Le cellule staminali pluripotenti presenti nel fegato fetale e nel midollo

osseo,note come cellule staminali ematopoietiche

(Hematopoietic Stem Cells,HSC) danno origine a tutte le cellule
circolanti,inclusi i linfociti.
Maturando,le HSC danno origine a progenitori linfoidi comuni che a loro
volta danno origine ai linfociti B e T,alle cellule linfoidi innate e ad alcuni
tipi di cellule dendritiche.
La maturazione dei linfociti B avviene prevalentemente nel midollo
osseo e prima della nascita,anche nel fegato fetale.
Le HSC epatiche fetali danno origine prevalentemente a un particolare
tipo di linfociti B definiti B-1,mentre le HSC midollari daranno origine alla
maggior parte dei linfociti B circolanti,linfociti B follicolari nonche a una
sottopopolazione di linfociti B detti linfociti B della zona marginale.
I precursori dei linfociti T che lasciano il fegato fetale o il midollo prima
e dopo la nascita rispettivamente entrano in circolo raggiungendo
successivamente il timo,dove completano la loro maturazione.
Le HSC presenti nel fegato fetale danno origine a linfociti T delta
gamma,mentre le HSC nel midollo osseo danno origine ai linfociti alfa
beta.
L’indirizzamento verso la linea differenziativa B o T e determinato
dall’attivazione di recettori di membrana che inducono l’espressione di
specifici fattori di trascrizione che a loro volta inducono un progenitore
linfoide comune a differenziarsi in un linfocita B o T.
I recettori di superfice e i fattori trascrizionali inducono l’espressione di
alcune proteine che interagiscono con loci del gene codificante il recettore
per l’antigene e ne regolano il riarriangiamento.
Per esempio nel caso della maturazione di un linfocita B,il locus della
catena pesante delle immunoglobuline,originariamente presente in una
configurazione in cui la cromatina e inaccessibile viene “smascherato” e
reso accessibile alle proteine regolatrici che ne determineranno il
riarrangiamento.
In modo simili,anchei il locus del gene che codifica per la catena beta del
recettore dei linfociti T viene reso accessibile.
Diversi classi di fattori trascrizionali guidano la differenziazione delle
cellule progenitrici in linfociti B o T.
I fattori di trascrizione Notch-1 e GATA-3 dirigono la differenziazione
verso la linea T.
Notch e una famiglia di proteine di membrana attivate dalla loro proteolisi
innescata dall’interazione con ligandi specifici presenti su cellule adiacenti.
La porzione intracellulare di Notch cosi generata migra verso il nucleo
dove andra a modulare l’espressione di specifici geni bersaglio.
Nelle cellule progenitrici linfoidi,Notch-1 viene attivato insieme a GATA3
inducendo l’espressione di una serie di geni necessari per l’ulteriore
sviluppo dei linfociti T alfa beta.
I fattori di trascrizione EBF,E2A e Pax-5 inducono l’espressione di geni
coinvolti nello sviluppo dei linfociti B,tra cui quelli che codificano per le
proteine Rag-1 e Rag-2,le proteine surrogate delle catene leggere e per le
proteine Igalfa e Ig beta necessarie per la trasduzione del segnale da
parte del recettore per l’antigene dei linfociti pre-B e B.

