabolizzati nei tessuti

• E’ localizzato nei mitocondri


• E’ costituito da 8 tappe
• Si possono distinguere due fasi:
- ossidazione di 2 atomi di C a CO2 (dalla reazione 1 alla 4)
- rigenerazione dell’ossalacetato (dalla reazione 5 alla 8)

• 3 tappe sono irreversibili:


- Formazione del citrato
- Ossidazione dell’isocitrato
- Ossidazione dell’α-chetoglutarato
Sono tappe fortemente esoergoniche

• E’ una via anfibolica: entra sia nei processi anabolici sia in quelli catabolici
Ruolo centrale del ciclo dell’acido
citrico nel metabolismo
Input: unita’ bicarboniosa
Output: 2 CO2, 1 GTP,
& 8 elettroni
• Un gruppo acetilico, sotto
forma di acetil-CoA (2
atomi di C), è introdotto nel
ciclo, combinandosi con
l’ossalacetato.

• 2 atomi di C escono dal


ciclo sotto forma di CO2 a
livello dell’ossidazione
dell’isocitrato e dell’α-
chetoglutarato.

• Alla fine del ciclo si


rigenera ossalacetato.
Reazioni del ciclo di Krebs: 1. Formazione del
fase ossidativa citrato
Enzima: citrato
sintasi.
La reazione è
fortemente
esoergonica.
o

2. Formazione
dell’isocitrato
attraverso il
cis-aconitato.
Enzima: aconitasi.
La reazione è
reversibile
Ciclo dell’acido citrico Gli enzimi del ciclo

La CITRATO SINTASI
catalizza la condensazione di acetil-CoA e
Ossalato
Sintasi (liasi)=condensazione senza uso di ATP
Sintetasi (ligasi)=condensazione con uso di ATP

-SH

+ H+

Condensazione Idrolisi
Reazioni del ciclo di 1. Formazione del
Krebs: fase ossidativa citrato
Enzima: citrato
sintasi.
La reazione è
fortemente
esoergonica.
o

2. Formazione
dell’isocitrato
attraverso il
cis-aconitato.
Enzima: aconitasi.
La reazione è
reversibile
Ciclo dell’acido citrico Gli enzimi del ciclo

H2O
to
L’ACONITASI
i ta proteina con un centro ferro-zolfo (4Fe-4S) che catalizza
on
- ac
ci
s
H2O l’isomerizzazione reversibile del citrato e dell’isocitrato
con la formazione dell’intermedio cis-aconitato che non si
dissocia dall’enzima. Per essere ossidato a gruppo carbonilico
l’ossidrile alcoolico terziario deve essere
trasformato (trasferito) in gruppo alcoolico secondario.

Deidratazione Idratazione
La reazione viene spinta verso l’isocitrato dal consumo di questo nella tappa
successiva
3. Ossidazione
dell’isocitrato ad
α-chetoglutarato
e CO2.
Enzima: isocitrato
deidrogenasi

4. Ossidazione dell’α-chetoglutarato a succinil-CoA e CO2.


Enzima: complesso dell’α-chetoglutarato deidrogenasi.
Sono reazioni essenzialmente irreversibili nella cellula. La
decarbossilazione ossidativa determina la liberazione di CO2 e
la riduzione di NAD+ a NADH.
Ciclo dell’acido citrico Gli enzimi del ciclo

La ISOCITRATO DEIDROGENASI
NAD+-dipendente e Mg++ o Mn++, catalizza la decarbossilazione
ossidativa dell’isocitrato ad -chetoglutarato. Questa reazione
produce la prima molecola di CO2 e di NADH del ciclo.
L’ossalosuccinato rimane legato all’enzima.

-decarbossilazione che elimina dal -chetoacido il


gruppo carbossilico come CO2

G°’= -20,9 kJ/mole


3. Ossidazione
dell’isocitrato ad
α-chetoglutarato
e CO2.
Enzima: isocitrato
deidrogenasi

4. Ossidazione dell’α-chetoglutarato a succinil-CoA e CO2.


Enzima: complesso dell’α-chetoglutarato deidrogenasi.
Sono reazioni essenzialmente irreversibili nella cellula. La
decarbossilazione ossidativa determina la liberazione di CO2 e
la riduzione di NAD+ a NADH.
Ciclo dell’acido citrico Gli enzimi del ciclo

La a-CHETOGLUTARATO DEIDROGENASI
catalizza la decarbossilazione ossidativa del
a-chetoglutarato. Questa reazione produce la seconda
molecola di CO2 e di NADH del ciclo.

