EFFETTI A LIVELLO AUTOECOLOGICO

Risposta di un individuo ad una sostanza tossica

Stabilit delle funzioni determinata da autoregolazione

Risposta di una popolazione ad una sostanza tossica

EFFETTI DELLE SOSTANZE TOSSICHE

LIVELLO BIOCHIMICO LIVELLO CELLULARE LIVELLO DI ORGANO LIVELLO ORGANISMICO
PRODUZIONE

GENETICO MOLECOLARE

RISPOSTE

DEFINIZIONE

BIOINDICATORI STATO DI SALUTE

VALUTAZIONE

BIOMARKERS

IMPORTANZA DEL LIVELLO BIOCHIMICO

Gli effetti macroscopici delle sostanze tossiche, osservabili a livello di individuo hanno origine dallinterazione tra molecole Di solito la sequenza di meccanismi attraverso cui leffetto a livello biochimico si traduce in un effetto macroscopico non conosciuta in modo completo Lo studio dei meccanismi biochimici non fa parte dellecotossicologia in senso stretto ma: - importante per illustrare il legame tra diversi livelli di organizzazione biologica -fornisce strumenti utili per la valutazione della tossicit e della qualit ambientale

EFFETTI: I COMPOSTI GENOTOSSICI

Alcuni IPA formano legami covalenti con il DNA (addotti) -devono prima essere attivati dalle monoossigenasi -riparazione (vedi figura) Se non vengono eliminati: -introducono errori quando il DNA viene duplicato -mutageni, cancerogeni, teratogeni
Una nucleasi un enzima capace di idrolizzare i legami fosfodiestere fra le subunit nucleotidiche degli acidi nucleici (taglia-incolla)

EFFETTI A LIVELLO MOLECOLARE

Due sono i principali meccanismi tramite cui le sostanze xenobiotiche agiscono e alterano le interazioni molecolari e la normale attivit biochimica cellulare Inibizione Competizione

eccone degli esempi....

INIBIZIONE ENZIMATICA
Eggshell thinning in Falcus sparverius per inibizione di Ca2+-ATPasi in relazione alla esposizione a DDT e DDE

wild (Ithaca, NY)

captive exposed to DDT

da Lincer, 1975

Altro caso di studio.... Riduzione della AminoLevulinicAcidDehydrase activity nel Germano reale (Anas platyrhincos) in relazione alla concentrazione di Pb nel sangue

da Peakall, 1992

<

La biosintesi del gruppo eme, essenziale per la produzione di emoglobina avviene nelle cellule del midollo. Il Pb interferisce con tre enzimi coinvolti in questo processo: stimola lenzima mitocondriale acido L-aminolevulinico sintetasi (ALAS); inibisce lenzima citoplasmatico acido L-aminolevulinico deidratasi (ALAD), con conseguente accumulo di acido L-aminolevulinico (ALA) nel sangue, nel plasma e nelle urine il Pb induce anemia in parte dovuta a ridotta sintesi delleme ed incorporazione del ferro nellanello emato-porfirinico da inibizione degli enzimi ALA-deidratasi ed eme-sintetasi, enzimi zinco dipendenti)

la terapia dellintossicazione da piombo consiste nellallontanamento del metallo dallorganismo mediante chelanti(EDTA)

COMPETIZIONE ENZIMATICA
Riduzione dellattivit della AChE in Zebra finch dopo somministrazione di fenitrothion

da Peakall, 1992

Le neurotossine rappresentano un esempio classico di competizione enzimatica Molti veleni hanno origine naturale: - tetrodotossina (pesce palla) - tossina del botulino (Clostridium botulinum) - atropina (Atropa belladonna) - nicotina (Nicotiana tabacum) - piretrina (Chrysanthemum sp) Sostanze di sintesi - organoclorurati - organofosforici - carbamati - piretroidi

COMPETIZIONE:LE NEUROTOSSINE

Alcune sostanze possono competere con lacetilcolina per il sito di legame sul recettore della membrana post-sinaptica

Insetticidi organofosforici -analogie strutturali con acetilcolina - competono per il sito attivo della AChE -il rilascio del prodotto pi lento

Lanalogia strutturale non perfetta o riguarda solo alcune parti della molecola [partial mimic] Alcuni composti (tetrodotoxina) provocano la chiusura ritardata dei canali del sodio nella membrana plasmatica dei neuroni Altri composti si legano ai recettori per il GABA, impedendo il passaggio dello ione cloruro
Il GABA (acido Gamma-AminoButirico) il principale neurotrasmettitore inibitore del SNC

EFFETTI: I VELENI MITOCONDRIALI Disaccoppiatori della fosforilazione ossidativa (2-4 dinitrofenolo):

permette il ritorno di H+ senza formazione di ATP Rotenone, cianuro: non permettono linstaurarsi del gradiente di H+ espletando una funzione antagonista

La vitamina K ha un ruolo fondamentale nella sintesi delle proteine per la coagulazione del sangue Serie ciclica di trasformazioni (ciclo della vitamina K). Durante il ciclo le proteine della coagulazione vengono carbossilate ad opera della vitamina K che nei passaggi successivi si riduce. La carbossilazione necessaria alla funzione della proteina Rodenticidi anticoagulanti (Warfarina e simili) - struttura molecolare simile alla vitamina K - competono per il sito di legame - impediscono la riduzione della vitamina k e quindi la carbossilazione delle proteine della coagulazione

EFFETTI: ANTAGONISTI DELLA VITAMINA K

emorragia

Due forme di vitamina K

ANTAGONISTI DELLA VITAMINA K

Warfarina

Il ciclo si ripete da 200 a 2000 volte al giorno negli uomini da acido glutammico ad acido carbossiglutammico, precursore della protrombina

Si blocca la riduzione!

Sostanze di sintesi immesse nellambiente con strutture molecolari simili ad ormoni sessuali In bacini di lagunaggio sono stati osservati pesci maschi con caratteri femminili sia morfologici che biochimici (sintesi di vitellogenina). Leffetto stato attribuito al nonilfenolo NB i pesci sono in qualche modo predisposti -alcune specie hanno ermafroditismo proterandro (prima maschio e poi femmina) - spesso in gasteropodi marini in siti inquinati sono osservati imposex (femmine con caratteri morfologici maschili come pene e vasi deferenti)

EFFETTI: ANDROGENI

ESTROGENI

EFFETTI: REAZIONI CON GRUPPI TIOLICI DELLE PROTEINE

Mercurio e Cadmio sono tra i metalli pi tossici Si legano con i gruppi tiolici (-SH) delle proteine I gruppi tiolici sono molto importanti nel determinare la struttura terziaria delle proteine (ponti disolfuro) La struttura terziaria delle proteine fondamentale per la loro funzione

EFFETTI A LIVELLO CELLULARE

Porcellio scaber
Crostacea, Isopoda

Dysdera crociata Aracnida,Araneida

Nelle cellule dellepatopancreas: tre diversi tipi di accumulo di metalli, corrispondenti a tre diversi percorsi, cio processi di immobilizzazione, e detossificazione percorso A: precipitazione di Ca e Mg (ma anche Zn e Pb) in forma di fosfati; percorso B: materiale ricco di zolfo, probabilmente prodotto del catabolismo delle metallotioneine (Cu, Cd, Hg, Zn, Pb) percorso C: transferrina ferritina emosiderina (Fe)

composto organico ferro-proteico che rappresenta una delle forme di deposito del ferro nei tessuti

Isopodi
percorso A e di tipo B nelle cellule di tipo S

accumulo in corrispondenza di membrane o attorno a granuli di materiale di tipo B o C (granuli B/A e C/A) percorso B solo nelle cellule di tipo S granuli distinti; il materiale si accumula senza essere mai eliminato percorso C solo nelle cellule di tipo B granuli distinti; subiscono un processo di lisi e liberano il loro contenuto nel lume (eliminazione)

Ragni
Si formano granuli distinti per ciascun tipo di percorso -i tre tipi di granuli si formano tutti allinterno di un solo tipo di cellule (cellule digestive) - le cellule digestive subiscono periodicamente un processo di lisi e liberano il loro contenuto nel lume dellepatopancreas

Gli isopodi possono accumulare elevate concentrazioni di metalli (sequestratori) I ragni che predano gli isopodi riescono a mantenere concentrazioni molto pi basse (regolatori)

