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Reazioni di idrolisi
Circa 2/3 delle biotrasformazioni riportate su composti non-naturali negli ultimi 20 anni usano enzimi idrolitici. Ci sono un certo numero di ragioni per questo: Le idrolasi non richiedono cofattori; Sono largamente ottenibili da fonti diverse; Rimangono attive anche in mezzi non-acquosi dando luogo ha reazioni di formazioni di esteri, per esempio, piuttosto che a reazioni di idrolisi Mostrano frequentemente una rimarchevole chemo- regio- e stereoselettivit anche accettando una grande variet di substrati: Tra tutti i tipi di reazioni, che coinvolgono gli enzimi idrolitici, le idrolisi delle ammidi e degli esteri sono quelle pi utilizzate e sono anche le pi facili. Queste reazioni coinvolgono proteasi, lipasi ed esterasi. Il meccanismo di una idrolisi enzimatica molto simile a quello di una idrolisi chimica base catalizzata. Un gruppo nucleofilico del sito attivo dellenzima attacca il gruppo carbonilico dellestere o dellammide. Questo operatore chimico nucleofilo pu essere il gruppo della serina, ad esempio lesterasi estratta del fegato del maiale (PLE), la subtilisina e le lipasi del pancreas suino (PPL) o da Mucor sp., il gruppo carbossilico dellacido aspartico (pepsina) o il tiolo della cisteina (papaina).

Il meccanismo proposto nello schema quello della serina-idrolasi. Due gruppi addizionali (acido aspartico e istidina) sistemati vicino alla serina, che il nostro operatore chimico formano la triade catalitica. Questa speciale configurazione aumenta lacidit del gruppo idrossilico e quindi la nucleofilicit che lo rende capace di attaccare il carbonile dellestere (step I).

2 Quindi il nucleofilo, normalmente lacqua, pu attaccare a sua volta lacil-enzima intermedio rigenerando lenzima e rilasciando lacido carbossilico. Quando lenzima opera in un mezzo dove la concentrazione di acqua bassa (bassa attivit di acqua) qualsiasi altro nucleofilo pu competere con lacqua per dare varie biotrasformazioni.

Lattacco di unaltra molecola di alcol porta ad un altro estere (reazione di interesterificazione), lentrata di unammina produce unammide e quando lossigeno funge da nucleofilo si ha un peracido. Le carbossil proteasi sono chiamate cos perch hanno due residui essenziali di aspartato cataliticamente essenziali. Erano anche chiamate proteasi acide perch sono attive ad un pH molto basso (2-3). Il membro pi noto di questa classe la pepsina che formata da ununica catena polipeptidica con 327 amminoacidi. Il sito attivo una regione estesa che pu accomodare almeno 4 o 5 residui substrato. Lenzima ha una preferenza per amminoacidi idrofobici su entrambi i lati da scindere. La pepsina raramente catalizza lidrolisi di esteri. Le proteasi tioliche sono ampiamente distribuite in natura. La papaina, che di origine vegetale, un polipeptide costituto da 212 amminoacidi. Il sito attivo cisteina-25 aiutata da istidina-159.

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(cisteina-25)
SH

istidina-159

N O N H R X O

(cisteina-25)

S R

HX istidina-159 (cisteina-25)
S N H H N N

istidina-159

N H

(cisteina-25)

SH

istidina-159
O

(cisteina-25)

S R

N H

H2O RCOOH istidina-159


N

(cisteina-25)
N H

H N

istidina-159

N H

Durante queste reazioni qualsiasi tipo di chiralit del substrato riconosciuta dallenzima e questo porta ad una preferenza per una delle due direzioni possibili di attacco. Il valore di questa discriminazione detta selettivit. Lidrolasi pu distinguere due enantiofacce di un substrato achirale come nel caso degli enol esteri.

Se i substrati prochirali possiedono due gruppi identici (X) ma enantiotopici chiamati pro-R e pro-S sono soggetti ad una idrolisi enzimatica, vi una discriminazione nella scelta di X che viene trasformato in Y.

Numerosi diesteri meso sono trasformati in composti chirali usando questa discriminazione.

Dal momento che le reazioni idrolitiche si compiono in acqua, esse sono praticamente irreversibili. La cinetica di queste reazioni ad un unico stadio (come quelle di un gruppo prochirale o di un composto meso che vengono idrolizzati) dove i substrati sono trasformati nei due enantiomeri P e Q e regolata dalle due costanti K1 e K2 rispettivamente.

