Ciclo dell’acido citrico

Il ciclo dell’acido citrico (detto anche ciclo di Krebs o ciclo degli acidi tricarbossilici) è una via
metabolica di importanza fondamentale per tutte le cellule. Negli organismi aerobici, il ciclo
dell’acido citrico collega le vie cataboliche dei carboidrati, dei grassi e delle proteine. Il ciclo
dell’acido citrico inizia con la molecola di acetil coenzima A (acetil-CoA), la forma attivata
dell’acetato.

L’acetil-CoA deriva da: ossidazione degli acidi grassi, ossidazione di alcuni amminoacidi,
decarbossilazione ossidativa del piruvato.

In condizioni aerobiche il piruvato che si forma nella demolizione glicolitica del glucosio non viene
ridotto a lattato, etanolo o qualche altro prodotto della fermentazione, come avviene in condizioni
anaerobiche, ma viene invece ossidato a CO2 e H2O. Questa fase aerobica del catabolismo è detta
“respirazione cellulare”. La respirazione cellulare si svolge in tre fasi: • Nella prima fase, le
molecole organiche, quindi glucosio, acidi grassi e qualche amminoacido, vengono ossidate ad
acetil-CoA; • Nella seconda fase, questi gruppi acetilici sono immessi nel ciclo dell’acido citrico, in
cui vengono ossidati enzimaticamente a CO2. L’energia rilasciata dall’ossidazione viene conservata
riducendo i trasportatori di elettroni NAD+ e FAD rispettivamente a NADH e FADH2; • Nella terza
fase della respirazione i cofattori ridotti sono a loro volta ossidati liberando protoni ed elettroni
(H+). Gli elettroni sono trasferiti lungo una catena di molecole di trasportatori di elettroni, nota
come “catena respiratoria”, all’ossigeno che si riduce formando acqua. Durante questo processo di
trasferimento degli elettroni viene rilasciata molta energia, che è poi convertita in ATP in un
processo chiamato “fosforilazione ossidativa”. Fase 1: Produzione di acetil-CoA Negli organismi
aerobici il glucosio e gli altri zuccheri, gli acidi grassi e la maggior parte degli amminoacidi sono
ossidati a CO2 e H2O attraverso il ciclo dell’acido citrico e la catena respiratoria. Prima di poter
entrare nel ciclo, lo scheletro carbonioso degli zuccheri e degli acidi grassi deve essere degradato a
gruppo acetilico dell’acetil-CoA. Il piruvato prodotto dalla glicolisi viene ossidato in acetil-CoA e
anidride carbonica ad opera del “complesso della piruvato deidrogenasi”, un insieme organizzato di
tre enzimi (rappresentati in più copie), localizzato neimitocondri delle cellule eucariotiche e nel
citosol delle cellule procariotiche. La reazione totale catalizzata dal complesso della piruvato
deidrogenasi è una decarbossilazione ossidativa in cui ilgruppo carbossilico è rimosso dal piruvato
sotto forma di una molecoladi CO2 e i due atomi di carbonio rimanenti diventano il gruppo
acetilico dell’acetil-CoA. Il NADH formato in questa reazione fornisce uno ione idruro, con i suoi
due elettroni, alla catena respiratoria, che li trasporta poi all’ossigeno. Il trasferimento degli elettroni
all’ossigeno produce 2,5 molecole di ATP per coppia di elettroni. L’irreversibilità della reazione
della piruvato deidrogenasi è stata dimostrata anche con esperimenti di marcatura isotopica: la CO2
marcata non può più riattaccarsi all’acetil-CoA per formare piruvato con il gruppo carbossilico
marcato.

Questa reazione richiede l’azione sequenziale di tre enzimi diversi e di cinque coenzimi o gruppi
prostetici: tiamina pirofosfato (TPP), FAD, coenzima A, NAD e lipoato. I l complesso della
piruvato deidrogenasi (PDH) è costituito da tre enzimi diversi: • La piruvato deidrogenasi (E1); • La
diidrolipoil transacetilasi (E2); • La diidrolipoil deidrogenasi (E3).

Il complesso della piruvato deidrogenasi è costituito da tre diverse attività enzimatiche (Figura 3):

 piruvato deidrogenasi (E1), il cui coenzima è la tiamina pirofosfato (TPP);  diidrolipoil

transacetilasi (E2), il cui coenzima è l’acido lipoico;  diidrolipoil deidrogenasi (E3), il cui
coenzima è il FAD.
Per la reazione complessiva sono necessari altri due coenzimi:

 coenzima A, come substrato di E2;  NAD+, come substrato di E3.