EFFETTI A LIVELLO DI ORGANO

Alcune sostanze tossiche sono concentrate in specifici organi - affinit fisico-chimica con tessuti (ad es. xenobiotici idrofobi nei tessuti adiposi) - meccanismi di immobilizzazione o detossificazione (ad es. metalli nellepatopancreas degli invertebrati Terrestri) caratteristiche simili a sostanze coinvolte nella funzione di specifici organi-tessuti (ad es. iodio radioattivo nella tiroide o lo stronzio nelle ossa per il possedere caratteristiche simili al calcio) Concentrazione critica nellorgano bersaglio

una sostanza si concentra in un organo lelevata concentrazione danneggia lorgano effetti avversi anche se le concentrazione media a livello di organismo relativamente bassa Epatopancreas isopodi terrestri - meno del 10% del peso complessivo dellanimale - pi del 90% di Cd, Pb, Cu, Zn su suoli contaminati nellepatopancreas sono state osservate [Zn] > 2% dw (weight dry) - le cellule S vengono distrutte morte - il Cd si accumula in fegato e reni dei Mammiferi che provoca rottura delle cellule del rene proteinuria

Il termine proteinuria indica la presenza di proteine nellurina. Normalmente le proteine presenti nel sangue (globuline, albumine ecc.), date le loro dimensioni, non riescono a oltrepassare il filtro renale, ma in varie condizioni patologiche che coinvolgono il rene ( conseguenti a reazioni allergiche, a intossicazioni da farmaci o droghe ecc. o glomerulopatie primitive) lapparato di filtrazione del rene stesso non pi in grado di trattenerle, consentendone la perdita nelle urine.

DANNI Gli effetti dai livelli inferiori (es:biochimico) si ripercuotono spesso a livelli FUNZIONALI
funzionali maggiori, di organismo; ecco alcuni esempi Inibizione e competizione enzimatica DDT-DDE vs Ca2+-ATPasi (metabolismo Ca, egg thinning) Pb vs ALAD (sintesi eme) OPC vs AChEsterasi (funzionalit nervosa) Budget energetico e riproduzione costi di trasformazione, accumulo, escrezione riduzione SFG (Scope for Growth) riduzione successo riproduttivo Fotosintesi inibizione RuBPC e PEPC (Phosphoenolpyruvate carboxylases) da SO2 (inibizione dei processi di fosforilazione ossidativa nei cicli fotosintetici) inibizione funzionalit stomatica da Pb, Cd, Ni inibizione trasporto elettronico da organofosfati

VARIAZIONE DEL BUDGET ENERGETICO

Riduzione del SFG in Arca zebra (Bivalvi) in funzione della distanza da un sito di inquinamento da metalli pesanti e idrocarburi Hamilton Harbour (Bermuda)
Sito di inquinamento
da Widdows et alii, 1990

Riduzione della taglia dei figli in Gammarus sp (Crostacei) in funzione dellinquinamento da Zn

da Peakall, 1992

Ritardo riproduzione in Bengalese finch (Uccelli) in funzione dellinquinamento da DDT

da Peakall, 1992

INIBIZIONE FOTOSINTESI E TRASPIRAZIONE NELLE PIANTE

Effetto della somministrazione di Pb nel mezzo di coltura in piante di soia

fotosintesi

traspirazione

da Bazzaz et alii, 1974, in Bullini

Assorbimento CO2 (mg h-1)

Effetto dellesposizione a F in piante di Pinus nigra nei pressi di una fonderia

Clorofilla (mg g-1)

Clorofilla CO2

da Keller, 1982, in Bullini

F (ppm)

DANNI FINALI INDOTTI DAGLI INQUINANTI

Carcinogenesi: induzione tumorale Mutagenesi: modificazioni ereditabili del DNA Gli IPA del sedimento producono neoplasie epatiche e cutanee nei pesci dei Grandi Laghi americani La riduzione del 99% nelluso di IPA (1981-87) ha ridotto del 75% lincidenza di questi tumori Le neoplasie del fegato della sogliola (Parophrys vetulus) nel Pudget Sound (UK) associate ad alti livelli di IPA e PCB carcinogenesi e mutagenesi sono associate: su 175 sostanze carcinogenetiche, il 90% sono anche mutagene Esempi di composti xenobiotici carcinogenetici e mutageni: IPA (benzo(a)pirene); composti alogenati alifatici (cloruro di vinile); composti alchilanti (ciclofosfamide); metalli (Cd, Cr)

Teratogenesi: induzione di malformazioni molti composti organoclorurati, organofosfati, PCB sono potenti teratogeni negli Uccelli lerbicida trifluralin causa deformazioni vertebrali in molte specie di Pesci i PCB causa di malformazioni scheletriche nei Rettili (tartarughe) i PCB, esaclorobenzene e dieldrina causano malformazioni nell apparato riproduttore femminile (aborti) nei Mammiferi (Pinnipedi) il TBT causa malformazioni nellapparato genitale femminile dei Gasteropodi

TIPI RISPOSTA
a) Protettive

DI

proteggono gli organismi dagli effetti avversi delle sostanze tossiche es.: induzione delle monossigenasi microsomali es.: induzione delle metallotioneine

b) Non protettive non proteggono gli organismi dagli effetto avversi delle sostanze tossiche; non necessariamente producono effetti avversi es.: inibizione dellacetilcolinesterasi es.: formazione di addotti di DNA

Diminuiscono lintensit dellinterazione tra sostanza e siti dazione 1) abbassano la quantit di sostanza presente allinterno dellorganismo - metabolismo - escrezione 2) segregando la sostanza tossica in modo che non possa interagire con i siti di azione -metallotioneine 3) riparano i danni delle sostanze tossiche - enzimi per la riparazione del DNA -proteine da stress 4) induzione di enzimi o altre proteine: attivazione gene aumento della sintesi aumento della concentrazione intracellulare aumento attivit

RISPOSTE PROTETTIVE

5) induzione dovuta direttamente alla sostanza tossica monossigenasi microsomiali (enzimi che metabolizzano le sostanze tossiche) - metallotioneine (proteine ricche di cisteina (-SH) che legano gli ioni metallici (Cu2+, Cd2+, Hg2+) - proteine che legano particolari composti organici 6) induzione in risposta ai danni provocati dalle sostanze - enzimi per la riparazione del DNA (attivate dalla formazione di addotti di DNA) - proteine di stress (gruppo eterogeneo, riparano danni cellulari) Spesso chiamate heat shock proteins (hsp) Sono state individuate per la prima volta come risposta a temperature elevate La loro sintesi viene indotta dai danni generati da diversi fattori di stress, tra cui le sostanze tossiche. Si tratta di un gruppo eterogeneo che comprende molte famiglie, in genere indicate con una sigla che ne indica il peso molecolare es: hsp60 (PM: 60 000), hsp70 (PM: 70 000), hsp90

Le hsp70 sono il gruppo di proteine da stress pi conosciuto Aiutano il corretto ripiegamento delle proteine, in particolare la corretta struttura terziaria (forma tridimensionale), necessaria per la specifica funzione proteica

Molte sostanze sono caratterizzate da proteotossicit, cio capacit di denaturare le proteine Le hsp70 contrastano la denaturazione Induzione delle hsp70 In presenza di proteine denaturate le hsp70 si legano alle catene peptidiche non ripiegate liberano la heat shock factor protein (hsf), cui normalmente sono legate lhsf, liberato dalla hsp, va a legarsi a una regione del DNA detta heat shock element viene attivata la sintesi di mRNA per le hsp70

SPECIFICIT DELLA RISPOSTA

Anche per quanto riguarda la diffusione tra diversi tipi organismi: -risposte comuni a tutti o a molti organismi in quanto alcune molecole o vie metaboliche sono comuni - risposte esclusive di un gruppo pi o meno ristretto di organismi veleni mitocondriali eucarioti organofosforici sistema nervoso animali inibitori della fotosintesi vegetali dimilin sintesi chitina artropodi Risposte diffuse in ampi gruppi di organismi possono per variare di molto la loro intensit Ci possono essere differenze molto grandi tra ceppi diversi di una stessa specie. Di solito differenze di questo tipo sono legate allo sviluppo della resistenza alle sostanze tossiche (es popolazioni di insetti resistenti agli insetticidi organofosforici) Lacetilcolinesterasi dei ceppi resistenti pu differire anche per un solo aminoacido: - sufficiente per modificare il sito attivo - lega (e idrolizza) lacetilcolina - non lega gli organofosforici

EFFETTI DELLE SOSTANZE TOSSICHE

LIVELLO BIOCHIMICO LIVELLO CELLULARE LIVELLO DI ORGANO LIVELLO ORGANISMICO
PRODUZIONE

GENETICO MOLECOLARE

RISPOSTE

DEFINIZIONE

BIOINDICATORI STATO DI SALUTE

VALUTAZIONE

BIOMARKERS

Per biomonitoraggio si intende la rilevazione sistematica dello stato dellambiente, in relazione a fenomeni di inquinamento, ottenuta mediante la registrazione di variazioni a carico della componente biotica del sistema Dati i fenomeni di propagazione degli effetti, il biomonitoraggio pu utilizzare osservabili a livello di organismo popolazione comunit

