1.

CARATTERISTICHE GENERALI DELLE RISPOSTE IMMUNITARIE

La funzione fisiologica del sistema immunitario di difendere lorganismo da agenti infettivi, ma anche agenti di natura non infettiva possono provocare una risposta immunitaria. Limmunit dunque una risposta a sostanze estranee allorganismo, che indipendente dalle conseguenze fisiologiche o patologiche di tale risposta. IMMUNITA INNATA : consta di meccanismi preesistenti allinfezione che reagiscono con rapidit contro i microbi, ma che nel ripetersi di una stessa infezione reagiscono in maniera identica; sono: le barriere fisico-chimiche dellorganismo, neutrofili, macrofagi, NK, proteine del complemento e citochine. IMMUNITA SPECIFICA o acquisita : consta di meccanismi che ad ogni riesposizione ad uno stesso agente acquistano potenza e capacit difensiva, essendo altamente specifici per le diverse macromolecole ed avendo una memoria immunitaria; sono: i linfociti e le molecole da essi prodotte. Le risposte innate stimolano le specifiche, che hanno come meccanismi effettori molti di quelli propri dellimmunit innata.

SEZIONE I

Tipi di risposte immunitarie specifiche

IMMUNITA UMORALE : mediata dagli anticorpi, prodotti dai linfociti B. Gli anticorpi riconoscono specificamente gli antigeni microbici, li neutralizzano e li destinano alleliminazione da parte di vari meccanismi effettori. IMMUNITA CELLULARE : o cellulo-mediata, mediata dai linfociti T e favorisce la distruzione dei microbi intracellulari. IMMUNITA ATTIVA : indotta dallesposizione ad un agente estraneo. IMMUNITA PASSIVA : conferita trasferendo in un individuo siero o linfociti da un soggetto gi immunizzato verso quellantigene.

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Caratteristiche delle risposte immunitarie specifiche

Specificit: le risposte immunitarie sono specifiche per i diversi antigeni; la porzione antigenica riconosciuta detta EPITOPO. Diversificazione: il numero delle diverse specificit antigeniche il REPERTORIO LINFOCITARIO e solitamente corrisponde a 109-1011. Memoria: la risposta alla riesposizione ad uno stesso antigene pi rapida e pi intensa della primaria. Autolimitazione: le normali risposte immunitarie si esauriscono col tempo dopo la stimolazione antigenica e il sistema immunitario torna in uno stato di omeostasi. Non reattivit verso il self: detta tolleranza ed fondamentale per leliminazione di linfociti che esprimono recettori specifici per antigeni self (alterazioni di questo meccanismo portano alle malattie autoimmuni.

Componenti del sistema immunitario specifico

LINFOCITI B : sono le uniche cellule in grado di produrre anticorpi e riconoscono antigeni extracellulari e antigeni espressi sulla membrana delle cellule. LINFOCITI T : sono responsabili dellimmunit cellulare e possono essere distinti in linfociti T helper e linfociti T citotossici o CTL; non producono anticorpi e riconoscono solo peptici antigenici legati a proteine autologhe codificate da geni del MHC ed espresse sulla membrana di altre cellule. I linfociti T helper secernono CITOCHINE che stimolano la proliferazione dei linfociti T stessi, dei linfociti B, dei macrofagi e di altri leucociti. I CTL uccidono cellule che producono antigeni estranei. LINFOCITI NK : sono coinvolti nellimmunit innata contro i virus e altri patogeni cellulari.

Fasi delle risposte immunitarie specifiche

1. RICONOSCIMENTO DEGLI ANTIGENI : i cloni di linfociti specifici per i differenti antigeni si sviluppano indipendentemente dal contatto con essi. Gli antigeni estranei interagiscono con cloni preesistenti di linfociti specifici nei tessuti linfoidi specializzati dove iniziano le risposte immunitarie (ipotesi della selezione clonale). Pagina 2 di 61

2. ATTIVAZIONE DEI LIFOCITI : richiede 2 segnali, di cui il primo lantigene e il secondo costituito da prodotti microbici o da componenti dellimmunit innata (ipotesi del doppio segnale) e prevede: sintesi di nuove proteine: citochine, recettori per le citochine e proteine coinvolte nella trascrizione genica e nella divisione cellulare; proliferazione cellulare: o espansione clonale per mitosi; differenziazione in cellule effettrici: i linfociti T helper producono citochine, i CTL lisano le cellule infettate e le cellule tumorali, i linfociti B producono anticorpi. 3. OMEOSTASI : al termine della risposta immunitaria un gran numero di linfociti T stimolati dallantigene vanno incontro ad apoptosi perch probabilmente la loro sopravvivenza dipende dalla presenza dellantigene e dai fattori di crescita che esso promuove. 4. DIFFERENZIAZIONE IN CELLULE DELLA MEMORIA : che sopravvivono per periodi prolungati. 5. ELIMINAZIONE DELLANTIGENE : gli anticorpi extracellulari, i linfociti T i microbi intracellulari. eliminano i microbi

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2. CELLULE E TESSUTI DEL S. I.

Linfociti
Originano da cellule staminali del midollo osseo; sono le uniche cellule dellorganismo in grado di riconoscere e distinguere i diversi antigeni e sono responsabili della specificit e della memoria. Le proteine presenti sulla membrana cellulare sono usate come marcatori fenotipici: i linfociti T helper esprimono CD4, i CTL esprimono CD8. CD sta per cluster differentation, quindi una molecola riconosciuta da un cluster (gruppo) di anticorpi monoclonali, che possono essere usati per identificare lo stadio di differenziazione dei linfociti. LINFOCITI T VERGINI : non hanno mai incontrato lantigene, sono anche conosciuti come piccoli linfociti (diametro di 8-10 m) e si trovano in uno stato di quiescenza. Allinterno del linfonodo si trovano particolari venule post capillari ad alto endotelio, le HEV, che presentano un elevato grado di adesivit da parte dei linfociti T vergini, che quando urtano lendotelio vi rimangono adesi per molti secondi e una parte di essi aumenta ladesivit e si fa larga fra le cellule endoteliali fino al linfonodo; nel linfonodo i linfociti T vergini possono essere attivati dallantigene accumulato, ma se ci non avviene lasciano il linfonodo e vanno a localizzarsi in un altro e cos via. LINFOCITI T EFFETTORI : escono dai linfonodi e si localizzano nei focolai infiammatori, perch le citochine potenziano lespressione sulle cellule endoteliali di ligandi per le integrine E- e P-selectina, la cui espressione notevolmente aumentata sui linfociti T attivati. LINFOCITI B : risiedono in tessuti linfoidi periferici, dato che secernendo anticorpi non hanno bisogno di migrare. I linfociti B vergini migrano dal sangue ai follicoli linfatici in risposta a chemochine prodotte nei follicoli, le BLC; quando la cellula stata attivata lespressione dei recettori per BLC diminuisce e il linfocita B maturo pu lasciare il follicolo.

Cellule accessorie
FAGOCITI MONONUCLEATI : originano nel midollo osseo e maturano e si attivano nei diversi tessuti. Quando lasciano il midollo osseo prendono il nome di MONOCITI e nei tessuti maturano diventando MACROFAGI. Presentano lantigene ai linfociti T e producono proteine di membrana che fanno da segnale per lattivazione di linfociti T.

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CELLULE DENDRITICHE : presentano numerosi prolungamenti citoplasmatici ramificati. Captano e trasportano gli antigeni proteici ai linfonodi, si localizzano nelle aree linfonodali contenenti linfociti T e presentano lantigene. CELLULE FOLLICOLARI DENDRITICHE : presentano prolungamenti citoplasmatici e sono presenti solo nel centro germinativo di linfonodi, milza e tessuto linfoidi. Captano antigeni combinati ad anticorpi o a prodotti del complemento e li presentano ai linfociti B.

Tessuti linfoidi
MIDOLLO OSSEO : la sede dellemopoiesi. La proliferazione e la maturazione delle cellule del S.I. sono stimolate dalle citochine, prodotte da cellule stromali, da macrofagi midollari, da linfociti T stimolati dallantigene e da macrofagi attivati da citochine o microbi. TIMO : la corticale ricca in linfociti T, la midollare presenta i corpuscoli di Hassal, strati concentrici di cellule epiteliali. La maturazione dei linfociti T inizia nella corticale e via via che maturano i timociti migrano verso la midollare e una volta maturi entrano in circolo. MILZA : un filtro per il sangue e il sito principale della fagocitosi di microbi opsonizzati (rivestiti da anticorpi). I macrofagi della polpa rossa eliminano dal circolo microbi e materiale particolato. LINFONODI : sono piccoli aggregati cellulari di tessuto linfoide. Nella corticale le cellule formano i FOLLICOLI, che si dicono primari se non presentano un centro germinativo e secondari se lo presentano. I follicoli primari sono popolati principalmente da linfociti B maturi vergini. I centri germinativi si sviluppano in risposta alla stimolazione antigenica: in essi i linfociti B proliferano, vengono selezionati quelli che producono anticorpi ad elevata affinit e si generano cellule della memoria. La paracorticale ricca in linfociti T. SISTEMA LINFATICO : raccoglie lantigene e lo convoglia verso i linfonodi, disposti regolarmente lungo il decorso dei vasi linfatici, che si comportano come filtri nei confronti della linfa. Gli antigeni entrati in circolo possono essere captati da macrofagi, cellule dendritiche del linfonodo e dai linfociti B (che a livello linfonodale riconoscono anche antigeni solubili) che lo processano e lo presentano ai linfociti T. CUTE : le cellule di Langerhans formano un reticolo sottocutaneo che capta gli antigeni che penetrano attraverso la cute e, dopo la stimolazione di chemochine, migrano nel derma e raggiungono i linfonodi per via linfatica. Pagina 5 di 61

SEZIONE II
Anticorpi

3. ANTICORPI E ANTIGENI
Sono presenti nel plasma, nelle secrezioni mucose e nel fluido interstiziale e il loro studio definito SIEROLOGIA. In circolo hanno unemivita di circa 3 settimane e la concentrazione anticorpale per un dato antigene viene stabilita per titolazione (per diluizioni sempre maggiori del siero). Dato che nellelettroforesi la maggior parte degli anticorpi forma il terzo picco di migrazione questi sono anche definiti -globuline. Sono prodotti dai linfociti B sotto forma di molecole di membrana che servono da recettore per lantigene; quando il linfocita B viene stimolato parte la produzione di anticorpi anche in forma secreta; sono sintetizzati sui ribosomi del RER e associate con ponti disolfuro nel RE; dopo lassemblaggio le Ig sono convogliate alle cisterne dellapparato del Golgi e trasportate verso la membrana. I linfociti B che producono anticorpi ad affinit pi elevata sono stimolate dallantigene in maniera preferenziale e diventano al popolazione dominante ad una successiva riesposizione secondo un processo detto MATURAZIONE DELLAFFINITA. La loro struttura stata definita grazie alla tecnica dell ibridoma, che prevede la fusione di un linfocita B normale e di uno di mieloma. Tutti gli anticorpi hanno identiche caratteristiche strutturali, ma una notevolissima variabilit nelle regioni che legano lantigene: ogni anticorpo formato da una struttura simmetrica di 2 catene leggere identiche (24 KD) e di 2 catene pesanti anchesse identiche (55-70 KD). Ognuna delle catene leggere legata ad una catena pesante da ponti disolfuro, cosi come le 2 catena pesanti tra loro. Tutte le catene contengono una serie di unit omologhe di 110 a.a. che si ripiegano a formare un motivo globulare, il dominio Ig, che contiene 2 strati di foglietto formati da 4-5 nastri antiparalleli (SUPERFAMIGLIA DELLE IG). Le catene, pesanti e leggere, presentano una regione variabile (V) N-terminale e una regione costante (C) C-terminale. Nelle catene pesanti la regione V contiene un solo dominio Ig,mentre la regione C ne contiene 3-4; nelle catene leggere sia la regione V che la regione C contiene un solo dominio Ig. La regione V di una catena pesante (VH) giustapposta alla regione V di una catena leggera (VL) a formare il sito di legame per lantigene; quindi ogni molecola Ig ha 2 siti di legame per lantigene. La regione V possiede 3 segmenti ipervariabili, tenuti assieme da cornici pi conservative, e sono indicati con le sigle CDR1, CDR2 e CDR3. Gli anticorpi sono distinti in classi, o ISOTIPI (IgA,IgD,IgE,IgG e IgM), e sottoclassi in base alla struttura delle regioni C delle catene pesanti; la maggior parte delle Pagina 6 di 61

funzioni effettrici proprio data dal legame delle regioni C delle catene pesanti su recettori cellulari o proteine del complemento. Quindi la regione V responsabile del riconoscimento dellantigene grazie alle sequenze amminoacidiche specifiche in essa contenute. La regione C responsabile delle funzioni effettrici,principalmente le regioni C delle catene pesanti,perch queste legano lanticorpo sulla superficie dei linfociti B. Le molecole anticorpali sono flessibili grazie ad una regione cerniera sita in certi isotipi tra i domini CH1 e CH2 (10-60 a.a.). Esistono 2 isotipi di catena leggera che si differenziano per le regioni C-terminali e denominate e . Ogni Ig possiede o due catene o due catene . Gli anticorpi possono essere espressi in 2 forme: nella forma secreta la sequenza Cterminale costituita da residui carichi ed idrofili, nella forma di membrana la sequenza C-terminale presenta 26 a.a. con catene laterali idrofobiche seguiti da residui basici. Con il clivaggio proteolitico delle IgG si ottengono frammenti con caratteristiche strutturali e funzionali differenti: le IgG di coniglio trattate con papaina si separano in 3 frammenti, 2 che conservano la capacit di legare lantigene detti Fab (fragment antigen binding) e un terzo, detto Fc, che conserva la capacit di attivare il complemento. Se invece le IgG di coniglio sono trattate con pepsina,il clivaggio interessa la regione C-terminale e si formano due frammenti: un frammento contenente i due domini Fab in grado di legare lantigene e la regione cerniera con i due ponti disolfuro , il secondo frammento invece non sar in grado di legarsi allo specifico recettore presente sulla superficie delle cellule effettrici. La presenza di anticorpi specifici prende il nome di DIVERSIFICAZIONE e linsieme degli anticorpi dotati delle diverse specificit detto REPERTORIO ANTICORPALE.

Antigene
ogni sostanza in gradi di legarsi specificamente ad una molecola anticorpale o ad un recettore antigenico sui linfociti T: gli anticorpi possono riconoscere come antigene quasi ogni tipo di molecola biologica (intermedi metabolici, zuccheri, lipidi , ormoni, carboidrati complessi, acidi nucleici e proteine), i linfociti T riconoscono solo peptici. Tutte le molecole che sono in grado di innescare una risposta immunitaria sono definite IMMUNOGENI. Solo le macromolecole possono stimolare i linfociti B, quindi una piccola molecola, APTENE, coniugata ad una macromolecola, CARRIER, affinch il complesso aptene-carrier possa comportarsi da immunogeno. Lanticorpo si lega ad una sola porzione della macromolecola, lEPITOPO, e una macromolecola che possiede determinanti multipli in uno stesso antigene detta multivalente. Lorganizzazione spaziale pu influire sul legame con gli anticorpi (effetto allosterico). Pagina 7 di 61

Gli epitopi formati da una sequenza lineare di a.a. sono detti DETERMINANTI LINEARI (6 a.a.) e sono accessibili agli anticorpi se esposti sulla superficie esterna dellantigene. I DETERMINANTI CONFORMAZIONALI sono formati da a.a. non in sequenza e si creano per la giustapposizione spaziale. Le proteine possono andare incontro a modifiche e quindi generare nuovi epitopi detti DETERMINANTI NEOANTIGENICI. Il riconoscimento dellantigene da parte dellanticorpo presuppone un legame non covalente e reversibile, e la forza di legame tra un singolo sito combinatorio e un epitopo antigenico viene chiamata AFFINITA dellanticorpo, espressa come costante di dissociazione (Kd) che definisce la concentrazione di antigene necessaria per occupare i siti combinatori di met delle molecole di Ig presenti in una data soluzione di anticorpo. LAVIDITA la forza complessiva fra il legame degli anticorpi a tutti gli epitopi antigenici. Solo linterazione completa fra antigene polivalente e anticorpi permette di innescare in maniera ottimale molte delle funzioni effettrici svolte dagli anticorpi stessi. Le diverse funzioni effettrici degli anticorpi sono innescate dal legame specifico degli antigeni e dal coinvolgimento di altre molecole o cellule effettrici; lelevato grado di specificit necessario ad evitare che gli anticorpi reagiscano con strutture autologhe correlate a strutture estranee. Quando stimolato dallantigene un clone di linfociti B pu produrre anticorpi di isotipo diverso (regione C diversa) ma con gli stessi domini V (SCAMBIO ISOTIPICO).

