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Due possibili approcci per la formazione del legame

fosfodiestereo:
accrescimento in direzione 3-5 o in direzione 5-3

3-5

5-3

Per poter ottenere un buon controllo della


regioselettivit delle reazioni di accoppiamento,
necessario proteggere i gruppi funzionali
potenzialmente interferenti

In linea di principio, necessario utilizzare gruppi


protettori adatti per:
1) le funzioni alcoliche dello zucchero non implicate
nella reazione di accoppiamento;
2) i gruppi amminici esociclici delle basi azotate
citosina, guanina e adenina (la timina
generalmente poco reattiva).

Gruppo protettore per lOH in 5:


4,4-Dimetossitrifenilmetile (DMT), acido-labile

Protezione per lOH in 3 come estere


(base-labile):
1) Conversione in estere benzoico (in sintesi in
soluzione) o
2) Aggancio al supporto solido attraverso un
linker succinico (in sintesi in fase solida)

Protezione per i gruppi amminici esociclici


delle purine o pirimidine:
formazione di ammidi aromatiche
(labili alle basi)

Formazione del legame 3-5


fosfodiestereo

Attivazione del fosfato con un


arensolfonilcloruro

Formazione di unanidride mista al fosfato, intermedio molto reattivo


(atomo di P reso centro elettrofilo, arensolfonato ottimo gruppo uscente)

Attivazione del fosfato con DCCI

Si realizza un legame anidridico con la DCCI; il P reso un buon


centro elettrofilo, con la dicicloesilurea come gruppo uscente

Metodo del fosfodiestere in fase solida

Supporto solido usato: resina poliacrilammidica; rese medie per


accoppiamento: 95%; tempo medio per singolo accoppiamento: 12 ore.

Problemi presenti nella chimica del


fosfodiestere: formazione di catene
parassite mediante legami pirofosfato

Metodo del fosfotriestere

Metodo del fosfotriestere


per sintesi in soluzione

Rimozione dei gruppi protettori


dalloligonucleotide protetto

Metodo del fosfotriestere in fase solida

Nucleotidi con fosfati a diversa reattivit

Sintetizzatore manuale per sintesi


di oligonucleotidi

Metodo del fosforammidito:


lintermedio chiave
Nucleosidi 3-fosforammidito sono
relativamente stabili (ad esempio,
una volta sintetizzati, possono
essere conservati a 18 C per
mesi), ma in presenza di acidi anche
molto deboli risultano estremamente
reattivi verso i nucleofili.
Il metodo del fosforammidito
stato descritto per la prima volta
da Serge Beaucage e Marvin
Caruthers nel 1981.
Attualmente il metodo pi usato
per la sintesi di oligonucleotidi in
fase solida.

Sintesi di ODN in fase solida con


chimica del fosforammidito

Meccanismo di attivazione di un fosforammidito

Nu =
nucleoside

2-cianoetile =
gruppo
protettore per il
fosfito

Un derivato fosfito triestere (P III,


molto reattivo) pu essere
rapidamente e quantitativamente
convertito in fosfato triestere [P (V),
stabile] mediante ossidazione in
condizioni anche molto blande.
Tipicamente, questa reazione
effettuata con I2 (0.1 M) in
piridina/THF con piccole percentuali di
acqua.

Ciclo di sintesi completo su


sintetizzatore di oligonucleotidi
Inizio del ciclo

Un sintetizzatore automatico di
oligonucleotidi su scala di laboratorio

ABI 392 DNA synthesizer (Applied Biosystem)

Monitoraggio dellefficienza di
accoppiamento mediante quantizzazione
del catione DMT+

Il catione DMT+ fortemente colorato in rosso-arancione


(max= 498 nm, =71700 cm-1 M-1)

Resa complessiva teorica in funzione della


resa per singolo accoppiamento e del
numero di accoppiamenti

Numero di accoppiamenti
% resa singolo accoppiamento
5

10

15

20

25

30

Il supporto solido pi usato: la CPG


(Controlled Pore Glass)

lcaa = Long Chain Alkylamine


(linker a lunga catena, terminante
con funzione amminica primaria)

Funzionalizzazione del supporto CPG


con il primo nucleoside

Funzionalizzazione
media: 30-100
micromoli per grammo
di supporto

Il supporto Tentagel una valida


alternativa alla CPG

Funzionalizzazione media:
100 micromoli per grammo di supporto secco