E2 è la porzione più complessa in quanto punto di inserzione del gruppo prostetico lipoato ed è
dotata di tre distinti domini funzionali: il dominio lipoile, il dominio aciltrasferasi che contiene il
sito attivo, e il dominio centrale legante E1 ed E3. Il sito attivo di E1 invece contiene la TPP,
mentre quello di E3 ha legato a sé il FAD.

Le vitamine coinvolte in questa reazione sono:

 Tiamina per la TPP.  Riboflavina per il FAD.  Niacina per il NAD.  Pantotenato per il
coenzima A.

L’acido lipoico può essere presente in forma ossidata o in forma ridotta. Nei mammiferi sono
presenti anche due proteine regolatrici, una proteina chinasi e una fosfoproteina fosfatasi. La
decarbossilazione del piruvato comprende essenzialmente 5 tappe:

• Nella prima tappa il piruvato viene decarbossilato dalla piruvato deidrogenasi (E1) formando
idrossietil- TPP (tiamina pirofosfato) mentre la CO2 si libera come primo prodotto (questa tappa è
la più lenta quindi è quella che limita la velocità dell’intero processo); • Nella seconda tappa il
gruppo idrossietilico viene ossidato a gruppo carbossilico (acetato) e i due elettroni rimossi
riducono il ponte disolfuro (-S-S-) del lipoato sull’E2 formando due gruppi tiolici(SH); • Nella terza
tappa l’acetato prodotto nella reazione precedente viene prima esterificato a uno dei due gruppi
tiolici e poi transesterificato al CoA, formando acetil-CoA; • Nella quarta tappa la diidrolipoil
deidrogenasi (E3) catalizza il trasferimento di due atomi di idrogeno dal gruppo lipoilico ridotto di
E2 al suo gruppo prostetico FAD, ripristinando la forma ossidata dell’acido lipoico (il FAD si
riduce a FADH2); • Nella quinta reazione il FADH2 viene riossidato a FAD da una molecola di
NAD

+ che si riduce a NADH. Il complesso enzimatico è ora pronto per un altro ciclo.

Reazioni del ciclo dell’acido citrico

Il ciclo dell’acido citrico avviene nella matrice mitocondriale ed è costituito da 8 reazioni:

 1 condensazione, 2 decarbossilazioni, 4 ossidazioni, 1 fosforilazione.

In ogni giro del ciclo entra una molecola di acetil-CoA ed escono 2 molecole di CO 2. In ogni giro
del ciclo viene utilizzata una molecola di ossalacetato che alla fine del ciclo viene rigenerato. Di
conseguenza, non vi è consumo netto di ossalacetato. L’ossalacetato è presente nella cellula in basse
concentrazioni. Il ciclo dell’acido citrico comprende otto reazioni, dove quattro di queste sono
ossidazioni in cui l’energia è conservata sotto forma di coenzimi ridotti NADH e FADH 2. Per
estrarre completamente il potenziale energetico da combustibili come i carboidrati, i grassi e le
proteine, l’acetil-CoA deve poter essere ossidato completamente a CO2. L’ossidazione diretta
dell’acetil-CoA a CO2 non è, però, biochimicamente fattibile. La decarbossilazione di questo acido
a due atomi di carbonio formerebbe infatti CO 2 e CH4. Il metano è chimicamente stabile e, eccetto
il caso di alcuni batteri metanotrofi, gli organismi non hanno i cofattori e gli enzimi necessari a
ossidare il metano. Quindi, se l’acetil-CoA deve essere ossidato in modo efficiente, il gruppo
metilico dell’acetil-CoA deve restare legato a qualcosa. La prima tappa del ciclo dell’acido citrico
risolve il problema della scarsa reattività del gruppo metilico per mezzo della condensazione
dell’acetil-CoA con l’ossalacelato. Il carbonile dell’ossalacetato agisce da centro elettrofilico, che
viene poi attaccato dal carbonio metiico dell’acetil-CoA in una condensazione di Claisen per
formare il citrato. Nell’acido citrico, il gruppo metilico dell’acetato è stato convertito in un gruppo
etilenico. Questo acido tricarbossilico va quindi rapidamente in contro a una serie diossidazioni che
eliminano due atomi di carbonio sotto forma di CO 2. Come in tutte le vie metaboliche, esiste una
logica chimica anche nella sequenza delle tappe del ciclo dell’acido citrico: ciascuna reazione
coinvolge un’ossidazione necessaria per la conservazione dell’energia oppure una tappa preliminare
essenziale per innescare una successiva ossidazione, collocando i gruppi funzionali nella posizione
corretta per favorire l’ossidazione o la decarbossilazione ossidativa.