Gli organismi usati nel biomonitoraggio sono detti bioindicatori

Bioindicatore un organismo passibile di fornire informazioni sullo stato di inquinamento di un sistema ambientale Biomarker qualunque risposta rilevabile sul bioindicatore per la quale sia dimostrata una relazione con lesposizione ad un fattore inquinante Requisiti di un buon bioindicatore: - risposte subletali nel range di concentrazioni oggetto di studio - relazione nota dose-risposta di uno o pi biomarkers - abitudini sedentarie o poco vagili - facilmente reperibile e identificabile - adeguate conoscenze su anatomia, fisiologia ed ecologia della specie - ad ampia distribuzione spaziale - sufficientemente grande da permettere la manipolazione - uniformit genetica e ciclo vitale adeguato

BIOMARKER S pi precisamente:
..qualunque variazione biochimica, cellulare, fisiologica o comportamentale che pu essere misurata, dando evidenza di esposizione e/o effetto ad uno o pi composti inquinanti

Il ruolo del biomarker non quindi quello di dare informazioni quantitative sui livelli di esposizione di un organismo, ma di fornire indicazioni sul suo stato di salute

BIOMARKERS: LIMITI

VANTAGGI

1) risposta integrata nel tempo e nello spazio allesposizione complessiva 2) risposta integrata dellinsieme delle interazioni tossicologiche e farmacocinetiche della miscela di composti a cui esposto lorganismo 3) risposta immediata allesposizione al tossico (ore-giorni), utile per previsioni anche a lungo termine Alcune reazioni enzimatiche subiscono variazioni legate a fattori come et, sesso, stato ormonale ecc...importante dunque saper interpretare le variazioni emerse, e fondamentale la conoscenza della fisiologia dellorganismo durante tutto il ciclo vitale

STRATEGIE DIMPIEGO
Caso 1 Si ignorano i composti, lorigine e la fonte della contaminazione; la durata dellesposizione non storicamente definita I biomarkers permettono di: -valutare se lecosistema in oggetto effettivamente esposto a stress chimico (biomarkers generali) -individuare le principali classi di inquinanti in azione (biomarkers specifici) -valutare il danno potenziale sulle popolazioni e comunit (biomarkers di effetto)

Caso 2 E nota, anche solo parzialmente, la natura, fonte e origine della contaminazione; la durata dellesposizione allo stress chimico storicamente definita I biomarkers permettono di: -individuare leffetto tossicologico come integrazione spazio-temporale -valutare se le popolazioni risultano esposte o meno a livelli di contaminazione che eccedono le normali capacit di compensazione e di riparazione dellorganismo (biomarkers di effetto) -valutare il danno potenziale sulle popolazioni e comunit

Caso 3 Individuazione di specie potenzialmente a rischio in ambiente in cui nota la natura della contaminazione sia qualitativamente che quantitativamente I biomarkers permettono di: -valutare se le popolazioni che occupano posizioni a rischio nellecosistema (es. Consumatori terminali) risultino esposte a livelli di contaminazione che superino le normali capacit di compensazione e riparo -lindividuazione della o delle specie pi a rischio in funzione della diversa suscettibilit agli inquinanti -valutare il danno potenziale sulle popolazioni e comunit

BIOMARKERS: SIGNIFICATO INTERPRETATIVO

Attraverso i biomarkers non otteniamo la valutazione quantitativa dei livelli di tossico a cui lorganismo sottoposto, ma la determinazione del livello di salute in cui si trova Al posto della curva dose-risposta, fondamentale in tossicologia, abbiamo la pi qualitativa curva della salute

Risulta fondamentale per operare in modo corretto: - conoscere i livelli normali di ciascun biomarker misurato nelle diverse specie -scelta di biomarker con riproducibilit e sensibilit adeguata -per inferire a livello di popolazione, individuare marcatori con peso ecologico maggiore (che comportino un cambiamento della fitness, cio alterazioni della crescita, comportamentali, successo riproduttivo, utilizzazione energetica ecc.)

Un individuo si trova in condizioni di salute quando la sua risposta cade entro lintervallo fiduciale del 95% ricavato dalla distribuzione di riferimento

BIOMARKERS
Si hanno tecniche di tipo invasivo e non invasivo

Vantaggi delluso di biomarkers non distruttivi: 1) Analisi di un numero pi ampio di individui senza produrre drastiche riduzioni della popolazione nellarea di studio 2) Analisi sequenziali sullo stesso individuo per un lungo arco di tempo 3) Analisi anche su popolazioni ecologicamente rilevanti caratterizzate da pochi individui

BIOMARKERS
I biomarkers possono essere: di esposizione di effetto

I BIOMARKERS DI ESPOSIZIONE sono risposte attive per lo pi basate sui sistemi di detossificazione o metabolizzazione. Forniscono informazioni sul tipo di inquinanti cui lorganismo esposto e sulla loro biodisponibilit. Indicano che lorganismo stato esposto a particolari categorie di sostanze Non misurano un danno biologico Non indicano se effettivamente ci sia stato un danno dovuto allesposizione Indicano che una certa categoria di sostanze presente e biodisponibile nellambiente ed potenzialmente in grado di determinare un danno, senza per questo dare indicazione su reali effetti tossicologici Esempi - ioni metallici bivalenti metallotioneine - composti organici idrofobi a PM < 800 monoossigenasi microsomiale (citocromo P450)

I BIOMARKERS DI EFFETTO sono risposte che denotano uno stato di sofferenza funzionale. Non ci informano necessariamente sulla natura chimica dellinquinante ma tuttavia evidenziano il danno subito dallorganismo. Sono importanti per il loro carattere predittivo (es. danni al DNA) Indicano la presenza di un danno biologico e permettono di quantificarlo Alcuni sono estremamente specifici, permettendo di risalire alla causa effetto dovuto unicamente al piombo -inibizione di ALAD -inibizione AchE da parte di carbammati e organofosforici

Altri sono molto generici -riduzione SFG, lesioni epatiche, disordini immunitari, certi danni al DNA - proteine di stress, stabilit lisosomiale (effetto dovuto a molte sostanze diverse, ma anche a situazioni di stress diverse come anossia e shock termico)

BIOMARKERS
I biomarkers generali sia di esposizione che di effetto vengono applicati quando larea in oggetto contaminata da sostanze di origine ignota La generalit permette di valutare in prima battuta lesistenza di un rischio chimico Successivamente, lutilizzo di biomarkers pi specifici permette di determinare la classe molecolare degli xenobiotici, definire i possibili effetti tossicologici, stabilire le misure preventive

TIPOLOGIE DI BIOMARKERS Possono essere utilizzati come biomarcatori:

livelli di bioaccumulazione corporea risposte biochimiche risposte cellulari risposte fisiologiche risposte comportamentali

Biomarkers funzionali

Utilizzati soprattutto per monitoraggio ambientale in sito - su organismi naturalmente presenti nel sito di studio su organismi appositamente introdotti nellambiente di studio (di solito organismi sessili o confinati in enclosures) - secondariamente misura della tossicit in laboratorio

Livelli di bioaccumulazione
Tutti gli organismi sedentari e non regolatori sono utilizzabili come bioindicatori da livello di accumulazione (es. bivalvi, balani) Il dosaggio pu essere a carico dellinquinante primario o di un suo metabolita Il dosaggio pu essere fatto sullintero individuo o (meglio) su organi bersaglio Per confronti tra aree o tempi diversi, i test di bioaccumulazione devono tener conto degli effetti di taglia, stato funzionale, stadio ontogenetico del bioindicatore

I molluschi bivalvi (spec. Mitili) possiedono determinate caratteristiche (abitudine filtratoria, sessilit, scarsamente regolatori, ampia distribuzione, facilit di raccolta, ciclo vitale noto, adattamento alle condizioni di laboratorio) che li rendono particolarmente idonei come bioindicatori di contaminazione costiera ed estuarina La scelta dellorganismo bioindicatore dipender dal tipo di informazioni che vogliamo ottenere (ad es. in base a particolari esigenze di conservazione di una determinata area o specie) Es. il bivalve Adamussium colbecki stato ampiamente studiato e caratterizzato nei valori basali e nelle risposte di numerosi biomarkers utilizzabili per monitorare il possibile impatto delle sempre crescenti attivit antropiche in antartide

Adamussium colbecki

Il primo programma su vasta scala di biomonitoraggio risale alla met degli anni 80 (US EPA) per il monitoraggio delle coste statunitensi: mussel watch Il protocollo prevedeva: trapianto di molluschi bivalvi (spec. Mitili) da aree indenni a siti di indagine (generalmente per 12 settimane). determinazione analitica dellaccumulo tissutale di vari tipi di inquinanti: Idrocarburi Totali, IPA, PCB's Metalli, Pesticidi, tensioattivi, etc.