La selettivit della reazione ( ) governata dal rapporto K1/K2 che costante durante tutta la reazione. Come conseguenza la purezza ottica (ee) non dipende dalla conversione. La selettivit in questo caso pu essere cambiata solo cambiando lambiente di reazione (modificazione del substrato, scelta di un altro enzima, addizione di un cosolvente organico, variazione delle temperatura e del pH). Daltra parte per alcuni diesteri la reazione non si ferma ad un unico stadio ma pu procedere allidrolisi dellaltra funzione dando un prodotto R achirale.

Facciamo un esempio di una reazione ad un singolo stadio e di una reazione a due stadi.

6 In questa reazione leccesso enantiomerico regolato dal rapporto K1/K2 ed costante lungo tutto larco della reazione.

La purezza ottica in questo caso dipende da tutte e quattro le costanti dal momento che il secondo stadio idrolitico non pu essere evitato. Dal momento che lenzima mantiene sempre la preferenza per la stessa chiralit, si pu concludere che se S (substrato) trasformato pi velocemente in P , Q sar idrolizzato pi velocemente di P nel diolo R. La selettivit in questo caso sar governata da K1 > K2 e da K4 > K3 La purezza ottica (ee) in questo caso sar funzione della conversione. La prima parte della reazione sar governata dalla K1 ma quando il secondo stadio idrolitico inizier la sua aumenter la purezza del primo stadio. Quando un substrato racemico viene sottoposto ad idrolisi enzimatica si ha la discriminazione tra i due enantiomeri dei quali uno reagir pi velocemente dellaltro perch fitter meglio con il sito attivo dellenzima. richiesta stereochimica

Questo porter ad una risoluzione cinetica del racemato. In ogni caso in queste reazioni la resa teorica sar al massimo al 50%.

Idrolisi di ammidi
Lidrolisi enzimatica di un legame ammidico legata alla chimica degli amminoacidi e dei peptidi. La produzione mondiale di amminoacidi enantiomericamente puri superiore a 0.5 milioni di tonnellate di materiale ed ha un mercato di 2 bilioni di dollari lanno. I tre amminoacidi, che dominano questa area, sono lacido glutammico, la lisina e la metionina racemiche, e sono prodotti per fermentazione o per via chimica.

Gli L-amminoacidi sono usati sempre di pi come additivi o come prodotti di partenza per la sintesi di farmaci, prodotti per lagricoltura e dolcificanti artificiali. Recentemente alcuni amminoacidi che possiedono la non-naturale configurazione D vengono usati come composti biologicamente attivi o come componenti di tali prodotti. Per esempio la D-fenilglicina e il suo p-idrossi derivato vengono utilizzati nella sintesi di antibiotici come lampicillina e lamoxicillina. Tra i principali metodi per la sintesi di amminoacidi enantiomericamente puri vi la risoluzione della miscela racemica utilizzando enzimi idrolitici come la proteasi e lesterasi, che certamente il pi comune, mentre le reazioni con liasi e deidrogenasi sono pi complesse.

8 Gli amminoacidi possono essere idrolizzati da proteasi ed esterasi quando il gruppo amminico protetto come gruppo acilico. In queste reazioni si possono utilizzare anche proteasi non specifiche come quelle delle cellule di lievito di birra.

Le ammidi degli amminoacidi sono idrolizzate anche da amidasi (chiamate anche amminopeptidasi) ottenute da vari microrganismi come Pseudomonas, Aspergillus o Rhodococcus.

Le amminoacilasi, isolate da Aspergillus e Penicillium catalizzano invece lidrolisi di N-acilamminoacidi.

Idrolisi di esteri

A differenza del grande numero di lipasi disponibili poche esterasi sono utilizzabili (come quelle estratte dal fegato del maiale, PLE, e del cavallo, HPLE) e la conseguenza era che quando lidrolisi di un estere non procede selettivamente non facile cambiare enzima. Per ovviare il problema spesso vengono utilizzati i microrganismi come tali anche se il controllo di queste reazioni pi complicato. Le strutture dei substrati che vengono idrolizzati da esterasi e proteasi si possono ricondurre alle seguenti strutture generali.

Tra le esterasi quella estratta dal fegato del maiale (PLE) la pi usata data la sua grande versatilit che probabilmente dovuta al ruolo giocato da questo enzima nella dieta del maiale. Una delle peculiarit di questo enzima sono le blande condizioni di utilizzo che permettono di evitare reazioni di decomposizione anche in prodotti molto sensibili alle condizioni di idrolisi chimica.

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Anche cellule di alcuni microrganismi sono utilizzate per lidrolisi di esteri, come Bacillus subtilis, Brevibacterium ammoniagenes, Bacillus coagulans, Pichia miso e Rhizopus nigricans. Sebbene il controllo di queste reazioni sia pi difficile, la selettivit di norma migliore di quella degli enzimi isolati. Un esempio la risoluzione di alcoli secondari per idrolisi degli acetati con Bacillus sp.