Reazione 1 La prima reazione del ciclo dell’acido citrico è la condensazione dell’acetil-CoA con
l’ossalacelato per formare citrato, reazione catalizzata dalla citrato sintasi. Il citril-CoA è un
intermedio transitorio che si forma sul sito attivo dell’enzima e va in contro ad una rapida idrolisi,
producendo CoA libero e citrato, che sono poi rilasciati dal sito attivo. L’idrolisi di questo
intermedio tioestere a elevata energia rende la reazione di scissione fortemente esoergonica. La
grande variazione di energia libera standard negativa della reazione catalizzata dalla citrato sintasi è
essenziale per il funzionamento del ciclo,

perché, la condensazione dell’ossalacelato normalmente è molto bassa. Il CoA liberato in questa

reazione viene riciclato e può partecipare alla decarbossilazione ossidativa di un’altra molecola di
piruvato da parte del complesso della piruvato deidrogenasi.

Reazione 2 Formazione dell’isocitrato attraverso il cis-aconitato

Nella seconda reazione l’enzima “aconitasi” catalizza la trasformazione reversibile del citrato in
“isocitrato”, mediante la formazione intermedia dell’acido tricarbossilico “cis-aconitato”.
L’aconitasi può aggiungere una molecola d’acqua al doppio legame dell’intermedio legato
all’enzima cis-aconitato, in due modi diversi; una via porta a citrato e l’altra a isocitrato:

L’aonitasi contiene un centro ferro-zolfo che agisce sia nel legame del substrato al sito attivo sia
nell’aggiunta o rimozione catalitica dell’acqua. Nelle cellule in cui la concentrazione di ferro è
bassa, l’aconitasi perde il suo centro ferro-zolfo, e acquisisce un ruolo nella regolazione
dell’omeostasi del ferro.

Reazione 3 Ossidazione dell’isocitrato ad α-chetoglutarato e COchetoglutarato e CO2

La terza reazione del ciclo è la decarbossilazione ossidativa dell’isocitrato per formare “alfa-
chetoglutarato” e CO2. La reazione è catalizzata dalla “isocitrato deidrogenasi” che ha come
coenzima il NAD +. Il NADH prodotto cede gli elettroni alla catena di trasporto degli elettroni.
Esistono due diverse forme di questo enzima nelle cellule, una che richiede appunto NAD+ come
accettore di elettroni e una che per lo stesso scopo richiede NADP+ : è questa l’unica differenza in
due reazioni altrimenti identiche. Probabilmente l’esistenza della forma NADP+ dipendente è legata
alla produzione di NADPH, essenziale nelle vie anaboliche riduttive della cellula.

Reazione 4: Ossidazione dell’α-chetoglutarato a succinil-CoA e CO2 La quarta reazione del

ciclo è la decarbossilazione ossidativa dell’ α -chetoglutarato per formare “succinil- CoA” e CO2.
La reazione è catalizzata dal complesso multienzimatico dell’”α-chetoglutarato deidrogenasi”, un
complesso molto simile per struttura e funzione al complesso della piruvato deidrogenasi.
L’accettore di elettroni in questa reazione è il NAD+, che cede gli elettroni alla catena di trasporto
degli elettroni, mentre il CoA è il trasportatore del gruppo succinile. L’energia di ossidazione del
reagente è conservata nella formazione del legame tioestere del succinil-CoA.

Reazione 5: Conversione del succinil-CoA a succinato La quinta reazione del ciclo è la

formazione del succinato: in questa reazione viene idrolizzato il legame tioestere del succinil-CoA.
Tale reazione è catalizzata dalla “succinil-CoA sintetasi”o succinico tiochinasi. L’energia rilasciata
dalla rottura del legame tioestere viene usata per favorire la sintesi di un legame fosfoanidride sotto
forma di GTP o ATP. In questa reazione che conserva energia vi è una fase intermedia in cui la
molecola dell’enzima diventa fosforilata a livello di un suo residuo di His presente nel sito attivo. Il
gruppo fosforico, viene quindi trasferito all’ADP o al GDP per formare rispettivamente ATP o
GTP. Le cellule animali hanno due isozimi, uno specifico per il GTP e uno specifico per l’ATP. La
formazione dell’ATP o GTP a spese dell’energia rilasciata dalla decarbossilazione ossidativa dell’α-
chetoglutarato è una fosforilazione a livello del substrato. Il GTP formato dalla succinil-CoA
sintetasi può donare il suo gruppo fosforico terminale all’ADP, per formare ATP, tramite una
reazione reversibile, catalizzata dalla nucleotide difosfato chinasi. Quindi il risultato netto
dell’attività di entrambi gli isozimi della succinil-CoA sintetasi è la conservazione dell’energia sotto
forma di ATP.

