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• Tecniche indirette
• a livello della risposta biologica: curve dose-effetto
• a livello del sito di legame: binding recettoriale
• a livello delle tappe di trasduzione: II e III messaggeri,
canali ionici aperti o chiusi
• Le tecniche dirette e le tecniche di binding consentono la
caratterizzazione delle proprietà fisico-chimiche e
localizzazione di un recettore senza evidenziarne l’effetto
biologico
• Il concetto di recettore nasce all’inizio del 900
con Erlich e Langley
• in seguito all’osservazione che un farmaco come
la nicotina applicata sul muscolo era in grado di
indurre un effetto analogo a quella della
stimolazione di nervi parasimpatici. L’effetto del
farmaco si aveva anche dopo la completa
degenerazione del nervo ed era bloccato da una
sostanza come il curaro.
• Il curaro bloccava anche l’effetto indotto dalla
stimolazione nervosa mentre non bloccava
l’effetto di contrazione dovuto alla stimolazione
diretta del muscolo.
• Queste osservazioni portarono a pensare
all’esistenza di un sito di riconoscimento
chimicamente specifico la cui occupazione
iniziava o inibiva la risposta biologica
• Il RECETTORE propriamente detto
• È una componente proteica presente sulla membrana
cellulare o dentro la cellula capace di riconoscere e
interagire selettivamente con una macromolecola
specifica (neurotrasmettitore, ormone o farmaco)
• Sul recettore un farmaco si può comportare come
agonista attivandolo o come antagonista e cioè
legandovisi senza però causarne l’attivazione
• Non si parla di agonisti e antagonisti, ma di attivatori o
inibitori per i legami a enzimi, molecole carriers o canali
ionici
• Quando il legame di un farmaco risponde alle
caratteristiche di un legame specifico includendo la
possibilità di antagonizzarne l’effetto con un altro farmaco
questo è indice di un legame recettoriale
L’esistenza di un tessuto ad alta concentrazione di proteina, l’esistenza di ligandi selettivi, e che
potessero essere marcati con alta AS , ha consentito l’isolamento del recettore nicotinico
Le curve dose-effetto
in presenza di un
antagonista
competivo o non
competitivo sono
diverse
ANTAGONISMO COMPETITIVO
• L’antagonista si lega sullo stesso sito
dell’agonista
• L’inibizione può essere superata aumentando la
concentrazione dell’agonista
• Il complesso antagonista-recettore deve essere
dissociabile
• In presenza dell’antagonista competitivo la
curva si sposta a destra e l’affinita’
dell’agonista risulta apparentemente
diminuita
• Come si calcola l’affinità di un antagonista
• In presenza di d-tubocurarina 10-7 M l’effetto della nicotina è ridotto a
metà: occorrono concentrazioni doppie per avere lo stesso effetto:
• da 5x10-6 =5 µmoli/ litro a 10-5 = 10 µmoli/litro
• L’affinità di un antagonista è fornita dal valore di IC50: la
concentrazione molare di antagonista che riduce a metà l’effetto di
un agonista.
• Nell’esempio è 10-7 M
• L’affinità di un antagonista può anche essere fornita dal valore di pA2
• Il pA2 di un antagonista è il logaritmo negativo della concentrazione
molare dell’antagonista che riduce a metà l’effetto dell’agonista.
• Nell’esempio il pA2 dell’antagonista è uguale a 7
• Più alto è il pA2 più alta è l’affinità dell’antagonista
• Altra misura di affinità dell’antagonista è
data dalla KB che si ottiene
dall’equazione di Shild che viene plottata
in in grafico in cui (r-1) rappresenta il
numero di volte meno 1 di cui devo
aumentare la quantità di agonista in
presenza di una determinata
concentrazione di antagonista per avere lo
stesso effetto.
• A parità di concentrazione di agonista, possono
essere paragonati antagonisti diversi per la loro
affinità.
• Un antagonista sarà tanto più affine quanto la sua
IC50 sarà bassa o quanto il suo pA2 sarà alto.
• Valori diversi di affinità di un antagonista in tessuti
diversi suggeriscono che siamo in presenza di
recettori diversi nei diversi tessuti.
• La valutazione della affinità di un antagonista
mediante il calcolo di IC50 o del pA2 sono utili per la
classificazione dei recettori che a sua volta è utile
per lo sviluppo di farmaci selettivi.
• L’effetto di un antagonista “di per sè” fornisce la
prova che un agonista endogeno è liberato ed ha
una azione fisiologica in un determinato tessuto,
organo, organismo agendo su recettori specifici.