E’ un complesso enzimatico, molto simile a quello della piruvato


deidrogenasi, sia come struttura che come funzione.

-chetoglutarato + NAD+ + CoA-SH  succinil-CoA + CO2 + NADH + H+

G°’= -33,5 Kj/mole

L’equilibrio della reazione è fortemente spostato verso la formazione del succinil CoA, un
tioestere ad alta energia (come visto per l’ acetilCoA)
Fase rigenerativa
5. Conversione del succinil-CoA
a succinato
Enzima: succinil-CoA sintetasi
L’energia rilasciata dalla rottura
del tioestere viene utilizzata per la sintesi
di GTP, che può donare il suo gruppo
fosforico a ADP per formare ATP,
reazione catalizzata
dalla nucleoside difosfato chinasi
Ciclo dell’acido citrico Gli enzimi del ciclo

La SUCCINIL-CoA SINTETASI
accoppia la scissione del legame ad alta energia del
succinil-CoA alla sintesi di un nucleotide trifosfato.
Il nome dell’enzima si riferisce alla reazione inversa.
Nei mammiferi GTP, nei batteri e nelle piante ATP
Fase rigenerativa

6. Ossidazione del succinato a


fumarato
Enzima: succinato deidrogenasi (legata
alla membrana).
Gli elettroni passano dal FAD alla catena
di trasporto degli elettroni della
membrana mitocondriale interna.
7. Idratazione del fumarato
per produrre malato
Enzima: fumarasi
L’enzima è altamente specifico e
reagisce solo con il fumarato e non
il suo isomero trans, il maleato.

8. Ossidazione del malato ad


ossalacetato.
Enzima: malato deidrogenasi
Una molecola di NAD+ viene
ridotta a NADH. Nonostante il
ΔG della reazione sia positivo,
l’equilibrio è spostato verso i
prodotti grazie alla continua
rimozione dell’ossalacetato.
Bilancio energetico del ciclo di Krebs
• Nel ciclo di Krebs, l’energia
rilasciata dall’ossidazione di una
molecola di acetil-CoA viene
conservata riducendo
contemporaneamente i trasportatori
di elettroni NAD e FAD
rispettivamente a NADH e FADH2
e producendo una molecola di ATP
• → rendimento totale di una
molecola di Acetil-CoA= 3NADH +
FADH2 + GTP = 10 ATP

CH3CO-CoA + 3H2O + 3NAD+ + GDP + FAD + Pi →


2CO2 + CoASH+ 3NADH + 3H+ + GTP + FADH2
Ossidazione di una molecola di glucosio
• Il rendimento del processo di ossidazione di una molecola di glucosio e`
del 40% rispetto alla quantità di energia ricavabile dall’ossidazione
completa di una molecola di glucosio (1160kj su 2840kj per mole di
glucosio).
• Il rimanente 60% è utilizzato per la produzione di calore corporeo e per
far si’ che la reazione proceda nel senso indicato.

Bilancio netto in ATP:


• Glicolisi: 4ATP+ 2NADH (2.5x2 ATP)-2ATP= 7
• Piruvato acetil-CoA: 2NADH (2.5 x 2)= 5
• Ciclo di Krebs: 6NADH (2.5x6) + 2 FADH2 (1.5 x 2) +2 GTP= 20 ATP

Totale= 32 ATP
Componenti del ciclo di krebs
• Il ciclo di Krebs è il
cuore del metabolismo
intermedio.

• E’ una via anfibolica:

• Catabolismo dei
carboidrati, degli acidi
grassi e degli aminoacidi

• Gli intermedi sono


precursori per molte vie
anaboliche.