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4. COMPLESSO MAGGIORE ISTOCOMPATIBILITA

Gli antigeni microbici sono presentati ai linfociti T da una particolare classe di proteine codificate da geni che mappano nel locus denominato COMPLESSO MAGGIORE DI ISTOCOMPATIBILITA MHC. Le molecole MHC sono parte integrante dei ligandi riconosciuti dai linfociti T e si distinguono in molecole MHC di classe I e di classe II, e quelle umane sono chiamate antigeni leucocitari umani HLA. I 2 tipi di geni MHC, che sono polimorfi (esistono forme alternative presenti in una percentuale variabile degli individui di una data popolazione), codificano 2 gruppi di proteine omologhe ma strutturalmente distinte. Sono geni espressi in maniera codominante, cio ogni individuo esprime gli alleli MHC presenti su entrambi i cromosomi, permettendo di sfruttare al massimo il numero di molecole MHC disponibili a legare peptici antigenici. Il set di alleli presenti su ciascun cromosoma definito APLOTIPO MHC. Ogni molecola MHC contiene una tasca di legame per il peptide, seguita da una coppia di domini a tipo Ig, ed ancorata alla cellula da un dominio transmembrana e da un dominio intracitoplasmatico. I residui aminoacidici polimorfi sono situati allinterno e nelle vicinanze della tasca di legame per il peptide, che formata dal ripiegamento dellestremit N-terminale delle catene: composta da una coppia di -eliche che formano le pareti che sono montate su un pavimento di 8 foglietti . I domini Ig non polimorfi contengono siti di legame per i recettori CD4 (helper) e CD8 (CTL) dei linfociti T. Cd4 si lega alle molecole MHC di classe II,mentre CD8 si lega alle molecole MHC di classe I.

Molecole MHC di classe I

Sono formate da 2 catene polipeptidiche associate non covalentemente: catena : 44-47 KD, che codificata nellMHC; catena 2-microglobulina: che non codificata nellMHC. La catena disposta per i della sua lunghezza allesterno della cellula; un breve segmento idrofobico attraversa la membrana; i residui C-terminale sono situati nel citoplasma. Nella catena , allestremit N-terminale, troviamo 2 domini, 1 e 2, ciascuno di circa 90 a.a. che formano il pavimento degli 8 nastri antiparalleli di foglietto che sostengono 2 pareti di -elica (le estremit della tasca sono chiuse). La tasca pu accogliere peptidi di 8-11 a.a., quindi le proteine globulari devono essere processate per generare frammenti pi piccoli. Pagina 9 di 61

I domini 1 e 2 sono polimorfi e sono responsabili del legame del peptide e del riconoscimento da parte di cloni di linfociti T differenti. Ogni individuo eterozigote esprime su ogni cellula nucleata 6 diverse molecole di classe I, codificate dai 2 alleli dei geni HLA-A, HLA-B e HLA-C. Il dominio 3 presenta una sequenza che conservata in tutte le molecole di classe I e serve come sito di legame per CD8+. La 2-microglobulina, che non codificata da un gene dellMHC, interagisce in maniera non covalente con 3, possiede la struttura di un dominio Ig e non varia fra l e varie molecole di classe I. Una molecola di classe I completamente assemblata un eterotrimero di catena , 2microglobulina e peptide antigenico legato. La loro espressione stabile sulla membrana richiede la presenza di tutti e tre i componenti.

Molecole MHC di classe II

Sono formate da 2 catene polipeptidiche associate non covalentemente, codificate da geni MHC polimorfi: catena : 32-34 KD; catena : 29-32 KD. La tasca di legame per il peptide data dallinterazione dei segmenti N-terminali 1 e 1, quindi 4 nastri di foglietto sono dati da 1 e 4 da 1. Anche in questo caso i residui polimorfi sono localizzati allinterno e allestremit della tasca, le quali per sono aperte in modo da poter accogliere peptidi anche maggiori di 30 a.a. I segmenti 2 e 2 formano domini Ig e non sono polimorfi, ma il dominio 2 possiede la regione di legame per CD4. il numero totale di molecole di classe II espresse da un individuo eterozigote di circa 10-20. Le estremit C-terminali si continuano con un elemento di connessione seguito da 25 a.a. idrofobici transmembrana e una breve coda citoplasmatica. Alle molecole MHc di classe II neosintetizzate sono associati peptici non polimorfi chiamati catene invarianti. Queste condizionano il legame dellantigene nella tasca della molecola stessa. Una molecola di classe II completamente assemblata un eterotrimero composto da una catena , da una catena e dal peptide antigenico legato.

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Interazione peptide-MHC

Ogni peptide verso il quale si possa generare una risposta immunitaria deve possedere residui per il riconoscimento delle sequenze polimorfe delle molecole MHC e residui che vengono riconosciuti dai linfociti T(epitopi). Ogni molecola MHC possiede una sola tasca di legame per il peptide e in momenti diversi pu ospitare peptidi differenti. I residui del peptide che si legano allMHC sono differenti da quelli che si legano ai linfociti T. Le molecole MHC non distinguono fra peptidi estranei e autologhi e quindi esprimono sia peptidi self che estranei. Quindi i linfociti T controllano i peptidi complessati con le molecole MHC in modo tale da individuare solo i peptidi estranei verso i quali diretta la risposta immunitaria. Linterazione a bassa affinit, con un tasso di associazione basso e un tasso di dissociazione ancora inferiore che permette ai complessi MHC-peptide di rimanere sulla superficie delle cellule che presentano lantigene abbastanza a lungo da permettere linterazione con i linfociti T. Il legame dei peptidi alle molecole MHC uninterazione non covalente fra i residui del peptide e della tasca dellMHC. I residui che si legano alla tasca nelle nicchie dei foglietti sono detti RESIDUI ANCORA, e si trovano nel mezzo o nella fine del peptide e ognuno ne contiene 1 o 2 (non tutti i peptidi li posseggono). Le -eliche intervengono sul peptide con ponti idrogeno o con ponti ionici. Per il riconoscimento antigenico i residui peptidici sono responsabili della specificit, i residui dellMHC influiscono sulla risposta immunitaria. Quindi la specificit del riconoscimento antigenico dovuto alla selettivit del recettore per lantigene dei linfociti T.

Organizzazione MHC
Nelluomo il complesso MHC mappa sul braccio corto del cromosoma 6, mentre la 2microglobulina sul cromosoma 15. lMHC umano occupa un segmento di DNA di 35000 Kb e codifica per molte molecole coinvolte nella processazione dellantigene e nella presentazione di questi ai linfociti T: TAP: proteina eterodimerica che trasporta peptidi dal citosol al RE, dove si associano a molecole MHC di classe I neosintetizzate; PROTEASOMA: genera i peptidi dalle proteine citosoliche; HLA-DM: proteina coinvolta nel legame dei peptidi alle molecole di classe II. Tra i geni di classe I e classe II alcuni geni codificano componenti del sistema del complemento, 3 citochine (TNF,linfotossina e linfotossina )e alcune proteine da stress; questi geni nellinsieme sono definiti MHC di classe III.

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Le molecole di classe I sono espresse costitutivamente su tutte le cellule nucleate: i linfociti T CD8, ristretti per la classe I, uccidono le cellule infettate da microbi intracellulari, come i virus, e dato che questi possono infettare tutte le cellule nucleate i ligandi riconosciuti da CD8 devono essere espressi da tutte le cellule nucleate. Le molecole di classe II sono espresse su cellule dendritiche, linfociti B, macrofagi e pochi altri tipi cellulari: i linfociti T CD4, ristretti per la classe II, eliminano i microbi extracellulari ed attivano i macrofagi ed i linfociti B, quindi devono interagire con n numero ristretto di tipi cellulari. Lespressione delle molecole MHC potenziata dalle citochine, prodotte sia nel corso delle risposte immunitarie innate che delle specifiche: IFN-, IFN- e IFN- aumentano lespressione dei geni di classe I, IFN- aumenta lespressione dei geni di classe II (pu essere prodotto dalle cellule NK nella risposta immunitaria innata). Le citochine potenziano lespressione dellMHC stimolando il tasso di trascrizione dei geni di classe I e II mediante il legame a fattori trascrizionali nei promotori dei geni MHC. Molti fattori di trascrizione possono essere assemblati e legarsi ad una proteina detta attivatore della trascrizione della classe II (CIITA): il complesso si lega al promotore e favorisce la trascrizione. Anche il CIITA viene sintetizzato in risposta a IFN-.

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5. PROCESSAZIONE E PRESENTAZIONE DELLANTIGENE AI LINFOCITI T

Le cellule che espongono peptidi associati alle molecole MHC ai linfociti T sono dette APC, cellule presentanti lantigene. I linfociti T sono specifici per la sequenza aminoacidica del peptide e li discriminano anche per un solo a.a., mentre i linfociti B possono riconoscere determinanti presenti anche in proteine globulari. La trasformazione da parte delle APC delle proteine native in frammenti peptidici che si legano alle molecole MHC prende il nome di PROCESSAZIONE DELLANTIGENE, inoltre le APC forniscono segnali ulteriori rispetto alla sola interazione con il complesso MHC-peptide, e sono detti SEGNALI COSTIMOLATORI. Gli epitopi antigenici pi capaci di evocare una risposta T sono spesso quei peptidi che si legano con maggiore avidit ai complessi MHC, e per questo sono detti EPITOPI IMMUNODOMINANTI. N.B. I linfociti T riconoscono solo peptidi; possono discriminare tra i diversi peptidi in quanto possiedono una elevata specificit per la sequenza amminoacidica dellepitopo. Inoltre rispondono agli antigeni estranei soltanto quando i peptidi da essi derivati sono presentati sulla superficie delle APC. I linfociti B invece sono in grado di riconoscere proteine,peptidi, acidi nucleici,polisaccaridi,lipidi e composti chimici di piccole dimensioni che attivano la risposta umorale. A differenza dei linfociti T,i linfociti B e gli anticorpi da essi secreti legano sia gli antigeni solubili presenti nei fluidi corporei,sia gli antigeni espressi sulla superficie cellulare. Questo dipende dal fatto che i linfociti T durante la maturazione vanno incontro ad un processo di restrizione per lMHC self,cos che maturano solo i linfociti T che sono in grado di riconoscere i peptidi legati alle molecole MHC. I linfociti T CD4 riconoscono gli antigeni legati alle molecole MHC di classe II. Questi sono antigeni che derivano da proteine extracellulari internalizzate dalle APC in vescicole endocitiche. I linfociti T CD8 invece riconoscono gli antigeni,rappresentati da proteine citosoliche di derivazione endogena,legati alle molecole MHC di classe I. Per indurre una risposta T verso un antigene proteico,lantigene deve essere somministrato insieme a sostanze adiuvanti(sostanze di derivazione microbica di cui svolgono la funzione) che agiscono: -inducendo una infiammazione locale,stimolando la produzione di citochine e lafflusso di cellule accessorie -attivando le cellule accessorie,aumentando lespressione di molecole di costimolazione Pagina 13 di 61

-prolungando la persistenza dei complessi MHC-peptide sulla superficie della cellula APC

Tipi di APC

Le cellule accessorie assolvono a due funzioni fondamentali: 1) Convertono gli antigeni proteici in peptidi e li complessano con molecole MHC self per il riconoscimento da parte dei linfociti T 2) Forniscono segnali di costimolazione ai linfociti T in seguito alla loro interazione con il complesso MHC-peptide per una loro piena attivazione CELLULE DENDRITICHE : presentano lantigene ai linfociti T CD4 e CD8 e sono le pi efficaci nel dare inizio alle risposte immunitarie T-dipendenti, in quanto esprimono costitutivamente un elevato livello di segnali costimolatori; un tipo di cellule dendritiche sono le cellule di Langerhans, che captano lantigene nel sottocute, migrano nel derma e raggiungono i linfonodi secondo un processo stimolato da chemochine, e durante la migrazione maturano ed esprimono livelli pi elevati di molecole MHC di classe II e costimolatori. MACROFAGI : fagocitano particelle di dimensioni cospicue e sono stimolati da IFN- ad esprimere MHC, in particolar modo di classe II. Intervengono nella presentazione di antigeni derivati da agenti infettivi (batteri e parassiti). LINFOCITI B : captano e internalizzano antigeni proteici solubili, li processano e presentano ai linfociti T i peptidi da essi derivati.

Processazione antigene in MHC di classe I

1. PRODUZIONE DI PROTEINE CITOSOLICHE: gli antigeni estranei del citosol possono essere il prodotto di virus o di altri microrganismi, ma sono presenti anche molte proteine autologhe. 2. DEGRADAZIONE PROTEOLITICA DELLE PROTEINE CITOSOLIHE: le proteine citosoliche sono degradate da un complesso enzimatico dotato di attivit proteolitica presente nel citosol, il proteasoma, che ha una specificit di substrato molto ampia e pu generare una vasta gamma di peptidi di 6-30 a.a. 3. TRASPORTO PEPTIDI DAL CITOSOL AL RE: il trasporto dal citosol al RE mediato dalla proteina TAP, localizzata nel RE, con trasporto attivo ATPdipendente; TAP legata in maniera non covalente sul lato interno della membrana del RE alle molecole MHC di classe I da una proteina di collegamento detta TAPASINA. 4. ASSEMBLAGGIO COMPLESSO PEPTIDE-MHC DI CLASSE I: la catena e la 2-microglobulina sono sintetizzate nel RE, e il ripiegamento della catena Pagina 14 di 61

favorito da diverse chaperonine del RE; quando il peptide entra nel RE grazie a TAP viene subito convogliato alla molecola MHC di classe I vuota. Il complesso quindi si stacca dalla tapasina ed asce dal RE. 5. ESPRESSIONE DEI COMPLESSI PEPTIDE-MHC DI CLASSE I: i complessi MHC-peptide stabili di classe I prodotti nel RE migrano nel complesso di Golgi e da qui sono trasferiti sulla membrana cellulare su vescicole esocitiche e riconosciute dai linfociti T CD8 specifici (CTL). N.B: Due sono le differenza tra la processazione in classe I e II: 1)I peptidi trasportati nel RE si legano a molecole MHC di classe I e non di classe II perch le molecole MHC di classe I sono mantenute dalla tapasina allimboccatura del complesso TAP. 2)La tasca dell MHC di classe II occupata dalla catena invariante e non disponibile per legare il peptide.

