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ECCITABILITÀ - FISIOLOGIA !

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ECCITABILITÀ

L ʼ eccitabilità è la capacità posseduta da alcune cellule di far variare il potenziale elettrico di membrana, pertanto le cellule non eccitabili hanno un potenziale di membrana costante. L ʼ eccitabilità è espressa nelle fibre muscolari attraverso un potenziale d ʼ azione che vede la contrazione delle fibre, mentre nelle cellule nervose vi è un potenziale elettrico che si traduce con il trasferimento di informazioni. La membrana cellulare è capace di separare le particelle ioniche, funzionando come un condensatore; normalmente in una soluzione acquosa il numero delle particelle positive è esattamente compensato da quello delle cariche negative sicché la quantità di carica si annulla. Un eccesso non compensato di cariche positive darà origine a una regione di potenziale elettrico elevato (alto voltaggio), respingendo così le cariche positive e attraendo le negative. Ovviamente con un eccesso di carica negative l ʼ effetto sarà opposto. Sebbene la carica depositata sulla membrana sia irrisoria* 1 , essa può agire come forza spingente per ioni. Per convenzione mondiale, il potenziale di membrana è calcolato come la differenza tra le cariche presenti in ambiente citosolico e quelle in ambiente esterno, pertanto il risultato è sempre un valore negativo. Per quanto riguarda i neuroni, il valore del potenziale di membrana può essere -60, -70 o -80 mV. Per le fibre muscolari l ʼ intervallo si limita tra i -90 e i -80 mV. Il potenziale di membrana si origina:

- dalla ineguale distribuzione degli ioni inorganici (nello specifico Na + , K + e Cl - )

- dalla permeabilità selettiva della membrana (canali ionici).

Quando gli ioni attraversano la membrana plasmatica determinano delle correnti elettriche e causano il potenziale di membrana. Gli ioni devono essere abbastanza permeabili nella membrana e poiché non vi sono canali per il calcio, questo non partecipa neanche minimamente a determinare il potenziale. A livello del plasmalemma si genererà un vero e proprio campo elettrico perché vi sarà un eccesso di cariche negative all ʼ interno e positivo all ʼ esterno, uno ione positivo sarà dunque attirato dalla regione intracellulare, a potenziale negativo.

" Esempio: il sodio è più concentrato in ambiente extracellulare pertanto subisce l ʼ effetto del gradiente elettrochimico* 2 ed è attratto

" verso l ʼ interno della cellula. Al contrario, il potassio sarà attratto per il potenziale elettrico ma respinto per il gradiente chimico. Quando la forza elettrica è uguale e contraria a quella chimica il flusso netto sarà nullo, in questo caso si parlerà di “potenziale di equilibrio dello ione”. La genesi del potenziale di membrana dipende fortemente dal flusso ionico e questo è determinato da appositi canali proteici.

De Simone Anna

* 1 compresa tra -10 e -90 mV * 2 somma algebrica tra il potenziale elettrico e il gradiente chimico.

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GENESI DEL POTENZIALE DI MEMBRANA - E CANALI IONICI* 1

De Simone Anna

Il

flusso ionico avviene attraverso proteine canali che come le acquaporine formano un poro che si allarga all ʼ esterno e si restringe

all

ʼ interno con il “filtro di selettività”. Analogamente alle AQP, anche per i canali ionici la dimensione è un fattore discriminante per il

passaggio: questi canali consentono il passaggio solo a sostanze con un peso molecolare inferiore ai 120.

A differenza delle AQP dove la parete interna del canale è data sia da amminoacidi acidi che basici, gli amminoacidi che compongono

l ʼ interno del poro dei canali sono più selettivi: gli ioni sono particelle dotate di una carica elettrica e il loro passaggio nel poro sarà sicuramente condizionato dalla presenza di cariche elettriche disposte sulle pareti interne del canale stesso e proprio in base alla desnità delle cariche, questi possono essere divisi in canali cationici e anionici. Canali Anionici, l ʼ interno del poro è costituito soprattutto da amminoacidi basici, questi determinano una carica positiva che consentirà il

passaggio solo ad anioni. L ʼ ambiente extracellulare può essere considerato una soluzione di cloruro di sodio, proprio per l ʼ abbondanza di questi due ioni. Gli anioni presenti all ʼ esterno sono di dimensioni troppo elevate per transitare attraverso il filtro di selettività dei canali anionici, pertanto, l ʼ unico ione carico negativo permeabile all ʼ interno della membrana sarà lo ione cloro. Ecco perché, anche in assenza

di una grossa specificità, i canali anionici sono esclusivi per il cloro, inoltre essi sono costitutivi cioè sempre presenti e funzionanti a livello

