Aspetti quantitativi dell’interazione


Farmaco-Recettore
 curve concentrazione-risposta e dose-risposta

Curva concentrazione-risposta: descrive la relazione tra concentrazione di

un farmaco ed il grado di risposta (esperimenti in vitro)

Curva dose-risposta: relazione tra dose somministrata ed il grado di

risposta (esperimenti in vivo)

Da un punto di vista quantitativo le risposte farmacologiche

possono essere definite come:

a)  Risposte graduali (risposte misurabili in continuo)

b) Risposte del tutto o nulla (quantali) (dose/numero individui in cui si

verifica l’effetto)
 Curve quantali

La risposta di tipo quantale mette in rapporto la frequenza con cui si

verifica una definita risposta, con il valore delle dosi impiegate (risposta
del “tutto o nulla”).
 Curve dose-risposta GRADUALI

L’effetto di un farmaco è proporzionale al numero di recettori occupati,

quindi aumenta all’aumentare della dose.
L’effetto massimo si verifica quando tutti i recettori sono occupati.
 Curve dose-risposta GRADUALI: Caratteristiche

Effetto massimo o efficacia

• Caratteristica principale del farmaco, è la risposta massima prodotta da un farmaco
• Plateau nella curva dose-effetto
• Dipende dalle sue proprietà intrinseche e dal sistema recettore-effettore
• Non è correlato alla potenza
Potenza
• Indica quanto farmaco è necessario per indurre il 50% della risposta (EC50).
• Più bassa la dose richiesta, più il farmaco è potente.
• Non è giustificata l’opinione che tra due farmaci il più potente sia clinicamente
migliore: una potenza bassa è uno svantaggio solo se la dose efficace è troppo grande
ed ostacola la somministrazione
 Curve dose-risposta GRADUALI: Caratteristiche

Pendenza (o coefficiente angolare)

• Indica la maneggevolezza del farmaco
• Una forte pendenza indica che un piccolo aumento della dose
del farmaco provoca un grande cambiamento della risposta

Variabilità (variazione biologica)

• differenze nella risposta tra individui della stessa popolazione
a cui è stata somministrata la stessa dose di farmaco
 Curve dose-risposta

Molto utilizzate per definire e confrontare l’attività di farmaci

diversi su di uno stesso target biologico
 TARGETS DEI FARMACI ATTUALMENTE IN USO

La maggior parte dei farmaci per indurre una risposta deve interagire
(legarsi) con uno specifico bersaglio molecolare (proteine).
Non rientrano in questa categoria
!  Antiacidi
!  Scavengers per radicali liberi
!  Lassativi
 FARMACI E MECCANISMO D’AZIONE

Caratteristiche del legame con il bersaglio:

" Specificità (riconoscimento specifico)

" Amplificazione e diversificazione della
risposta (secondi messaggeri)
" Reversibilità (spegnimento del segnale)

I principali bersagli molecolari dei farmaci sono:

"  Recettori di membrana

"  Recettori intracellulari
"  Canali ionici
"  Enzimi
"  Trasportatori
FARMACI E MECCANISMO D’AZIONE
 Tipi di RECETTORI

Le cellule distanti tra loro comunicano attraverso molecole

(MEDIATORI o NEUROTRASMETTITORI) che si legano a
macromolecole nella cellula ricevente (RECETTORI)

1) RECETTORI DI MEMBRANA

• Legati a canali ionici

• Legati a proteine G
• Legati ad enzimi

2) RECETTORI INTRACELLULARI
 RECETTORI DI MEMBRANA: RECETTORI CANALE

"  Sono dei complessi macroproteici transmembranari che

formano un canale ionico (aperto dal legame con il
neurotrasmettitore o con farmaci agonisti)

"  La loro attivazione determina

dei rapidi cambiamenti delle
concentrazioni ioniche intra-
cellulari e del potenziale
elettrico transmembranario

"  Sono recettori canale:

-  Recettori nicotinici -  Recettori per la glicina
-  Recettori GABAA -  Recettori per il glutammato
-  Recettore 5-HT3 per la serotonina
 RECETTORI DI MEMBRANA: RECETTORI CANALE

I recettori legati a canali ionici possono avere effetto di tipo:

Eccitatorio: acetilcolina,
glutammato, serotonina
(apertura dei canali Na+ con
conseguente depolarizzazione)

Inibitorio: GABA, glicina

(apertura dei canali Cl- con
conseguente iperpolarizzazione)
RECETTORI DI MEMBRANA: RECETTORI ACCOPPIATI ALLE PROTEINE G
 RECETTORI ACCOPPIATI ALLE PROTEINE G