Processazione antigene in MHC di classe II

1. CAPTAZIONE DELLE PROTEINE EXTRA-CELLULARI: lantigene nativo viene captato da una APC e internalizzato per pinocitosi o endocitosi; dopo linternalizzazione gli antigeni proteici si ritrovano in endosomi a pH acido, che intersecano la via di traffico dei lisosomi. 2. PROCESSAZIONE DELLE PROTEINE INTERNALIZZATE: le proteine internalizzato sono degradate enzimaticamente negli endosomi e nei lisosomi da proteasi che agiscono a pH acido, generando peptidi; le proteasi pi rappresentate sono le catepsine. 3. BIOSINTESI E TRASPORTO MOLECOLE MHC DI CLASSE II AGLI ENDOSOMI: le molecole MHC di classe II sono sintetizzate nel RE, e lassemblaggio delle catene e e il loro ripiegamento favorito da chaperonine; nel RE queste molecole sono associate ad una catena invariante Ii, che va ad occupare la tasca di legame ( formata da 3 subunit ciascuna delle quali va ad occupare una tasca di legame), in modo che i peptidi che devono essere legati alle molecole di classe I presenti nel RE non si leghino alle molecole di classe II. Durante il transito delle vescicole esocitiche verso la superficie cellulare queste incontrano le vescicole endocitiche, contenenti gli antigeni processati, e si fondono con esse. 4. ASSOCIAZIONE PEPTIDE-MHC II: nel MIIC gli enzimi proteolitici agiscono su Ii fino a lasciare uno spezzone di 24 a.a. detto CLIP, che sua volta rimosso dalla molecola HLA-DM. 5. ESPRESSIONE DEI COMPLESSI PEPTIDE-MHC DI CLASSE II: le molecole MHC di classe seconda sono stabilizzate dal legame col peptide, e i complessi sono portati sulla superficie cellulare delle APC, dove sono riconosciuti dai linfociti T CD4 (helper), i quali necessitano di riconoscere un numero di circa 100 complessi per essere attivati. Pagina 15 di 61

6. RECETTORE PER LANTIGENE ACCESSORIE DEI LINFOCITI T

MOLECOLE

I linfociti T hanno una duplice specificit: riconoscono residui polimorfi delle molecole MHC self e residui del peptide antigenico presentato dalle molecole MHC. Il recettore che riconosce i complessi MHC-peptide prende il nome RECETTORE DEI LINFOCITI T-TCR, ed clonalmente distribuito, cio cloni di linfociti T con diverse specificit esprimono un TCR diverso. I segnali evocati nel linfocita T sono trasdotti da proteine non polimorfiche chiamate CD3 e , che sono associate a formare il COMPLESSO CDR.

Recettore
il recettore per lantigene dei linfociti T CD4 e CD8 ed un eterodimero formato da 2 catene polipeptidiche transmembrana, e , legate da un ponte disolfuro. Entrambe le catene contengono un dominio Ig variabile (V) N-terminale, un dominio Ig costante (C), una regione idrofobica transmembrana e una breve regione citoplasmatica. La regione V delle catene del TCR contiene 3 tratti in cui si concentra la variabilit, i CDR, inoltre la catena contiene una quarta regione ipervariabili, sito di legame per i superantigeni (prodotti microbici); la variabilit maggiore concentrata in CDR3. La regione transmembrana presenta a.a. di carica positiva. Il sito di legame per lantigene del TCR una superficie planare formata dalle CDR delle 2 catene. Laffinit del TCR per i complessi MHC-peptide molto bassa, cos come il tasso di dissociazione della reazione; per questo motivo sono necessarie molecole accessorie che stabilizzano ladesione dei linfociti T alle APC.

Sono associate in modo non covalente alleterodimero del TCR. CD3 costituito da 3 proteine, --, un omodimero. Sono proteine monomorfe identiche in tutti i linfociti T e in tutti gli individui di una specie. Le catene -- presentano un dominio Ig extracellulare, il segmento transmembrana un residuo negativo, che quindi interagisce con i residui positivi del segmento transmembrana del recettore . Ognuno dei domini intracitoplasmatici contiene un motivo conservato, la sequenza ITAM, che contiene 2 sequenze tiroxina-x-x-leucina, e sono coinvolte nella traduzione del segnale. Pagina 16 di 61

Proteine CD3 e

La catena presenta una breve regione extracellulare, un dominio transmembrana a carica negativa e una lunga coda citoplasmatica con 3 sequenze ITAM. Il primo evento che si verifica nei linfociti T dopo il riconoscimento dellantigene la fosforilazione dei residui di tirosina presenti nelle ITAM. La fosfotirosina diventa sito di aggancio per tirosin-chinasi, la cui attivazione stimola vie di traduzione del segnale che culminano nella modificazione e nellespressione genica dei linfociti T.

un secondo tipo di recettore antigenico eterodimerica espresso su una sottopopolazione di linfociti T scarsamente rappresentati. Le catene e sono costituite da regioni V e C extracellulari di tipo Ig, da una regione cerniera, da un dominio transmembrana a carica positiva e da una breve coda citoplasmatica. La regione transmembrana interagisce con CD3. I linfociti che esprimono questo tipo di recettore non riconoscono peptidi in associazione a molecole MHC e sono per lo pi presenti negli epiteli.

Recettore

Molecole accessorie dei linfociti T

Si legano ai ligandi presenti sulle APC, sulle cellule endoteliali vascolari e nella matrice extracellulare. Sono proteine non polimorfe che possono regolare la risposta T o modulare la forza di adesione fra APC e linfociti T.

CD4 e CD8

Sono anche chiamate CORECETTORI (il 65% dei linfociti T esprime CD4, il 35% CD8) e sono glicoproteine transmembrana della superfamiglia delle Ig espresse dai linfociti T che si legano a regioni non polimorfe delle molecole MHC, quando il linfocita T si combina con il complesso MHC-peptide delle APC; la funzione principale quella di trasmettere un segnale nel momento del riconoscimento antigenico (mediante la tirosin-chinasi Lck legata alla coda citoplasmatica) e rafforzare ladesione dei linfociti T alle APC. CD4 un monomero dotato di 4 domini Ig extracellulari, una regione transmembrana idrofobica e una coda citoplasmatica; si lega al dominio non polimorfo 2 delle molecole MHC di classe II mediante 2 domini Ig N-terminali. CD8 un eterodimero formato da 2 catene omologhe legate da ponti disolfuro, con un dominio Ig extracellulare, un segmento transmembrana e una coda citoplasmatica; si lega al dominio non polimorfo 3 delle molecole MHC di classe I mediante il dominio Ig.

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CD28 una proteina transmembrana che trasduce segnali complementari a quelli del complesso TCR per lattivazione dei linfociti T vergini: il primo segnale costituito dal legame dei complessi MHC-peptide al TCR e ai recettori CD4 e CD8; il secondo segnale fornito da costimolatori. I COSTIMOLATORI per i linfociti T sono B7-1 e B7-2, espressi dalle APC e interagiscono con CD28, un omodimero della superfamiglia delle Ig: il suo legame a B7 trasduce nel linfocita T lespressione di proteine anti-apoptotiche, di citochine e inoltre favorisce la proliferazione e la differenziazione dei linfociti T. CTLA-4 sempre recettore per le B7 ma la sua funzione inibire CD28, contrastandone i segnali.

CD28 CTLA-4

Molecole accessorie con funzione di trasmissione di segnale

CD45 : una glicoproteine di membrana con dominio citoplasmatico tirosinfosfatasico. La famiglia CD45 composta da vari componenti tutti prodotti da un solo gene di 34 esoni; i trascritti di RNA di 3 esoni vanno incontro a splicing alternativo, generando fino a 8 prodotti differenti. Il dominio citoplasmatico (750 a.a.) contiene una regione dotata di attivit tirosin-fosfatasica che defosforila numerosi substrati, fra cui Lck, attivandola. CD2 : una glicoproteine espressa su pi del 90% dei linfociti T maturi e il ligando principale LFA-3, espresso su cellule ematiche e non.

Integrine
Sono proteine eterodimeriche espresse sui leucociti, il cui dominio citoplasmatico connesso al citoscheletro; le principali sono LFA-1 e VLA. Uno dei ligandi di LFA ICAM-1, una glicoproteine di membrana espressa su un ampia gamma di cellule, ematiche e non. Mediano ladesione dei linfociti T alle APC, alle cellule endoteliali e alle proteine della matrice extracellulare.

Selectine
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Sono proteine in grado di legarsi ai carboidrati delle glicoproteine espresse sullendotelio alto dei capillari linfonodali, e regolano la migrazione leucocitaria nei diversi tessuti. La L-selectina presente a livelli elevati sui linfociti T vergini e media la loro migrazione nei linfonodi.

7. MATURAZIONE DEI LINFOCITI ED ESPRESSIONE DEI GENI DEL RECETTORE PER LANTIGENE
La MATURAZIONE LINFOCITARIA il processo attraverso cui i precursori linfocitari derivati dal midollo si trasformano in linfociti maturi, e la caratteristica centrale del processo maturativo lespressione dei geni del recettore per lantigene; lintera gamma di recettori, espressi dai linfociti B e T, il repertorio linfocitario. I linfociti B maturano nel midollo osseo, i linfociti T nel timo e le fasi precoci della maturazione sono caratterizzate da unelevata attivit mitotica stimolata da IL-7. Ogni clone linfocitario esprime un recettore di struttura unica, sono 1 miliardo a pi i cloni linfocitari differenti, e derivano tutti da stesse sequenze di DNA che, secondo un processo di RICOMBINAZIONE SOMATICA, vengono diversamente ricongiunte. La ricombinazione mediata dal complesso enzimatico RICOMBINASI V(D)J espresso solo dai linfociti immaturi negli organi linfoidi primari; se il processo non genera recettori funzionali il linfocita che lo esprime ma incontro ad apoptosi, difatti meno del 10% delle cellule generate arrivano a maturazione completa.

SEZIONE III

Organizzazione dei loci Ig

Esistono 3 loci separati, ognuno su un cromosoma diverso, che codificano per la catena leggera , la catena leggera e tutte le catene pesanti. Ogni locus Ig composto da 3 tipi diversi di segmenti genici V, J e C (il locus IgH possiede anche segmenti D). Allestremit 5 di ogni locus Ig si trova un gruppo di segmenti genici V (300 bp) separati tra loro da tratti di DNA non codificante. In posizione 3 rispetto ai geni V si trovano i segmenti genici C. Tra i geni V e C si trovano altre sequenze codificanti che formano i segmenti genici J; nel locus della catena pesante si trovano anche i segmenti D. Le sequenze di DNA non codificante contengono sequenze di riconoscimento che condizionano la ricombinazione fra i differenti segmenti genici e sequenze che regolano la trascrizione e lo splicing dellRNA.

Ricombinazione V(D)J ed espressione dei geni delle Ig

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Nel linfocita B la prima ricombinazione si verifica nel locus della catena pesante e porta al congiungimento con uno dei segmenti D con uno dei segmenti J, con formazione del complesso D-J; a questo punto un segmento V, in posizione 5 rispetto a D-J, si collega a questo complesso creando V-D-J. In questa fase tutti i segmenti D in 5, rispetto al segmento D riarrangiato, e tutti i segmenti V in 3, rispetto al segmento V riarrangiato, vengono eliminati. I geni della regione C sono separati da VDJ dal tratto di DNA che contiene i geni J pi distali. LRNA primario viene generato per trascrizione di tutto il complesso VDJ riarrangiato fino ai geni C; prima che lRNA sia funzionale deve subire un processo di splicing per la rimozione degli introni compresi fra il gene J e il gene C. Il locus della catena pesante si riarrangia per primo su uno dei 2 cromosomi e se il processo va a buon fine viene sintetizzata una catena , che blocca il riarrangiamento del locus della catena pesante sullaltro cromosoma mediante modificazioni nella struttura della cromatina; se il primo riarrangiamento non stato produttivo, i geni della catena pesante sul secondo cromosoma possono riarrangiare: questo fenomeno, di ESCLUSIONE ALLELICA, garantisce che ogni l linfocita B abbia una sola specificit. La produzione della catena stimola anche il riarrangiamento della catena leggera; il locus riarrangia per primo e se viene prodotta una catena leggera si blocca il riarrangiamento a livello del locus : questo fenomeno, di ESCLUSIONE ISOTIPICA, garantisce che un certo linfocita B possa produrre un solo tipo di catena leggera.

Organizzazione dei loci del TCR

I geni che codificano la catena , la catena e la catena del TCR mappano in 3 loci separati; il gene che codifica per la catena situato allinterno del gene per la catena . Ogni locus comprende 3 tipi di segmenti genici V, J e C (i loci e possiedono anche segmenti D). Allestremit 5, di ognuno dei loci TCR, si trovano i segmenti genici V; i prodotti microbici detti superantigeni si legano alla quarta CDR della regione V della catena del TCR. In posizione 3 rispetto ai segmenti V, si trovano i segmenti genici C. I segmenti J sono interposti fra i segmenti V e C; nei loci della catena e si trovano anche segmenti D.

Nelle cellule destinate ad esprimere un TCR il locus della catena si riarrangia prima di quello della catena . Lespressione della catena blocca il riarrangiamento del locus della catena su entrambi i cromosomi facendo diminuire gli enzimi che mediano la ricombinazione e limitando laccessibilit dellaltro alleli agli enzimi stessi:

Ricombinazione V(D)J ed espressione dei geni del TCR

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lesclusione allelica della catena fa si che un linfocita T maturo esprima solo uno dei 2 alleli della catena ereditati. Il riarrangiamento della catena si pu verificare su entrambi i cromosomi perch in questo caso non vale la regola dellesclusione allelica; quindi uno stesso linfocita T pu esprimere 2 TCR diversi, dotati della stessa catena e di 2 catene differenti.

Meccanismi di ricombinazione somatica dei geni del recettore per lantigene

Il riarrangiamento dei geni Ig e TCR coinvolge segmenti genici non omologhi ed mediata dagli enzimi della RICOMBINASI V(D)J, codificata dai geni RAG1 e RAG2 e di cui fanno parte anche enzimi di riparazione del DNA presenti in molti tipi cellulari. La ricombinasi riconosce le sequenze di ricombinazione del DNA, che sono site in 3 rispetto ai segmenti genici V, in 5 rispetto ai segmenti genici J e ad entrambi i lati nei segmenti D. Le sequenze di ricombinazione sono costituite da un eptamero, adiacente alla regione codificante seguito da 12 o 23 nucleotidi non conservati, e da un nonamero. La ricombinasi riconosce i le sequenze, rompe entrambi i filamenti di DNA e ricongiunge i monconi; talvolta alcuni geni sono in orientamento trascrizionale opposto, quindi la ricombinasi inverte lorientamento del DNA interposto.

Diversificazione del repertorio dei linfociti B e T

DIVERSITA COMBINATORIA : ogni clone di linfociti B esprime nelle catene leggere e pesanti delle Ig una combinazione di segmenti genici V, D e J assolutamente unica, cos come ogni clone di linfociti T esprime nelle catene e del TCR una combinazione V,D e J unica. Il numero di combinazioni possibili per locus dato dal prodotto del numero dei segmenti V, J e D, anche se il grado reale di diversit combinatoria molto minore rispetto alla teoria. DIVERSITA GIUNZIONALE: si produce per la rimozione o laggiunta di nucleotidi nel punto di unione fra V e D, fra D e J o fra V e J, mediata dallenzima TdT. La diversit giunzionale responsabile delle regioni ipervariabili CDR3, alla giunzione tra le regioni V e C.

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Maturazione dei LINFOCITI B

1. I primi progenitori midollari sono chiamati cellule pro-B: non producono Ig ma esprimono molecole come CD19 e CD10. 2. Le cellule che sintetizzano la catena pesante sono le cellule pre-B: una parte delle catene pesanti presenti nel citosol si associa ad una catena leggera sostitutiva, con la formazione dei recettori pre-B che vengono espressi sulla membrana cellulare,dove si associano con le proteine Ig e Ig che sono deputate a trasdurre allinterno della cellula segnali necessari a far proseguire la maturazione. 3. Le cellule che sintetizzano le catene leggere sono i linfociti B immaturi: la catena leggera si associa alla catena pesante e la molecola IgM completa viene espressa sulla superficie cellulare associata alle proteine Ig e Ig; queste cellule non proliferano e non si differenziano in risposta allantigene. 4. Le cellule che iniziano a coesprimere IgM e IgD sono i linfociti B maturi: sia IgM che IgD hanno la medesima regione V, quindi la medesima specificit; queste cellule sono funzionali e lasciano il midollo osseo per entrare negli organi linfoidi periferici. 5. Una volta stimolati dagli antigeni e da altri segnali i linfociti B maturi sono definiti linfociti T attivati, che proliferano e sintetizzano Ig in forma secreta. Parte della progenie dei linfociti T attivati va incontro a scambio isotipico esprimendo catene pesanti differenti, altri linfociti si trasformano in cellule della memoria. 6. La differenziazione indotta dallantigene nei linfociti B vergini o della memoria culmina nello sviluppo delle cellule secernenti anticorpi, o plasmacellule.