Per evitare il problema del controllo della reazione si pu utilizzare limmobilizzazione di cellule cresciute come lesempio dato dal lievito di birra.

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Limportanza degli -aril e degli -arilossi derivati dellacido propionico come antiifiammatori (Naproxen) e prodotti chimici per lagricoltura (Diclofop), in cui lattivit maggiore in uno solo dei due enantiomeri (S nel caso del Naproxen), ha portato alla loro risoluzione con carbossil esterasi estratta da ceppi di Bacillus.

Un altro esempio di idrolisi di un agente antinfiammatorio il Ketorolac che viene risolto per idrolisi del suo estere con una proteasi ottenuta da Streptomyces griseus. Quando lidrolisi viene condotta a pH > 9 vi una spontanea racemizzazione del prodotto di partenza che porta alla risoluzione totale (risoluzione cinetica dinamica).

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Lottimizzazione della selettivit di questi enzimi si pu ottenere per modificazione del substrato. Questo concetto applicabile a tutte le reazioni enzimatiche infatti labilit degli enzimi a riconoscere la chiralit di un dato substrato dipende fortemente dalla forma sterica del substrato stesso. Questa variazione si pu ottenere semplicemente variando i gruppi protettori.

La variazione del solvente con laggiunta di cosolventi organici miscibili con lacqua come metanolo acetone, diossano, dimetilformammide un metodo usato frequentemente per migliorare la selettivit dellenzima. Si utilizza il cosolvente da un minimo del 10% ad un massimo del 50%. A concentrazioni superiore si rischia di inattivare lenzima.

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Lottimizzazione delle condizioni di reazione come laggiustamento del pH e la variazione di temperatura danno risultati inferiori.

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Idrolisi di epossidi
Gli epossidi enantiomericamente puri e i corrispondenti dioli ottenibili da loro sono intermedi importanti in sintesi organica e quindi molti metodi chimici e biochimici sono stati studiati per ottenerli. Tra i metodi biochimici viene riportata la diretta epossidazione degli alcheni con monoossigenasi isolate (citocromo P 450) o monoossiganasi batteriche (da pseudomonadacee, mycobatteri, xanthobatteri, corynebatteri e nocardia). Le rese sono basse ma gli eccessi enantiomerici alti. Daltra parte gli epossidi prodotti hanno configurazione R e i batteri hanno unalta specificit di substrato. Lultimo approccio biocatalitico dato dalla risoluzione cinetica o tramite lipasi, ma esiste la necessit della presenza nella molecola di una funzione esterea, acida o alcolica, o tramite diretta idrolisi con epossido idrolasi.
O

Epossido idrolasi
R2

HO

OH

R1

R1

R2

Le epossido idrolasi sono isolate da una grande variet di organismi. Si trovano in tutte le specie di mammiferi e la pi studiata quella estratta dal fegato dei mammiferi (mEH). Fino a poco tempo fa si riteneva che le epossido idrolasi derivanti da altre fonti fossero rare, soprattutto quelle prodotte da microrganismi che avrebbero permesso una produzione su larga scala. Invece un buon numero di epossido idrolasi sono state recentemente purificate da microrganismi, patate, insetti e semi di soia. Lapertura degli anelli epossidici avviene con attacco del nucleofilo in posizione anti allossigeno dellanello con inversione di configurazione del carbonio attaccato. Lidrolisi dei cis-epossidi perci produce dioli la cui configurazione assoluta treo in proiezione di Fischer e anti nella struttura a zigzag. Cos lidrolisi dei trans-epossidi porta agli anti (eritro) dioli.
H2O
C3H7 OH HO O OH HO OH C3H7 HO

syn treo
OH O C3H7 OH OH OH C3H7

H2O

anti eritro

15 Lepossido idrolasi estratta dal fegato dei mammiferi (mEH), che di gran lunga la pi studiata, una singola catena peptidica con un peso molecolare tra 48.5 e 49.5 kDa e il pH ottimale di lavoro compreso tra 8.9 e 9.4. Sono proposti due meccanismi per questa idrolisi.

Il primo un meccanismo generale base catalizzato dove un residuo di istidina prende un protone da una molecola di acqua intrappolata nel sito attivo dellenzima. Questo genera un anione idrossilico libero che attacca una delle due estremit dellepossido, che daltra parte pu essere attivato da una parziale protonazione, per esempio, da un residuo di lisina.