Livelli di bioaccumulazione: casi di studio

Concentrazione corporea di Cu e Zn in Nereis diversicolor (Policheti) in relazione alla concentrazione dei due metalli nel sedimento in estuari del Devon e Cornwall

Bryan, 1976

Concentrazione corporea di Pb in Scrobicularia plana (Bivalvi) in relazione alla concentrazione del metallo nel sedimento in ambiente di estuario (SW England)

Luoma & Brian, 1978 in Moriartry, 1983

Concentrazione corporea di Pb e Cd in Porcellio scaber (Isopodi) in relazione alla densit di traffico automobilistico in varie aree di Innsbruck

Dallinger et alii, 1992

Concentrazione foliare di metalli nel leccio (Quercus ilex) in relazione alla densit di traffico automobilistico in varie aree di Napoli

Alfani et alii, 1989

DIGESTIVE GLAND
15 20

REMAINING TISSUES

FROM FOOD (shrimp exp 18 ng/l sw)

10

15 10 5

10

15

20

10

15

20

Bioaccumulo dellesaclorobifenile (PCB) in Sepia officinalis da acqua, sedimenti e cibo

30

FROM SEAWATER (18 ng/l)

ng g-1 lipids

150 20 100 10 50 0

10

15

20

10

15

20

15

80 60 40

FROM SEDIMENTS (30 ng/g dry wt)

10 5 0 0 5 10 15 20

20 0 0 5 10 15 20

Danis et al. (2005)

Time (d)

Accumulo di cadmio nelle branchie del bivalve di acqua dolce Lamellidens

marginalis lungo un
gradiente di inquinamento nel fiume Ichhapore, West Bengala, India

Lamellidens marginalis Das and Jana (2003)

Accumulo di cadmio, rame e mercurio nel bivalve Donax trunculus (Haifa Bay, Israel) in funzione della taglia

Donax trunculus Fishelson et al. (1998)

TIPOLOGIE DI BIOMARKERS Possono essere utilizzati come biomarcatori:

livelli di bioaccumulazione corporea risposte biochimiche risposte cellulari risposte fisiologiche risposte comportamentali

Biomarkers funzionali

BIOMARKERS FUNZIONALI Qualunque risposta funzionale facilmente rilevabile e la cui relazione

con un inquinante sia nota e consistente pu essere utilizzata come biomarcatore I biomarcatori possono essere altamente specifici generici la scelta degli uni o degli altri dipende dallobiettivo del programma di biomonitoraggio esposizione a singoli inquinanti o categorie omogenee valutazione di stress generale da inquinamento

Biomarkers Alta specificit Inibizione ALAD Inibizione AChE Imposex Media specificit Livello delle MFO Livello delle MT Bassa specificit Scope for Growth

Fattore inquinante

Pb OPs TBT

IPA, Insetticidi, Erbicidi vari metalli pesanti, stress naturale

+ stress ambientale non antropogenico

Classificazione gerarchica di importanza dei biomarkers funzionali

Alterazioni del DNA -addotti -modificazioni secondarie -eventi irreversibili -mutazioni -induzione MFO -induzione MT -esterasi -proteine da stress Prodotti metabolici -porfirine

2) Risposte a livello di proteine

6) Variazioni a carico del sistema immunitario e ormonale 8) Alterazioni istopatologiche 6) Biomarkers non specifici e fisiologici

BIOMARKERS GENETICI
GENOTOSSICIT: capacit di una molecola di produrre danni al DNA Alcune classi di contaminanti (Es. IPA, composti organoclorurati) possono indurre alterazioni genotossiche dovute a: -interazione diretta della molecola -interazione di un suo metabolita Es. benzo[a]pirene - formazione di ROS (Reacting Oxygen Species, radicali attivi dellO2)

Una sostanza genotossica pu essere cancerogena se si verificano alcuni steps: danni al genoma riparazione del DNA manchevole o incompleta mutazione che altera lequilibrio tra proliferazione e morte cellulare insorgenza di formazioni cancerogene

Una mutazione nella linea germinale pu indurre mutagenesi: mutazioni ereditabili del DNA In alcune condizioni di particolare vulnerabilit (es. fase embrionale) si pu avere teratogenesi: insorgenza di malformazioni.

BIOMARKERS GENETICI
Sostanze capaci non solo di causare danni al DNA, ma anche di scatenare alterazioni a cascata. Vediamoli in ordine di importanza Addotti Il benzopirene ad es., si lega stabilmente al DNA formando degli addotti. Metodologie per identificazione -metodo immunochimico (ELISA
Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay ) Metodo usato in diagnostica e per studiare interazioni antigene-anticorpo. Rilevazione del complesso antigene-anticorpo attraverso enzimi specifici che fungono da marcatori. Viene quindi utilizzato per rilevare la presenza di un dato antigene caratteristico di un organismo patogeno in un campione che ne probabilmente affetto

Benzo(a)pirene

Epossid. + H2O

Epossid.

-metodo radiochimico (32P- postlabeling) Biomarkers che individuano risposte di tipo precoce

la separazione degli addotti tramite cromatografia su strato sottile bidimensionale

DNA

BDPE (benzo-a-pirene7,8-diol-9,10epossido)

L'antigene una molecola che pu legarsi a una specifica immunoglobulina (anticorpo) E' definibile quindi come qualsiasi sostanza capace di produrre una risposta immunitaria Gli antigeni sono solitamente proteine, ma possono essere di qualsiasi natura chimica.

Essi si basano sullutilizzo di antisieri specifici contro addotti del DNA o, pi genericamente, campioni di DNA modificati a seguito del trattamento con cancerogeni vari. La sensibilit dei saggi immunoenzimatici pu arrivare a 1 addotto per 108 nucleotidi Questi tests sono affidabili, poco costosi e consentono lanalisi contemporanea di diversi campioni (fino a 20 al giorno). Gli svantaggi includono la necessit di grosse quantit di DNA

Modificazioni secondarie

Se la presenza di addotti non riparata, si creano rotture nel DNA, con modificazioni strutturali Metodologie di identificazione - n di fratture nel DNA -test Cometa - metodo della Alkaline Unwinding, indagine spettrofotofluorimetrica che individua il n di rotture

Eventi irreversibili

La generazione di modificazioni secondarie, se eccede le capacit di riparo dellorganismo, pu causare fenomeni irreversibili, come aberrazioni cromosomiche. Metodologie per identificazione test citologici quali: - determinazione dei micronuclei -sister-chromatide exchanges (SCEs) Biomarkers che individuano risposte di tipo ritardato

Mutazioni

Lultimo stadio di alterazione rappresentato da mutazioni capaci di alterare la funzionalit del gene Metodologie per identificazione -attivazione delloncogene Biomarkers che individuano risposte di tipo ritardato

ADDOTTI STABILI DEL DNA

I metaboliti di molti inquinanti formano addotti stabili con la molecola del DNA. La formazione di questi addotti considerata un evento critico per quanto riguarda la carcinogenesi Questi addotti sono marcati radioattivamente visualizzati con tecniche autoradiografiche HPLC-fluorimetry (Leclercq et al, 1997) immunochemical (Den Engelse et al, 1990) Il principale vantaggio (almeno per i vertebrati) ottenuti possono essere direttamente correlati dannoso (insorgenza di fenomeni di teratogenesi, carcinogenesi). Per gli invertebrati resta pi un esposizione che i dati con leffetto mutagenesi e biomarker di con
32

Su contadini esposti a vari tipi di pesticidi

Le Goff et al. (2005)

Le Goff et al. (2005)

Media periodo Simbolo pieno: fumatori Fumatore

Oltre alle incertezze per quanto riguarda gli invertebrati, si ricorda che la formazione degli addotti pu essere anche: - di origine naturale - specie-specifica - regolata da fattori endogeni indipendenti dalla presenza di contaminanti

MODIFICAZIONI SECONDARIE Numero di fratture lungo la doppia elica La molecola di DNA viene denaturata, srotolata in condizioni alcaline e fatta reagire con un colorante fluorescente Il numero di rotture direttamente proporzionale alla velocit di srotolamento. Lintensit della fluorescenza diversa per le rotture a singolo o doppio filamento.