della membrana plasmatica. Strutturalmente, sono degli omotetrameri dove ogni subunità è formata da 13 segmenti transmembrana e contribuisce alla formazione del poro e come tutti i trasportatori sia l ʼ estremità amminica che carbossilica sporgono nel citosol. Canali Cationici, qui l ʼ interno del canale è costituito da aminoacidi in maggioranza acidi cosicché, la carica negativa generata consentirà il passaggio di ioni positivi. Dato l ʼ abbondanza di cationi a basso peso molecolare, i canali cationici necessitano di una maggiore selettività; tra i pori cationici vi sono canali costitutivi e canali regolati. I canali per il Potassio e il sodio sono presenti sia in forma costitutiva che regolata, al contrario, i canali per il Calcio sono presenti solo in forma regolata. Se l ʼ ipotesi del setaccio può, almeno in parte, reggere per le acquaporine, questa è scartata a priori per i canali cationici: il fattore discriminante non è esclusivamente la dimensione dello ione: solo alla fine del secolo scorso si è notato che lo ione Sodio, pur essendo

più piccolo del potassio, non riesce ad attraversare i canali del K + . Questa “anomalia” ha invalidato l ʼ attribuzione dell ʼ ipotesi del setaccio

al filtro di selettività dei canali cationici. Come le AQP, anche i canali cationici hanno un filtro di selettività costituito da alcune anse che si

le anse che si immettono nel doppio strato lipidico sono dette anse P. Nelle acquaporine sono

introflettono all ʼ interno della membrana,

solo 2 le anse che formano il filtro, mentre nei canali cationici ne sono 4. Questa differenza è mossa dalla necessità che hanno i canali ionici di far transitare ioni disidratati: la guaina di idratazione è limitante per il passaggio dello ione, infatti questo viene reso anidro nel filtro di selettività, dove i legami che vincolano lo ione ai dipoli idrici devono essere vinti mediante un anello di cariche elettriche di segno opposto. Prendendo in esame un catione, la guaina di idratazione si forma per l ʼ interazione con il δ- dell ʼ ossigeno della molecola d ʼ acqua, queste interazioni devono essere sostituite da legami simili che il catione instaura con atomi di Ossigeno localizzati nei residui carbonilici degli aminoacidi presenti sulle 4 anse P.

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Un catione riuscirà a migrare attraverso il poro solo se interagisce con le 4 cariche negative presenti sulle anse. L ʼ interazione tra la carica cationica e quella negativa delle anse del filtro è di tipo debole e non costituisce alcun impedimento per la migrazione del catione: il transito terminerà quando nel canale sarà presente un ʼ altra carica positiva che interagendo con le anse determinerà il passaggio definitivo del catione già presente nel filtro. Una volta in soluzione, il catione riprenderà la sua forma idrata. Per questo processo di disidratazione, i canali cationici sono muniti di una grossa specificità strutturale: la selettività di ciascun tipo di canale ionico è dovuta alla diversa natura e disposizione degli aminoacidi che compongono le quattro “regioni P” della molecola, in particolare di quelli preseti nella loro parte apicale, questi definiscono una sorta di impronta digitale, la fingerprint di ogni famiglia di canali. Considerando che il fattore determinante per i canali cationici è dato dalle anse, queste molecole, strutturalmente possono essere monomeri, dimeri o tetrameri, in dipendenza al numero di anse presenti sulla singola subunità: se un ʼ unica subunità possiede tutte e 4 le anse, il canale sarà un monomero, se ne possiede due si tratterà di un dimero e ancora, se la subunità presenta un ʼ unica ansa, il poro sarà un omotetramero. Canali Costitutivi: Struttura del canale del potassio, il singolo monomero è costituito da 4 segmenti transmembrana le anse tra il segmento 1 e 2 e i segmenti 3 e 4 sono anse P perché si introflettono nella membrana plasmatica, in questo caso la struttura finale sarà un omodimero. Struttura del canale del Sodio: non ha bisogno di una struttura quaternaria per svolgere la sua attività, il monomero è già munito di 4 anse P. Il canale specifico per il sodio è dato da 4 domini dove ogni dominio è dato da 6 segmenti transmembrana cosicché il singolo monomero costituisce già un canale funzionale. Canali regolati:

I canali cationici non costitutivi sono omotetrameri, hanno una duplice proprietà, infatti essi non si limitano a discriminare la tipologia di ione destinato al transito, ma possono anche esercitare una certa “controllabilità”, vale a dire, la facoltà del canale di passare da una forma inattiva ad una attiva, in risposta ad un determinato comando. In base al m eccanismo di comando, i canali regolati possono essere suddivisi in due categorie: -canali voltaggio-dipendenti, dove, a regolarne l ʼ attività è il potenziale di membrana: le cariche elettriche del canale possono risentire delle variazioni del campo elettrico trasnmembranario in modo da attivare il passaggio o chiudersi. -canali chemio-dipendenti, o operati da recettori, questi canali coinvolgono una molecola messaggero che legandosi specificamente ad un dominio ne consente l ʼ apertura.

De Simone Anna

* 1 vedi trasporti, Fisiologia 1.