• I composti utilizzati
sono rimpiazzati
mediante reazioni
anaplerotiche.
(es. Carbossilazione del
piruvato tramite CO2 per
formare ossalacetato,
catalizzata dalla
piruvato carbossilasi).
Regolazione del ciclo di Krebs
Fattori che regolano la velocità del
ciclo:

• disponibilità di substrato
• inibizione da accumulo di prodotti
• inibizione allosterica retroattiva (a
feedback) dei primi enzimi del ciclo
da parte degli ultimi intermedi
Regolazione del ciclo di Krebs
Tre tappe fortemente
esoergoniche catalizzate da:
• Citrato sintasi
• Isocitrato deidrognasi
• α-chetoglutarato deidrogenasi

• NADH: ↓ le deidrogenasi
• Accumulo di prodotti: ↓ delle
tre reazioni
• ATP: ↓ citrato sintasi e
isocitrato deidrogenasi
• ADP: ↑ citrato sintasi
• Ca2+: ↑ isocitrato e α-
chetoglutarato deidrogenasi
La respirazione cellulare
• Fase 1: Produzione di
acetil-CoA da parte di
aminoacidi, acidi grassi
e carboidrati
• Fase 2: Ossidazione
dell’acetil-CoA (Ciclo di
Krebs)
• Fase 3: Trasferimento
degli elettroni (Catena
respiratoria) e
fosforilazione
ossidativa
La Fosforilazione Ossidativa
• E’ la sintesi di ATP guidata dal
trasferimento di elettroni
all’ossigeno.
• Determina la riduzione
dell’ossigeno molecolare ad
acqua.
• Gli elettroni sono forniti da
NADH e FADH2 (sotto forma di
ioni idruro H-).
• Avviene nei mitocondri
Il flusso elettronico
mitocondrile
• La membrana mitocondriale
esterna è permeabile a
piccole molecole e ioni grazie
alla presenza di numerosi
canali costituiti dalla
proteina porina.
• La membrana mitocondriale
interna è impermeabile a
quasi tutti gli ioni e piccole
molecole compresi i protoni;
le specie chimiche che
possiedono uno specifico
trasportatore sono in grado
di attraversare la membrana.
• In questa struttura sono
localizzati la CATENA
RESPIRATORIA e IL
COMPLESSO ENZIMATICO
CHE SINTETIZZA ATP
La Teoria Chemiosmotica di P. Mitchell (1961):
Trasduzione di energia
attraverso gradienti protonici transmembrana
• La fosforilazione ossidativa è un flusso di elettroni attraverso
intermedi proteici redox, trasportatori legati alla membrana
mitocondriale che comprendono chinoni, citocromi e proteine
ferro-zolfo.

• L’energia libera resa disponibile da questo flusso esoergonico di


elettroni è accoppiata al trasporto endoergonico di protoni (H+)
attraverso una membrana impermeabile ai protoni (la membrana
mitocondriale interna); questo trasporto crea un potenziale
elettrochimico (forza motrice protonica, differenza di
concentrazione di protoni e di carica).

• Il flusso transmembrana di protoni in senso inverso, mediato da


specifici canali protonici, fornisce l’energia libera per la sintesi di
ATP.
Teoria chemiosmotica
La catena respiratoria
• Gli elettroni sono incanalati in trasportatori di elettroni
universali (NADH) che interagiscono con la catena
respiratoria.
• La catena respiratoria è costituita da una serie di
trasportatori di elettroni, la maggior parte dei quali sono
proteine integrali di membrana contenenti gruppi
prostetici in grado di accettare e di donare uno o due
elettroni.

•Ogni componente della catena


può accettare elettroni dal
trasportatore che lo precede e
trasferirli a quello che lo segue,
generando una sequenza
specifica.