TEST COMETA (stling & Johansson , 1984)

Determina i danni al DNA a livello di una singola cellula, non di filamento di DNA come il metodo precedente. Non si deve estrarre il DNA I nuclei cellulari vengono isolati e posti in un campo elettroforetico. Se il nucleo intatto esso migra compatto allinterno del campo altrimenti si ha una migrazione differenziale che ci permette di osservare una scia, detta coda. La coda tanto pi lunga quanto pi consistenti sono i danni al DNA

Metodologia Una sospensione cellulare viene immobilizzata in un gel di agarosio. Le membrane vengono lise e il nucleo isolato. Il preparato viene fatto migrare in un campo elettroforetico. Se il nucleo intatto migra compatto allinterno del campo, se ci sono danni ho una migrazione differenziale
A B
Cellule di ratto A: controllo B: bassa dose micro-onde (2h)

MOMENT TAIL= (|CGTail . CGHead|) %DNATail

Centro gravit Centro gravit coda testa

Buona correlazione con la presenza di mutageni ambientali, ma si riscontra anche una notevole variabilit intraindividuale Recentemente si evidenziato nei mitili come esistano livelli basali di frammentazione del DNA, la cui presenza influenzata da fattori quali let, la stagione, la disponibilit alimentare...

TEST COMET-FISH FISH:Fluorescence In Situ Hybridization

Nella sonda (probe) sono incorporate direttamente molecole fluorescenti oppure sono presenti antigeni che possono essere riconosciuti con anticorpi fluorescenti

La FISH una tecnica mediante la quale una sonda colorata specifica per un dato segmento di DNA viene ibridata con i cromosomi metafasici, profasici o interfasici, e quindi visualizzata con un microscopio a fluorescenza La FISH si basa sulla propriet del DNA di fondersi in modo reversibile e prevede il legame tra una sonda molecolare (frammento di DNA specifico per la regione di interesse marcato con composti fluorescenti) e la sequenza di DNA complementare: la regione cromosomica di interesse risulta cos facilmente individuabile ad un microscopio a fluorescenza.

La FISH consente lidentificazione di piccole delezioni (perdita di materiale genetico), traslocazioni e altri riarrangiamenti cromosomici troppo piccoli per essere visti con le consuete tecniche di bandeggio e colorazione dei cromosomi.

Il test comet-fish combina le due tecniche

Cromosoma non danneggiato

Cromosoma danneggiato

Permette di misurare il tasso di danneggiamento di una regione specifica di DNA

ALKALINE UNWINDING TEST

Le membrane vengono lise in presenza di detergenti e alte concentrazioni saline La molecola di DNA viene denaturata (unwinding) in condizioni alcaline. Il DNA viene poi frammentato tramite applicazioni di ultrasuoni, stabilizzato e separato per via cromatografica Il numero di rotture direttamente proporzionale alla velocit di srotolamento. In genere si valuta la frazione di dDNA rispetto al totale (dDNA+sDNA).

Sul mitilo Perna viridis in relazione allesposizione a benzo[a]pyrene F=(auDNA-sDNA)/(dDNA-sDNA)

Perna viridis

Ching et al. (2001)

EVENTI IRREVERSIBILI Frequenza di micronuclei (MN) I MN rappresentano frammenti acentrici di cromosomi, o cromosomi interi esclusi dal nucleo principale per errori avvenuti durante lanafase. Nelle cellule in interfase appaiono come corpuscoli citoplasmatici di forma rotondeggiante e chiaramente distinti dal nucleo principale. Sono biomarkers di aberrazioni cromosomiche strutturali, e utilizzati come test di screening aspecifici. Tecnica semplice che non richiede particolare abilit

Un micromucleo (MN) si forma in una cellula danneggiata durante la transizione tra metafase e anafase.

Pu derivare da un frammento cromosomico che contiene il centromero (evento ANEUGENICO) oppure da un frammento acentrico (evento CLASTOGENICO)

Integrando il test con la tecnica FISH si pu distinguere tra aneugenesi e clastogenesi

Vantaggi - molto sensibile per riconoscere i danni al DNA - rapido e di facile utilizzo - sono sufficienti poche cellule - applicabile alla maggior parte delle cellule eucariote - discriminazione tra eventi aneugenici e clastogenici (se integrato con FISH) - con esperimenti in vitro si pu avere unidea della capacit di riparazione cellulare Svantaggi - non sensibile a tutti i tipi di aberrazioni cromosomiche - necessaria la divisione cellulare - pu essere difficile risalire al tipo di mutazione

VALUTAZIONE DELLE ABERRAZIONI CROMOSOMICHE

Aberrazioni strutturali Sono rotture del DNA osservabili con il microscopio ottico durante la metafase. Due classi principali: a) chromosome-type aberrations: coinvolgono entrambi i cromatidi di un cromosoma (radiazioni ionizzanti) Es: cromosomi dicentrici, cromosomi ad anello b) chromatid-type aberrations: coinvolgono solo uno dei due cromatidi (> parte mutageni chimici) Es: fratture, delezioni Aberrazioni numeriche Poliploidi (4n) ; Ipodiploidi(<n) ; Iperdiploidi (>n)

CROMOSOMA DICENTRICO

CROMOSOMA AD ANELLO

Vantaggi
-Sono sufficienti poche cellule

- Riconoscimento dei diversi tipi di mutazioni

Svantaggi - Richiede coltivazione in vitro - Richiede apparecchiature e competenze specifiche

SCEs (Sister Chromatid Exchanges)

Consiste in uno scambio di frammenti tra cromatidi fratelli durante la fase S dellinterfase

I cromatidi vengono differentemente colorati ed evidenziati con tecniche fluorimetriche

Si valuta la presenza cromosomi arlecchino

di

CASI DI STUDIO

TEST COMETA E FREQUENZA DEI MN

Test cometa e frequenza dei MN sul mitilo Perna viridis in relazione allesposizione a benzo[a]pyrene (B[a]P)
Olive Tail Moment= lunghezza della coda % di DNA migrato nella coda rispetto a quello della testa

Perna viridis Siu et al. (2004)

ADDOTTI DEL DNA e ALKALINE UNWINDING TEST

Sul mitilo Perna viridis in relazione allesposizione a benzo[a]pyrene (B[a]P)
Perna viridis

Addotti del DNA

Ching et al. (2001)

SCEs and Chromosome aberrations

-Ciclide Etroplus suratensis in relazione allesposizione a

insetticidi organofosforici SCE -MP: Methyl Parathion -PM: Phosphamidon

Etroplus suratensis

Das and John (1999)

Chromosome aberrations

Das and John (1999)

FRAMMENTO

DELEZIONE

Classificazione gerarchica di importanza dei biomarkers funzionali

Alterazioni del DNA -addotti -modificazioni secondarie -eventi irreversibili -mutazioni -induzione MFO -induzione MT -esterasi -proteine da stress Prodotti metabolici -porfirine

2) Risposte a livello di proteine

6) Variazioni a carico del sistema immunitario e ormonale 8) Alterazioni istopatologiche 6) Biomarkers non specifici e fisiologici

BIOMARKERS A LIVELLO PROTEICO - INDUZIONE DELLE METALLOTIONEINE

(esposizione) Si tratta di proteine citoplasmatiche a basso peso molecolare, monomeriche e dimeriche, termostabili, caratterizzate da un alto contenuto di cisteina, e quindi ricche di gruppi SH. Questo le rende ottimi agenti chelanti

Struttura aminoacidica molto conservata, con similitudini maggiori tra specie evolutivamente pi vicine; presenti comunque in modo diffuso, sia tra vertebrati che invertebrati Inquinante: metalli pesanti In particolare chelano metalli come Ag, Cd, Cu, Hg, Zn, che sono legati allinterno di clusters con chiralit opposta

Ruolo fisiologico legato alla regolazione intracellulare di metalli essenziali (Zn, Cu)

Sono inducibili, quindi la loro concentrazione in rapporto con la quantit di metallo I vari tipi di metallotioneine sono specifici per i singoli metalli Biomarker di esposizione, permette di inferire sulla presenza di metalli nellecosistema e la loro biodisponibilit, non necessariamente sulleffetto tossico di questa esposizione per lorganismo Varie metodologie analitiche di quantificazione - cromatografia a scambio ionico - cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC) - spettrofotometria UV-visibile - ELISA - saggi radioimmunologici - polarografia - titolazione dellRNA messaggero a livello di espressione genica a livello di proteine

Strumento che in questi anni si rivelato utile e versatile, quindi molto utilizzato Porre comunque attenzione al fatto che: -la presenza delle metallotioneine presenta fluttuazioni stagionali dovute al ciclo riproduttivo -presenza e induzione influenzata da glucocorticoidi (ormoni da stress, prodotti dal surrene), condizioni di stress, ipossia, basse temperature

- PROTEINE DA STRESS Proteine citosoliche, aumentano in presenza di stress di varia natura, chimici, fisici, fisiologici Si tratta di biomarkers generali di effetto, utili per valutare se lorganismo esposto o meno a situazioni di stress Misurate con tecniche immunochimiche o elettroforetiche

- INIBIZIONE DELLAChE (effetto) Le esterasi sono una famiglia di proteine suddivisibile in due classi Esterasi A Attivate da insetticidi organofosforici e carbammati, sono responsabili della loro detossificazione (esterasi A-tissutale; carbossilesterasi) Esterasi B Inibite in presenza di insetticidi organofosforici e carbammati Tra queste abbiamo le esterasi ematiche (Butyrylcholinesterase, CbE) e le esterasi cerebrali (AChE)

Biomarker specifico di tipo inibitorio Si pu valutare in modo indiretto misurando laumento della concentrazione di ACh a livello sinaptico La AchE infatti lenzima responsabile dellidrolisi dell Ach in colina e acido acetico. Linibizione di questa attivit enzimatica porta ad un incremento di ACh.