Reazione 6: Ossidazione del succinato a fumarato La sesta reazione del ciclo è l’ossidazione del
succinato a “fumarato”. La reazione è catalizzata dalla “succinato deidrogenasi”. L’enzima contiene
tre diversi centri ferro-zolfo e una molecola di FAD legata covalentemente. Gli elettroni del
succinato passano attraverso il FAD e i centri ferro-zolfo prima di entrare nella catena di trasporto
degli elettroni. Il flusso di elettroni dal succinato attraverso questi trasportatori fino all’accettore
finale, l’ossigeno, è accoppiato alla sintesi di 1,5 mol di ATP pmpetitivo della succinato
didrogenasier coppia di elettroni. Il malonato, analogo del succinato normalmente assente nelle
cellule, è un fattore competitivo della succinato deidrogenasi e quindi, se aggiunto ai mitocondri,
blocca il ciclo dell’acido citrico.

Reazione 7: Idratazione del fumarato a malato La settima reazione del ciclo è l’idratazione
reversibile del fumarato ad “L-malato”. La reazione è catalizzata dalla “fumarasi”.

Reazione 8: Ossidazione del malato a ossalacetato

L’ottava ed ultima reazione del ciclo è l’ossidazione di “L-malato” a “ossalacetato”. Tale reazione
catalizzata dalla “malato deidrogenasi”, il cui coenzima è il NAD+. Il NADH prodotto cede gli
elettroni alla catena di trasporto degli elettroni. Nelle condizioni termo dinamicamente standar
questo equilibrio è spostato verso sinistra. Nelle cellule, invece, l’ossalacetato viene rimosso
continuamente dalla reazione esoergonica della citrato sintasi, contribuendo a mantenere
estremamente bassa la concentrazione dell’ossalacetato e contemporaneamente spingendo la
reazione della malato deidrogenasi verso destra.

IL ciclo dell’acido citrico è terminato. L’ossalacetato, prodotto dell’ultima reazione, si condensa

con un’altra molecola di acetil CoA e il ciclo continua. Ogni giro del ciclo dell’acido citrico
produce:

 2 CO2  1 GTP → ATP  3 NADH  1 FADH2

Quando le due molecole di piruvato sono state completamente ossiadate a CO2 dalle reazioni del
complesso della piruvato deidrogenasi e del ciclo dell’acido citrico e gli elettroni sono trasferiti
all’O 2 dalla catena respiratoria, si ottengono tramite la fosforilazione ossidativa ben 32 molecole di
ATP per molecola di glucosio. La funzione del ciclo dell’acido citrico non è però esclusivamente
quella di ossidare l’acetato; questa via metabolica è il cuore del metabolismo intermedio. I prodotti
finali a quattro o a cinque atomi di carbonio di molti processi catabolici entrano nel ciclo e possono
servire da nutrienti come l’ossalacetato e l’α-chetoglutarato. In alcune situazioni, invece, dal ciclo
possono essere prelevati intermedi da usare come precursori in varie vie biosintetiche.

Regolazione ciclo di Krebs La prima regolazione del ciclo dell’acido citrico si ha a livello della
piruvato deidrogenasi (PDH), la quale è fortemente inibita dal suo prodotto diretto e dai prodotti del
ciclo: ATP, acetil-CoA e NADH; AMP, CoA e NAD+, che invece vengono accumulati quando vi è
scarsità di acetato, sono tutti attivatori allosterici della PDH. L’attività enzimatica del ciclo, quindi,
viene spenta quando sono disponibili grandi quantità di acidi grassi o di acetil-CoA e quando i
rapporti [ATP]/[ADP] e [NADH]/[NAD] sono elevati nella cellula, mentre viene attivata
allostericamente quando questi rapporti diminuiscono. Il ciclo dell’acido citrico è regolato anche a
livello delle sue tre tappe esoergoniche: quelle catalizzate dalla citrato sintasi, dall’isocitrato
deidrogenasi e dall’α-chetoglutarato deidrogenasi. In tutti i casi l’inibizione è data dai prodotti del
ciclo: il succinil-CoA inibisce l’a-chetoglutarato deidrogenasi, il citrato blocca la citrato sintasi e
l’ATP inibisce sia la citrato sintasi, sia l’isocitrato deidrogenasi. L’attivazione del ciclo, invece, è
data dall’ADP e dal Ca2+: l’inibizione della citrato sintasi da parte dell’ATP viene infatti eliminata
dall’ADP, un attivatore allosterico di questo enzima; gli ioni Ca2+, invece, attivano sia l’isocitrato
deidrogenasi sia l’a-chetoglutarato deidrogenasi, oltre al complesso della piruvato deidrogenasi.