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GENESI DEL POTENZIALE DI MEMBRANA - FLUSSO IONICO

Flusso= Numero dei canali x Forza spingente, dove la forza spingente è data dal gradiente elettrochimico* 2 - PAG. 1 . Trattandosi di un prodotto, anche se una di queste grandezze è esigua, il flusso sarà lento. La legge per calcolare flusso mediante i canali ionici è stata elaborata da Nernst-Plank e a rivestire un ruolo di notevole importanza è la permeabilità. Questa è influenzata soprattutto dall ʼ area dei pori, cioè dal numero dei canali presenti a livello della membrana: maggiore sarà la densità dei pori e maggiore sarà l ʼ area; al contrario, non ha alcun influenza il coefficiente di diffusione: essendo i canali specifici, anche se la sostanza che attraversa ha un raggio esiguo, se essa non è specifica per interagire con le 4 anse P, ugualmente non transiterà. Il flusso è determinato dalla permeabilità e questa è direttamente proporzionale alla densità dei pori specifici. Quando lo ione attraversa un canale si determina una corrente generata dal singolo canale, questa corrente è detta i (intensità di corrente); ogni canale avrà la sua intensità e per calcolare il flusso bisognerà sommare tutte le correnti generate dai vari canali. Per eseguire la sommatoria ci si può avvalere della legge di Ohm giungendo all ʼ esemplificazione I= conduttanza × forza spingente; dove I rappresenta la corrente totale che attraversa la membrana; la forza spingente rappresenta la cosiddetta “forza elettron motrice” ed è data dal gradiente elettrochimico. Quando il gradiente elettrico esercita una forza uguale e opposta a quello chimico, si raggiunge una condizione di equilibrio dello ione con forza spingente uguale a zero. In questo caso, anche se vi è un ʼ alta conduttanza, Iʼ intensità di corrente sarà nulla. La conduttanza è un valore costante che dipende dalla “facilità” con la quale uno ione attraversa il poro ed è condizionata dalle caratteristiche del conduttore. La conduttanza di un canale può essere calcolata tenendo presente ciò che facilità il passaggio dello ione, cioè la concentrazione: maggiore sarà la concentrazione e più sarà alta la conduttanza, ma a livello cellulare la concentrazione ioniche in ambiente extra- e intracellulare è costante* 1 . Sempre a livello del plasmalemma, la conduttanza non può essere riferita ad un unico canale perciò il suo valore dipenderà dalla permeabilità della membrana, ovvero dalla densità dei canali. Pertanto è possibile fare l ʼ associazione Permeabilità = Conduttanza = numero dei canali, tenendo conto però che la conduttanza è influenzata anche dalle concentrazioni. Per quanto riguarda la forza spingente essa è data dalla differenza tra il potenziale di equilibrio dello ione e il potenziale di membrana, questo ultimo è determinato sperimentalmente dunque si tratta di valori costanti. I= Cx × (Ex - Em) Al contrario di Em il potenziale all ʼ equilibrio di una specie ionica non può essere calcolato sperimentalmente perché la membrana diffonde, attraverso i canali costitutivi, tre differenti ioni; per calcolare Ex bisognerà riferirsi ad una condizione in cui è diffuso un ʼ unica specie ionica. Considerato che il potenziale di membrana origina dalla ineguale distribuzione degli ioni inorganici tra il liquido intra- ed extracellulare, se la specie ionica K + presente nel citosol inizia a migrare all ʼ esterno per una differenza di concentrazione, con questa migrazione, essa innescherà una differenza del gradiente elettronico che non potrà essere compensata dalla migrazione di anioni, in tal modo la membrana plasmatica si carica perché si genera una diseguale distribuzione degli ioni: la carica negativa presente all ʼ interno

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della cellula attrae i cationi. Quindi si avrà una diffusione per gradiente chimico che porta il potassio all ʼ esterno e un flusso dettato dalla

forza attrattiva della carica elettrica che spinge il potassio ad entrare nella cellula. Quando queste due forze si eguaglieranno si giungerà alla condizione dell ʼ equilibrio ionico: sulla membrana si verificherà il potenziale all ʼ equilibrio. Il fattore determinante è il gradiente chimico. Da ciò si evince che il valore del potenziale di equilibrio dello ione può essere calcolato conoscendo le concentrazioni esterne e interne della specie in questione. Potenziale di membrana in questo caso corrisponde al potenziale all ʼ equilibrio in quanto è considerato un solo ione. Il potenziale di membrana è calcolato con l ʼ equazione di Nernst:

Ex = -RT/zF 2.3 log Cx interno/Cx - esterna "

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|"

togliendo il segno negativo e elidendo le costanti ne ricaviamo:

Ex = 58 mx log 10 Cx esterno / Cx interno "

dove le concentrazioni ioniche interne ed esterne sono note.

"

Per il quanto riguarda il cloro, essendo questo un anione si introduce il segno negativo Ex = -58 ml x log 10 Cx esterno/Cx interno Ex = potenziale dello ione

R

= costante dei gas perfetti

T

= temperatura assoluta (gradi Kelvin, -273°C)

F

= Costante di Faraday ; z = valenza dello ione

Alla temperatura di 25C° il rapporto RT/F è 25mV, e il fattore di conversione del logaritmo naturale in logaritmo decimale 2.3

Terminologia: Quando la membrana diventa più negativa all ʼ interno assume uno stato iperpolarizzato. Se la negatività diminuisce si dice che la membrana si depolarizza. Il potenziale di equilibrio del potassio è sempre più iperpolarizzato del potenziale di membrana (il potassio non è all ʼ equilibrio).