"  Le proteine G sono una famiglia di molecole proteiche,

chiamate così per la loro interazione con i nucleotidi guaninici
GTP e GDP

"  Ogni proteina G è formata da 3 subunità (α, β e γ)

"  GTP e GDP si legano alla subunità α, che ha attività GTPasica

(GTP → GDP)

"  β e γ sono associate a formare un complesso βγ, sono

idrofobiche e sono ancorate alla superficie citoplasmatica della
membrana
RECETTORI ACCOPPIATI ALLE PROTEINE G
 RECETTORI ACCOPPIATI ALLE PROTEINE G

DAG PK-C
+
PIP2 IP3 + Ca++ RS

Ca++
PL-C
R +

Ca++
Gq GTP
+ PK-A
GDP ATP cAMP

GTP GDP GTP GDP

+ -
R Gs AC Gi R
 Cascata amplificatrice
1° messaggero neurotrasmettitori - ormoni

recettori

proteine G

adenilatociclasi guanilatociclasi fosfolipasi canali ionici

IP3
Ca 2+

2° messaggero cAMP cGMP Ca 2+

calmodulina fosfatidilserina

proteinchinasi A proteinchinasi C proteinchinasi proteinchinasi

Ca-calmodulina fosfatidilserina
dipendenti dipendenti

3° messaggero substrati per le diverse proteinchinasi

effetti biologici
 RECETTORI ACCOPPIATI ALLE PROTEINE G
Le proteine G:
Tipo Recettori Effettori
Ammine β-adrenergiche,
Gs istamina, 5-HT, glucagone
↑ cAMP

Ammine α-adrenergiche, Ach
Gi1, Gi2, Gi3 (muscar), 5-HT, oppioidi etc.
Ach (muscar), 5-HT,
Gq bombesina etc.
↓ cAMP,
apertura canali K+
(↓ frequenza cardiaca)
↑ PLC
(↑ IP3, DAG, Ca++ citopl)

G0 Neurotrasmettitori cerebrali

"  Il 50% dei farmaci oggi in uso agiscono sui GPCR

(G-Protein Coupled Receptors)

"  210 ligandi endogeni agiscono sui GPCR

…ma ci sono ancora circa 800 GPCR da identificare!

 RECETTORI DI MEMBRANA: RECETTORI LEGATI AD ENZIMI

I Recettori Tirosina Chinasi (RTK) legano ormoni peptidici e fattori di

crescita ( insulina, EGF, IGF, NGF, PDGF, ecc.) e regolano la
moltiplicazione e il differenziamento cellulare.
 RECETTORI DI MEMBRANA: RECETTORI LEGATI AD ENZIMI

I Recettori Tirosina Chinasi (RTK) possono essere:

•  recettori dotati di attività enzimatica intrinseca: possiedono attività tirosin-

chinasi stimolata dal ligando. Nella maggior parte dei casi il ligando si lega
come dimero stimolando la dimerizzazione del recettore e la stimolazione
della sua attività chinasica.
Questi recettori autofosforilano residui di tirosina presenti nel loro dominio
citosolico e possono fosforilare anche varie proteine substrato.
 RECETTORI DI MEMBRANA: RECETTORI LEGATI AD ENZIMI

I Recettori Tirosina Chinasi (RTK) possono essere:

• recettori associati alla tirosina chinasi: sono privi di attività catalitica

intrinseca, ma il legame con il ligando induce la formazione di un
recettore dimerico che interagisce ed attiva delle tirosina-chinasi
citosoliche
 RECETTORI INTRACELLULARI

"  Trasducono il segnale portato da ormoni e da altri

mediatori lipofilici (ormoni steroidei e tiroidei, acido
retinoico, vitamina D, ecc)
"  Interagiscono con il genoma, modificando l’espressione
genica e quindi la composizione proteica della cellula
Tipi di RECETTORI
 Sistemi di modulazione del segnale

Oltre a sistemi di attivazione recettoriale e di amplificazione del

segnale sono presenti meccanismi di interruzione del segnale

• Autoregolazione del rilascio del neurotrasmettitore

(feedback negativo)

Questo meccanismo si realizza mediante recettori presinaptici che

possono essere controllati dallo stesso neurotrasmettitore
(autorecettori) o da un neurotrasmettitore differente (eterorecettori)

• Sistemi di recupero del neurotrasmettitore

• Sistemi enzimatici preposti alla degradazione

• Desensitizzazione recettoriale
(in recettori accoppiati alla G-protein)
 Sistemi di modulazione del segnale

La desensitizzazione può essere:

•  omologa (specifica per un recettore) oppure eterologa (non

specifica);
•  rapida (~ 20 minuti) oppure lenta (giorni);
•  perdita funzione recettoriale (uncoupling) o con diminuzione dei
recettori (down-regulation)
 •  Uncoupling del recettore (desensitizzazione rapida)

La fosforilazione non altera la capacità del recettore di attivare la

G-protein ma aumenta l’affinità del recettore fosforilato per la
proteina β-arrestina che inibisce l’interazione del recettore
con la G-protein determinando il disaccoppiamento).
 •  Uncoupling del recettore (desensitizzazione lenta)

Molti sistemi recettoriali sono fosforilati dai loro stessi enzimi

effettori PKA e PKC

Questo tipo di fosforilazione è un feedback diretto negativo che al

tempo stesso sopprime l’attivazione dell’enzima effettore PKA.

Questo meccanismo di desensitizzazione è eterologo in quanto

l’attivazione di PKA o PKC è sufficiente a determinare la
fosforilazione del recettore.

La desensitizzazione da PKA è più lenta ma è molto più sensibile alla

concentrazione di agonista.
 Agonisti e Antagonisti
Agonista endogeno Farmaco Farmaco
(Ormone, Agonista Antagonista
neurotrasmettitore, ecc)

Risposta Nessuna
biologica Risposta
Si definisce AGONISTA un farmaco che si lega ad un recettore e genera
una risposta biologica. Generalmente un agonista riproduce gli effetti
dei ligandi endogeni.
Un ANTAGONISTA è un farmaco che interagendo con un recettore non
produce da solo alcuna risposta ma modifica l’interazione dell’agonista
con il recettore diminuendone la risposta.
 Attivazione dei recettori: valutazione degli agonisti

Teoria di Clark per l’interazione farmaco-recettore

L’assunzione più importante di questa teoria è la proporzionalità

lineare tra la risposta provocata e il numero di recettori occupati.
[R] [F]
R+F RF all’equilibrio: KD =
[RF]
Ne consegue che:
•  La risposta massima (Emax) si ottiene con l’occupazione di tutti i
recettori
•  La risposta osservata (E) ad una data concentrazione di farmaco
([F]) corrisponde all’occupazione dei recettori all’equilibrio ([RF])

E [RF]
=
E max [R T]
 Attivazione dei recettori: valutazione degli agonisti

Dobbiamo esprimere diversamente sia [RA] che [RT] in modo tale da

poter inserire grandezze note o ricavabili sperimentalmente.

[R] [F]
poichè [R T] = [R] + [RF] e [RF] =
KD
Sostituendo avremo:
[R] [F]
E [RF] E KD
= =
E max [R T] E max [R] + [RF]

Emax [F]
che diviene: E=
K D + [F]
Si ottiene un effetto pari al 50% dell’effetto massimo quando [F]= Kd
La concentrazione di agonista che determina il 50% dell’effetto
massimo viene definita EC50.
 Attivazione dei recettori: valutazione degli agonisti
La maggior parte delle interazioni farmaco-recettore può essere
descritta con un’equazione analoga all’equazione di Michaelis-
Menten usata per descrivere le interazioni enzima-substrato

Relazione teorica tra concentrazione del farmaco e concentrazione del

complesso farmaco-recettore (FR) secondo la teoria dell’occupazione.
Emax

• L’interazione farmaco recettore è

saturabile
Effetto %

Emax [F]
E= • Il legame tra il Farmaco e Recettore
K D + [F] aumenta all’aumentare della dose.
 Attivazione dei recettori: valutazione degli agonisti

Esprimendo la concentrazione del farmaco in scala logaritmica:

Effetto %

• la curva dose-risposta sigmoide è lineare tra 20 e 80% dell’effetto

•  il punto di flesso corrisponde alla KD

 Attivazione dei recettori: valutazione degli agonisti
Per la teoria di Clark quindi KD = EC50.

Cioè la costante di dissociazione di un agonista KD può essere

calcolata direttamente dalla curva dose risposta.

EC50
EC50

La teoria di Clark non può spiegare gli agonisti parziali né gli

antagonisti.
 Attivazione dei recettori: valutazione degli agonisti

Teoria di Ariëns La risposta biologica dipende da due fattori:

Affinità
E’ la capacità di un farmaco di legarsi al recettore ed è espressa
dalla costante di dissociazione KD

Attività intrinseca
E’ la capacità del farmaco di indurre una risposta biologica (α)
 Attivazione dei recettori: valutazione degli agonisti

EA α [A]
La risposta biologica allora sarà: =
E max KA + [A]

Secondo questa teoria, fermo restando che la risposta biologica

dipende ancora dal numero di recettori attivati, l’interazione viene
studiata sotto due aspetti:

affinità (capacità di legare il recettore).

attività (capacità di indurre una risposta biologica).