16 Il secondo meccanismo coinvolge lattacco di un residuo carbossilato, nucleofilico, allepossido che viene ancora attivato per protonazione. Questo d origine ad un -idrossiestere intermedio, legato in maniera covalente al sito attivo dellenzima. Lintermedio idrolizzato da un anione idrossido, ancora generato dalla deprotonazione di una molecola dacqua operata da un residuo di istidina. Il rilascio del diolo rigenera il carbossilato nucleofilo. Questo sembra essere il meccanismo pi probabile di azione di questo enzima. In aggiunta agli studi sul loro ruolo biologico e al loro meccanismo, si focalizzata lattenzione sul loro possibile impiego come catalizzatori nella sintesi organica. In generale mEH mostra una grande enantioselettivit e si visto che gli epossidi monosostituiti con una larga parte idrofobica sono degli ottimi substrati, i cis- e gli 1,1-disostituiti sono ancora ragionevolmente accettati, mentre i trans-disostituiti, i tri- e i tetra sostituiti non sono substrati accettabili. Alta stereoselettivit si ha anche nellapertura di epossidi aril sostituiti.

mEH R
HO

OH

S
Ph Ph Ph

mEH R
Ph HO

OH

S R
Ph

Ph

Lo stirene ossido viene idrolizzato dando lR diolo otticamente puro al 12% di conversione, mentre al 78% di conversione viene lasciato lS-epossido enantiomericamente puro. Per quanto riguarda il metil stirene ossido si ottengono entrambi i prodotti enantiomericamente puri. Gli stessi R,R-dioli si ottengono con cis-epossidi alifatici. Ampi studi su questa idrolasi hanno dimostrano che questa agisce secondo queste linee guida:
Lanello epossidico sempre aperto per attacco anti rispetto allossigeno; Lattacco avviene sul carbonio meno stericamente impedito: questo normalmente un primario o

secondario, mai un terziario;


Se lepossido come nella figura lattacco avviene inizialmente sul carbonio di sinistra;

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Il problema della reperibilit delle epossido idrolasi derivanti dal fegato dei mammiferi non si pone per gli enzimi ottenuti da microrganismi. Solo recentemente sono stati isolati questi enzimi da batteri e funghi e hanno dimostrato una buona selettivit oltre alla possibilit di fare reazioni su larga scala non essendoci limitazioni alla loro produzione. Una delle prime idrolasi stata estratta, dopo un ampio screening su varie specie batteriche, da
Rhodococcus sp. e si dimostrata capace di idrolizzare una serie di epossidi monosostituiti e 1,1-

disostituiti.

Rhodococcus sp
H 3C O CH3

R
O CH3

S
OH

OH

Substrato R =

Conversione %

Epossido ee%

Diolo ee%

n-pentile n-eptile n-nonile

43 20 36

71 (R) 25 (R) 55 ( R)

96 (S) 98 (S) >99 (S)

Allaumentare della catena aumenta la selettivit. Altre specie come Rhodococcus equi, Rhodococcus
ruber, Mycobacterium paraffinicum e Nocardia hanno alta selettivit verso epossidi 1,1-disostituiti.

In tutti i casi esaminati, lidrolisi procede con inversione del carbonio ossiranico non-sostituito portando a ritenzione di configurazione nel diolo prodotto.

67%

33% 44%

56%

18 Dai dati finora ottenuti (pochi data la recente sperimentazione) possiamo dire che lalta enantioselettivit di questi enzimi si esplica solo su substrati con struttura ben definita e questo indica che il gruppo metilico in C-2 gioca un ruolo importante nella selettivit quando lo confrontiamo con gli epossidi monosostituiti. Molti funghi possiedono delle EH che hanno strereospecificit in alcuni casi diversa. Un esempio lidrolisi di stirene ossido con Aspergillus niger e Beauveria sulfurescens.

OH O OH

S A. niger
O

OH O OH

B. sulfurescens

Entrambe le specie danno lo stesso R-diolo ma lasciano lepossido opposto. Questo indica che A. niger idrolizza lR-stirene ossido con ritenzione di stereochimica (attacco al C-2) e che B. sulfurescens idrolizza lS-stirene ossido con inversione di stereochimica (attacco al C-1 in posizione benzilica). Altra spiegazione lattacco in posizione benzilica di un gruppo nucleofilico del sito attivo con la formazione di un complesso enzima-substrato (prima inversione) che viene idrolizzato da una molecola dacqua (seconda inversione).

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OH O OH

ritenzione A. niger

H2O
OH O OH

inversione B. sulfurescens

H2O

Enz

Enz
X O OH OH OH

inversione

inversione

H2O

E del 1997 la scoperta di un lievito, Rhodotorula glutinis, in grado di idrolizzare con enantioselettivit eccezionalmente alta sia epossidi alchilici che arilici ed aliciclici.