Come il potassio, anche il sodio non è mai all ʼ equilibrio, qui il potenziale dello ione all ʼ equilibrio è sempre più depolarizzato del potenziale

di

membrana. Per il cloro il discorso cambia, generalizzando si può affermare che per la maggior parte delle cellule si trova in uno stato

di

equilibrio, ciò significa che non vi è forza spingente per il cloro: la forza elettrica è uguale e contraria a quella chimica.

* 1 La regola generale per tutti gli organismi riscontra che -nel liquido extracellulare si trovino in maggiore concentrazione ioni Na + e Cl - ; "

Cenni: Un potenziale di equilibrio di uno ione è quel valore del potenziale di membrana in cui la forza elettrica è uguale e contraria a quella chimica. Flusso netto dello ione=0 che è la classica condizione di equilibrio. Conoscendo il potenziale di equilibrio si può conoscere la corrente ionica, perché la forza spingente è determinata dalla differenza tra il potenziale di equilibrio dello ione e il potenziale di membrana della cellula. Per convenzione, una corrente che entra è positiva e una corrente che esce è negativa. Se dalla legge di Ohm risulta un valore negativo la corrente sarà diretta all ʼ esterno.

-nel liquido intracellulare sia molto più concentrato il K +

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DATI ESEMPLIFICATIVI

NEURONI: Il potenziale di membrana è -60, esattamente come il potenziale di equilibrio del Cloro (questo anione è generalmente

all ʼ equilibrio). Per quanto riguarda il potassio, essendo questo iperpolarizzato il suo valore all ʼ equilibrio sarà -80. Il sodio è fortemente

depolarizzato, infatti il suo valore è di +50." FIBRA MUSCOLARE: Il potenziale di membrana è -90, il potenziale del potassio è -102 anche in questo caso iperpolarizzato (l ʼ interno della membrana sarà più negativo), mentre il potenziale del sodio è depolarizzato ed ha un valore di +60. Come nella maggior parte delle

cellule, anche in quelle muscolari il valore del potenziale del cloro all ʼ equilibrio corrisponde al potenziale di membrana, il cloro è quasi sempre all ʼ equilibrio.

I cationi K e Na, hanno valori che si discostano da quello del potenziale di membrana pertanto il loro potenziale è detto potenziale di

diffusione; il potenziale di diffusione si genera solo quando due specie ioniche diffondono con una differente permeabilità: il potassio si

diffonderà

quello interno, generando due flussi uguali e contrari.

I flussi saranno uguali e contrari nonostante la permeabilità del potassio è di circa 100 volte superiore a quella del sodio perché il

potassio ha una forza spingente minore rispetto al sodio. La conduttanza del potassio sarà superiore di circa 5-10 volte a quella dello

ione Na + (la conduttanza è assimilabile alla permeabilità ma non dipende solo dal numero di canali ma anche dalla concentrazione).

A bilanciare la differente permeabilità/conduttanza sarà il potenziale di membrana garantendo così due flussi uguali e contrari. Per sua

natura il potenziale di diffusione tende all ʼ equilibrio, cioè ad annullare i gradienti che li hanno generati; se dovessero annullarsi i gradienti automaticamente si annullerebbe anche il potenziale di membrana: zero differenza di concentrazione, zero potenziale di membrana. Questa situazione non si verifica: sfruttando l ʼ ATP la cellula potrà creare uno stato stazionario di disequilibrio così da mantenere il potenziale di membrana. La diffusione passiva mediante canali ionici del sodio e del potassio è tamponata dalle pompe di trasporto attivo: il sodio che entra passivamente nella cellula esce con la pompa Na + /K + consumando ATP. Al valore del potenziale di membrana, anche se il potenziale di diffusione non genera una corrente, saranno comunque presenti due flussi di ioni. Questo è stato verificato sperimentalmente con l ʼ uso di cianuro che impedisce la respirazione mitocondriale e di conseguenza non sarà prodotto ATP; se il potenziale di membrana fosse una situazione di equilibrio non sarebbe necessario il consumo di molecole di ATP, ma si è osservato che

le cellule trattate con il cianuro non presentavano alcun potenziale di membrana, pertanto questo è indotto da una condizione stazionaria

secondo gradiente, dall ʼ ambiente interno a quello esterno della cellula mentre il sodio si diffonderà dall ʼ ambiente esterno a

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di non equilibrio che per perdurare nel tempo ha bisogno di ATP. Perché deve essere mantenuto il potenziale di membrana? Il costo energetico è indotto dalla necessità della cellula di mantenere il potenziale di membrana, questo nelle cellule eccitabili (neuroni e fibre muscolari) porterà alla formazione del potenziale d ʼ azione. Per quanto riguarda le cellule non eccitabili, il potenziale di membrana è mantenuto come conseguenza della necessità della cellula di mantenere i gradienti del Sodio. L ʼ Na + agisce come forza spingente di molti trasporti attivi secondari e al contempo mantiene il valore del potenziale di membrana.