La risposta degli invertebrati marini sembra molto meno evidente e caratterizzata rispetto ai vertebrati (pesci, uccelli) Lenzima estratto dagli invertebrati marini mostra unalta somiglianza con quello dei vertebrati, ma grazie alla sostituzione di pochi residui aminoacidi nella molecola, lattivit colinesterasica diventa insensibile allazione degli organofosforici e carbammati

- PROLIFERAZIONE DEI PEROSSISOMI Inquinante: varie classi di inquinanti Sono organuli cellulari contenenti enzimi (spec. catalasi) che catalizzano la demolizione delle specie reattive dellossigeno Sono in grado di autoreplicarsi e sono inducibili.

Sono delimitati da una membrana singola e hanno un cuore cristallino

- INDUZIONE DELLE MFO (esposizione/effetto) Inquinante: xenobiotici idrofobi Lorganismo pu biotrasformare le molecole tossiche in modo da renderle pi idrosolubili e quindi pi facilmente espellibili. Nella trasformazione degli xenobiotici idrofobi intervengono gli enzimi MFO (mixed function oxidase) che appartengono alla famiglia multienzimatica del citocromo P450. Questi enzimi presentano, nella forma ridotta e complessata con CO, un picco di assorbimento a 450 nm, da cui il nome
450 nm

400

450

500 nm

Sono inducibili e la risposta di induzione abbastanza specifica Es: gli IPA inducono la famiglia del citocromo P-450 1A; gli insetticidi organoclorurati inducono la famiglia del citocromo P-450 2B La loro attivit poco evidente negli invertebrati che utilizzano sistemi enzimatici differenti

Attivit dellenzima 7-ethoxyresorufin-O-deethylase (EROD) in esemplari di Platycephalus bassensis provenienti da zone di Port Phillip Bay (Australia) a maggiore (nord) e minore (sud) grado di inquinamento da PCB.

Platycephalus bassensis Gagnon & Holdway (2002)

MALE FEMALE

-MISURE DI FLUORESCENZA DEL CONTENUTO BILIARE DI PESCI

Inquinante: IPA Dopo la trasformazione degli IPA da parte degli enzimi MFO i metaboliti prodotti nel fegato vengono accumulati nella bile fino al momento dellescrezione Gli IPA sono una classe di composti con forti propriet di fluorescenza Ciascun composto caratterizzato da specifici picchi, in base dimensione, alla struttura e alla presenza di sostituenti Osservando la presenza-assenza e lintensit di determinati picchi si risale alla tipologia e alla concentrazione di esposizione E unanalisi molto usata perch breve e poco costosa

Analisi fluorometrica della bile di pesci: Esposto a naftalene, pirene e benzo[a]pirene Proveniente da un ambiente inquinato da benzo[a]pirene Proveniente da un ambiente di controllo

90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 250

Intensit

Benzo[a]pirene

Pirene

Naftalene

(b) (a)

(c)
300 350 400 450 500

Lunghezza donda (emissione) (nm)

Aas et al. (2000)

Come metodo di screening, lanalisi fluorimetrica della bile presenta alcuni vantaggi: -elevata sensibilit -possibilit di distinguere le principali classi di IPA (ad esempio se a 2 o 5 anelli aromatici) -tecnica semplice, rapida, economica svantaggi: difficolt di standardizzazione quantitativa del metodo poich la bile pu per sua natura essere diversamente concentrata o ciclicamente escreta anche in funzione del regime alimentare dellorganismo

- EFFICIENZA DEL SISTEMA ANTIOSSIDANTE Il metabolismo aerobio degli organismi ha come conseguenza inevitabile la formazione di molecole ossidanti molto reattive, in grado di produrre gravi danni molecolari Tra queste i ROS (specie reattive dellossigeno): O2-, H2O2, OH, NO Gli organismi hanno evoluto un sistema antiossidante endogeno per contrastare la loro azione In caso di stress lequilibrio pu essere alterato per: - aumento delle forze ossidanti (Es: contam. organici, metalli) - riduzione delle difese Si innescano un ciclo di reazioni a feed-back positivo

Lesposizione a diverse classi di inquinanti provoca un aumento nella produzione di ROS: Es: contaminanti organici O2metalli pesanti OH In presenza di stress ossidativo si pu avere induzione o inibizione dei singoli componenti del sistema antiossidante Lefficienza del sistema antiossidante si studia osservando: 1) livelli dei singoli componenti (enzimi scavenger, enzimi specifici vitamine liposolubili) 2) la capacit antiossidante totale (TOSCA) e

LIVELLI DEI SINGOLI COMPONENTI DEL SISTEMA ANTIOSSIDANTE

-Enzimi scavenger
Si tratta di molecole a basso peso molecolare che reagiscono direttamente con i radicali ossidandosi (coniugazione) Si trovano nel citosol o legati alle membrane I principali: superossido-dismutasi (SOD), glutatione perossidasi (GPX), catalasi (CAT)

Le SOD sono metallo-enzimi, classificate a seconda del cofattore metallico: ferro (Fe-SOD), manganese (Mn-SOD) e rame-zinco (Cu/ZnSOD). Esistono quindi molte forme diverse distinguibili per il cofattore utile per la catalizzazione delle reazioni

Catalizzano quindi la dismutazione del superossido in ossigeno e perossido di idrogeno. Si tratta quindi di un importante antiossidante in quasi tutte le cellule esposte all'ossigeno

SOD CAT GPX

2O2- + 2H+ H2O2 + O2 2H2O2 2H2O + O2 riducono perossidi organici e inorganici

Nell'uomo, sono presenti tre forme di superossido dismutasi. La SOD1 si trova nel citoplasma, la SOD2 nei mitocondri mentre la SOD3 extracellulare. La SOD1 e la SOD3 contengono rame e zinco, mentre la SOD2 ha manganese nel suo centro di reazione.

Il superossido uno dei maggiori agenti ossidanti nella cellula e di conseguenza, la SOD ha un ruolo antiossidante chiave. L'importanza fisiologica delle SOD visualizzabile dalle gravi patologie evidenti nei topi modificati geneticamente per mancare di questi enzimi. I topi mancanti della SOD2 muoiono pochi giorni dopo la nascita, a causa del forte stress ossidativo. Quelli cui manca la SOD1 sviluppano una gran variet di patologie, tra cui il carcinoma epatocellulare, un'accelerazione della perdita di massa muscolare legata all'et, un'incidenza precoce della cataratta ed una speranza di vita minore. Quelli che mancano della SOD3 non mostrano nessun difetto evidente ed hanno una normale aspettativa di vita. Mutazioni nel primo enzima SOD (SOD1) sono state collegate alla Sclerosi laterale amiotrofica familiare (ALS, una forma di malattia dei motoneuroni).