I componenti di ogni clone di linfociti B esprimono sempre la stessa regione V, mantenendo la stessa specificit antigenica, ma nel corso della risposta allantigene si verificano minime modificazioni a carico della regione V degli anticorpi secondo un processo noto come MATURAZIONE DELLAFFINITA. Allinterno dei linfociti B esiste una sottopopolazione, denominata B-1, che esprime sulla membrana la molecola CD5 (5% linfociti in circolo); si trovano in gran numero a livello peritoneale e secernono IgM contro polisaccaridi microbici o antigeni self; tutte le leucemie linfatiche croniche B derivano da linfociti B CD5. Pagina 22 di 61

La SELEZIONE NEGATIVA il processo secondo il quale linfociti B immaturi che esprimono recettori ad elevata affinit per antigeni autologhi vanno incontro o ad apoptosi o restano non funzionali. Alcuni linfociti B immaturi che riconoscono gli antigeni autologhi possono essere indotti a modificare la propria specificit tramite un editing recettoriale, con la produzione di una nuova catena leggera e con la conseguente espressione di un diverso recettore Ig non autoreattivo.

Maturazione dei LINFOCITI T

I linfociti T originano da precursori del midollo osseo che maturano nel timo, e qui sono detti timociti. Gli stimoli necessari per la proliferazione e la maturazione arrivano da cellule epiteliali timiche, da macrofagi e da cellule dendritiche e sono costituiti da molecole MHC e da citochine: nella corticale del timo le cellule esprimono MHC di classe II, nella midollare sia MHC di classe I che di classe II; la pi importante citochina IL-7. Il tasso di proliferazione e apoptosi dei timociti della corticale molto elevato, difatti il 95% della progenie di un singolo precursore va in apoptosi prima di raggiungere la midollare. 1. I timociti pi immaturi non esprimono n TCR n CD4 o CD8, e sono detti timociti doppio-negativi, che si trovano nello stadio pro-T. 2. Lo stadio pre-T caratterizzato dallespressione del complesso pre-TCR, costituito dalla catena del TCR in associazione ad una catena pre-T e dalle proteine CD3 e , implicato in un meccanismo di traduzione del segnale che permette alla maturazione di proseguire. 3. Nello stadio successivo i timociti esprimono sia CD4 che CD8, per questo vengono detti timociti doppio-positivi: in questo stadio viene espresso il TCR completo associato alle proteine CD3 e ; queste cellule sono responsive agli antigeni e vanno incontro ai processi di selezione positiva e negativa. 4. Le cellule che sopravvivono ad entrambi i processi selettivi diventano timociti singolo-positivi, esprimenti solo CD4 o solo CD8. Le cellule T che esprimono catene e funzionali non esprimono un TCR e viceversa; questa sottopopolazione simile alla B-1 per i linfociti B, e anche se possiede una diversificazione limitata, potrebbe funzionare come primo argine di difesa contro un numero limitato di microbi a larga diffusione, incontrati a livello della barriere epiteliali. La SELEZIONE POSITIVA il processo secondo il quale i timociti dotati di un TCR che si lega debolmente ai complessi MHC-peptide autologhi vengono stimolati e sopravvivono, mentre i timociti il cui TCR non in grado di riconoscere tali complessi vanno incontro a morte; questo processo condiziona anche la restrizione per classe I e classe II (educazione timica). Pagina 23 di 61

La SELEZIONE NEGATIVA il processo secondo il quale i timociti dotati di un TCR che si lega con avidit ai complessi MHC-peptide autologhi vengono uccisi.

8. ATTIVAZIONE DEI LINFOCITI T

Il riconoscimento dei complessi MHC-peptide da parte del TCR il presupposto della specificit della risposta T. I corecettori CD4 e CD8 interagiscono con le molecole di classe II e I, e trasmettono segnali attivatori allinterno dei linfociti. Le molecole di adesione, come le integrine, stabilizzano ladesione dei linfociti alle APC affinch linterazione sia abbastanza lunga per permetter lavvio della risposta T: laffinit dei TCR per i complessi MHC-peptide molto bassa, il contatto medio avviene per meno di 10 secondi. Lattivazione richiede che i TCR si impegnino ripetutamente con i complessi, fino ad un accumulo di segnali che porta al raggiungimento di una soglia critica; le cellule T effettrici e della memoria hanno una soglia di attivazione inferiore rispetto ai linfociti T vergini. La risposta dei linfociti T influenzata dalla natura delle APC, ad esempio le cellule dendritiche mature esprimono elevati livelli di molecole MHC e di molecole costimolatorie che forniscono il secondo segnale. I linfociti T effettori CD4 secernono numerose citochine, in particolare IL-2, e aumentano lespressione dei recettori per le citochine stesse, secondo un fenomeno di CRESCITA AUTOCRINA. Le citochine agiscono anche sui linfociti B, sui macrofagi sui granulociti e sulle cellule endoteliali. I linfociti T helper attivati esprimono anche il ligando di CD40, che interagisce con lantigene CD40 dei linfociti B e dei macrofagi attivandoli. Quando lantigene viene eliminato le risposte T via via declinano perch i linfociti vengono privati degli stimoli alla sopravvivenza forniti dallantigene, dei fattori costimolatori e delle citochine. Parte della progenie dei linfociti T stimolati dallantigene si differenzia in cellule della memoria, che sopravvivono per periodi molto lunghi e si accumulano con let; i linfociti T della memoria esprimono elevati livelli di integrine e CD44, che favoriscono la migrazione di queste cellule nei focolai periferici di infezione e infiammazione e ne garantiscono la permanenza in tali siti. Pagina 24 di 61

Ruolo delle molecole costimolatorie

Il primo segnale trasmesso dal legame dellantigene al relativo recettore, il secondo segnale fornito da molecole espresse sulle APC e denominate COSTIMOLATORI. In assenza di segnali costimolatori le cellule T o muoiono o entrano in uno stato di ANERGIA: CD28 potenzia la capacit di sopravvivere, la produzione di citochine e la differenziazione da cellule vergini ad effettrici; B7-1 e B7-2 sono 2 glicoproteine Ig espresse su APC professionali, la cui espressione pu essere indotta da endotossina microbica, citochine o il legame CD40L.

Le cellule dendritiche mature esprimono i livelli pi elevati di molecole costimolatorie, ma molto importanti sono anche gli ADIUVANTI, sostanze di derivazione microbica o che ne mimano lattivit la cui funzione incrementare lespressione di costimolatori sulle APC.

Trasduzione del segnale

Ras e Rac
Il riconoscimento dellantigene avvia allinterno dei linfociti T una cascata di segnali biochimici che portano alla trascrizione di numerosi geni e allattivazione della cellula. Linterazione del linfocita T con i complessi MHC-peptide espressi sulle APC provoca laggregazione dei complessi TCR e dei corecettori CD4 e CD8 in aree ristrette, localizzate nel punto di contatto: Lck, una tirosin-chinasi associata alla coda citoplasmatica di CD4 e di CD8, si avvicina alle ITAM delle catene CD3 e della catena , e una volta attivata ne fosforila i residui tirosinici; alle ITAM fosforilate si aggancia la tirosin-chinasi ZAP-70, che viene a sua volta fosforilata da Lck; ZAP-70 fosforilata acquisisce unattivit tirosin-chinasica, e fosforila LAT, che recluta proteine adattatrici, tra cui Grb-2, che attiva uno scambiatore GDPGTP chiamato Sos; le molecole Ras sono proteine in grado di legare GTP, associate debolmente alla membrana plasmatica, e nella forma inattiva legano GDP; lo scambio con GTP causa modificazioni conformazionali in Ras, conferendogli la capacit di attivatore allosterico su numerosi una cascata di enzimi, le chinasi MAP; Pagina 25 di 61

la via delle chinasi MAP attiva lenzima ERK, che fosforila Elk; Elk stimola la trascrizione di Fos, il primo componente del fattore di trascrizione AP-1.

Le molecole adattatrici fosforilate dalle chinasi associate al TCR attivano anche una proteina scambiatrice GDP-GTP chiamata Vav, che agisce sulla molecola Rac: Rac-GTP innesca una cascata MAP che attiva la chinasi JNK, che fosforila c-Jun, il secondo componente del fattore di trascrizione AP-1.

Calcineurina e PKC
La trasduzione del segnale porta allattivazione della PLC, che catalizza la scissione di un fosfolipide di membrana in IP3 e DAG: IP3 : diffonde nel citosol fino al RE e stimola il rilascio degli ioni calcio nel citosol, inoltre si apre un canale del calcio con conseguente afflusso di ioni calcio anche dallesterno; il calcio si lega alla calmodulina, e il complesso attiva la calcineurina, importante per lattivazione di fattori di trascrizione. DAG : attiva la PKC, presente in corrispondenza della membrana plasmatica, il cui sito catalitico diventa accessibile a diversi substrati.

Le differenti vie di trasduzione del segnale attivano fattori trascrizionali diversi: NFAT : necessario per lespressione dei geni di IL-2, IL-4, TNF e altre citochine; AP-1 : composto dalle proteine Fos e Jun, con lavvio della trascrizione del gene Fos e la fosforilazione di proteine Jun gia presenti nel citosol; NF-B : essenziale per la sintesi di citochine. I costimolatori possono attivare vie separate di trasduzione di segnale che possono convergere o meno con quelle innescate dal TCR.

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9. ATTIVAZIONE DEI LINFOCITI B

Riconoscimento dellantigene
Il BCR, recettore per lantigene dei linfociti B, trasmette allinterno della cellula un segnale di attivazione quando due o pi molecole vengono aggregate da parte di un antigene multivalente. Le IgM e le IgD di membrana hanno una coda citoplasmatica di 3 a.a. (lisina, valina, lisina) che troppo corta per trasdurre il segnale, proprio per questo sono associate alle molecole Ig e Ig, che contengono sequenze ITAM nei domini citoplasmatici. Laggregazione delle Ig avvicina le sequenze ITAM con il conseguente innesco della cascata di trasmissione del segnale: la protein-chinasi Syk si lega ai residui fosforilati delle sequenze ITAM di Ig e Ig, si attiva mediante fosforilazione e a sua volta attiva la PLC1; PLC1 scinde un fosfolipide di membrana in IP3 e DAG: IP3 promuove un innalzamento dei livelli di calcio citoplasmatico, che causa una traslocazione di PKC a livello della membrana; DAG attiva la PKC che fosforila altre proteine. Anche Ras viene attivata dallaggregazione delle Ig, e questo provoca lattivazione della cascata delle chinasi MAP. Tutele cascate di segnale hanno come fine ultimo lattivazione dei fattori di trascrizione che inducono lespressione di geni indispensabili per lattivazione B. Laggregazione del BCR da parte dellantigene stimola il linfocita B: ad entrare in G1, ad accendere geni anti-apoptotici, ad esprimere MHC II e B7-2 e B7-1, ad aumentare lespressione di citochine di derivazione T.

Lattivazione B richiede anche secondi segnali, che posso no essere trasmessi dalle proteine del complemento: un prodotto proteolitico del complemento, C3d (prodotto dalla proteolisi di C3 e che si lega a microbi o a complessi antigene-anticorpo che Pagina 27 di 61

Secondi segnali

hanno attivato il complemento) si lega al recettore CR2 dei linfociti B, un complesso trimolecolare noto come complesso co-recettoriale dei linfociti B; questo legame potenzia le vie di trasduzione del segnale.

La risposta anticorpale agli antigeni proteici richiede il riconoscimento dellantigene da parte dei linfociti T helper e la cooperazione fra linfociti T e B specifici per quellantigene. I linfociti B riconoscono lantigene a livello dei follicoli linfatici, vengono attivati e cominciano a migrare verso le aree T, e incontrano i linfociti T a limite fra follicoli e aree T; linterazione B-T dipende dal riconoscimento dellantigene e anche dallinterazione di numerose molecole di superficie espresse dai 2 tipi cellulari. I linfociti B specifici captano lantigene tramite le Ig di membrana, lo processano e lo presentano ai linfociti T helper CD4 in associazione a molecole MHC II, assumendo la funzione di APC. I diversi peptidi di una stessa proteina, presentati dai linfociti B associati alle MHC II a linfociti T helper diversi, inducono comunque una risposta anticorpale verso la proteina nativa. Il legame dellantigene alle Ig di membrana potenzia lespressione di molecole costimolatrici, come B7-2 e B7-1) che aumentano la capacit dei linfociti B di attivare le cellule T helper. I linfociti T helper attivati esprimono CD40L, che interagisce con CD40 presente sui linfociti B e provoca il reclutamento delle proteine citoplasmatiche TRAF, le quali innescano una cascata enzimatica che attiva numerosi fattori di trascrizione. I linfociti T helper attivati secernono citochine che potenziano le proliferazione e la differenziazione dei linfociti B; citochine diverse inducono stimoli diversi e la loro azione pu essere sinergica o antagonista. Parte dei linfociti B che hanno proliferato si differenziano in cellule secernenti anticorpi: gli anticorpi di membrana e gli anticorpi secreti differiscono per la composizione della regione C-terminale, e il passaggio dalla forma di membrana a quella di secrezione il risultato di una diversa processazione dellmRNA della catena pesante. Molte cellule B che secernono anticorpi si differenziano in plasmacellule, destinate ad una massiccia produzione anticorpale. Pagina 28 di 61

Risposta anticorpale dipendente da linfociti T helper

Parte dei linfociti B attivati va incontro allo scambio dellisotipo della catena pesante, con conseguente produzione di anticorpi di classe diversa; questo fenomeno stimolato da citochine prodotte da sottopopolazioni differenti di linfociti T helper. Il meccanismo alla base dello scambio di classe la ricombinazione per scambio: il segmento genico VDJ si collega ad un gene C pi a valle di quello a cui era ricombinato e segmento di DNA interposto viene eliminato. Dopo 4-7 giorni dalla stimolazione alcuni linfociti B migrano pi in profondit nel follicolo e formano un centro germinativo, che contiene cellule derivate da un solo linfocita; la progenie va poi incontro a processi di selezione e diversificazione, anche grazie alle cellule follicolari dendritiche, che esprimono molecole stimolanti i linfociti B immaturi (recettori per il complemento, per Fc, CD40). MATURAZIONE DELLAFFINITA : mediante un processo di ipermutazione somatica i linfociti B proliferanti, allinterno del centro germinativo, mostrano un alto tasso di mutazioni a livello dei geni che codificano per le catene pesanti e leggere delle Ig; tali mutazioni hanno lo scopo di generare anticorpi a maggiore affinit per lantigene, perch man mano che lantigene viene eliminato sopravvivono selettivamente solo quei linfociti che presentano unaffinit sempre pi elevata e che possono anche differenziarsi in plasmacellule. LINFOCITI B DELLA MEMORIA : acquisiscono la capacit di sopravvivere per lunghi periodi e sono capaci di generare una rapida e pi potente risposta umorale in caso di riesposizione allantigene; posseggono un BCR permutato ed esprimono un solo isotipo Ig; possono rimanere nel linfonodo o stanziarsi in altri tessuti linfoidi.

Molti antigeni non proteici, come i polisaccaridi e i lipidi, denominati antigeni timoindipendenti (TI), stimolano la produzione di anticorpi in assenza dei linfociti T helper. Gli anticorpi prodotti in assenza di cooperazione T hanno una bassa affinit e sono rappresentati da IgM; la generazione di cellule della memoria scarsa. Molti polisaccaridi attivano il sistema del complemento per la via alternativa (la via classica prevede linterazione con molecole di anticorpo legate allantigene) generando C3d che si lega allantigene e pu fungere da secondo segnale.

Risposta anticorpale agli antigeni T-indipendenti

Feedback anticorpale

Consiste nellinibizione della sintesi di anticorpi da parte degli stessi anticorpi prodotti. Gli anticorpi IgG formano un complesso con lantigene e questo complesso si Pagina 29 di 61

lega a recettori Fc, che presentano una coda citoplasmatica con una sequenza ITIM che avvia una cascata enzimatica che termina con lo spegnimento della risposta allantigene (limpegno simultaneo delle Ig e dei recettori Fc espressi sulla membrana dei linfociti B ne inibisce lattivazione).

10. TOLLERANZA IMMUNOLOGICA

uno stato di non responsivit ad un antigene indotto da una precedente esposizione a quello stesso antigene e gli antigeni in grado di indurre tolleranza sono chiamati TOLLEROGENI. La tolleranza centrale si verifica perch tutti i linfociti, nel corso della loro maturazione negli organi linfoidi primari, passano attraverso uno stadio in cui lincontro con lantigene porta alla tolleranza e non allattivazione, ma gli unici antigeni presenti in tali organi a concentrazione elevata sono antigeni self. La tolleranza periferica si genera grazie al riconoscimento degli antigeni in assenza di un livello adeguato di costimolazione o grazie ad una persistente e ripetuta stimolazione per opera degli antigeni autologhi a livello dei tessuti periferici.