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Perché deve essere mantenuto il potenziale di membrana? Il costo energetico è indotto dalla necessità della cellula di mantenere il potenziale di membrana, questo nelle cellule eccitabili (neuroni e fibre muscolari) porterà alla formazione del potenziale d ʼ azione. Per quanto riguarda le cellule non eccitabili, il potenziale di membrana è mantenuto come conseguenza della necessità della cellula di mantenere i gradienti del Sodio. L ʼ Na + agisce come forza spingente di molti trasporti attivi secondari e al contempo mantiene il valore del potenziale di membrana.

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LA LEGGE DI GHK Ricapitolando, il potenziale di membrana per quanto riguarda lo ione potassio e lo ione sodio è un potenziale di diffusione mentre, generalizzando, per quanto riguarda il cloro si tratta di un potenziale all ʼ equilibrio. In alcune cellule nervose, il potenziale di membrana è

di diffusione anche per il cloro. Tenendo conto dei potenziali di diffusione di tutti e tre gli ioni, mediante l ʼ equazione di GHK sarà possibile

calcolare il potenziale di membrana.

di GHK sarà possibile calcolare il potenziale di membrana. A differenza delle legge di Nernst, l

A differenza delle legge di Nernst, l ʼ equazione di GHK mette in evidenza come il contributo di ciascuno ione alla genesi del potenziale di

membrana (Vm) dipenda sia dal gradiente di concentrazione ai due lati della membrana sia dalla permeabilità (P) che la membrana ha per quella determinata specie ionica. Il mantenimento dei gradienti di concentrazione, alla base della genesi del pdm, è assicurato dalla pompa Na + /K + -ATPasi, che portando fuori dalla cellula 3Na + e dentro 2K + determina una leggera negatività (elettrogenica). L ʼ uso di uabaina, inibitore della pompa, determina dissipazione dei gradienti di concentrazione e l ʼ annullamento del potenziale di membrana. Per quanto riguarda il Cl - non essendoci pompe specifiche per questo anione, si utilizzerà un trasporto attivo secondario Na-dipendente. Le permeabilità di tutte e tre le specie ioniche sono differenti: la permeabilità del cloro è il doppio di quella del potassio e la permeabilità del potassio è 100 volte superiore a

quella del sodio. Nella maggior parte delle cellule il Cloro è all ʼ equilibrio pertanto viene escluso dall ʼ equazione di GHK e per semplificarla

al massimo si converte il ln naturale in logaritmo in base dieci, si calcolano le costanti e si pone la permeabilità del potassio =1 ed

essendo 100 volte maggiore rispetto a quella del sodio, la permeabilità di questo ultimo sarà=0,01, ne segue:

58 mV × log10 ×

× [2.5] + [0.01 × 120]

[140] + [0.01 × 10 ]

= -92

[K + ] e = 2.5;

[K + ] i =140;

[Na + ] e =120; [Na + ] i =10

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Sperimentalmente, il potenziale di membrana risulta essere pari a -90, un valore molto simile a quello calcolato con la legge di GHK ed è molto vicino al valore del potenziale di equilibrio del potassio: per compensare le differenze di permeabilità la forza spingente del potassio deve necessariamente essere minore di quella del sodio e questo è realizzabile solo se il potenziale di membrana ha un valore più vicino a quello all ʼ equilibrio dello ione cui la membrana è più permeabile. La membrana sarà più permeabile allo ione che ha un potenziale di equilibrio più vicino al valore del potenziale di membrana.

Nelle cellule eccitabili il potenziale di membrana è detto “potenziale di riposo” perché queste cellule sono caratterizzate dal cosiddetto potenziale d ʼ azione.

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In breve. Il potenziale di riposo di una cellula eccitabile è determinato da:

Presenza di canali ionici costitutivi e gradienti per gli ioni permeabili. Più uno ione è permeabile più influenzerà il pdm.

Elevata permeabilità della membrana al K + , dovuta alla presenza di canali costitutivi, che consentono l ʼ uscita di K + sotto la spinta di un

forte gradiente di concentrazione contrastato dal gradiente elettrico. Il pdm negativo all ʼ interno è dovuto all ʼ alta concentrazione di K + intracellulare e alla tendenza dello ione ad uscire dalla cellula.

Impermeabilità della membrana agli anioni proteici, che rimanendo all ʼ interno della cellula, determinano la polarizzazione negativa del

versante interno della membrana.

Scarsa permeabilità della membrana al Na + , che ne riduce l ʼ ingresso, nonostante la forte spinta determinata dal gradiente elettrico e

di

concentrazione, essendo il sodio poco permeabile non influenzerà molto il potenziale di membrana.

Sono necessari trasporti attivi: Azione della pompa Na + /K + che contrasta il modesto flusso entrante di Na + e la conseguente fuoriuscita

di

K + mantenendo inalterati i rapporti di concentrazione degli ioni a cavallo della membrana. Trasporto attivo secondario Na + -dipendente

per mantenere i gradienti del Cl - .