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Lipasi
I lipidi sono gli elementi chiave nella chimica della vita. La maggior parte degli organismi usa la chimica supramolecolare inerente ai fosfolipidi per formare membrane. Molte piante ed animali immagazzinano energia sotto forma di trigliceridi che non sono solubili in acqua. Per il riciclo di tali sostanze e altre molecole biologiche, essi producono esterasi, enzimi che sono in grado di idrolizzare legami di esteri solubili in acqua. Le esterasi, che possono idrolizzare trigliceridi allinterfaccia acqua/olio, sono chiamate lipasi o pi sistematicamente triacilglicerolo idrolasi e quelle che attaccano i fosfolipidi sono chiamate fosfolipasi. Entrambi i tipi di enzimi hanno ricevuto recentemente grande attenzione. Mentre le fosfolipasi sono coinvolte in molti processi metabolici, quali il ripristino delle membrane, le lipasi hanno diverse
funzioni nella degradazione dei cibi e dei grassi. Esse trovano anche applicazioni nelle biotecnologie

(in particolare come additivi di detergenti) e come catalizzatori per la produzione di speciali prodotti
oleochimici e per la sintesi organica.

Questa larga potenzialit sintetica dovuta al fatto che le lipasi, a differenza di molti altri enzimi, accettano una grande variet di substrati, sono abbastanza stabili in solventi organici non-acquosi e a seconda del sistema solvente usato possono dare reazioni di idrolisi e di esterificazione.
OAc OAc OH

OAc

OAc

HOAc HOAc
OAc OAc OAc OAc

H2O HOAc
OAc OH

H2O HOAc
OH OH

H2O HOAc
OH OH

In aggiunta le lipasi possono ospitare una grande variet di substrati, oltre ai trigliceridi, come gli esteri alifatici, aliciclici ed aromatici e reagiscono con alta enantio- e regioselettivit. Infine lacil-enzima intermedio nelle reazioni catalizzate da lipasi non solo formato da esteri carbossilici, ma da molti altri substrati come tioesteri ed ammine attivate, che allargano considerevolmente la potenzialit sintetica delle lipasi. Pur essendo ubiquitarie e quindi estraibili da tessuti animali e vegetali, le lipasi che si trovano in commercio sono derivate da microrganismi. Dallavvento delle tecniche di ingegneria genetica un crescente numero di lipasi sono preparate da ricombinanti batteri e lieviti. Un esempio la lipasi detergente ottenuta dal fungo Humicola lanuginosa che commercialmente prodotta in larga scala (parecchie tonnellate allanno) per fermentazione di Aspergillus oryzae in cui stato clonato il gene che codifica per la lipasi di Humicola lanuginosa. Nella tabella sono riportate importanti lipasi commerciali.

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Tabella. Importanti lipasi commerciali ORIGINE SIGLA M (kDa) SPECIFICITA APPLICAZIONI

da mammiferi lipasi pancreatica umana lipasi gastrica umana lipasi pancreatica suina da funghi Candida rugosa Candida antarctica B Geotrichum candidum
Humicola lanuginosa Rhizomucor miehei Aspergillus orizae Penicillium camamberti Rhizopus delemar Rhizopus oryzae Rhizopus arrhizus

HPL HGL PPL

50 50 50

sn-1,3 sn-3 sn-1,3

Sintesi organica, aiuto digestivo

CRL CAL GCL HLL RML AOL PEL RDL ROL RAL

60 60 60 30 30 30 41 41 41 41

non-specifica sn-1,3 acidi grassi insaturi non-specifica sn-1,3 sn-1,3 sn-1,3 sn-1,3 sn-1,3

Sintesi organica Sintesi organica Oleochimica Detergenti Produzione formaggi Produzione formaggi Monogliceridi Oleochimica Oleochimica Oleochimica

da batteri Pseudomonas glumae


Burkholderia cepacia Pseudomonas pseudoalcaligenes Pseudomonas mendocina Chromobacterium viscosum Bacillus thermocatenulatus Fusarium solani

PGL BCL PPL PML CVL BTL-2 FSl

33 33 33 33 33 43 22

non-specifica non-specifica sn-1,3 sn-1,3 sn-1,3 sn-1,3

Enzima detergente, sintesi organica Sintesi organica Detergenti Detergenti Sintesi organica Detergenti

Sebbene le lipasi idrolizzino e formino il legame estereo come le esterasi e le proteasi, hanno un meccanismo differente. La differenza pi importante sta nella interazione con il substrato. Mentre le esterasi e le proteasi seguono la normale legge di Michaelis-Menten in cui lattivit dellenzima dipende dalla concentrazione del substrato, le lipasi invece non mostrano quasi attivit fino a che sono disciolte nel mezzo, mentre quando la concentrazione del substrato cresce fino al limite della sua solubilit, vi un repentino aumento di attivit.