ANTAGONISMO COMPETITIVO
• L’antagonista si lega sullo stesso sito dell’agonista
• L’inibizione può essere superata aumentando la
concentrazione di agonista
• Il complesso antagonista-recettore è dissociabile
• L’antagonismo competitivo è infatti reversibile
• Agonista totale 1
• Antagonista 0
• Antagonista 0
• Tecniche indirette
• a livello della risposta biologica: curve dose-effetto
• a livello del sito di legame: binding recettoriale
• a livello delle tappe di trasduzione: II e III messaggeri, canali ionici
aperti o chiusi
• Le tecniche dirette e le tecniche di binding consentono la
caratterizzazione delle proprietà fisico-chimiche e localizzazione di
un sito di legame senza evidenziarne l’effetto biologico. Identificano
così siti di legame ma non recettori propriamente detti
• RICHIESTE PER GLI STUDI DI BINDING
• avere un ligande specifico e affine
• avere un ligande che non sia metabolizzato
• avere un ligande che abbia attività specifica sufficientemente alta
•
Preparazione delle membrane
• Omogenizzazione del tessuto
• Centrifugazione 1000 x g x 20 min
• Centrifugazione 17000 x g x 30 min
• Risospensione del precipitato in una soluzione fisiologica a
composizione del liquido extracellulare
• Incubazione con un ligande radioattivo
• Filtrazione o centrifugazione del tessuto
• Aggiunta del liquido di scintillazione
• Lettura della radioattività al contatore di scintillazione
Dalla elaborazione matematica
dei dati di binding con lo
Scatchard plot si ottiene una
retta che alla intersezione con
l’asse delle ascisse dà il valore di
Bmax che esprime in moli/ mg di
proteina di tessuto il numero dei
recettori e
dalla pendenza della retta si
ottiene il valore di KD (costante
di equilibrio o di dissociazione) in
concentrazione molare che
esprime l’affinità dell’agonista
per il recettore
L’inverso della KD fornisce la
costante di affinità
• Le stesse curve possono essere ottenute con tecniche di
• Autoradiografia “in vitro” ad “in vivo”
• Fettine di organo
• Incubate con un ligande radioattivo
• Seccate sotto corrente dia aria secca
• Esposte a emulsione fotografica che è impressionata
dalla radiattività per circa 6-8 settimane a 4° C
• Viene sviluppato l’autoradiogramma con lettura al
microscopio su griglia calibrata che consente la
numerazione dei grani autoradiografici
• PET “positron emission tomography”
• Nell’animale “in vivo” vengono iniettati ligandi
radioattivi che sono isotopi emittenti positroni a
corto tempo di dimezzamento
• La distribuzione della radioattività è elaborata da
uno scanner di immagini computerizzato che
trasforma la radioattività in densita’ di colore
• Altre tecniche che consentono la determinazione quantitativa e
qualitativa di proteine (recettori o enzimi) sono le tecniche di
immunoistochimica
• Vengono preparati usualmente nel coniglio o nel topolino
anticorpi contro un determinato recettore (o enzima)
• Il tessuto solitamente fettine di organo sono incubate con
anticorpi e il complesso proteina –anticorpo che si forma viene
colorato con tecniche istochimiche di colorazione
• Vengono preparati usualmente nel coniglio o nel topolino
anticorpi contro un determinato recettore (o enzima)
• Il tessuto, solitamente fettine di organo, sono incubate con
anticorpi e il complesso proteina –anticorpo che si forma viene
colorato con tecniche istochimiche di colorazione e può essere
quantificato con appositi programmi al computer. Può inoltre
qualitativamente essere identificato su tipi cellulari diversi.
• Tecniche di colocalizzazione con anticorpi diversi usati
contemporaneamente (per esempio contro un recettore e contro
un epitopo di un determinato tipo cellulare), permettono di
definire su quale tipo di cellula quel recettore è presente.
• Da qui figure tolte
• Come si calcola l’affinità di un antagonista
• In presenza di propanololo 10-7 M l’effetto dell’isoprenalina è ridotto a
metà: occorrono concentrazioni doppie per avere lo stesso effetto:
• da 5x10-6 =5 µmoli/ litro a 10-5 = 10 µmoli/litro
• L’affinità di un antagonista è fornita dal valore di IC50: la
concentrazione molare di antagonista che riduce a metà l’effetto di
un agonista.
• Nell’esempio è 10-7 M
• L’affinità di un antagonista può anche essere fornita dal valore di pA2
• Il pA2 di un antagonista è il logaritmo negativo della concentrazione
molare dell’antagonista che riduce a metà l’effetto dell’agonista.
• Nell’esempio il pA2 dell’antagonista è uguale a 7
• Più alto è il pA2 più alta è l’affinità dell’antagonista