K + è determinante per il pdm, modificando il suo flusso potrà variare anche il valore del pdm. Poiché la permeabilità allo ione è data da canali costitutivi, è possibile modificare la concentrazione esterna del potassio così da far variare la forza spingente.

- se si diminuisce [K + ] e la forza spingente aumenta con un conseguente aumento del flusso verso l ʼ esterno; il flusso uscente di K sarà maggiore rispetto al flusso entrante di Na, pertanto si creerà una distribuzione disequa delle cariche per la quale la membrana risulterà iperpolarizzata: migrando attraverso il suo canale specifico, il potassio lascerà nell ʼ ambiente intracellulare uno ione proteinato che non potendo transitare attraverso il canale renderà negativo l ʼ interno del plasmalemma.

- se si aumenta [K + ] e la forza spingente diminuisce e il pdm si depolarizza perché, essendo il flusso di potassio inferiore a quello di sodio, la quantità di cariche positive portate all ʼ interno dallo ione Na è maggiore della quantità di cationi potassio diretti all ʼ esterno. Man mano che la membrana si depolarizza diminuirà anche il flusso di sodio fino a quel valore in cui i due flussi saranno uguali e contrari.

Il potenziale di membrana è quel valore per cui la somma di tutti gli ioni che attraversano la membrana è pari a zero.

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CELLULE ECCITABILI - IL POTENZIALE DI AZIONE

Nelle cellule eccitabili il pdm oscilla tra il valore di riposo e quello d ʼ azione, questo perché le cellule eccitabili hanno la capacità intrinseca

di far variare il potenziale di riposo in seguito ad uno stimolo.

La differenza tra le cellule eccitabili e quelle non eccitabili risiede a livello della membrana plasmatica. Nella membrana delle cellule eccitabili, oltre ai canali costitutivi vi sono anche i canali ad accesso regolato, delle proteine intrinseche di membrana che normalmente si trovano in forma inattiva, senza svolgere alcun ruolo; solo quando la cellula riceve uno stimolo la proteina cambia di conformazione e

costituisce un canale funzionante. Quando i canali non regolati sono inattivi il potenziale sarà di riposo, al contrario, quando sono attivati

si avrà un nuovo potenziale di membrana detto potenziale d ʼ azione. I canali saranno attivati da una depolarizzazione della membrana

plasmatica innescata dall ʼ effetto di un neurotrasmettitore. Affinché si inneschi un potenziale d ʼ azione, è necessario che il potenziale di riposo della membrana raggiunga un determinato “valore soglia del potenziale” che è sempre più depolarizzato rispetto al potenziale di membrana. Generalizzando si può affermare che il valore del potenziale soglia è sempre di 15 mV inferiore al valore del potenziale di riposo. Ad esempio, per un pdr -70 si avrà un valore soglia del potenziale pari a -55. Affinché si verifichi un potenziale d ʼ azione, lo stimolo depolarizzante deve essere liminare o sopraliminare, cioè deve raggiungere o superare il valore soglia del potenziale. Con uno stimolo depolarizzante sottliminare, cioè che non raggiunge il valore soglia del potenziale, non si avrà alcuna variazione del potenziale di riposo, per questo motivo, il potenziale d ʼ azione è detto fenomeno ON/OFF. Anche se la variazione del potenziale di riposo in potenziale d ʼ azione è un meccanismo rapidissimo -nell ʼ ordine di pochi millisecondi-, si possono distinguere due fasi, la prima è comune per tutte le cellule eccitabili ed è detta Depolarizzante, la seconda fase è detta Ripolarizzante e si diversifica con le diverse classi di cellule eccitabili tanto da variare anche tra gli stessi neuroni.

IL POTENZIALE D ʼAZIONE - FASE DEPOLARIZZANTE

Comprende tutti i valori del pdm più depolarizzati del valore soglia del potenziale: inizia con il raggiungimento del valore soglia del potenziale e termina quando viene raggiunto un valore tra i +30 a +40 mV, il picco di maggiore depolarizzazione denominato Spike. Il valore Spike, se tenuto costante, potrebbe rappresentare uno stato di maggiore permeabilità per lo ione Na + , infatti il valore del picco

tende al valore del potenziale all ʼ equilibrio del sodio, infatti è proprio in questa fase che si verifica una variazione di permeabilità a favore del sodio. Questo aumento di permeabilità è dato dall ʼ attivazione di una popolazione di canali specifici per il sodio a controllo di potenziale, cioè canali che iniziano il loro funzionamento grazie all ʼ effetto di un neurotrasmettitore che innesca la depolarizzazione. Come le variazione di [K + ] e influenzano il pdm, una qualsiasi variazione riguardante il flusso del sodio farà variare il valore del picco.