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La prima struttura tridimensionale di una lipasi (raggi X nel 1990) suggerisce che lattivazione interfacciale sia dovuta alla presenza di un gancio peptidico amfifilico che copre il sito attico dellenzima in soluzione, proprio come un coperchio. Dalla struttura di un cocristallo tra una lipasi e il substrato, vi unevidenza che quando avviene il contatto con linterfaccia lipide/acqua, questo coperchio si riarrangia e rende il sito attivo accessibile al substrato.

Le idrolisi catalizzate da lipasi quindi avvengono in un sistema bifasico. E sufficiente impiegare il

substrato ad alte concentrazioni in quanto esso stesso costituisce la fase organica o un solvente organico immiscibile con lacqua per aver lattivazione dellenzima. E da tenere presente che non tutte le lipasi mostrano il fenomeno dellattivazione interfacciale e quindi non questo il criterio per classificarle ma rimane quello della loro capacit di idrolisi degli acil gliceroli a lunga catena.

23 Comunque tutte le lipasi finora studiate idrolizzano i legami esterei attraverso una triade catalitica composta da una serina nucleofilica attivata da un legame idrogeno con listidina e aspartato o glutammato.

Mentre molte lipasi hanno grandi somiglianze, piccole variazioni nellarchitettura del sito di legame dellenzima hanno grandi ripercussioni sulle propriet catalitiche, la temperatura e la stabilit della lipasi in un solvente.

Applicazioni in oleochimica
Mentre la maggior parte dei 60 milioni di tonnellate di grassi e oli prodotti ogni anno sono direttamente usati nei cibi, pi di 5 milioni di tonnellate sono una fonte chimica rinnovabile per applicazioni nonalimentari (oleochimica) come saponi, trigliceridi transesterificati e monogliceridi.

a) Saponi

La maggior applicazione dei trigliceridi nella produzione dei saponi. Il processo chimico fornisce rese quantitative (2 milioni di tonn/anno) in pochi minuti a 100C partendo da qualsiasi tipo di grasso.

24 La produzione di sapone con lipasi (34 h a 30C) oggi effettuato soltanto da una ditta giapponese (Miyoshi Yushi) che produce saponi usando lipasi da Candida rugosa. A favore dellutilizzo di lipasi sta il minor costo dimpianto, il miglior colore del sapone e la produzione di glicerolo acquoso al 20% invece del diluitissimo glicerolo che si ottiene con il processo chimico mediante vapore.

b) Trigliceridi transesterificati

Molte lipasi mostrano una specificit sn-1,3 e possono quindi essere usate in reazione di transesterificazione delle posizioni 1 e 3 di un trigliceride naturale: bisogna per sopprimere la tendenza degli acili a migrare dalla posizione 2 alle posizioni 1 e 3. Tre tipi di trigliceridi modificati hanno oggi importanza commerciale:
1. Grassi con alta spalmabilit 2. Equivalenti del burro di cacao 3. Trigliceridi altamente digeribili

Grassi con alta spalmabilit

Il punto di fusione di un grasso modulato sul numero di doppi legami presenti nelle catene alchiliche. Nella produzione di margarine dopo il processo di idrogenazione , bisogna modificare la quantit di acidi grassi saturi per renderle morbide e questo viene fatto con lipasi sn-1,3 e reazioni di transesterificazione.
Equivalenti del burro di cacao

Nel 1995 sono state importate dai paesi tropicali 100.000 tonnellate di burro di cacao. Il burro di cacao ha un grande uso alimentare perch fonde alla temperatura del corpo umano e quindi ha un gradevole sapore in bocca. I trigliceridi predominanti nel burro di cacao sono glicerolo con in posizione sn-2 acido oleico e in posizione sn-1 e sn-3 acido stearico e palmitico (SOS o SOP). Questi equivalenti del burro di cacao vengono preparati chimicamente o con lipasi attraverso reazioni di transesterificazione di trigliceridi naturali come la frazione intermedia di olio di palma (POP) o di olio di girasole con alto contenuto di oleico (OOO) con la tristearina (SSS).

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Poich i gruppi idrossilici primari sono pi reattivi del secondario, i trigliceridi del tipo SOP e SOS si formano in maniera predominante. LUnichema produce parecchie tonnellate di grasso di cioccolata da olio di girasole OOO con acido stearico usando lipasi da Rhizomucor miehei.

