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Meccanismi di desensitizzazione e

tachifilassi

• Sono quei meccanismi che rendono


conto del fatto che lo effetto di un
farmaco gradualmente diminuisce
quando il farmaco è dato
continuamente o in modo ripetuto.
• Meccanismi di desensitizzazione si
osservano già nei batteri: è questo il
fenomeno della chemiotassi. Negli
eucarioti tale meccanismo si attua non
soltanto nei confronti di molecole
esogene come i farmaci, ma anche per
sostanze endogene o ormoni e in tal
senso i meccanismi di
desensitizzazione vanno visti come
fenomeni adattativi, che sviluppatisi nel
corso dell’evoluzione, hanno persistito
in quanto sono di fondamentale
importanza per proteggere l’organismo
da una eccessiva stimolazione.
• Sono meccanismi che si instaurano
nell’arco da minuti a ore
• Tolleranza:
• in seguito alla somministrazione
prolungata di un farmaco, l’effetto
diminuisce.
• Occorre aumentare la dose per
avere lo stesso effetto.
• Una tolleranza può instaurarsi
lentamente in seguito alla
somministrazione cronica di un
farmaco o può instaurarsi
rapidamente (tolleranza acuta) in
seguito a modificazioni rapide di
conformazione del recettore tipiche
del recettore ionotropo o per
fenomeni di tachifilassi:
esaurimento del mediatore
Fenomeni di tolleranza possono essere dovuti a

Fenomeni cellulari:
• cambiamenti di conformazione dei recettori
(tolleranza rapida, esempio recettore
nicotinico)
• perdita dei recettori (tolleranza lenta, esempio
delle catecolamine, degli oppiodi: morfina)
• esaurimento del mediatore (tachifilassi
propriamente detta, tolleranza rapida,
esempio tolleranza alla tiramina)

Fenomeni metabolici
• cambiamenti a carico di enzimi del
metabolismo (tolleranza lenta, esempio del
fenobarbital)

Adattamenti fisiologici :(tolleranza lenta,


esempio le azioni di un farmaco che abbassa
la pressione sono compensate in via riflessa
da un aggiustamento pressorio)
Desensitizzazione del recettore nicotinico

Blocco di fase I o da depolarizzazione. E’


dovuto alla perdita di eccitabilità elettrica
che si verifica durante un periodo di
protratta depolarizzazione ed è dovuto a
inattivazione dei canali al sodio voltaggio
dipendenti

Blocco di fase II è dovuto al fenomeno della


desensitizzazione recettoriale
• Un blocco di fase I e II può essere ben
osservato”in vitro” con la nicotina.
• Un blocco di fase I e II può essere
osservato “in vivo” con la succinilcolina
agente depolarizzante che induce un
blocco iniziale di fase I e poi II.
La succinilcolina è un agente coadiuvante
degli anestetici generali in quanto induce
miorilassamento
Stato di Riposo ------------------------- Stato Attivo
------------------------ /
Il recettore è attivabile /
\ /
\ /
Stato Refrattario
Il recettore non è attivabile

• Stato di riposo il canale è chiuso e l’affinita è alta


• Stato attivo il canale è aperto e l’affinità diminuisce
• Stato refrattario il canale è chiuso e l’affinità è alta

Quando l’agonista permane sul recettore per un lungo


tempo, il recettore entra nel cosiddetto “stato refrattario”.
Studi iniziali su membrane di Torpedine vescicolate che
mantengono la integrità dei canali ionici e più di recente,
studi in patch clamp che hanno permesso lo studio dei
flussi ionici sono stati messi in relazione con studi di
binding su membrane. Tali studi hanno messo in evidenza
che il recettore nello stato di riposo e attivato ha una
affinità per il recettore più bassa che nello stato refrattario
(Kd nell’ordine del 50-100 uM contro una Kd di 1-3 nM
nello stato refrattario).
Questo rende conto di un forte legame del recettore con
l’agonista pur non aprendosi il recettore.
Man mano che l’agonista è lavato in studi “in vitro” o
degradato lentamente “in vivo” è allontanato dal recettore il
recettore torna nello stato di riposo e quindi attivabile.
Risposte di desensitizzazione del recettore nicotinico
sono mediate dal “binding site” della acetilcolina
(subunità alfa 1 e alfa 2)
ma possono essere modulate nel senso di una
accellerazione dello stato di desensitizzazione del
recettore nicotinico da:

• da antagonisti non competitivi della acetilcolina:


antagonisti non competitivi del recettore nicotinico
legano dentro il canale come la istrionicotossina o ad un
sito allosterico a bassa affinità posto alla interfaccia del
recettore con la membrana.
Questi ultimi sono:
-Gli anestetici locali
-La fenciclidina: la “polvere degli angeli”
-La clorpromazina bloccante dei recettori D2
dopaminergici, farmaco antipsicotico

• da mediatori intracellulari:
proteino chinasi cAMP dipendenti:Kinasi cAMP
dipendenti, fosforilando il recettore sulle subunità
gamma e delta ne accellerano lo stato di
desensitizzazione

• dal potenziale elettrico della membrana: la


iperpolarizzazione accellera lo stato di
desensitizzazione
Kinasi cAMP dipendenti fosforilano il recettore nicotinico
accellerandone lo stato di desensitizzazione.
La protein chinasi C e la tirosino chinasi fosforilano il
recettore, non è però certo se accelerano lo stato di
desensitizzazione del recettore.
• Proteino chinasi si sono rivelate
importanti nei processi di
desensitizzazione rapida:
• Le proteino chinasi A che è cAMP
dipendente che fosforila il recettore
su residui di serina e le GRK
(famiglia di chinasi che fosforilano i
recettori legati a proteine G). La
prima GRK identificata è stata
βARK: β adrenoceptor kinase) che
è cAMP indipendente e fosforila il
recettore su residui di serina e
treonina
• I siti fosforilati sono stati identificati
con studi di recettori mutanti
transfettati in fibroblasti di Hamster
cinese
Fenomeni di fosforilazione tipicamente rendono conto
della desensitizzazione del recettore beta per le
catecolamine.
Oggi sappiamo che una varietà di altri recettori
accoppiati alle proteine G desensitizzano con lo
stesso meccanismo

Due meccanismi di desensitizzazione sono stati


evidenziati:
• Una fase di disaccoppiamento:
- fenomeno rapido che si instaura nell’arco di minuti
(richiede quindi brevi esposizioni all’agonista)
- dipende da fenomeni di fosforilazione del recettore
- può accompagnarsi a sequestro dei recettori che
vengono internalizzati ma non distrutti: sono solo
transientemente rimossi dalla superficie cellulare
- non si misura una diminuizione del numero dei
recettori
-si può misurare una riduzione di affinità

• Una fase di “down regulation”:


- fenomeno lento che si instaura da minuti a ore
(richiede esposizioni all’agonista di almeno
un’ora)
-- si ha un processo di endocitosi dei recettori che
vengono poi distrutti
- si registra una progressiva diminuizione del numero
di recettori
• La fosforilazione da parte di βARK
procede solo se è presente una
proteina intracellulare, l’arrestina,
che svolge un ruolo nel
disaccoppiamento del recettore
dalla proteina Gs:
• La fosforilazione da parte di βARK
induce una modificazione
conformazionale del recettore che
si lega ad “arrestin like protein” e
non più a Gs
• L’arrestina è stata inizialmente
identificata nella retina dove
legandosi al recettore alla luce
(rodopsina) impedisce un corretto
legame con transducina
impedendone così il funzionamento
che consiste nella attivazione di
fosfodiesterasi che idrolizzano il
cGMP
• Il recettore internalizza legato
a proteine come “arrestin -like
protein” che ne impedisce il
legame con la proteina Gs.
• Altre proteine involte nel
fenomeno della
desensitizzazione e
internalizzazione del recettore
sono la clatrina, la caveolina
• Il recettore β internalizzato
colocalizza con i recettori della
transferrina che sono un marker
delle membrane degli endosomi i
quali hanno la funzione:
• di sequestrare le proteine
recettoriali e riciclarle sulla
membrana
• oppure dirigerle verso i lisosomi
dove verranno distrutti
• Gli endosomi sono così una
struttura che permette il sequestro
il riciclo o la “down regulation”
• Il fenomeno della “down regulation”
del recettore beta è stato ben
descritto “in vitro” su colture
cellulari esposte per 8 hr ad un
agonista.
• Il numero di recettori è ridotto al
10% e possono essere necessari
alcuni giorni perché il numero torni
normale.
• “In vivo” una down regulation del
beta recettore è descritto in seguito
a trattamento cronico con farmaci
antidepressivi inibitori del reuptake
delle catecolamine
• Desensitizzazione omologa:
GRK (βARK)
Il recettore si desensitizza in seguito
all’interazione con l’agonista di quel
recettore (ex: recettore β
adrenergico si desensitizza alla
isoprenalina)
• Desensitizzazione eterologa:
proteino chinasi A e la chinasi C
Il recettore si desensitizza in seguito
all’interazione di altri agonisti non
correlati strutturalmente e che
agiscono tramite altri recettori.
Altri agonisti che attivano recettori
che determinano una attivazione di
Gs stimolatorie (ex. recettore
muscarinico) sulla produzione di
cAMP e conseguente attivazione
della chinasi A possono
desensitizzare il recettore β)
La proteina βARK
• è stata clonata dal gruppo di Leflowitz
• ha analogie con la famiglia delle proteino chinasi C
• derivano da un comune gene ancestrale?
• È maggiormente presente a livello del cervello, milza,
cuore, dove sono presenti anche i più alti livelli di
catecolamine
Le osservazioni che βARK:
• media una desensitizzazione omologa quando
sperimentalmente sono utilizzate alte concentrazioni di
un β agonista e un alto numero di recettori è occupato
• che è presente in maggior quantità in distretti dove la
trasmissione catecolaminergica è altamente attiva
hanno portato a speculare sui ruoli fisiologici di βARK e
oggi sappiamo anche di altre GRK
• βARK sarebbe involta nei processi di desensitizzazione
omologa alla sinapsi per limitare l’eccessiva
stimolazione del recettore beta conseguente ad un
aumentata trasmissione noradrenergica ( ex: in
presenza di farmaci inibitori del reuptake delle
catecolamine come gli antidepressivi triciclici).
• Prospettiva farmacologica è quella di poter modulare
una desensitizzazione recettoriale con farmaci che
vanno ad interagire con proteino chinasi involte nella
desensitizzazione recettoriale.
Meccanismi di endocitosi e “down
regulation” sono stati ben descritti per il
recettore tirosino chinasico e per il
recettore intranucleare agli ormoni
steroidei.

La desensitizzazione del recettore


tirosino chinasico (insulina e fattori di
crescita) studiata con EGF involge:
• 1) una riduzione di affinità per il ligando
• 2) una inibizione della attività tirosino
chinasica
• 3) una internalizzazione e “down
regulation”
• 4) il recettore può essere desensitizzato
eterologamente ad opera della proteino
kinasi C

La desensitizzazione del recettore


intracellulare per gli ormoni steroidei
involge:
• una riduzione della trascrizione di DNA e
quindi sintesi del recettore e in un
secondo momento ad
• aumento della sua distruzione
Fenomeni di “up regulation”

• Supersensitività da denervazione alla


giunzione neuromuscolare: in seguito
a denervazione di fibre motorie i
recettori nicotinici si estendono anche
nella zona extragiunzionale. Questo
rende conto del fenomeno definito
come “ipersensibilità da denervazione”
agli agenti colinergici
• Alla base di tale fenomeno esiste una:
• Diminuizione delle concentrazioni di
Ca++ intracellulare
• Diminuita attività di chinasi Ca++-
calmodulina dipendenti inibitorie sulla
espressione genica di alcune subunità
del recettore nicotinico
• La up regulation si accompagna anche
a modificazioni della composizione
delle subunità del recettore
Fenomeni di up regulation sono
alla base delle discinesie che
si verificano nella malattia di
Parkinson. Nella malattia in
seguito alla massiva
degenerazione dei neuroni
dopaminergici si sviluppa una
supersensitività del recettore
dopaminergico che è
responsabile di una risposta
esagerata alla L-DOPA. Tali
discinesie scompaiono infatti
riducendo la dose di L-DOPA