NADH + H+ + ½O2 →H2O + NAD+


Trasportatori di elettroni della
catena respiratoria
• NAD
• FAD/FMN
• Ubichinone (coenzima Q): è una moleocola di piccole
dimensioni, lipofila, che diffonde liberamente
attraverso la membrana e può agire da ponte tra
trasportatori di elettroni meno mobili.
• Citocromi: sono proteine contenenti ferro che
trasferiscono gli elettroni localizzati nella membrana
interna. L’atomo di ferro è localizzato nel gruppo
eme.
• Proteine ferro-zolfo: il ferro è associato ad atomi di
zolfo di residui di cisteina della proteina;
trasferiscono un elettrone per volta
Trasferimento di elettroni
• Nella catena respiratoria i trasportatori sono organizzati in 4
complessi e gli elettroni sono trasferiti da un complesso all’altro.
• Complesso I (NADH deidrogenasi): dal NADH all’ubichinone→ gli
elettroni vengono ceduti dal NADH al gruppo FMN e poi ai centri Fe-
S del complesso I che li trasferisce all’ubichinone, determinando uno
spostamento di protoni dalla matrice allo spazio intermembrana.
• Complesso II (succinato deidrogenasi): dal succinato all’ubichinone →
gli elettroni vengono trasferiti dal succinato all’ubichinone dalla
succinato deidrogenasi, l’unico enzima del ciclo di Krebs legato alla
membrana mitocondriale.
• Complesso III : da ubichinone a citocromo c→
l’ubichinone-citocromo c ossidoreduttasi catalizza
il trasferimento di elettroni dall’ubichinone al
citocromo c rilasciando protoni nello spazio
intermembrana.

 Complesso IV: riduzione


dell’O2→ il complesso
enzimatico della
citocromo ossidasi
trasferisce elettroni dal
citocromo c all’O2 che
viene ridotto ad acqua e
contemporaneamente
pompa protoni nello
spazio intermembrana.
Sintesi di ATP: fosforilazione di ADP
• Il trasferimento di elettroni
lungo la catena respiratoria è
accompagnato da un pompaggio
di protoni attraverso la
membrana mitocondriale
interna che porta ad una
differenza di concentrazione
di protoni.
 Il gradiente elettrochimico (forza motrice
protonica) generato rappresenta la
conservazione di parte dell’energia liberata
dalle ossidazioni. La forza motrice protonica
viene utilizzata per la sintesi di ATP
catalizzata dall’ATP sintasi.
ATP sintasi
• L’ATP sintasi è un
complesso enzimatico
formato da due componenti
principali, la porzione di
membrana F0 e l’unità F1
che sintetizza ATP ed è
costituita da varie
subunità. Le due unità
formano il canale
attraverso cui si genera il
flusso di protoni dallo
spazio intermembrana alla
matrice mitocondriale.
Meccanismo di sintesi dell’ATP
• Nell’unità F1 l’enzima possiede tre siti di legame dei nucleotidi
adeninici tra loro equivalenti.
• In un dato momento uno dei tre siti è nella conformazione T
(legame forte), un altro è nella conformazione L (legame debole) e
il terzo è nella conformazione O (aperto o vuoto, legame molto
debole).
• All’inizio di un ciclo catalitico una molecola di ATP è legata al sito T
mentre il sito L lega ADP + Pi.
• La forza motrice protonica, passando attraverso il canale,
determina emissione di energia che altera la conformazione: il sito
T si converte nel sito O con dissociazione di ATP e il sito L in T
dove ADP e Pi si convertono in ATP.
• Il sito O diventa sito L e lega anche se debolmente ADP e Pi.
• Il ciclo ricomincia con il canale ruotato di una subunità.
• L’ATP non può essere rilasciato da un sito se ad un altro sito non vi
sono legati ADP + Pi.
Regolazione della
fosforilazione ossidativa
• La velocità della fosforilazione ossidativa è
regolata dal rapporto [ATP]/[ADP].
• Questo rapporto è normalmente molto elevato;
quando all’interno della cellula la velocità di
qualche processo, che richiede energia e che
quindi consuma elevate quantità di ATP, tende ad
aumentare, il rapporto diminuisce per un aumento
della concentrazione di ADP.
• Avendo a disposizione più ADP la velocità della
fosforilazione ossidativa aumenta, determinando
la rigenerazione di ATP.
La produzione di calore
• I mitocondri del grasso bruno (presente nel neonato
e nei mammiferi che vanno in letargo) utilizzano ATP
per produrre calore.
• La membrana interna di questi mitocondri contiene
una proteina chiamata termogenina o proteina
disaccoppiante. Questa proteina genera una via di
ritorno dei protoni nella matrice senza dover
attraversare l’ATP sintasi.
• Per effetto di questo cortocircuito, l’energia
prodotta dalle ossidazione non viene conservata
sotto forma di ATP ma dissipata come calore, che
contribuisce a mantenere la temperatura del corpo.
E IL METABOLISMO DEL MUSCOLO
LEZIONE 8: CICLO DI KREBS E FOSFORILAZIONE OSSIDATIVA