- Enzimi specifici
Neutralizzano molecole specifiche Es: le gliossalasi (I e II) sono metalloenzimi a base di zinco che catalizzano linattivazione glutatione-dipendente del metilgliossale
O CH3 H O Metilgliossale SDLACTOYLGLUTATHIONE

HEMITHIOACETAL

Il metilgliossale una molecola glucosio-derivata che prodotta in eccesso nelle cellule danneggiate a causa della iperglicemia Implicata nel processo patologico delle due maggiori complicanze del diabete: retinopatia e insufficienza renale. E inoltre prodotta dal

- Vitamine
Sono le vitamine: A (retinolo), C (acido ascorbico), E (alfa-tocoferolo), Cedono ai radicali lelettrone mancante trasformandosi a loro volta in radicali poco attivi facilmente neutralizzabili dagli enzimi cellulari

I risultati che otteniamo dallanalisi della quantit dei singoli componenti del sistema antiossidante sono difficilmente interpretabili Es: - La quantit di glutatione perossidasi diminuisce in condizioni di stress ossidativo - Le catalasi si trovano ad uguale concentrazione in organismi della stessa specie provenienti da siti a diverso grado di inquinamento. -Le gliossalasi sono inducibili ma ad alte concentrazioni risultano tossiche

CAPACITA ANTIOSSIDANTE TOTALE TOSCA [Total Oxyradical Scavenging Capacity Assay] Parametro quantitativo di efficienza complessiva dellintero sistema ossidante E un biomarker molto utilizzato. Non presenta ambiguit. Per determinare la TOSCA: si generano artificialmente diverse forme di radicali liberi e si mettono in contatto con un substrato dalla cui ossidazione si forma un prodotto noto (etilene). Inseriamo nel sistema gli antiossidanti provenienti da un estratto citosolico, i quali reagiranno con i radicali. Gli antiossidanti cellulari reagiscono pi efficacemente del substrato con i radicali, e la produzione di etilene risulta quantitativamente inibita. La capacit antiossidante totale sar rilevata in base alla diminuzione del prodotto di ossidazione In genere si osserva che gli organismi provenienti da un ambiente inquinato hanno una TOSCA pi bassa rispetto a quelli che derivano da un sito pulito Sono molto utili osservazioni integrate dei vari biomarkers

- DESTABILIZZAZIONE DEL SISTEMA LISOSOMIALE

I lisosomi sono organuli cellulari circondati da membrana. Contengono enzimi (idrolasi), immagazzinati in forma inattiva, con funzione digestiva e detossificante; regolano infatti lomeostasi cellulare e sono implicati nella difesa immunitaria e nella digestione intracellulare. Per svolgere la loro funzione lintegrit della membrana

fondamentale. Molte sostanze tossiche sono in grado di danneggiare le membrane dei lisosomi secondo un meccanismo che non ben chiaro

Misura della stabilit lisosomiale

A questo proposito possono essere studiati diversi tipi di biomarkers Tempo di labilizzazione acida della membrana Grado di ritenzione del rosso neutro Grado di fusione lisosomiale Accumulo di lipofuscine Metodi semplici, economici, rapidi Le principali alterazioni lisosomiali sono accettati come biomarkers a livello internazionale, e le metodologie di valutazione raccomandate da i pi importanti organi di controllo mondiale (WHO-FAO, UNEP, OSPARCOM) Questo perch la destabilizzazione del sistema lisosomiale un grave tipo di alterazione, non recuperabile nel breve-medio periodo. Visto limportanza dei lisosomi a livello immunitario, una perdita di funzionalit pu determinare una compromissione generale dello stato di salute dellorganismo e quindi una diminuzione tangibile della fitness (successo riproduttivo, salute ecc.)

Tempo di labilizzazione acida della membrana

Metodologia che si applica su cellule morte. Campioni fissati con azoto liquido. La membrana viene trattata con un acido per labilizzarla artificialmente e renderla permeabile al substrato usato, posto esternamente. Questo, entrando nel lisosoma, reagisce con gli enzimi dando luogo ad un prodotto colorato. Il grado di labializzazione proporzionale al tempo di esposizione allacido, fino ad un livello massimo (max grado di colorazione) oltre il quale la membrana si rompe. Il tempo dopo il quale viene raggiunta la massima colorazione viene detto tempo di labilizzazione. Questo tempo dipendente dallo stato di danneggiamento iniziale del lisosoma.

Tempo di ritenzione del rosso neutro (Neutral Red Retention NRR)

Principio del metodo: capacit dei lisosomi di assorbire e trattenere il rosso neutro (colorante cationico) -cellule sane (citosol incolore) -cellule danneggiate (citosol colorato)

I lisosomi (cellule vive) vengono incubati con un colorante lipofilico. Si osserva il tempo di rilascio nel citosol. Lefficienza di ritenzione infatti inversamente proporzionale al grado di danneggiamento della membrana.

Rosso Neutro (esempio sui Lombrichi)

Tecnica invasiva con una siringa si prelevano i celomociti vengono immersi in una soluzione contenente il rosso neutro incubati su un vetrino osservati al microscopio a intervalli di tempo regolari si conta il numero di cellule con il citoplasma colorato ENDPOINT: tempo al quale il 50% delle cellule colorato Tempo di ritenzione del rosso neutro

Morfologia dei lisosomi

Laumento nelle dimensioni stato osservato soprattutto nelle cellule digestive dei bivalvi. La presenza dei cosiddetti lisosomi giganti riflette uno scompenso a carico dei normali processi di fusione dei componenti del sistema lisosomiale, indotta da contaminanti sia chimici che metallici. I processi di fusione sarebbero proporzionali al grado di danneggiamento della membrana. Anche lincremento nel numero assume lo stesso significato.

Accumulo di lipofuscine
Le lipofuscine sono uno dei prodotti terminali della perossidazione lipidica. Si tratta quindi di residui dell'ossidazione di lipidi e proteine. Si tratta infatti di un accumulo granulare di molecole polimeriche non degradabili dalle idrolasi lisosomiali n eliminabili per esocitosi. Tali granuli assumono solitamente una colorazione marrone e sono prevalentemente composti di lipidi. A livello lisosomiale, una eccessiva presenza di questo pigmento (rilevabile con colorazione istochimica) indice di aumentati processi autofagici e di un danneggiamento della membrana legato allinstaurarsi di condizioni di stress ossidativo

Attenzione: anche i parametri di funzionalit lisosomica sono sensibili a fattori diversi dallinquinamento chimico quali -incremento della temperatura -variazioni stagionali -fase riproduttiva (durante la fase di emissione dei gameti, ad es. nei mitili, si ha la degenerazione degli epiteli digestivi e una destabilizzazione del sistema lisosomiale) La presenza di lipofuscine da sempre correlata allinvecchiamento

NEUTRAL RED RETENTION

Tempo di ritenzione del rosso neutro nei lisosomi degli emociti di Perna viridis in funzione dellesposizione a Cu

Perna viridis

Nicholson et al. (2003)

Classificazione gerarchica di importanza dei biomarkers funzionali

Alterazioni del DNA -addotti -modificazioni secondarie -eventi irreversibili -mutazioni -induzione MFO -induzione MT -esterasi -proteine da stress Prodotti metabolici -porfirine

2) Risposte a livello di proteine

6) Variazioni a carico del sistema immunitario e ormonale 8) Alterazioni istopatologiche 6) Biomarkers non specifici e fisiologici

BIOMARKERS METABOLICI

DA

PRODOTTI

Gli inquinanti possono alterare il normale metabolismo di composti endogeni, provocandone un accumulo anormale.

Il nome "porfiria" deriva dal fatto che queste malattie provocano l'accumulo di sostanze chimiche dette porfirine Tutte le forme di porfiria sono dovute a dei difetti enzimatici nella sintesi dell'eme, per cui il processo di sintesi si arresta ad un certo livello, portando all'accumulo di un precursore dell'eme. Questo accumulo pu verificarsi nel fegato o nella pelle che diventa cos sensibile alla luce inducendo alterazioni. La porfiria una malattia geneticamente trasmessa Forme pi o meno gravi di anemie, fotosensibilit, sensibilit a farmaci che possono scatenare crisi anche gravi (coma, paralisi, atrofie)

Le porfirine hanno un ruolo nel corpo umano perch entrano nella sintesi della emoglobina che trasporta l'ossigeno e dei pigmenti respiratori delle cellule. - PORFIRINE (effetto) Alterazione del metabolismo delle porfirine Produzione anomala di prodotti intermedi (protoporfirine, uroporfirine, coproporfirine) Accumulo sopratutto nel fegato Produzione di un danno epatico Responsabili: PCBs, esaclorobenzene (HCB), alcuni metalli pesanti (Pb) Biomarker specifico; le uroporfirine sono ad es. dovute a HCB, le protoporfirine a Pb ecc.