Tolleranza dei linfociti T

La tolleranza dei linfociti T helper previene risposte immunitarie verso gli antigeni proteici perch questi linfociti sono necessari sia per indurre risposte cellulari che umorali verso questi antigeni. Le proteine autologhe sono processate e presentate da APC timiche coniugate a molecole MHC, ma i linfociti T immaturi che riconoscono complessi MHC-antigene autologhi ad alta affinit vanno incontro ad eliminazione, quindi i linfociti T maturi che lasciano il timo per andare nei tessuti linfoidi periferici sono tolleranti verso gli antigeni self espressi o presenti nel timo. Se i linfociti T helper riconoscono un peptide presentato da APC che non esprimono molecole costimolatorie entrano in uno stato di anergia. Lo stato di anergia si instaura Pagina 30 di 61

anche se le APC presentano ligandi peptidici alterati (antagonisti peptidici) perch in questo caso esprimono molecole costimolatorie ma il riconoscimento dellantigene, o I segnale, risulta alterato. La ripetuta stimolazione dei linfociti T da parte di antigeni persistenti porta alla coespressione di 2 molecole: Fas, che un recettore capace di indurre morte cellulare, e il suo ligando FasL. FasL interagisce con molecole di Fas, espresse sulla stessa cellula o su cellule adiacenti, attivando una cascata di proteasi, denominate caspasi, che causano lapoptosi della cellula. IL-2 aumenta la sensibilit dei linfociti T ai segnali apoptotici mediati da Fas. I linfociti T soppressori producono citochine, come TGF, in grado di bloccare lattivazione e le funzioni dei linfociti T effettori. Lignoranza clonale il fenomeno secondo il quale linfociti autoreattivi possono non incontrare gli antigeni autologhi verso cui sono specifici e quindi rimanere in uno stato di quiescenza; questo fenomeno avviene per gli antigeni del SNC e dellocchio, che o non riescono ad accedere agli organi linfoidi dove si avvia la risposta T o sono situate in tessuti dove non sono presenti APC.

necessaria per mantenere la non responsivit verso gli antigeni self TI, come i polisaccaridi e i lipidi, ma pu anche svolgere un ruolo nel prevenire risposte anticorpali verso antigeni proteici autologhi. I linfociti B immaturi che riconoscono antigeni autologhi presenti nel midollo ad affinit elevata possono subire 2 sorti: o vengono eliminati per apoptosi o esprimono una nuova catena leggera Ig cambiando la loro specificit. I linfociti B maturi che riconoscono antigeni self in periferia in assenza di linfociti T helper specifici o sono resi funzionalmente non responsivi, o perdono la capacit di migrare nei follicoli linfatici (per essere attivate a produrre autoanticorpi) non esprimendo pi i recettori per le chemochine.

Tolleranza dei linfociti B

Omeostasi del S.I.

Le risposte agli antigeni estranei sono auto-limitate e si esauriscono man mano che lantigene viene eliminato, con il ritorno del S.I. ad uno stato di quiescenza. Gran parte del declino della risposta immunitaria avviene per morte apoptotica dei linfociti, i quali una volta attivati esprimono CTLA-4 che interagisce con le molecole BPagina 31 di 61

7 inibendo la proliferazione linfocitaria, ed esprimono anche Fas e FasL la cui interazione porta allapoptosi; anche citochine ad azione inibitoria contribuiscono allomeostasi. La teoria della rete idiotipica, un altro possibile meccanismo omeostatico, si basa sul principio che i recettori per lantigene dei linfociti sono estremamente diversificati e queste sequenze uniche formano idiotipi che possono essere riconosciuti da altri linfociti esprimenti recettori anti-idiotipici; i linfociti possono quindi dare luogo a risposte anti-idiotipiche, portando il sistema idiotipo e anti-idiotipo allequilibrio; quando un antigene estraneo si introduce nel sistema lequilibrio si altera, portando allespansione clonale di linfociti specifici, che a loro volta innescano risposte antiidiotipiche che tendono a riportare il sistema allequilibrio.

SEZIONE IV

11. LE CITOCHINE
Sono secrete dalle cellule di entrambi i compartimenti del sistema immunitario in risposta agli antigeni; citochine diverse stimolano risposte diverse. La loro secrezione richiede la trascrizione di geni fino ad allora silenti, il cui mRNA altamente instabile (si tratta di una sintesi di breve durata). Una volta sintetizzate vengono rapidamente secrete, dando luogo ad una esplosione di effetti, in quanto una citochina pu stimolare la produzione di altre citochine avviando una cascata. Una singola citochina pu svolgere la propria azione su pi di un tipo cellulare. La maggior parte svolge unazione autocrina, stimolando la stessa cellula che lha prodotta, o unazione paracrina, stimolando cellule vicine; se invece sono prodotte in elevate quantit possono entrare in circolo e svolgere unazione endocrina. La risposta delle cellule bersaglio al legame con le citochine consiste in modificazioni dellespressione genica, eccetto che per le chemochine e il TNF, che esplicano le rispettive funzioni senza indurre lespressione di geni fino ad allora silenti.

Recettori

Le citochine si legano a recettori specifici espressi sulla membrana delle cellule bersaglio con unaffinit molto alta, quindi per far si che linterazione avvenga sono sufficienti anche concentrazioni di citochine molto basse. I recettori sono costituiti da uno o pi domini transmembrana, e la classificazione si basa sullomologia fra i domini extracellulari: RECETTORI DI TIPO I : contengono un dominio dotato di 2 coppie di residui di cisteina e legano molecole che si ripiegano in 4 dominio ad -elica; sono formati Pagina 32 di 61

da una catena che interagisce con a citochina e da una o pi catene che trasducono il segnale. RECETTORI DI TIPO II : hanno una struttura simile ai recettori di tipo I, eccetto che per lassenza di una particolare sequenza aminoacidica. SUPERFAMIGLIA DELLE Ig : contengono domini extracellualri di tipo Ig e legano citochine diverse che trasducono il segnale con meccanismi differenti. RECETTORI PER TNF : possiedono domini extracellulari ricchi in cisteina e attivano proteine in grado di indurre apoptosi o di stimolare lespressione genica. RECETTORI A 7 DOMINI -ELICA TRANSMEMBRANA : sono recettori a serpentina che attraversano il doppio strato lipidico della membrana cellulare pi volte; sono deputati ad interagire con le chemochine.

Citochine che mediano e regolano limmunit innata

Fattore di necrosi tumorale
Il TNF il principale mediatore della risposta infiammatoria acuta ai batteri gramnegativi e ad altri agenti infettivi. La principale sorgente rappresentata dai fagociti mononucleati attivati, dove il TNF viene sintetizzato come proteina di membrana, ed espresso sulla superficie cellulare come trimetro dalla forma di tronco di piramide triangolare. Esistono 2 diversi tipi di recettori per TNF: quando TNF-RI interagisce col suo ligando porta allattivazione di caspasi che determinano lapoptosi cellulare; quando TNF-RII interagisce col suo ligando determina lattivazione di proteine TRAF, che attivano determinati fattori di trascrizione. Il TNF stimola le cellule endoteliali ad esprimere molecole di adesione, ligandi per le integrine e ligandi per le selectine; inoltre stimola le cellule endoteliali e i macrofagi a secernere chemochine. In caso di infezioni persistenti viene prodotto in quantit elevate e pu anche generare gravi danni sistemici.

Interleuchina-1

LIL-1 agisce come mediatore locale dellinfiammazione e in quantit maggiori esplica una funzione endocrina. La principale sorgente rappresentata dai fagociti mononucleati attivati e la sua secrezione stimolata da prodotti batterici e altre citochine. Esistono 2 forme di IL-1, ma entrambe si legano a recettori della superfamiglia delle Ig ed esplicano le stesse funzioni. Sono stati individuati 2 tipi di recettori:

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IL-1RI espresso sulla quasi totalit delle cellule e trasduce gli effetti biologici di IL-1; IL-1RII non trasduce segnali di attivazione allinterno della cellula, ma un recettore in grado di inibire il legame della citochina al vero recettore attivatore.

Chemochine

Sono citochine in grado di stimolare la locomozione dei leucociti, tramite alterazioni della forma cellulare e polarizzazione e depolarizzazione dei filamenti di actina con conseguente movimento verso la sorgente di chemochine. Sono polipeptidi caratterizzati dalla presenza di ponti disolfuro. Possono essere raggruppate in 2 sottofamiglie, a seconda che i residui di cisteina N-terminali che partecipano alla formazione di ponti disolfuro siano adiacenti (chemochine CC) o siano separati da un aminoacido (CXC). Sia le chemochine CC che le chemochine CXC si legano a proteoglicani eparan-solfati espressi sulle cellule endoteliali. I recettori presentano una notevole promiscuit di legame, presentano la struttura a 7 domini -elica transmembrana e sono accoppiati a proteine G, che sono in grado di attivare enzimi in grado di mediare la locomozione cellulare.

IL-12 il principale mediatore delle prime fasi delle risposte innate verso microrganismi intracellulari e stimola le risposte specifiche verso tali cellule. un eterodimero e le catene sono legate tra loro da un ponte disolfuro. La principale sorgente di IL-12 sono i fagociti mononucleati attivati e le cellule dendritiche. Il recettore, un eterodimero, comporta il coinvolgimento della via di trasduzione di segnale JAK/STAT. IL-12 stimola la produzione di IF- da parte di linfociti T e cellule NK: microbi-> risposta macrofagi-> IL-12-> IF--> attivazione macrofagi->uccisione microbi IL-12 stimola anche la differenziazione dei linfociti T helper in linfociti TH1 producenti IF- e potenzia la funzione citolitica delle cellule NK e delle cellule CTL.

Interleuchina-12

Interferoni di tipo I

Mediano le risposte innate nei confronti di infezioni virali; sono conosciute 2 forme, ma si legano ad uno stesso recettore e mediano risposte simili. Il recettore appartiene ai recettori di tipo II e trasduce segnali tramite una via JAK/STAT. LIFN di tipo I provoca la sintesi di numerosi enzimi che interferiscono con la trascrizione dellRNA o del DNA virale. Agisce con un meccanismo paracrino, infatti la

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cellula infettata secerne IFN che protegge dallinfezione le cellule adiacenti non ancora infettate. Inoltre potenzia lespressione di MHC I e quindi il riconoscimento delle cellule infettate da parte delle CTL.

Interleuchina-10
LIL-10 una citochina che inibisce lazione dei macrofagi, quindi un esempio di citochina a feedback. Inibisce la produzione di IL-12 e TNF e lespressione di costimolatori e molecole MHC II da parte dei macrofagi.

Citochine che mediano e regolano limmunit specifica

Interleuchina-2

LIL-2 prodotta dai linfociti T CD4 e in minor misura dai linfociti CD8 stimolati dallantigene ed responsabile della loro espansione clonale; agisce in maniera autocrina. Presenta una struttura globulare con 4 domini ad -elica ed interagisce con recettori di tipo I; linterazione con il recettore porta a trasduzione di segnale tramite la via JAK/STAT, tramite Ras e tramite la via PIP3. Favorisce la proliferazione di cellule NK e linfociti B, ma potenzia la morte apoptotica dei linfociti T rendendo tali cellule suscettibili allapoptosi dalla via di Fas.

Interleuchina-4
LIL-4 la principale responsabile dello scambio isotipico verso le IgE nei linfociti B e della differenziazione in cellule TH2 dai linfociti T helper vergini. Presenta una struttura globulare con domini ad -elica ed interagisce con recettori di tipo I; linterazione con il recettore porta a trasduzione di segnale tramite la via JAK/STAT.

LIL-5 un attivatore degli eosinofili; presenta una struttura globulare con 4 domini ad -elica con un recettore di tipo I che trasduce il segnale tramite una via JAK/STAT.

Interleuchina-5

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Stimola la proliferazione e la differenziazione degli eosinofili e lattivazione degli eosinofili maturi; inoltre stimola la proliferazione dei linfociti B e la produzione di IgA.

LIFN- la citochina attivatrice dei macrofagi per eccellenza, inducendo al sintesi di intermedi reattivi dellossigeno e dellossido di azoto; prodotta da cellule NK, linfociti CD4 TH1 e linfociti CD8. Il recettore di tipo II, e linterazione con IFN- stimola la trascrizione di geni che codificano molecole MHC, enzimi microbicidi e citochine. Stimola lespressione da parte delle APC delle molecole MHC e di molecole costimolatorie, e promuove la differenziazione dei linfociti T helper vergini in cellule TH1 e TH2.

Interferone-

Fattore di crescita trasformante

Il TGF inibisce la proliferazione dei linfociti e di altri leucociti; prodotto dai linfociti T stimolati dallantigene, dai fagociti mononucleati stimolati da LPS e da altri tipi cellulari.

Linfotossina

La LT prodotta dai linfociti T e da altre cellule; attivatrice delle cellule endoteliali e dei neutrofili.

Le cellule TH1 e TH2 si differenziano a partire dei linfociti T helper CD4 vergini; il loro profilo condizionato dagli stimoli presenti nel microambiente nel corso delle prime fasi della risposta. Ognuna delle 2 sottopopolazioni si auto-amplifica, bloccando la differenziazione dellaltra. La differenziazione in TH1 stimolata dai parassiti intracellulari e si caratterizza per la produzione di IFN-; la principale funzione effettrice la difesa mediata da fagociti. La differenziazione in TH2 si verifica in risposta ali allergeni e agli elminti e si caratterizza per la produzione di IL-4 e IL-5; la principale funzione effettrice la risposta mediata da IgE e da cellule quali eosinofili e mastociti.

Sviluppo e funzioni delle sottopopolazioni TH1 e TH2

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Citochine che stimolano lemopoiesi

Le citochine sono necessarie per i normali processi emopoietici a livello midollare, in quanto promuovono la crescita e la differenziazione dei progenitori nel midollo osseo. La differenziazione e lespansione delle cellule progenitrici guidata da alcune citochine chiamate collettivamente fattori stimolanti la formazione di colonie, CSF.

Fattore delle cellule staminali (Ligando di c-Kit)

Le cellule staminali pluripotenti esprimono sulla loro membrana un recettore c-Kit e la citochina che interagisce con tale recettore denominata ligando di c-Kit o SCF; sintetizzata da cellule stromali midollari e rende le cellule staminali responsive ad altri CSF.

Interleuchina-3

LIL-3 dotata di 4 domini ad -elica; prodotta da linfociti T CD4 ed esplica al propria azione su progenitori midollari immaturi, innescando una trasmissione del segnale che segue la via JAK/STAT.

Interleuchina-7

LIL-7 dotata di 4 domini ad -elica; prodotta da cellule stromali del midollo osseo ed capace di stimolare la sopravvivenza e la proliferazione di precursori immaturi dei linfociti B e T. Pagina 37 di 61

12. IMMUNITA INNATA

Limmunit innata rappresenta il primo argine di difesa contro le infezioni e funge da segnale di allarme per il resto del sistema immunitario, favorendo al generazione di una risposta specifica. I meccanismi effettori sono spesso utilizzati anche nellambito delle risposte specifiche. Il compartimento naturale riconosce solo molecole di origine microbica, e le strutture microbiche bersaglio delle risposte innate sono definite profili molecolari, ma presenta una specificit limitata. La reazione che pi precocemente si verifica linfiammazione locale, che ha lo scopo di distruggere lagente patogeno, portando in contatto le cellule effettrici con il microbo. La risposta infiammatoria ai microrganismi si avvia grazie alle citochine, che agiscono su cellule endoteliali e leucociti.