A differenza delle concentrazione esterne del potassio, quelle del sodio non possono essere variate facilmente perché questo ione

svolge un ruolo importante nel mantenere la pressione osmotica; per questo motivo, metà del NaCl extracellulare è sostituito con cloruro

di colina. La colina (C 5 H 14 NO + ) è una molecola dal PM troppo elevato per poter penetrare nella cellula e restando all ʼ esterno ne regola la

pressione osmotica. Sperimentalmente è stato dimostrato che la causa della depolarizzazione è data dall ʼ aumento della conduttanza del

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sodio, infatti il valore Spike si raggiunge nel momento di massima conduttanza di Na + : diminuendo la [Na + ] e con la somministrazione di (C 5 H 14 NO + )Cl - diminuirà anche la forza spingente con conseguente diminuzione del valore del picco di potenziale di azione. L ʼ esperimento dimostra che il valore del picco varia in funzione della permeabilità dello ione sodio. Se la conduttanza del sodio non subisse alcuna variazione, il potenziale di membrana resterebbe costante al valore di Spike e si avrebbe una condizione esattamente opposta a quella riscontrata con il potenziale di riposo; Al potenziale di riposo ci sarà alta permeabilità per il potassio e ma il valore del pdm sarà tendente al valore del potenziale di equilibrio del potassio. Al contrario, il valore del picco è caratterizzato da un ʼ alta permeabilità per il sodio ma da una maggiore forza spingente per il potassio. Il valore del picco è in grado di bilanciare l ʼ alta permeabilità al sodio facendo in modo che i due flussi siano uguali. Come nel pdm, anche al valore del picco non si genererà corrente: la corrente del sodio in ingresso sarà uguale alla corrente del potassio in uscita. La membrana si ripolarizzerà perché i canali regolati del sodio si inattiveranno, si ristabilizzerà la conduttanza costitutiva del sodio che assicurerà il passaggio del potenziale d ʼ azione a quello di riposo, il flusso del potassio diventa superiore a quello del sodio e la membrana diviene nuovamente negativa all ʼ intero, questo con la fase ripolarizzante.

De Simone Anna

IL POTENZIALE D ʼAZIONE - FASE RIPOLARIZZANTE

Come è stato letto al termine del paragrafo precedente, la ripolarizzazione dipende dall ʼ inattivazione dei canali sodio a controllo di voltaggio. Questa fase inizia quando terminato il picco (cioè quando la membrana inizia a tornare al suo potenziale di riposo) e finisce proprio quando si ristabilisce il potenziale di membrana a riposo. Per far variare il potenziale di riposo sarà necessario un nuovo stimolo depolarizzante. Non tutte le popolazioni cellulari presentano lo stesso andamento della fase ripolarizzante, ad esempio, in alcune cellule muscolari e a livello dei neuroni degli invertebrati, sebbene il raggiungimento del potenziale di riposo avviene nello stesso arco di tempo (3, 4 millisecondi), questa presenta un andamento del tutto differente. Il motivo di questa differenza? A livello dei neuroni degli invertebrati e a livello di alcune cellule muscolari, oltre alla presenza di canali Na a controllo di voltaggio, ci saranno anche canali regolati per il potassio (Kv slow); entrambi i canali si attiveranno in seguito allo stimolo depolarizzante ma il funzionamento del Kv avviene in ritardo rispetto al canale del sodio, ovvero dopo circa 0,2 - 0,3 millisecondi. In questo lasso di tempo, la maggiore conduttanza del sodio sarà tale da determinare il raggiungimento del valore Spike che sarà caratterizzato da due eventi contemporanei: da un lato si inattiveranno i canali Na voltaggio dipendenti e dall ʼ altro si attiveranno i canali Kv. E ʼ importante che questi due eventi siano contemporanei perché se così non fosse, la membrana presenterebbe il medesimo valore di permeabilità sia per il Na che per il K, così da annullare il potenziale: non ci sarebbe il passaggio di corrente. Con l ʼ attivazione dei canali Na, la membrana raggiunge il suo valore di riposo (-70) solo dopo 1 millisecondo ma questo non sarà stabile:

la membrana attraverserà una fase di iperpolarizzazione postuma (dopo il raggiungimento del picco), proprio a causa dell ʼ attivazione dei canali Kv che iperpolarizzerano la membrana e nel complesso, la membrana raggiungerà il valore di -70 in 3, 4 millisecondi, cioè nel tempo impiegato dalle altre popolazioni cellulari.

ECCITABILITÀ - FISIOLOGIA !

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Poiché la conduttanza del potassio aumenta e diminuisce più lentamente di quella del sodio, la membrana avrà modo di raggiungere il potenziale di riposo per l ʼ azione dei canali regolati dell ʼ Na, questo valore depolarizzato (-70) disattiverà il funzionamento del Kv ma dato che questi sono a cinetica lenta, il potenziale di riposo sarà instabile: la membrana si iperpolarizza e solo dopo la fase di iperpolarizzazione, quando gli unici canali attivi saranno quelli costitutivi, la membrana potrà tornare al suo potenziale di riposo. Esistono varie tipologie di canali a voltaggio dipendenti per il Potassio, i Kv sono peculiari del meccanismo di ripolarizzazione. NB.: l ʼ inattivazione dei canali voltaggio dipendenti non dipende dal ligando (neurotrasmettitore) ma dal potenziale di membrana.