Trigliceridi altamente digeribili

Lassorbimento dei trigliceridi nellintestino tenue dipende dalla struttura del trigliceride. I trigliceridi che contengono acido palmitico in posizione sn-2, come nel latte umano, sono assorbiit molto bene. LUnichema produce OPO, che viene utilizzato nella dieta dei neonati prematuri, da tripalmitina (PPP) con acido oleico utilizzando lipasi da Rhizomucor miehei.
c) Monogliceridi

26 Nel 1993 sono state prodotte 120.000 tonnellate di mono- e digliceridi via glicerolisi di trigliceridi. I
monogliceridi sono dei blandi emulsionanti e sono permessi come additivi alimentari.

Lapplicazione industriale include lemulsificazione dei cibi, dei cosmetici e dei farmaci. Dal punto di vista economico questo processo enzimatico non ancora conveniente perch comunque si ottengono miscele di mono- e digliceridi.

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Applicazioni come detergenti


Dopo il grande successo commerciale delle proteasi come additivi di detergenti, sono state studiate le le lipasi per lo stesso scopo. Si sperava che le lipasi competessero con i tensioattivi chimici in modo da poter cambiare la formulazione dei detersivi in modo da abbassare le temperature di lavaggio e diminuire limpatto ambientale. Un liquido di lavaggio standard contiene tensioattivi anionici e non-ionici, ossidanti e agenti complessanti a pH di circa 10 e a temperature di 50C che sono un ambiente ostile per gli enzimi. Daltra parte lutilizzo di lipasi portava ad un netto miglioramento delle prestazioni di lavaggio soprattutto quando sui tessuti erano presenti macchie di rossetto. La prima compagnia a commercializzare lipasi come detergenti stata la Novo-Nordisk che ha prodotto la LIPOLASE, una lipasi fungina ricombinante da Humicola lanuginosa espressa in Aspergillus oryzae. Oggi le lipasi sono usate in molte formulazioni di detergenti. I maggiori prodotti commerciali sono nella tabella.

Tabella. Lipasi usate in formulazioni di detergenti Nome corrente Compagnia Origine pH ottimale T ottimale

Lipolase

NovoNordisk

Humicola lanuginosa, clonata ed espressa

10

40C

in Aspergillus oryzae
Pseudomonas pseudoalcaligenes,

Lipomax

GistBrocades

11

45C

riclonata ed espressa nello stesso organismo

Lumafast

Genencor

Pseudomonas mendocina, clonata ed

10.5

40C

espressa in Bacillus

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Applicazioni nellindustria alimentare


Il caglio, isolato dallo stomaco dei ruminanti, una miscela di enzimi tradizionalmente usata per la preparazione di formaggio. Il componente attivo del caglio la chimosina, un aspartato proteasi coinvolta nella coagulazione del latte attraverso lidrolisi della caseina: inoltre le lipasi ed le esterasi contenute del caglio contribuiscono alla maturazione del formaggio. Quando in America sono state proibite le importazioni di cagli dallEuropa, proteasi e lipasi sono state usate largamente nella produzione di formaggi. La specificit delle lipasi per lunghezze di catena diversa, hanno permesso di innalzare il profumo dei formaggi, di rendere pi veloce la maturazione o preparare formaggi modificati enzimaticamente (EMC). Nella tabella vengono indicati alcuni esempi di lipasi utilizzate nella produzione di formaggi o nellaccelerazione della loro maturazione.

Tabella. Esempi di lipasi utilizzate nella produzione di formaggi

FORMAGGIO Romano, domiati, feta

LIPASI Lipasi pregastriche da agnello o capra, Mucor


miehei

Mozzarella, parmigiano, provolone Fontina, ras, romi Cheddar, manchego, blue

Lipasi pregastriche da agnello o capra


Mucor miehei Aspergillus oryzae, Aspergillus niger

A seconda della specificit di lunghezza di catena delle lipasi, c la predominante liberazione di acidi grassi a corta catena (C4-C6) che porta ad un odore intenso, o di acidi grassi a media o lunga catena (>C12) che portano ad un sapore di sapone che vengono rapidamente metabolizzati dai consorzi microbici che si trovano nei formaggi ad latri odori e sapori.