Componenti del compartimento dellimmunit innata

Barriere epiteliali
Rappresentano una barriera fisica tra i microbi e i tessuti dellospite e sono: la cute, le mucose dellapparato gastro-intestinale e le mucose dellalbero respiratorio. Pagina 38 di 61

Gli epiteli producono peptidi dotatati di attivit antibiotica naturale, le defensine; lepitelio del tratto gastro-intestinale secerne le criptocidine, capaci di sterilizzare localmente il lume intestinale. Le barriere epiteliali e le cavit sierose contengono, rispettivamente, linfociti T intraepiteliali e linfociti B-1, che svolgono il ruolo di sentinelle pur esprimendo un repertorio recettoriale molto limitato: i linfociti T intra-epiteliali secernono citochine, attivano fagociti e uccidono le cellule infettate; i linfociti B-1 producono IgM (definiti anticorpi naturali) contro batteri comunemente presenti nellambiente.

Fagociti: granulociti neutrofili e macrofagi

I granulociti neutrofili mediano le fasi pi precoci delle risposte infiammatorie. Sono dotate di numerosi prolungamenti ciliari e presentano un nucleo segmentato. Il citoplasma contiene 2 tipi di granuli: granuli specifici, contenenti lisozima, collagenasi ed elastasi; granuli azzurrofili, contenenti esclusivamente lisozima. I monociti si generano dal midollo osseo, e una volta migrati nei tessuti si differenziano in macrofagi; sono localizzati in tutti i siti attraverso cui gli agenti microbici possono penetrare nellorganismo, e possono andare incontro a proliferazione a livello dei focolai infiammatori. LLPS, o endotossina, si lega ad un recettore espresso dai macrofagi e ne stimola lattivit microbicida e la secrezione di citochine, nonch lattivazione del processo infiammatorio. I macrofagi dopo la fagocitosi riconoscono la esistenza di DNA batterico al loro interno grazie alla presenza di sequenze citidina-guanina non mutilate (CpG), e reagiscono producendo IL-12 e IFN di tipo I. i macrofagi producono anche chemochine, mediatori lipidici e fattore tissutale, attivando il processo della coagulazione. I prodotti microbici ed alcuni mediatori prodotti in risposta allinfezione sono captati dai fagociti tramite specifici recettori con 7 domini ad -elica transmembrana; linterazione da parte del recettore con chemochine o prodotti batterici induce la migrazione delle cellule dal circolo verso gli endoteli e la produzione di sostanze microbicide. Lefficienza di fagocitosi aumenta se il microbo rivestito da opsonine, che possono essere anticorpi Ig, componenti del complemento e proteine plasmatiche. Quando legano i microbi protrudono attorno ad essi una estroflessione della membrana plasmatica, le cui estremit si saldano formando un fagosoma; il fagosoma si fonde con il lisosoma, in cui sono presenti molecole ad attivit microbicida che uccidono i microbi.

Le cellule NK sono una sottopopolazione linfocitaria in grado di lisare cellule infettate da virus e da patogeni intracellulari; secernono citochine (IF-) e possono essere stimolate da esse (IL-12, IL-15). Costituiscono il 5-20% delle cellule mononucleate Pagina 39 di 61

Cellule Natural Killer

presenti in circolo o nella milza, ma sono scarsamente rappresentate in altri organi linfoidi. Sono attivate dal riconoscimento di 3 tipi di strutture: 1) cellule rivestite da anticorpi, 2) cellule infettate da virus e altri patogeni intracellulari, 3) cellule prive dellespressione di molecole MHC di classe I. Lattivazione si traduce nellinnesco di funzioni effettrici specifiche, come la lisi di cellule infettate e la produzione di citochine, ma non si accompagna allespansione clonale alla differenziazione della cellula. Esprimono recettori inibitori che riconoscono molecole MHC I: sono inibite da cellule che esprimono molecole MHC I ed attivate da cellule mancanti dellespressione di tali molecole. Questo meccanismo permette di riconoscere le cellule infette da virus, i quali hanno sviluppato la capacit di inibire lespressione di molecole MHC I, sfuggendo cos ai linfociti T CD8. Sono stati identificati 2 recettori ad azione inibitoria: KIR, appartenente alla superfamiglia delle Ig; un eterodimero contenente CD94 e NKG2. Le cellule NK sono dotate di granuli contenenti perforina, che formano pori nella membrana della cellula bersaglio, ed alcuni enzimi chiamati granzimi, che penetrano nella cellula bersaglio attraverso i pori provocando lapoptosi.

Il sistema del complemento

Il riconoscimento dei microbi da parte del complemento si verifica attraverso 2 strade: 1. la VIA CLASSICA: che si basa sullinterazione di IgM, IgG1 o IgG3 legate alla membrana di un microbo o ad altre strutture, con una proteina chiamata C1; 2. la VIA ALTERNATIVA: che viene attivata dallinterazione diretta con strutture di membrana dei microbi. Il riconoscimento dei microbi per entrambi le vie porta al reclutamento e allassemblaggio delle proteine in complessi dotati di attivit proteasica; i prodotti di clivaggio generati da queste proteine si legano ai microrganismi fungendo da opsonine favorendone la fagocitosi.

Proteine effettrici solubili

LECTINA LEGANTE IL MANNOSIO : o MBL, una proteina ad attivit opsonizzante; interagisce con carboidrati provvisti di un residuo di mannosio o di fucosio, tipicamente presenti nella parete batterica; pu interagire con proteine del sistema del complemento, attivando al via classica in assenza di anticorpi. PROTEINA C-REATTIVA : o CRP, una proteina plasmatica che lega fosfolipidi batterici e funziona come opsonina; anche i fattori della coagulazione possono arginare le infezioni, prevenendo la diffusione dei microbi nellorganismo. Pagina 40 di 61

Citochine

Vedi il capitolo 11.

13. MECCANISMI EFFETTORI CELLULO-MEDIATA

DELLIMMUNITA

Limmunit cellulo-mediata la funzione effettrice dei linfociti T, e funge da meccanismo di difesa contro i microbi intracellulari: potenzia lazione microbicida dei fagociti, in caso di microbi resistenti capaci di sopravvivere e replicarsi dentro di essi; causano la lisi di cellule infette mediante CTL. Anche le cellule NK intervengono in questo tipo di immunit.

Attivazione dei macrofagi mediata dai linfociti T

Lattivazione macrofagica mediate dai linfociti T pu talvolta causare danni ai tessuti normali circostanti allinfezione, una reazione di ipersensibilit ritardata, o DTH. Il processo di attivazione macrofagica da parte dei linfociti T pu essere suddiviso in tappe successive: 1. FASE DI INDUZIONE : corrisponde alla sensibilizzazione dei linfociti T vergini che riconoscono lantigene a livello linfonodale e vengono stimolati a proliferare e a differenziarsi in cellule effettrici; 2. FASE DI MIGRAZIONE : dei linfociti T effettori e di altri leucociti nel focolaio di infezione; Pagina 41 di 61

3. FASE DI ATTIVAZIONE DEI MACROFAGI.

Quando un microbo o un antigene viene inoculato per via sottocutanea, APC specializzate, come le cellule di Langerhans, captano tali antigeni per trasportarli ai linfonodi, e nel corso della migrazione maturano esse stesse, cos da acquisire tutti i caratteri delle APC; nei linfonodi presentano peptidi derivanti dagli antigeni proteici associati a molecole MHC II ai linfociti T CD4. Allo stesso tempo gli antigeni provocano anche una risposta immunitaria innata, che stimola le APC ad esprimere livelli pi elevati di molecole costimolatorie e a secernere citochine, come IL-12: macrofagi e cellule dendritiche in risposta a costituenti microbici, allinterazione fra CD40 e il suo ligando espresso dai linfociti T, e a IFN- prodotto dalle cellule NK e dagli stessi linfociti T, producono IL-12, che stimola i linfociti T a differenziarsi nella sottopopolazione TH1. I linfociti T attivati secernono IL-2, che funziona come fattore autocrino di crescita.

Fase di induzione

I linfociti T effettori, che si sono sviluppati negli organi linfoidi e sono entrati in circolo, lasciano il torrente circolatorio e penetrano nel focolaio dinfezione secondo un processo stimolato da citochine, in special modo chemochine e TNF prodotte da macrofagi e cellule endoteliali. Il TNF induce alterazioni morfologiche nelle cellule endoteliali ed un rimodellamento della membrana basale dei capillari in modo da favorire la trasmigrazione delle cellule. La migrazione dei linfociti T attivati nei tessuti periferici mediata anche da selectine ed integrine, infatti i linfociti T attivati esprimono ligandi per la E- e la Pselectina elevati livelli di integrine e lendotelio dei vasi dei tessuti sede dinfezione esprime elevati livelli di selectine e di ligandi per le integrine (i linfociti T vergini presentano lespressione del recettore per L-selectina, il cui ligando espresso sulle venule ad alto endotelio dei linfonodi). Una volta giunti nella sede dinfiammazione i linfociti T specifici effettori in grado di riconoscere lantigene presentato dalle APC ricevono segnali che potenziano laffinit delle loro integrine per i rispettivi ligandi, rimanendo intrappolati in sede extravascolare.

Fase di migrazione

I segnali prodotti dai linfociti TH1 in risposta allantigene, e quindi la secrezione di IFN- e lespressione di CD40L, provocano la trasformazione del monociti in macrofagi, con la conseguente variazione del livello di espressione di numerose proteine. I macrofagi attivati aumentano lespressione delle componenti del proteasoma, delle catepsine e delle molecole MHC II; uccidono i microbi extracellulari e quelli fagocitati Pagina 42 di 61

Fase di attivazione dei macrofagi

principalmente grazie alla produzione di intermedi reattivi dellossigeno, di ossido nitrico e di enzimi lisosomiali; inoltre inducono flogosi tramite la secrezione di citochine e mediatori lipidici, con intervento dei granulociti neutrofili che rimuovo il tessuto danneggiato nel corso del processo flogistico inducendo la formazione di tessuto cicatriziale. Se i macrofagi attivati non riescono ad eliminare completamente lantigene patogeno continuano a produrre citochine e fattori di crescita, e il tessuto danneggiato viene sostituito da connettivo; il volume del citoplasma dei macrofagi aumenta e pi cellule si fondono a formare aggregati, che producono noduli di tessuto infiammatorio, denominati granulomi.

Linfociti T citotossici
La maggior parte dei CTL esprime la molecola CD8 e riconosce peptidi estranei presentati da molecole MHC I, solo una piccola parte esprime la molecola CD4 e riconosce peptidi estranei associati a molecole MHC II. I linfociti T CD8 maturano nel timo, ma quando sono immessi in periferia non sono pienamente differenziati e sono definiti pre-CTL; ricevono il primo segnale di attivazione dal riconoscimento dellantigene coniugato a molecole MHC I e il secondo dallintervento di citochine secrete dalle stesse APC che hanno presentato lantigene. I CTL attivati hanno funzioni citolitiche e si legano alla cellula bersaglio che espone lantigene riconosciuto tramite il TCR, la molecola CD8 e lintegrina LFA-1. Laggregazione del TCR genera una serie di segnali biochimici che inducono un rimodellamento del citoscheletro del CTL, che consente lo spostamento dei microtubuli e dei granuli secretori verso la zona di contatto delle 2 cellule: i granuli secretori, contenenti perforina e granzimi, vengono esocitati sulla superficie della cellula bersaglio (colpo mortale). La perforina, una volta esocitata nellambiente extracellulare, viene a trovarsi in presenza di elevate concentrazioni di ioni calcio che causano la sua polimerizzazione sulla membrana della cellula bersaglio e la conseguente formazione di pori; se i pori sono sufficienti la cellula muore per scoppio osmotico, altrimenti gli elevati livelli di ioni calcio che entrano nella cellula provocano lavvio dellapoptosi. I granzimi sono proteasi che penetrano nella cellula bersaglio a livello dei pori generati dalla perforina e attivano le caspasi avviando lapoptosi cellulare. Dopo aver trasmesso il colpo mortale il CTL si dissocia dalla cellula bersaglio grazie alla diminuzione dellaffinit delle molecole accessorie, senza aver subito alcun danno.

Ruolo delle cellule TH2 nellimmunit cellulo-mediata

Le cellule TH2 possono comportarsi come cellule soppressorie, mediante la produzione di IL-4 e IL-13, che si comportano da antagonisti di IFN- e bloccano lattivazione dei Pagina 43 di 61

macrofagi indotta dai linfociti T. Le citochine prodotte limitano anche leventuale danno tissutale causato dalle risposte cellulo-mediate. Le cellule TH2 mediano anche alcune reazioni infiammatorie in cui predominano eosinofili e mastociti, contribuendo alla eliminazione degli elminti; esse secernono IL4, che stimola la produzione di IgE che opsonizzano il parassita, e IL-5, che attiva gli eosinofili che si legano agli elminti opsonizzati dalle IgE tramite il recettore Fc di cui dispongono e liberano i granuli distruggendo i parassiti (anche i mastociti possiedono recettori Fc).

14. MECCENISMI UMORALE

EFFETTORI

DELLIMMUNITA

Limmunit umorale mediate dagli anticorpi e la sua funzione la difesa dai microbi extracellulari e dalle tossine microbiche. Gli anticorpi sono sintetizzati dai linfociti B e dalle plasmacellule negli organi linfoidi secondari e nel midollo osseo, ma svolgono la loro funzione effettrice entrando in circolo e nelle secrezioni mucose raggiungendo la sede dove si trova lantigene. La prima esposizione ad un antigene porta allattivazione dei linfociti B e alla loro differenziazione in cellule effettrici e della memoria; alcune cellule producenti anticorpi migrano nel midollo osseo, continuando a produrre anticorpi per anni. Quando un soggetto gi immunizzato verso un dato antigene incontra nuovamente quello stesso antigene le cellule producenti anticorpi residuate dalla prima infezione garantiscono un livello di anticorpi nel siero in grado di offrire una protezione immediata allinfezione, inoltre i linfociti B della memoria generano unelevata quantit di anticorpi specifici. Pagina 44 di 61

Molte delle funzioni effettrici degli anticorpi sono mediate dalle regioni costanti della catena pesante di anticorpi che abbiano legato un antigene: il legame con lantigene alla regione variabile degli anticorpi porta alterazioni conformazionali a livello della regione costante, che permette allanticorpo di interagire con i recettori per Fc e con le proteine del complemento.

Molti microbi penetrano nelle cellule dellorganismo grazie al legame di particolari molecole di superficie a recettori espressi sulle cellule dellospite; anticorpi diretti contro le molecole di legame microbiche interferiscono con la loro capacit di interagire con i recettori cellulari secondo un processo di inibizione sterica. Per la neutralizzazione dei microbi e delle tossine sufficiente il legame di questi alla regione di legame per lantigene delle Ig.

Neutralizzazione dei microbi e delle tossine

I fagociti esprimono recettori di membrana che legano i microbi e ne consentono linglobamento anche in assenza di anticorpi, ma lefficienza della fagocitosi aumenta enormemente se i microbi sono opsonizzati, in quanto i fagociti esprimono un recettore per il legame della catena pesante Fc delle Ig. Questi recettori sono denominati recettori Fc, e nella porzione citoplasmatica contengono numerose sequenze ITAM per la trasduzione del segnale. Linterazione dei recettori Fc con i microbi opsonizzati porta al loro inglobamento e allattivazione del fagocita, che consiste nellattivazione della ossidasi fagocitica e nella secrezione di enzimi deputati a distruggere microrganismi troppo grandi per essere fagocitati. Lespressione del recettore Fc sui fagociti indotta da IFN-. I microbi possono essere opsonizzati anche da un prodotto di attivazione del sistema del complemento denominato C3b. Il recettore per Fc delle cellule NK interagisce con anticorpi IgG legati ad una cellula, con la conseguente lisi di questultima, secondo un processo denominato citotossicit naturale mediata da anticorpi, o ADCC. Limpegno del recettore attiva la sintesi e la secrezione di citochine e la liberazione del contenuto dei granuli.

Opsonizzazione e fagocitosi mediata da anticorpi

Il sistema del complemento

costituito da numerose proteine solubili e di membrana che interagiscono con altre molecole del sistema immunitario. Lattivazione del complemento porta alla proteolisi di C3 e alla formazione di un complesso litico. La regolazione dellattivazione garantita da numerose proteine solubili e di membrana.