Durante lo sviluppo dei linfociti B e T,le cellule progentrici gia indirizzate

verso le distinte linee differenziative proliferano dapprima in risposta alle
citochine e quindi in risposta ai segnali generati da un
recettore pre-antigene che seleziona le cellule che hanno correttamente
riarrangiato il primo gruppi di geni codificanti per il recettore per
l’antigene.
L’attivita mitotica fa si che venga generato un pool abbastanza numeroso
di cellule che daranno vita a un repertio molto ampio di linfociti antigene
specifici.
Nell’uomo IL-7 e necessaria per la proliferazione dei progenitori dei
linfociti T ma non del B.
IL-7 e sintetizzata dalle cellule stromali del midollo osseo e ne ltimo dalle
cellule epiteliali e da altri tipi di cellule.
Mutazioni nella catena comune gama,condivisa dai recettori per diverse
citochine incluse IL-2,IL-7 e IL-15 provocano un’ummnodeficienza definita
immunodeficienza grave combinata legata al cromosoma X.
Tale malattia blocca lo sviluppo dei linfociti T IL-7 e delle natural killer
IL-15.
Riarrangiamento ed espressione dei geni che codificano per il
recettore per l’antigene e un evento chiave nella maturazione
linfocitaria essenziale per la generazione di un repertorio diversificato.
Ogni clone linfocitario B o T produce un recettore dotato di caratteristiche
di riconoscimento per l’antigene uniche.
Possono esistere 10 alla 7 cloni di linfociti B e T ognuno con un specifico
recettore.
La capacita di generare un repertorio cosi diversificato sta non nel numero
dei geni ma nel riarrangiamento genico.
I geni in grado di codificare per i recettori per l’antigene sono prodotti nei
linfociti B immaturi,nel midollo osseo e nei linfociti T immaturi nel timo
attraverso un processo di riarrangiamento genico che genera un enorme
numero di esoni in grado di codificare per la regione variabile del
recettore pur partendo da una frazione di genoma relativamente piccola.
Durante la maturazione,in ogni singolo linfocita uno dei diversi segmenti
genici che codificano per le regioni variabili viene scelto a caso e
coniugato a un segmento di DNA successivo.
Processi di selezione che affinano il repertorio dei linfociti B e T
Durante lo sviluppo linfocitario sono presenti numerosi punti di
controllo,checkpoints i quali assicurano che solo le cellule che hanno
correttamente portato a termine le varie fasi della differenziazione
proseguano nel processo di maturazione.
Uno di quest punti di controllo si basa sulla corretta espressione di una
delel due catene del recettore per l’antigene,mentre in un punto
successivo verrano controllati il corretto assemblaggio e la funzionalita del
recettore completo.
I punti di controllo successivi avranno lo scopo di eliminare i linfociti
autoreattivi,potenzialmente pericolosi,oppure di orientare i linfociti verso
speficihe forme di differenziazione.
Sia i pre-recettori per l’antigene sia i recettori per l’antigene trasmettono
segnali essenziali per la sopravvivenza,la proliferazione e la continuazione
del processo maturativo dei linfociti.
I pre-recettori per l’antigene definiti pre-BCR nei linfociti B e pre-TCR nei
linfociti T,sono recettori in grado di trasdurre segnali che vengono
espressi nel corso dello sviluppo linfocitario.
Essi contengono solo una delle catene che compongono il recettore per
l’antigene maturo.
I pre-BCR contengono la catena pesante di Ig mu mentre i pre-TCR
contengono la catena TCR beta.
Per riuscire a esprimere le catene Ig mu o TCR beta i linfociti B o T
devono prima andare incontro a riarrangiamento dei geni che codificano
per i recettori.Un processo che necessita l’esposizione di particolari loci
genici e la loro fusione con particolari segmenti di DNA necessari a
generare un recettore funzionale.
Al fine di ottenere la massima diversificazione possibile tra i recettori
generati,diversi nucleotidi vengono aggiunti o rimossi causalmente dai
segmenti genici che si congiungono.
Nel caso che i linfociti non abbiano correttamente riarrangiato i loci per la
catena Ig mu o per la catena beta del TCR non esprimeranno un recettore
provvisorio funzionante e non riceveranno i necessari segnali di
sopravvivenza,andando incontro a morte cellulare programmata.
In conclusione,l’espresione dei recettori provvisori rappresenta il primo
punto di controllo nello sviluppo linfocitario.
I linfociti B e T in corso di sviluppo cominceranno a esprimere recettori
per l’antigene completi e funzionanti e saranno quindi selezionati per la
sopravvivenza in base a cio che tali recettori possono riconoscere.
I linfociti che hanno superato il checkpoint del pre-recettore procedono al
riarrangiamento e all’espressione dei geni codificanti la seconda catena
del BCR o del TCR,esprimendo cosi sulla loro superficie il recettore
completo e funzionante.
Il processo che salvaguarda i linfociti dotati di specificita “utile” e detto
selezione positiva ed e connesso al processo di differenziazione dei
linfociti nelle diverse sottopopolazioni.
Durante lo sviluppo dei linfociti T,la selezione positiva garantisce la
maturazione di cellule dotate di recettori in grado di riconoscere le
molecole del complesso maggiore di istocompatibilita e di corecettori CD8
o CD4 in grado di riconoscere rispettivamente le molecole MHC.
Selezione negativa: e il processo che elimina o modifica i linfociti dotati
di recettori che riconoscono con elevata affinita gli antigeni self presenti
negli organi linfoidi primari.
Durante questa fase,i linfociti T immaturi che possiedono un’elevata
affinita per gli antigeni self vengono eliminati per apoptosi,fenomeno
conosciuto come delezione clonale.
I linfociti B immaturi dotati di forte autoreattivita possono essere indotti a
riarrangiare i gene delle Ig al fine di modificare la loro
specificita,fenomeno chiamato editing recettoriale.
Se l’editing recettoriale non va a buon fine,il linfocita B autoreattivo
muore per delezione clonale.

La selezione negativa dei linfociti rappresenta un importante meccanismo

per il mantenimento della tolleranza al self,fenomeno definito tolleranza
centrale perche avviene negli organi linfoidi primari.