De Simone Anna

STRUTTURA E FUNZIONAMENTO - CANALI A VOLTAGGIO DIPENDENTE

Canale regolato del sodio: questo ha una struttura molto simile al canale Sodio costitutivo, tra le differenze minori, vediamo la presenza

di una subunità β che svolge esclusivamente un ruolo di supporto per inserire il canale nella membrana. E ʼ la subunità α isoforma 1 a

svolgere l ʼ attività selettiva. La principale differenza strutturale risiede nel quarto segmento transmembrana di ognuno dei 4 domini; Il quarto segmento transmembrana è ricco di amminoacidi basici -carichi positivamente-, i residui amminoacidici hanno fatto supporre che siano proprio gli S4 a svolgere un ruolo di “sensori del voltaggio” mediante attrazioni o repulsioni elettrostatiche: quando arriva uno stimolo depolarizzante e la carica negativa all ʼ interno della membrana diminuisce e non ci sarà una perfetta neutralizzazione delle

cariche positive cosicché gli S4 saranno indotti a ruotare di circa 2 Å e causare una variazione conformazionale dell ʼ intero canale, in particolar modo dei segmenti 5 che legati alle anse P causeranno l ʼ attivazione del canale. Dopo una frazione di millisecondi, il canale del sodio si inattiverà. Il meccanismo di “chiusura” è legato a due loop citosolici:

- l ʼ ansa che collega il sesto segmento transmembrana del secondo dominio al primo segmento del terzo dominio.

- l ʼ ansa IFM -detta così perché è formata da 3 aminoacidi, isoleucina, fenilalanina e metionina-. L ʼ IFM è il loop che unisce il sesto segmento del terzo dominio al primo segmento transmembrana del quarto dominio.

Il coinvolgimento dell ʼ IFM al meccanismo di inattivazione è stato evidenziato in situazioni di mutamento di uno dei residui aminoacidici, infatti in queste condizioni il canale del sodio potenziale dipendente, era incapace di inattivarsi. Queste due strutture sono dette loops di inattivazione e sono anse che potranno interagire con il filtro di selettività solo quando questo

si trova nella sua forma attiva: l ʼ interazione con il filtro di selettività porterà alla chiusura del canale.

Come è chiaro, l ʼ attivazione del canale dipende dal potenziale di membrana, mentre l ʼ inattivazione dipende dall ʼ interazione tra il poro attivo e i loops di inattivazione. Dopo l ʼ inattivazione del canale, quando il potenziale di membrana avrà raggiunto la sua forma di riposo, non si potrà avere immediatamente un secondo potenziale d ʼ azione: il raggiungimento della conformazione non funzionale del canale è rallentata dagli S4 ancora sporgenti dal lato esterno e le due anse di inattivazione ancora in interazione con la regione del filtro; questa situazione permane per circa un millisecondo ed è un fenomeno denominato “periodo refrattario assoluto” durante il quale non si potrà avere nessun potenziale d ʼ azione, infatti questo fenomeno determina la frequenza massima dei potenziali d ʼ azione.

ECCITABILITÀ - FISIOLOGIA !

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Con la presenza dei canali Kv il discorso cambia: il meccanismo di inattivazione del canale Na + coincide con la fase di iperpolarizzazione postuma e questo darà luogo ad un periodo refrattario relativo dove solo stimoli sopraliminari sono in grado di innescare un potenziale d ʼ azione. La struttura del Kv è omotetramerica dove le quattro subunità sono uguali ai domini del canale voltaggio dipendente del sodio: sei segmenti transmembrana e le anse P sono quelle che collegano il quinto segmento al sesto. Proprio come i canali regolati dell ʼNa + , anche qui sono i 4 segmenti 4 a svolgere il ruolo di “sensori del voltaggio” sempre per l ʼ abbondante presenza di cariche positive. L ʼ unica differenza tra i due canali regolati responsabili dei potenziali d ʼ azione, è dettata dalla velocità; il Kv funziona più lentamente:

quando il Kv si sarà attivato si sarà già raggiunto il valore spike, pertanto il Kv contribuirà esclusivamente alla fase di ripolarizzazione. Inoltre, al contrario del canale regolato per il sodio e il Ka, per il Kv, sia l ʼ attivazione che l ʼ inattivazione dipenderanno dal pdm.

De Simone Anna

Come per il canale regolato del sodio, anche il meccanismo di inattivazione del Ka è effettuato dalle anse citosoliche ma con il Ka saranno le 4 estremità amminiche ad interagire con il filtro di selettività impedendone il funzionamento.

note:

L ʼ accomodazione è un fenomeno non fisiologico che impedisce alla cellula di innescare un potenziale d ʼ azione a prescindere dal periodo refrattario, che sia questo relativo o assoluto. Questo fenomeno insorge quando lo stimolo viene somministrato lentamente così da rendere la depolarizzazione NON immediata.