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Molte attivit biologiche del sistema del complemento sono mediate dallinterazione delle sue componenti con recettori espressi su vari tipi di cellule: il CR1 favorisce la fagocitosi di particelle rivestite da C3b o C4b, garantendo lo smaltimento degli immunocomplessi; il CR2 espresso sui linfociti B e lega prodotti di clivaggio di C3b, che potenziano lattivazione delle risposte umorali; il CR3 espresso da fagociti e cellule NK, lega il frammento C3bi favorendo la fagocitosi; il CR4 svolge una funzione simile al CR3. Il sistema del complemento promuove la fagocitosi dei microbi che ne hanno causato lattivazione, ne induce la lisi e stimola il processo infiammatorio tramite le cosiddette anafilotossine (i frammenti C3a, C4a e C5a).

Attivazione della via alternativa

In condizioni normali le molecole di C3 presenti nel plasma vanno incontro ad un lento ma continuo clivaggio, quindi C3b pu legarsi alla superficie delle cellule o combinarsi con una molecola di acqua inattivandosi. Se C3b si lega covalentemente ad una molecola esso pu associarsi con la proteina Fattore B, il quale appena legatosi a C3b viene scisso, dalla proteasi Fattore D, in un frammento Ba e in un frammento Bb; il complesso C3bBb rappresenta la C3 convertasi della via alternativa. Se il complesso C3bBb si forma sulla membrana della cellula di un mammifero viene rapidamente degradato da proteine regolatrici espresse su tali cellule, se invece si forma sulla membrana di una cellula batterica lassenza delle proteine inibitrici permette lattivazione della C3 convertasi della via alternativa e la prosecuzione della cascata, inoltre la proteina properdina stabilizza tale complesso. Parte delle molecole C3b generate dalla C3 convertasi si lega alla convertasi stessa, formando il complesso C3bBbC3b, ossia la C5 convertasi della via alternativa.

Attivazione della via classica

La componente C1 un complesso multimerico formato dalla subunit C1q, deputata al legame con gli anticorpi, e dalle subunit C1r e C1s dotate di attivit enzimatica. C1q formata da sei catene radiali, ciascuna legata ad uno stelo centrale, e si lega alle regioni Fc delle catene pesanti delle Ig legate allantigene; lattivazione di C1q richiede linterazione con almeno 2 frammenti Fc (ogni frammento Fc possiede un solo sito di legame per C1q) e ogni molecola di IgG possiede un solo frammento Fc, ogni molecola IgM ne possiede 5. C1r e C1s sono serinesterasi, organizzate in C1 sottoforma di tetrametro composto da una coppia di ogni subunit; limpegno di C1q attiva C1r, che a sua volta attiva C1s; C1s cliva C4, generando C4a e C4b. Pagina 46 di 61

C4b si associa a C2, che viene clivato in C2a e C2b; il frammento C4b si associa a C2b, formando il complesso C4bC2b che rappresenta la C3 convertasi della via classica. La C3 convertasi lega e scinde C3 in C3a e C3b; parte dei frammenti di C3b si lega alla convertasi stessa, generando C4b2b3b, cio la C5 convertasi della via classica.

Attivazione della via lectinica

avviata in assenza di anticorpi dallinterazione di polisaccaridi di derivazione microbica con lectine circolanti, come la lectina legante il mannosio MBL. MBL si lega a residui di mannosio dei polisaccaridi; strutturalmente simile a C1q e infatti pu attivare il complemento o innescando il complesso enzimatico C1r-C1s, o associandosi ad altre proteine in grado di attivare C4.

Le C5 convertasi clivano C5, liberando C5a e C5b, il quale rimane associato alla superficie cellulare. C5b si lega a C6 e poi a C7, formando un complesso recettoriale C5b,6,7 che si inserisce nella membrana plasmatica e lega C8, formando il complesso C5b-8, che ha una certa capacita di lisare la cellula su cui si inserito. La componente C9 polimerizza nel sito in cui si inserito il complesso C5b-8 permettendo la formazione di un MAC completo, che forma pori sulla membrana cellulare, che portano alla morte della cellula o per scoppio osmotico o per lingresso di ioni calcio che avviano processi apoptotici.

Sequenza terminale di attivazione

Funzioni degli anticorpi in particolari sedi anatomiche

Immunit a livello delle mucose
Le IgA sono la principale classe di anticorpi prodotti dal compartimento del sistema immunitario associato alle mucose, del tratto respiratorio e del tratto gastrointestinale; le IgA contenute nelle secrezioni mucose si legano ai microbi e alle tossine, neutralizzandoli e bloccandone lentrata nelle cellule e nei tessuti dellospite. Le IgA sono secrete dai linfociti B presenti nella lamina propria della mucosa sottoforma di dimeri, legati da una catena J. Il recettore poli-Ig, una glicoproteina a 5 domini Ig, cattura le IgA nel sito di produzione, per trasportarle attraverso lepitelio; i complessi vengono endocitati dalle cellule endoteliali e trasportati allinterno di vescicole verso la superficie luminale della cellula; in questa sede le vescicole si fondono con la membrana della cellula, e la porzione transmembrana e intracellulare del recettore viene clivata, mentre la porzione extracellulare, detta componente secretoria, resta legata alla molecola IgA che viene liberata nel lume Pagina 47 di 61

bronchiale o intestinale. Il recettore poli-Ig responsabile anche della secrezione di IgA nel latte, nella saliva e nella bile.

Immunit neonatale

Nei mammiferi i neonati sono protetti dalle infezioni: da anticorpi IgG presenti nel siero della madre, e trasportati nel circolo fetale attraverso la placenta; da anticorpi IgA e IgG presenti nel latte materno, e assorbiti attraverso lepitelio intestinale del lattante.

SEZIONE V

15. MALATTIE DA IPERSENSIBILITA

Limmunit acquisita difende lospite dalle infezioni microbiche, ma pu anche provocare danno tissutale e malattia, le cosiddette malattie da ipersensibilit. Le malattie provocate da una mancata tolleranza agli antigeni autologhi prendono il nome di MALATTIE AUTOIMMUNI. Le malattie da ipersensibilit sono classificate in: IPERSENSIBILITA DI TIPO I : ipersensibilit immediata, causata da IgE e mastociti; REAZIONI DI IPERSENSIBILITA DI II TIPO : causate da anticorpi rivolti contro antigeni espressi da un particolare tipo di cellule o dalla matrice extracellulare; Pagina 48 di 61

REAZIONI DI IPERSENSIBILITA DI III TIPO : causate da anticorpi che formano immunocomplessi in circolo, che si depositano a livello di alcuni tessuti; REAZIONI DI IPERSENSIBILITA DI IV TIPO : causate da linfociti T che attivano meccanismi effettori dellipersensibilit ritardata (DTH) o lisano le cellule bersaglio.

Meccanismi immunologici di danno tissutale e malattia

Malattie causate da anticorpi
Anticorpi rivolti contro antigeni fissati a cellule o alla matrice provocano malattia attraverso lopsonizzazione e la fagocitosi della cellula bersaglio, linfiammazione, il danno tissutale e linterferenza con le funzioni fisiologiche della cellula. Gli immunocomplessi causano malattia quando sono prodotti in quantit eccessiva, o non vengono eliminati abbastanza velocemente, permettendo un accumulo e una deposizione a livello tissutale. Possono attivare leucociti e mastociti, inducendo la produzione di citochine e mediatori infiammatori (lupus eritematoso sistemico).

Le malattie immunologiche causate dai linfociti T sono riscontrabili dalla loro presenza a livello delle lesioni e dallisolamento di linfociti T specifici per antigeni autologhi; inoltre le citochine secrete inducono modificazioni nei tessuti circostanti, come lIFN, secreto dai linfociti TH1, che stimola lespressione di molecole MHC II su cellule che di norma non esprimono tali antigeni. Nelle reazioni DTH il danno tissutale causato dai mediatori prodotti dai macrofagi attivati, come gli enzimi lisosomiali, gli intermedi reattivi dellossigeno, lossido nitrico e le citochine pro-infiammatorie; spesso causano malattie organo-specifiche. La risposta CTL alle infezioni virali pu portare a danno tissutale per luccisione delle cellule infettate, in quanto i CTL non riescono a distinguere fra virus citopatici e non.

Malattie causate dai linfociti T

Meccanismi di autoimmunit
Lautoimmunit una causa importante di malattie nelluomo, che possono essere sistemiche o organo specifiche. Deriva da un malfunzionamento dei meccanismi che presiedono al mantenimento della tolleranza al self ed coadiuvata da alterazioni che interessano i linfociti, le cellule che presentano lantigene, i geni che predispongono allautoimmunit, le infezioni microbiche e il danno tissutale.

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La tolleranza centrale il meccanismo di selezione dei linfociti immaturi autoreattivi, che presentano recettori ad elevati affinit per antigenio self. La tolleranza periferica viene mantenuta grazie allingresso delle cellule autoreattive in uno stato di anergia funzionale, ma lespressione di molecole costimolatorie a livello dei tessuti sulle APC presentanti lantigene self pu interrompere lo stato di anergia. Lanergia pu essere interrotta anche da un alterazione delle molecole che di solito presiedono allattivazione di queste cellule, come CTLA-4. Anche mutazioni che interferiscono con la morte apoptotica possono tradursi in malattie autoimmuni, cos come alterazioni della funzione soppressiva dei linfociti T. Lesposizione dei linfociti B ad attivatori policlonali, come LPS, possono attivare un grande numero di cellule, fra cui quelle specifiche per antigeni autologhi.

I geni pi coinvolti nei meccanismi di autoimmunit sono quelli MHC, di classe I e II: una associazione dei geni HLA con la malattia pu essere individuata mediante tipizzazione sierologica dei loci HLA. In molte malattie autoimmuni le molecole HLA differiscono dalle molecole di soggetti sani solo per la tasca di legame del peptide antigenico, inoltre molte sequenze HLA associate a malattie autoimmuni sono riscontrabili in soggetti sani, quindi la presenza di particolari loci HLA solo un fattore di rischio. Alla generazione di autoimmunit contribuiscono anche numerosi geni estranei allMHC.

Fattori genetici di autoimmunit

Ruolo delle infezioni nellautoimmunit

Le infezioni possono contribuire al manifestarsi o allaggravarsi delle malattie autoimmuni, anche se nella maggior parte dei casi gli agenti infettivi non sono direttamente presenti a livello dei tessuti interessati: le lesioni non sono quindi dovute allagente infettivo, ma derivano da una risposta immunitaria dellospite che ha reagito contro quel patogeno. Gli agenti infettivi inoltre possono contenere antigeni cross-reagenti con antigeni autologhi, quindi la risposta verso i microbi pu tradursi in una risposta verso il self secondo un processo detto mimetismo molecolare.

Altri fattori di autoimmunit

Linfiammazione, lischemia o un trauma possono portare al riconoscimento di antigeni self normalmente inaccessibili alle cellule del sistema immunitario.

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Una flogosi tissutale pu causare alterazioni strutturali di antigeni autologhi, generando nuovi determinanti in grado di scatenare reazioni autoimmuni. Anche gli influssi ormonali svolgono un ruolo importante in alcune malattie autoimmuni, che presentano unincidenza pi elevate nel sesso femminile.

16. IPERSENSIBILITA IMMEDIATA

La stimolazione mediata dalle IgE sui mastociti tissutali e sui granulociti basofili uno dei pi potenti meccanismi di risposta del sistema immunitario, difatti provoca lipersensibilit immediata. Nella forma pi estrema, lanafilassi, i mediatori dellipersensibilit possono provocare restringimento delle vie aeree e collasso cardiocircolatorio (shock anafilattico). Le reazioni di ipersensibilit immediata si accompagnano ad una reazione tardiva, caratterizzata da un infiltrato di eosinofili, basofili, neutrofili e linfociti.

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Gli individui predisposti alla produzione di anticorpi IgE in risposta a diversi antigeni e che presentano forti risposte di ipersensibilit immediata sono definiti atopici, e si suol dire che sono affetti da allergia. Gli antigeni che causano reazioni di ipersensibilit sono definiti allergeni, sono proteine o sostanze chimiche che si legano a proteine, e stimolano la differenziazione dei linfociti T CD4 in cellule effettrici TH2, che forniscono ai linfociti B specifici per quellantigene segnali che ne favoriscono la differenziazione in cellule producenti IgE. Le IgE circolano nei fluidi corporei e si legano a recettori specifici per la catena pesante, espressi sulla membrana di granulociti basofili e mastociti, cosicch quando lantigene penetra nuovamente nellorganismo si lega alle IgE legate alle suddette cellule, provocando la trasduzione del segnale che comporta la degranulazione e la sintesi e la secrezione di mediatori.

Ruolo delle IgE

Le IgE circolano nel siero in forma monomerica: le regioni V delle catene pesanti e le catene leggere sono codificate dagli stessi geni responsabili della produzione della altre Ig, mentre le regioni C delle catene pesanti sono codificate dal gene C . La loro produzione dovuta al fenomeno dello scambio isotipico, dato dalla predisposizione dei diversi individui a generare una risposta TH2 allallergene. La sottopopolazione TH2 dei linfociti T helper CD4 secerne diverse citochine: IL-4, che indispensabile per lo scambio isotipico; IL-5, che attiva gli eosinofili; IL-13, che regola vari aspetti dellinfiammazione. La predisposizione a produrre IgE influenzata dallereditariet di numerosi geni, ma nellambito di una stessa famiglia lorgano bersaglio delle manifestazioni atopiche pu essere diverso.

Recettori Fc per le IgE

Gli effetti biologici delle IgE sono mediati dal recettore FcRI, espresso sulla membrana di mastociti, basofili, cellule di Langerhans e alcuni macrofagi presenti nel derma. Laffinit di legame delle IgE per questo recettore molto elevata. Ogni molecola di FcRI formata da 3 subunit transmembrana separate: una catena , che media il legame delle IgE tramite due domini Ig nella porzione N-terminale della parte extracellulare; una catena , deputata alla trasduzione del segnale, attraversa la membrana per 4 volte, ha entrambe le estremit nel citoplasma e possiede una sequenza ITAM nella porzione C-terminale; Pagina 52 di 61

un dimero di catene legate da un ponte disolfuro, anchesse deputate alla trasduzione del segnale, contengono ognuna una sequenza ITAM citoplasmatica.

Lespressione di FcRI su mastociti e basofili potenziata dalle IgE stesse, si viene quindi a creare un circuito di amplificazione delle risposte allergiche.