BIOMARKERS: SISTEMA IMMUNITARIO E ORMONALE

Il sistema immunitario, essendo deputato alla difesa dellorganismo, rappresenta nel suo funzionamento, un ottimo indicatore dello stato di salute dellorganismo I biomarkers immunologici maggiormente utilizzati sono: -lattivit di fagocitosi dei macrofagi -la chemioluminescenza e lattivit citotossica dei leucociti Si tratta di biomarkers a risposta ritardata Anche il sistema ormonale risente in modo sensibile della presenza di inquinanti, fornendo possibilit di valutazione dello stato di contaminazione dellorganismo

- DEGENERAZIONI ORMONALI (effetto)

Possono essere causate da un vasto pool di sostanze che interferiscono con il sistema endocrino (EDC, Endocrine Disruptor Chemicals). Es: Bisfenolo A, Ftalati, Parabeni, PCBs, TBT, etc. Il disturbo ormonale si ripercuote su crescita, comportamento, riproduzione e funzione immunitaria Le forme pi note di disturbo sono: -sostanze che mimano lazione di ormoni -sostanze che bloccano lazione di ormoni Questo avviene in particolare per ormoni steroidei, a livello dei recettori

Si conoscono sostanze capaci di alterare la sintesi, il metabolismo, il trasporto o lescrezione di ormoni, e altre capaci di interferire con meccanismi di feedback tra ipotalamo e la ghiandola pituitaria, fino a composti capaci di un danneggiamento diretto di organi endocrini

In alcuni casi dal tipo di degenerazione si pu risalire allinquinante che lha provocata, in questo caso il biomarker ha caratteristiche intermedie tra esposizione ed effetto ed molto informativo. Es: - Ermafroditismo orsi polari PCBs - Imposex gasteropodi TBT

Vernici antifouling (TBT)

Nei gasteropodi marini induce il fenomeno conosciuto come IMPOSEX: insorgenza di caratteristiche maschili nelle femmine Normal female

Hydrobia ulvae

Female with imposex

Schulte-Oehlmann et al. (1997)

- LESIONI EPATICHE (effetto)

Sono dovute ad agenti inquinanti ad azione cancerogena Lo sversamento di PCBs nel Fox River (Wisconsin) induce lesioni epatiche nel pesce Stizostedium
Stizostedium vitreum

BIOMARKERS ISTOPATOLOGICI

vitreum
FCA= Foci of Cellular Alteration HT= Hepatic Tumors
Barron et al. (2000)

Biomarkers fisiologici: un caso di studio

Patellidi
Medio-litorale superiore P. rustica

Mediterranee
Patella caerulea Medio-litorale inferiore P. caerulea

Frangia sublitorale

P. aspera

Tropicali

Cellana grata

Cellana tourema

Acanthopleura japonica

Shek O

Procambarus clarkii
Procambarus clarkii

Fucecchio

Strumentazione per la rilevazione dellattivit cardiacaeventilatoria

Computer per acquisizione automatica

Oscilloscopio programmabile

Scheda di alimentazione amplificazione e filtraggio fototransistor fotodiodo IR

Lamodulazionedellattivitcardiacapuessere:

PO

IVA T I S

NE GA T

IVA

Infrequenza:CRONOTROPA

Lamodulazionedellattivitcardiacapuessere:

PO

IVA T I S

NE GA T

IVA

Infrequenza:CRONOTROPA Inampiezza:INOTROPA

Effetto del rame sullattivit cardiaca di Patella caerulea

3 h
1.6

n=27

6 h
1.6

Heart Rate Variation (HRV)

1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2

Heart Rate Variation (HRV)

1.4

1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2

0.25

0.5
-1

0.25

0.5
-1

Copper (mg l )

Copper (mg l )

-Lesposizioneacutaarameinduceunarispostabradicardica tempoeconcentrazionedipendente - Alte concentrazioni di metallo e tempi di esposizione prolungatipossonoprovocarerisposteacardichereversibili

Effetto del rame sullattivit cardiaca di Patella caerulea

Cu 0.5mgl-1

t 3h 6h

2V 10sec

Attivit cardiaca e respiratoria in Procambarus clarkii

Alla fine del periodo di acclimatazione (n=72): Heart rate (mean SD) 1.50 0.52 beats s-1 Scaphognatite rate (mean SD) 1.44 0.59 beats s-1
Struttura delle seconde mascelle atto a convogliare il flusso dacqua verso la camera branchiale
3.5 3 2.5 2 1.5 1 0.5 0 0 0.5 1 1.5 2
-1 -1

Scaphognatite rate (beats sec

Pearson productmoment correlation coefficient r=0.349, P<0.01

2.5

Heart rate (beats sec )

(a)

Heart Rate Variation (HRV)

Effetto del rame sullattivit cardiaca di Procambarus clarkii

1.5
3h 6h 96 h

0.5

0 0 Scaphognatites Rate Variation (SRV) 0.5 1 10 0 0.5 1 10

-1

0.5 1

10

Copper (mg l )

(b)

1.5

3h

6h

96 h

0.5

0 0 0.5 1 10 0 0.5 1 10
-1

0.5 1

10

Copper (mg l )

n=72

Effetto del rame sullattivit cardiaca di Acanthopleura japonica

2 Heart Rate Variation (HRV)

1.5

0.5

0 0 0.25 0.33
-1

0.50

Copper concentration (mg l )

T=3 h; n=28

Somministrazione combinata di rame e (TTX)

Heart Rate Variation (HRV) 2 1.5 1 0.5 0 0 0 0.5 1 Tetrodotoxin (M) 0.5 1

= Cu 0 = Cu 0.25 mg l-1

Patella caerulea

T=3 h n=54

2 Heart Rate Variation (HRV)

1.5

= Cu 0.33 ppm = Cu 0.33 mg l-1

= Cu 0 ppm

= Cu 0

Acanthopleura japonica

0.5

0 0 0 1 Tetrodotoxin (M) 1

T=3 h n=28

Somministrazione combinata di carbacolo e (TTX)

With TTX (1 M)
2 1.8 1.6 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 0 10 100

Heart rate variation (HRV)

Without TTX

10

100

Carbachol concentration (M)

Patella caerulea

T=10 min; n=54

P.caerulea: atropina, benzochinone, d-tubocurarina

d-Tubocurarina T=3h;n=24 Atropina T=3h;n=48

Benzochinone

T=3h;n=48

Acanthopleura japonica: atropina e benzochinone

Heart Rate Variation (HRV) 2 1.5 1 0.5 0 0 T=3h;n=28 2 1.5 1 0.5 0 0 T=3h;n=28 0 5 5 Benzoquinonium (M) 0 20 Atropine (M) = Cu 0 ppm = Cu 0.33 20 = Cu 0 ppm = Cu 0.33

Atropina

Heart Rate Variation (HRV)

Benzochinone

Registrazioni cuore-arteria in A. japonica

Heart Dorsal artery

Controllo

Dorsal Artery

Heart

Dorsal artery

Pericardium

Heart

Cu 0.5 ppm (20 min)

Risposta al rame in popolazioni di P.caerulea provenienti da siti a diverso grado di inquinamento

Effettodelramesullattivitcardiaca Pollution
Unpolluted Polluted

Site

Quercianella

Castiglioncello

Marina di Pisa

Porto di Livorno

Treatment (ppmCu)

0 0.25

0.5

0 0.25

0.5

0 0.25

0.5

0 0.25

0.5

9 repliche per ciascun livello di trattamento

Risposta al rame in popolazioni di P.caerulea provenienti da siti a diverso grado di inquinamento

2

UNPOLLUTED Quercianella Castiglioncello

POLLUTED Marina di Pisa Porto di Livorno

Heart Rate Variation (HRV)

1.8 1.6 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0

0.25 0.5

0.25 0.5

0
-1

0.25 0.5

0.25 0.5

Copper (mg l )

T=3 h; n=108

Leffetto bradicardico indotto dallesposizione a rame dipendentedalgradodiinquinamentodelsito In particolare esso pi consistente nei siti unpolluted rispettoaquellipolluted

Risposta al rame in popolazioni di P.caerulea provenienti da siti a diverso grado di inquinamento

LC50 Quercianella Porto di Livorno 0 (controlli), 0.05, 0.1, 0.5 ppm Cu n= 20 per concentrazione

Probit Analysis
95% Confidence Limits Time (h) 72 96 Site Quercianella Porto di Livorno Quercianella Porto di Livorno LC50 0.099 0.205 0.053 0.085 Lower 0.067 0.134 0.037 0.062 Upper 0.148 0.368 0.063 0.125

Risposta al rame in popolazioni di Cellana provenienti da siti a diverso grado di inquinamento

POLLUTED UNPOLLUTED

T=2 h Cu=0.5 ppm

Effetto della pre-esposizione a rame in Procambarus clarkii

(a) Heart Rate Variation (HRV) 1.5

0.5

0 0 (b) 0.1 Pre-exposure concentration (mg Cu l-1) 1

Scaphognatites Rate Variation (SRV)

1.5

0.5

0 0 0.1 Pre-exposure concentration (mg Cu l-1) 1

Cu=10 mg l-1; T=3 h; n=30