Attivazione dei recettori: valutazione degli agonisti

In base all’attività intrinseca i farmaci sono classificati in:

Agonisti pieni: Attività intrinseca (α) = 1

Antagonisti: Attività intrinseca (α) = 0

Agonisti parziali: Attività intrinseca (α) compresa tra 0 e 1

NB: Alta affinità!!!

 Attivazione dei recettori: valutazione degli agonisti

Possiamo determinare anche di un agonista parziale la KD e definire la

sua attività intrinseca disponendo di un agonista pieno:

A= agonista pieno
EmaxA
B= agonista parziale

EmaxB Emax B
KDA
α=
Emax A

KDB

Dalle teorie di Clark e Ariëns si evince che la risposta massima si

ottiene quando tutti i recettori sono occupati ma questo non è sempre
e comunque vero…(vedi recettori di riserva)
 Attivazione dei recettori: valutazione degli agonisti

Agonisti inversi:
!  hanno azione opposta a quella degli agonisti e riportano il
sistema recettoriale costitutivamente attivato allo stato
basale.
!  Possono essere utili in alcune malattie caratterizzate da
anomalie funzionali del recettore dipendenti, ad esempio, da
mutazioni

Modello recettoriale a due stati:

R R* R: recettore inattivo
R*: recettore attivo

FR FR* FR FR* Agonista

FR FR* Agonista inverso

Attivazione dei recettori: modello recettoriale a due stati
Curve dose-risposta di un agonista pieno, parziale,
inverso e di un antagonista
 Attivazione dei recettori: attività degli antagonisti
Farmaco Farmaco
Antagonismo competitivo Agonista Antagonista
Gli antagonisti possono interagire con lo stesso sito
dell’agonista e quindi competere nell’interazione
con il recettore.
Effetto percentuale

Se in presenza di un antagonista si
osserva uno spostamento parallelo
verso destra, senza che venga
alterata la risposta massima
dell’agonista, l’antagonismo viene
definito sormontabile.
log [agonista]
 Attivazione dei recettori: attività degli antagonisti
Farmaco Farmaco
Antagonismo competitivo Agonista Antagonista
Gli antagonisti possono interagire con lo stesso sito
dell’agonista e quindi competere nell’interazione
con il recettore.
Effetto percentuale

Se in presenza di un antagonista si
osserva una diminuzione della
risposta massima dell’agonista,
l’antagonismo viene definito
insormontabile.
.
log [agonista]
 Attivazione dei recettori: attività degli antagonisti

Effetto percentuale

Effetto percentuale
log [agonista] log [agonista]

Generalmente l’antagonismo sormontabile è legato all’antagonista

competitivo mentre quello insormontabile a quello irreversibile.

In realtà ci sono situazioni intermedie:

a basse dosi l’antagonista irreversibile può dare un antagonismo

sormontabile (vedi recettori di riserva)
 Attivazione dei recettori: recettori di riserva

In alcuni tessuti veniva evocata la risposta massima con agonisti pieni.

In presenza di un antagonista irreversibile veniva osservato il seguente
comportamento:
Effetto percentuale (%)

Invece di osservare subito la risposta

dell’antagonismo non competitivo
(curve rosse) si ha lo spostamento
parallelo verso destra delle curve
dose risposta (curve nere).

log [agonista]
 Attivazione dei recettori: recettori di riserva

Questo si spiega con il blocco di un gran numero di recettori prima di

ottenere la risposta attesa. Secondo Clark ed Ariëns questo non sarebbe
spiegabile.

Questi risultati vengono spiegati postulando la presenza nel tessuto dei

recettori di riserva.

I recettori di riserva spiegano l’ottenimento della risposta massima di

un agonista ad una concentrazione al di sotto di quella necessaria ad
occupare tutti i recettori.

Ricordando quanto prima detto per la determinazione della KD degli

agonisti (KA = EC50) si può dedurre che tale stima non è più corretta in
presenza di recettori di riserva.
 Calcolo della costante di dissociazione degli antagonisti

Le interazioni dell’agonista e dell’antagonista competitivo, all’equilibrio,

dipendono:
- dalle rispettive costanti di dissociazioni (KA e KB)

A+B+R
KA KB

R—A+B R—B+A

- dalle concentrazioni (aumentando la concentrazione di agonista, si

può superare l’occupazione da parte dell’antagonista).
 Calcolo della costante di dissociazione degli antagonisti

Schild ha verificato che le curve dose risposta dell’agonista in

presenza di dosi crescenti di antagonista risultano spostate verso
destra in modo parallelo.
Le risposte ottenute con un agonista in assenza o in presenza di un
antagonista risulteranno uguali solo quando l’agonista occuperà lo
stesso numero di recettori.