Riarrangiamento dei geni recettoriali

I geni che codificano per il recettore per l’antigene sono generati per
riarrangiamento di regioni diverse del gene che codifica per la regione
variabile con segmenti di geni della diversita e quelli della ricongiunzione
(J).
Tale processo e detto ricombinazione V(D)J.
Organizzazione dei loci per le Ig
Tre loci separati codificano per tutte le catene pesanti,le catene leggere di
tipo kapa e quello di tipo lambda delle Ig.
Ogni locus e localizzato su un diverso cromosoma.
All’estremita 5’ di ogni segmento variabile e un esone “leader” che
codifica i 20-30 residui N-terminali della proteina.Questa sequenza
leader rappresenta la sequenza segnale presente in tutte le proteine
neosintetizzate secrete o transmembrana.
La sequenza leader svolge un ruolo importante durante la sintesi proteica
guidando i polipeptidi nascenti dai ribosomi al lume del reticolo
endoplasmatico.
Qui la sequenza leader viene rapidamente rimossa,manca nella proteina
matura.
Alla posizione 3’ dei geni variabili si trovano i segmenti genici J (Joining-
unione) stretamente associati agli esoni che codificano per la regione
costante.
Tra i geni V e J,nella catena pesante si trovano sequenze codificanti
aggiuntive note come segmenti D (diversita).
Questi segmenti non sono presenti nei loci delle catene leggere.
La regione costante della catena pesante e costituita da circa 9 geni dove
3 o 4 di essi bastano per codificare l’intera regione costante e altri 2 per
codificare la regione carbossi-terminale di membrana.
La regione costane della catena leggera e costituita da un solo esone che
codifica per tutta la regioen costante.
Nelle catene leggere kapa e lapmba il dominio variabile e codificato da
segmenti V e J mentre nelle pesanti da V,D e J.
Organizzazione dei loci genici per il TCR
L’organizzazione e molto simile a quella per le Ig.I geni che codificano per
le catene alfa,beta e gamma sono su cromosomi separati,mentre quello
per delta e contenuto in quello per la catena alfa.
Regione variabile-V,J,D
solo nelle catene beta e gamma e una regione costante con 2 geni.
Ricombinazione
I recettore pe l’antigene funzionanti vengono prodotti solo nei linfociti B e
T dopo il riarrangiamento del DNA che porta alla fusione casuale di
segmenti genici V,D e J.
Il processo di ricombinazione V(D)J che avviene in qualsiasi locus per le Ig
o per il TCR prevede la scelta casuale di un gene V,un segmento J e un
segmento D (quando presente) e il loro riarrangiamento a formare un
singolo esone VDJ che codifichera per la regione variabile di un recettore
per l’antigene specifico per ogni singolo linfocita.
Siccome i segmenti scelti si trovano lontani sul cromosoma devono essere
effettuate rotture.
Tale ricombinazione e effettuata da un complesso detto ricombinasi.
Il complesso della ricombinasi riconosce specifiche sequenze dette RSS
(Recombination Signal Sequences) situate nel 3’ del segmento V e 5’ del
segmento J e ai due estremi dei segmenti genici D.
Tali sequenze sono costituite da una sequenza altamente conservata di 7
nucleotidi detta eptamero distaccata da una sequenza spaziatrice di 12 o
23 nucleotidi da una seconda sequenza conservata di 9 nucleotidi detta
nonamero.
Gli intervalli di 12 e 23 nucleotidi corrispondono a uno o due giri completi
di elica di DNA e presumibilmente protano due eptameri in posizione tale
da poter essere simultaneamente accessibili agli enzimi di ricombinazione.
Durante la ricombinazione VDJ vengono effettuati dei tagli nella doppia
elica tra l’eptamero delle RSS e le sequenze V,D o J adiacenti.
I tagli verranno effettuati per esempio all’estremita 3’ di un segmento V e
a quella 5’ di un segmento J.
Il frammento di DNA a doppia elica tagliato,che contiene le parti terminali
dei segnali ( a loro volta contenenti l’eptamero e il resto delle RSS) viene
rimosso sotto forma di anello,permettendo quindi alle estremita dei
segmenti genici codificanti di congiungersi.
In alcuni casi gli eptameri sono situati entrambi a destra sia di V che di J
in tal caso e necessaria una inversione del DNA intermedio e le RSS
tagliate non vengono eliminate ma rimangono nel cromosoma.
La ricombinazione tra due segmenti si verifica solo se uno e fiancheggiato
da uno spaziatore di 12 e l’altro di 23: e la cossidetta regola 12/23.
Meccanismo di ricombinazione
1. Sinapsi