Mastociti e basofili

I mastociti derivano da precursori midollari, migrano alla periferia come cellule immature e completano la differenziazione nei tessuti periferici di tutto lorganismo. Nei granuli contengono proteoglicani acidi che legano coloranti basici. Sono identificate 2 sottopopolazioni: i mastociti della mucosa, che predominano a livello della mucosa intestinale e degli spazi alveolari polmonari; i mastociti connettivali, che predominano a livello cutaneo e della sottomucosa intestinale. I basofili sono simili ai mastociti, ma derivano da uno stipite differenziativi diverso; derivano da progenitori midollari, maturano nel midollo osseo ed entrano in circolo come cellule pienamente differenziate e di norma non sono presenti nei tessuti; i granuli legano coloranti basici e secernono molti dei mediatori dei mastociti. Mastociti e basofili si attivano per aggregazione delle molecole FcRI presenti sulla loro superficie, che si verifica quando un antigene multivalente si lega alle molecole IgE ad essi legate, che innesca una cascata di segnali: parte con la fosforilazione delle ITAM citoplasmatiche del recettore, che causano attivazione di PLC e poi di PKC, la quale causa la disgregazione dei complessi actina-miosina nel foglietto interno della membrana, con conseguente esocitosi dei granuli. Laggregazione del recettore attiva anche una via che inibisce la degranulazione controllata da cAMP. Un individuo allergico ad un dato antigene presenta una quota significativa di IgE specifica per quellantigene, e lesposizione ad esso provoca laggregazione di numerosi recettori che attivano le cellule e inducono la degranulazione. In un soggetto non allergico le IgE fissate ai mastociti sono specifiche per molti antigeni diversi, ognuno dei quali pu aver indotto una minima produzione di IgE, quindi un solo antigene non riesce ad aggregare un numero di recettori sufficienti ad attivare la cellula. Lattivazione dei mastociti comporta la secrezione dei granuli e la neosintesi e la secrezione di mediatori lipidici e citochine: la sintesi dei mediatori lipidici controllata dallenzima citosolico fosfolipasi A2, che idrolizza i fosfolipidi di membrana; la sintesi di citochine il risultato della trascrizione dei relativi geni. Sia mastociti che basofili possono essere attivati da numerose sostanze biologiche, composti polibasici, peptidi, citochine e le anafilotossine derivanti dallattivazione del complemento. Pagina 53 di 61

AMINE VASOATTIVE : sono composti non lipidici che presentano un gruppo amminico; nei mastociti umani la pi abbondante listamina, che si lega a recettori specifici su cellule bersaglio provocando una cascata di eventi intracellulari. Il loro legame allendotelio causa contrazione della cellula e fuoriuscita di plasma negli spazi extravascolari, e inoltre stimola la produzione di sostanze rilassanti la muscolatura liscia; la combinazione di queste azioni causa la reazione ponfo-erimatosa che caratterizza i fenomeni di ipersensibilit immediata. La loro azione di breve durata, in quanto sono rimosse da un sistema di trasporto specifico per le ammine. PROTEINE E PROTEOGLICANI DEI GRANULI : sono per lo pi proteasi seriniche neutre: la triptasi, che presente in tutti mastociti umani e scinde il fibrinogeno e attiva la collagenasi, contribuendo al danno tissutale; la chimasi, contenuta solo in alcuni mastociti, che converte langiotensina I in angiotensina II, che degrada la membrana basale dellepidermide e stimola la secrezione di muco. I proteoglicani intracellulari permettono laccumulo dei granuli e dei mediatori lipidici in particolari sedi della cellula, favorendo la degranulazione e lesocitosi. MEDAITORI LIPIDICI : i pi importanti sono i metabolici dellacido arachidonico, che si generano per la via della ciclossigenasi e della lipossigenasi: per la via della ciclossigenasi si produce prostaglandina D2, che si lega a recettori delle cellule muscolari lisce ed esplica unazione vasodilatatrice e broncocostrittrice, inoltre stimola la migrazione dei neutrofili ed il loro accumulo nei focolai infiammatori; per la via della lipossigenasi si producono leucotrieni, che si legano alle cellule muscolari lisce provocando una vasocostrizione prolungata. Un terzo mediatore lipidico prodotto il fattore attivante le piastrine, PAF, che ha unazione broncocostrittrice e causa una retrazione delle cellule endoteliali. CITOCHINE : quelle prodotte da mastociti e basofili contribuiscono allinfiammazione allergica e sono le principali responsabili dellinstaurarsi della fase tardiva della reazione.

Si sviluppano nel midollo osseo e una volta maturi entrano in circolo; sono presenti nei tessuti periferici prevalentemente a livello della mucosa del tratto gastro-enterico, respiratorio e genito-urinario, e il loro numero pu aumentare nel corso dei processi flogistici. Le citochine prodotte dalle cellule TH2 favoriscono lattivazione degli eosinofili, e la citochina attivatrice per eccellenza lIL-5. Gli eosinofili liberano proteine, contenute allinterno di granuli, che sono dotate di un effetto tossico sui parassiti e sono in grado di danneggiare i tessuti normali, e secernono citochine e mediatori lipidici ad attivit pro-infiammatoria.

Eosinofili

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Malattie allergiche nelluomo

Soggetti con gravi forma allergiche mostrano livelli elevati di IgE nel siero e una maggiore quantit di recettori per le IgE su loro mastociti. Le forme pi comuni di atopia sono la rinite allergica, lasma bronchiale, la dermatite atopica e lallergia alimentare. IPERSENSIBILITA IMMEDIATA SISTEMICA : i mediatori liberati da mastociti e basofili penetrano nel letto vascolare e in tutti i distretti dellorganismo, provocando vasodilatazione ed essudazione di plasma; la diminuzione del tono vascolare e la perdita di plasma pu portare allo shock anafilattico. ASMA BRONCHIALE : una malattia infiammatoria provocata dal ripetersi di reazioni di ipersensibilit, caratterizzata da ostruzione delle vie respiratorie, infiammazione bronchiale, ipertrofia delle cellule muscolari lisce dellalbero bronchiale ed esaltata reattivit ai broncocostrittori.

CAPITOLO 17 IMMUNOLOGIA DEI TRAPIANTI

Il TRAPIANTO consiste nel prelievo di cellule,tessuti o organi da un individuo,il donatore,ad un altro,il ricevente. Ad esempio la trasfusione un vero e proprio trapianto di cellule ematiche e/o plasma da un individuo allaltro. Pu definirsi ortotopico se il tessuto trapiantato viene posto nella sua normale sede anatomica; si definisce eterotopico se invece il tessuto trapiantato viene posto in una diversa sede anatomica. Generalmente viene eseguito per supplire ad una carenza anatomica o Pagina 55 di 61

funzionale del ricevente; il suo limite principale la risposta immunitaria specifica del ricevente ai tessuti del donatore. Questa risposta induce ad un mancato attecchimento del tessuto trapiantato accompagnato da una reazione infiammatoria chiamata rigetto. Il trapianto pu essere: AUTOLOGO se eseguito nellambito dello stesso individuo,spostando il tessuto da un punto allaltro dello stesso organismo. SINGENICO se eseguito tra individui geneticamente identici. XENOGENICO se eseguito tra individui di specie diverse. Le molecole espresse su questi trapianti e riconosciute come estranee sono definite xenoantigeni e i linfociti capaci di riconoscerle sono chiamati xenoreattivi. Le principali barriere immunologiche per questo tipo di trapianto sono il rigetto iperacuto, il rigetto ritardato ed il rigetto cellulare acuto causati dalla presenza nel siero del ricevente di anticorpi naturali diretti contro gli xenoantigeni. Tutto ci dovuto alla combinazione di due specie diverse,cio discordanti. La maggior parte dei tessuti trapiantati infatti sono di origine porcina. Nel corso del rigetto iperacuto, lattivazione del sistema del complemento induce effetti pi disastrosi perch alcune proteine regolatrici del complemento nel tessuto porcino non sono in grado di interagire con le componenti del complemento umano,quindi non riescono a limitare il danno. Anche se si riesce a prevenire il rigetto iperacuto,entro 2-3 giorni dal trapianto si manifesta un rigetto vascolare acuto (il cosiddetto rigetto ritardato) caratterizzato da trombosi intra vascolare e necrosi fibrinoide nelle pareti vasali. I trapianti xenogenici possono anche essere rigettati attraverso una risposta agli xenoantigeni mediata da i linfociti T, risposta notevolmente pi violenta di quelle mediate dai linfocitiT negli allo trapianti. ALLOGENICO se eseguito tra individui appartenenti alla stessa specie. Le molecole espresse su questi trapianti e riconosciute come estranee sono dette allo antigeni e i linfociti in grado di individuarle sono detti allo reattivi. Il riconoscimento delle cellule trapiantate condizionato dai prodotti di geni polimorfi espressi in maniera codominante ed ereditati da entrambe i genitori presenti allinterno dello stesso tessuto trapiantato. Questi geni mappano sullMHC e codificano per molecole MHC allogeniche, che hanno le stesse caratteristiche e le stesse funzioni delle molecole MHC self, in grado di legare gli alloantigeni, per questo tutti i tipi di tessuto possono essere riconosciuti dai linfociti T alloreattivi. Le molecole MHC allogeniche di un trapianto vengono presentate ai linfociti T alloreattivi del ricevente in 2 modi: presentazione diretta presuppone il riconoscimento di molecole MHC intatte espresse sulla superficie delle APC del donatore,in forma associata ad un peptide, da parte di un TCR normale,selezionato per riconoscere una molecola MHC self. Questo per via della somiglianza strutturale tra molecole MHC allogeniche e MHC autologhe. presentazione indiretta presuppone la processazione delle molecole MHC allogeniche da parte delle APC del ricevente. I peptici ottenuti sono complessati a MHC self e presentati ai linfociti T che vengono cos sensibilizzati o attivati. Sia i linfociti T CD4 che i linfociti TCD8 contribuiscono al rigetto del trapianto. Le APC professionali possono penetrare nei tessuti trapiantati e captare Pagina 56 di 61

alloantigeni,oppure gli stessi alloantigeni possono penetrare nei linfonodi del ricevente per via linfatica: in entrambe i casi gli antigeni estranei vengono processati dalle APC e presentati ai linfociti T in maniera indiretta,stimolandone cos lattivazione. Il rigetto pu essere: IPERACUTO dovuto ad IgG rivolte contro alloantigeni proteici espressi sulle cellule endoteliali. Questi alloanticorpi nel ricevente sono generati a seguito di precedenti trasfusioni,trapianti a cui egli si sottoposto,o gravidanze precedenti;agiscono legandosi alle cellule endoteliali cos da attivare il sistema del complemento,la quale attivazione determina emorragia,occlusione trombotica della vascolatura. Il rigetto iperacuto insorge pochi minuti dopo il trapianto. ACUTO caratterizzato da danno vascolare e parenchimale mediato da anticorpi,macrofagi e linfociti T che rispondono agli alloantigeni del trapianto e, una volta attivati, provocano la lisi delle cellule trapiantate o la produzione di citochine che reclutano cellule infiammatorie,provocando necrosi tissutale. Il rigetto acuto si manifesta entro una settimana al massimo dal trapianto. CRONICO Si manifesta a distanza di molto tempo dal momento in cui viene eseguito il trapianto. caratterizzato da fibrosi del tessuto trapiantato con perdita della sua normale struttura. Per prevenire il rigetto si tratta il paziente con farmaci immunosoppressori,come ciclosporina e rapamicina, che uccidono i linfociti T o ne inibiscono le funzioni in modo tale da evitare che possano riconoscere e innescare una risposta immunitaria contro gli antigeni presenti nel tessuto trapiantato. TRAPIANTO DI MIDOLLO OSSEO Il trapianto di midollo osseo altamente suscettibile al rigetto,per questo motivo i riceventi devono essere sottoposti ad una drastica immunosoppressione preventiva. Nei pazienti questo tipo di trapianto comporta due problemi: i linfociti T maturi presenti nel tessuto trapiantato possono rispondere agli alloantigeni del ricevente causando una risposta da parte del trapianto nei confronti dellospite. Questa reazione si definisce risposta del trapianto contro lospite GVHD e pu essere : acuta,spesso mortale, caratterizzata da necrosi delle cellule epiteliali della cute,del fegato e del tratto gastrointestinale; cronica,fatale, caratterizzata da atrofia e fibrosi di uno degli organi bersaglio e inoltre dellepitelio bronchiale. i pazienti sottoposti al trapianto di midollo osseo presentano uno stato di immunodeficienza che li rende suscettibili a numerose infezioni.

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TECNICHE DI LABORATORIO USATE IN IMMUNOLOGIA

APPENDICE

COMUNEMENTE

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Gli anticorpi sono essenziali per rilevare, purificare e quantificare gli antigeni, dal momento che possibile produrre anticorpi contro qualsiasi macromolecola o sostanza chimica di piccole dimensioni.

Quantificazione degli antigeni mediante saggio immunologici

SAGGIO RADIOIMMUNOLOGICO : o RIA, prevede la disponibilit di una preparazione di antigene o anticorpo la cui quantit pu essere misurata grazie ad una sonda marcata con un radioisotopo, la cui emissione radioattiva viene poi misurata. SAGGIO IMMUNOENZIMATICO : o ELISA, prevede che la sonda sia legata ad un enzima, e lantigene o lanticorpo possono essere quantificati determinando la velocit con cui un enzima converte un substrato incolore in uno colorato mediante limpiego di uno spettrofotometro.

Purificazione ed identificazione di proteine

IMMUNOPRECIPITAZIONE : lanticorpo viene legato ad una particella insolubile come una biglia di agarosio e viene incubato con la soluzione contenente lantigene; le molecole che non si sono legate vengono lavate via, lantigene legato allanticorpo viene eluito mediante modifiche del pH o dellosmolarit. WESTERN BLOT : utilizzata per stabilire la quantit relativa e il peso molecolare di una proteina contenuta in una miscela di proteine o di altre molecole; la miscela viene sottoposta ad elettroforesi, le proteine vengono poi trasferite ad una membrana di nylon e la posizione della proteina di interesse pu essere individuata mediante un anticorpo sonda specifico marcato; se la sonda radiomarcata le proteine vengono visualizzate per autoradiografia. CROMATOGRAFIA PER AFFINITA : utilizzata per purificare un antigene o un anticorpo da una soluzione; prevede la coniugazione di un anticorpo specifico per un dato antigene ad un sopporto insolubile, con cui viene riempita un colonna cromatografica attraverso cui viene fatta passare una miscela di antigeni: le molecole che non si sono legate vengono lavate via, quelle che si sono legate vengono eluite e studiate.

Marcatura ed evidenziazione di antigeni in cellule e tessuti

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CITOMETRIA A FLUSSO E SEPARAZIONE CELLULARE ATTIVATA DALLA FLUORESCENZA : le cellule vengono marcate con sonde fluorescenti specifiche per date molecole (anticorpi marcati con fluorocromi diretti verso una molecola espressa sulla membrana cellulare) e viene misurata la quantit di fluorescenza emessa facendo passare le cellule una ad una attraverso un fluorimetro a raggi laser. Il separatore di cellule attivato dalla fluorescenza, o FACS, si basa sulla citometria a flusso e permette di separare diverse popolazioni cellulari a seconda di quale e quanta sonda fluorescente sia ad esse legata. IMMUNOFLUORESCENZA E IMMUNOISTOCHIMICA : in questo caso gli anticorpi marcati con un fluorocromo o con un enzima sono utilizzati per identificare la distribuzione anatomica di un antigene allinterno di un tessuto o di un organo tramite la rilevazione della posizione del tracciante.

Valutazione delle interazioni antigene-anticorpo

DIALISI ALLEQUILIBRIO : una soluzione di anticorpo viene racchiusa allinterno di una membrana semipermeabile di cellulosa, un tubo da dialisi (che lascia transitare molecole di piccole dimensioni, come gli antigeni, ma blocca molecole di grandi dimensioni, come gli anticorpi) ed immersa in una soluzione contenente una quantit nota di antigene: lanticorpo lega lantigene, che viene impossibilitato a fuoriuscire dalla membrana, mentre la concentrazione dellantigene libero uguale allinterno dei 2 compartimenti. Laumento della quantit di antigene presente nel tubo da dialisi dipende dalla concentrazione dellantigene, dalla concentrazione dellanticorpo e dalla costante di dissociazione, che viene calcolata mediante spettroscopia o altre tecniche.

Analisi della struttura e dellespressione genica

SOUTHERN BLOT : il DNA genomico viene ridotto in frammenti minori da endonucleasi di restrizione, che sono enzimi che riconoscono particolari sequenze denominate siti di restrizione; il DNA digerito viene sottoposto ad elettroforesi e poi trasferito su una membrana di nylon, viene poi denaturato e fatto ibridare con una sonda, la cui posizione viene rilevata per autoradiografia e valutata. NORTHERN BLOT : lmRNA viene sottoposto ad elettroforesi e viene poi fatto ibridare con una sonda; la posizione in cui si lega la sonda indica le dimensioni dellmRNA, e il grado di legame la quantit di mRNA presente nel campione.

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SAGGIO DI PROTEZIONE DELLRNA : lRNA viene ibridato con una sonda radiomarcata e viene aggiunto un enzima che degrada solo RNA a singolo filamento, permettendo di evidenziare lRNA ibrido come bande radioattive nellelettroforesi. PCR : permette di ottenere un numero elevato di copie di un segmento di DNA di cui si conosca una regione al 5 e una regione al 3 su cui si vanno a legare specifici primers che permettono ad una polimerasi batterica termostabile di sintetizzare di continuo lo stesso segmento del DNA.

Topi transgenici e knockout

Per generare topi transgenici vengono introdotte sequenze di DNA estraneo nel pronucleo di ovociti murini fertilizzati; la maggior parte dei neonati esprime il transgene in tutte le cellule. I topi knockout, portatori di una mutazione mirata o della delezione di un gene, vengono generati basandosi sul metodo della ricombinazione omologa: se il gene da inserire contiene sequenze omologhe ad un gene endogeno, esso si ricombiner con sequenze omologhe sostituendole. La ricombinazione omologa pu essere utilizzata per sostituire una sequenza genica normale con quella di un altro gene.

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