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Applicazioni come biocatalizzatori in sintesi organica


Se vengono considerate solo le specifiche e limitate funzioni nel metabolismo, le lipasi dovrebbero avere uno scarso interesse in chimica organica mentre si finora visto che uno degli enzimi pi versatili per poche e semplici ragioni:
A causa del grande dominio enzimatico richiesto per legare il gruppo acilico e il comportamento

non-definito delle catene aciliche, le lipasi possono ospitare una grande variet di substrati
sintetici mantenendo ancora enantio- e regioselettivit. Le lipasi agiscono allinterfaccia acqua/lipide, che esibisce unalta energia interfacciale. Per resistere

alleffetto denaturante dellinterfaccia, le lipasi hanno strutture stabili che possono sopravvivere anche in presenza di un solvente organico.
Lenergia libera dellidrolisi degli acidi grassi vicino a 0 kJ/mol. Come risultato, gli equilibri

termodinamici sono governati dalla concentrazione dei reagenti, e lidrolisi di esteri in acqua catalizzate da lipasi possono essere reversibili. In mezzi non-acquosi si possono avere lesterificazione e la transesterificazione.
Lacil-lipasi formato nel primo stadio della reazione enzimatica pu essere formalmente considerato

un agente acilante. La grande specificit di substrato di questa classe di enzimi porta allacilazione di nucleofili diversi dai gruppi idrossilici, per esempio idroperossidi, ammine e tioli.

Il risultato lutilizzo delle lipasi in una grande variet di reazioni. Un terzo circa delle biotrasformazioni sono operate da lipasi. Quando si usano composti polifunzionali, isomeri o substrati racemici o prostereogenici, le lipasi di solito mostrano regio- e stereoselettivit. Cos PPL che idrolizza i trigliceridi da la esterificazione regioselettiva di dioli e RML catalizza la

AcOEt
OH OAc

PPL
OH OH

transesterificazione enantioselettiva in alte rese di biciclo eptenolo acetilato.

30
H AcO H H PhCOO H AcO H H H H

PhCOOMe
H AcO H H H

RML

Il solo grave inconveniente delle lipasi la loro ristretta specificit verso il gruppo acilico degli esteri.

La maggior parte delle lipasi accettano gruppi alifatici lineari molto meglio che grossi gruppi aromatici. Il fatto che le lipasi siano capaci di idrolizzare esteri diversi dai triacilgliceroli le rende molto utili soprattutto nella risoluzione dei racemati. Dal momento che i substrati naturali sono esteri di un alcol chirale, il glicerolo, con un acido achirale, ci si aspetta che le lipasi siano pi utili nellidrolisi di esteri di alcoli chirali (struttura tipo I) pi che di acidi chirali (struttura tipo II).

Assumendo che la sequenza sia largo > piccolo lenantiomero del tipo I preferito dalla lipasi avr configurazione R al centro alcolico ed esattamente lopposto di quello preferito dalla maggior parte delle proteasi ed esterasi. La richiesta sterica delle varie lipasi presenti in commercio abbastanza differente. Mentre le lipasi estratte da Aspergillus sono in grado di idrolizzare anche substrati piuttosto voluminosi e quindi dimostrano scarsa selettivit per quelli di dimensioni ridotte, le lipasi da Candida sp. sono meno

31 vincolate. In questo ambito invece le lipasi estratte da Pseudomonas e da Mucor mostrano una elevata selettivit per substrati di dimensioni ridotte non accettano substrati voluminosi.

In un caso di racemato, le lipasi vengono sfruttate per ottenere la risoluzione cinetica della miscela fino alla resa teorica del 50%. Inoltre le reazioni catalizzate da lipasi sono di solito reversibili e bisogna tenere presente che la reazione inversa porta a racemizzazione. Cos se lacilazione di un alcol racemico fornisce prevalentemente lS-alcol e lR-estere, la reazione inversa dellalcol achirale ottenuto R3OH con lR estere porter alla formazione dellR-alcol.
O R1
R,S

O OR3 R1
S

OH R2

OH R2
R

OR1

R3

OH

Questo porta ad una diminuzione di purezza enantiomerica. Si pu ovviare a questo eliminando lacqua durante lesterificazione o utilizzando un grande eccesso (solvente) di acil donatore. Il metodo migliore finora usato quello di utilizzare enolesteri ( di solito vinil o isopropenil). Lalcol primario che si forma isomerizza a composto carbonilico che non pu partecipare alla reazione inversa.
O O OH OH O R1 R1 R1 R1 O R2 O OH R2

lipasi

racemo

32 Le lipasi sono anche utilizzate nelle acilazioni regioselettive di gruppi alcolici come quelli del cloramfenicolo e sobrerolo.

OH HO OH NHCHCl2 O2N

sobrerolo

cloramfenicolo

OH

Vengono anche risolti gli stereoisomeri E/Z di un alcol allilico: nella miscela geraniolo (E) e nerolo (Z), il geraniolo viene acetilato pi velocemente del nerolo in un rapporto 4:1.

OH

OH

(E) geraniolo

(Z) nerolo