Effetto percentuale (%)

log [agonista]
La frazione recettoriale occupata da un agonista [RA] / [RT] in
presenza di un antagonista può essere così calcolata:
[RT] = [R] + [RA] + [RB]
[R] ed [RB] si possono ricavare dai rispettivi equilibri:

[B] [R] [B] [R]

KB = da cui [RB ] =
[RB] KB
[A] [R] KA [RA]
KA = da cui [R] =
[RA] [A]

sostituendo avremo:

KA [RA] [B] KA [RA]

[RT ] = + [RA] +
[A] KB [A]
Mettendo in evidenza [RA]:

KA KA [B]
[RT ] = [RA] +1+
[A] KB [A]

la frazione recettoriale occupata dall’agonista sarà:

[RA] 1
=
[RT ] KA KB + KB [A] + KA [B]

K B [A]

Dividendo tutto per KB e mettendo in evidenza KA avremo:

 [RA] [A]
=
[RT ] [B]
KA 1+ + [A]
KB

[A] è la concentrazione dell’agonista in presenza dell’antagonista [B]

Per [B] = 0 avremo: [RA] [A]

=
[RT ] [A] + KA

In presenza di [B], l’agonista darà la stessa risposta che si otterrebbe in

assenza di [B] solo quando verranno occupati lo stesso numero di
recettori.
Definiamo [A] la concentrazione di agonista che fornisce la stessa
risposta di [A] in assenza di antagonista:

[RA] [A]
=
[RT] [B]
KA 1+ + [A]
KB

A questa concentrazione di [A] il numero di recettori occupati è lo

stesso di quando non è presente l’antagonista, quindi avremo
eguagliando le due equazioni:
[A] [A]
=
KA + [A] [B]
KA 1+ + [A]
KB
 [A] [B]
risolvendola in funzione di [A] / [A]: -1=
[A] KB
Ponendo [A] / [A] = X e passando ai logaritmi avremo:
log (X - 1) = log [B] - log KB

Riportando in grafico (Analisi di Schild) avremo:

log (X - 1)
Quando la retta ha pendenza = 1
l’antagonismo è competitivo

Se X = 2 avremo che
(n = 1)
log KB = log [B]
log [B]
L’intercetta viene chiamata pA2 e rappresenta il logaritmo negativo
della concentrazione di antagonista competitivo che determina il
raddoppiamento della concentrazione dell’agonista per l’ottenimento
del medesimo effetto in assenza di antagonista.

pA2 = - log KB

Solo quando la regressione di Schild è lineare ed ha uno slope = 1

pKB = pA2
 Farmaco Farmaco
Antagonisti allosterici Agonista Antagonista

Un antagonista viene definito allosterico quando

interagisce con un sito differente ma connesso al
sito dell’agonista.

Gli antagonisti allosterici spostano, come gli antagonisti competitivi,

verso destra e parallelamente le curve dose risposta degli agonisti.
Inoltre possono dare nella regressione di Schild un valore pari a 1.
Però per concentrazione elevate si ha una marcata deviazione
dall’antagonismo competitivo (saturazione del sito allosterico).

log (x - 1)

log KB

log [B]
 Come evidenziare un antagonismo allosterico?

Si possono effettuare esperimenti in presenza di un antagonista competitivo

noto. Se l’antagonista in esame è competitivo noteremo che l’effetto prodotto
dai due antagonisti sarà additivo.

Gli antagonisti non competitivi competono con l’agonista per lo stesso recettore
ma non per lo stesso sito.
I due siti sono tra loro indipendenti e l’inibizione provocata da B non è
influenzata dalla concentrazione dell’agonista A.
La curva dose risposta non viene spostata verso destra ma si ha un
abbassamento della risposta massima ottenibile con l’agonista.

A B C
A: nessun Antagonista

Effetto massimo
percentuale
B: Antagonista competitivo noto (S)
C: S+Antagonista competitivo D
D: S+Antagonista non competitivo

log [agonista]
Un metodo semplice per calcolare la potenza di un antagonista consiste nella
determinazione della concentrazione che determina l’inibizione del 50 % della
risposta massima dell’agonista.

Tale valore viene indicato come IC50