Parti del cromosoma sono rese accessibili ai componenti del processo di
ricombinazione.
Due distinti segmenti genici codificanti e le loro RSS adiacenti vengono
posti in contatto grazie alla formazione di strutture ad anello e vengono
mantenuti in questa posizione per i sucessivi eventi di
taglio,processamento e ricongiunzione.
2.Taglio
Medante reazione enzimatica,alle giunzioni tra RSS e sequenze codificanti
si operano i tagli della doppia elica del DNA.
Questo processo e specifico per i linfociti.Due proteine codificate da geni
specifici per cellule linfoidi,definite geni attivanti la ricombinazione 1 e
2 (RAG1 e RAG2) si assemblano a formare un complesso contenente due
molecole di ciascuna proteina,conosciuto come ricombinasi VDJ.
Agendo come un endonucleasi di restrizione,la proteina Rag1 riconosce
taglia le sequenze di giunzione tra eptameri e segmenti genici codificanti.
E da notare che Rag-1 diventa enzimaticamente attiva solo quando viene
complessata a Rag-2.
La terminazione 3’OH dell’estremita codificante cosi generata si lega
covalentemente all’altro filamento di DNA mediante legame
fosfodiesterico,formando una struttura a forcina (hairpin).
L’altra estremita non si organizza a hairpin.
Questa rottura del doppio filamento fa si che l’hairpin chiusa di un
segmento codificante si trovi di fronte all’hairpin chiusa dell’altra
estremita codificante.
I geni RAG sono attivati durante la maturazione delle cellule
linfoidi,mentre rimangono silenti durante la fase proliferativa proprio per
minimizzare il rischio di rotture inapropriate del DNA.
3.Apertura delle hairpin e processamento
Le estremita codificanti tagliate vengono modificate dall’aggiunta o dalla
rimozione di nucleotidi,al fine di aumentare il livello di diversificazione.
Dopo i tagli le hairpin devono essere aperte per permette l’aggiunta di
nucleotidi.
Artemis e un’endonucleasi il cui compito e proprio quello di aprire le
hairpin alla terminazione delle sequenze codificanti.
Un enzima specifico deossinucleotiditransferasi terminale ha invece il
compito di aggiungere basi alle terminazioni di DNA neoformate.
4.Unione:
Le estremita codificante tagliate e le estremita segale si avvicinano
mediante il processo di riparazione delle rotture del doppio
filamento.Processo noto come unione delle estremita non omologhe.
Ku70 e Ku80 sono due proteine che ricongiungono le terminazioni di DNA
e reclutano la subunita catalitica dell’enzima DNA-PK (DNA dipendent
Protein Kinase) in grado di riparare la doppia elica.
Generazione della diversita linfocitaria
L’enorme diversificazione dei linfociti B e T e dovuta soprattuto al
riarrangiamento dei geni per il recettore.
Questa diversificazione e dovuta a una diversita combinatoria dovuta
semplicemente alle diverse combinazioni possibili tra i diversi segmenti
V,J e D.
Diversita giunzionale data dalla aggiunta e rimozione di nucleotidi dai
segmenti V, J e D.
Primo meccanismo e la rimozione di nucleotidi dalla sequenza germinale
alle estremita del gene a opera di una endonucleasi.
Se la scissione da Artemis e asimmetrica i nucleotidi aggiunti devono
essere complementari a quelli del tratto parallelo e tali nucleotidi sono
detti nucleotidi P.
Ultimo meccanismo e la aggiunta causale di un massimo di 20 nucleotidi
non codificati da alcuno stampo detti nucleotidi N mediata da un’enzima
chiamato TdT.
Sviluppo dei linfociti B
Il primo progenitore midollare orientato verso la linea B e chiamato cellula
pro-B.
I linfociti pro-B non producono ig ma possono essere distinti dalle altre
cellule immature per l’espressione di molecole di superficie come CD19 e
CD10.
In questa fase sono espresse le proteine Rag-1 e Rag-2 che mediano la
prima ricombinazione dei geni del locus della catena pesante.
Questa ricombinazione avvicina un segmento D a un segmento J con
delezione del DNA interposto.
I rimanenti segmenti genici D,in posizione 5’ rispetto al segmento D
riarrangiato cosi come i rimanenti segmenti genici J in posizione 3’
rispetto al segmento J riarrangiato vengono eliminati.
Dopo la ricombinazione D-J uno dei molti geni V e ricongiunto al
segmento DJ neoformato originando un esone VDJ riarrangiato.
In questo caso anche tutti i segmenti genici V e D compresi tra i geni V e
D riarrangiati vengono rimossi.
Poi e l’aggiunta di nucleotidi da parte di TdT e poi la trascrizione di VDJ se
l’aggiunta di nucleotidi ha generato una sequenza produttiva.