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FARMACODINAMICA

E’ quella disciplina che studia che cosa fa il


farmaco al corpo
Cioè studia il meccanismo d’azione dei farmaci
Capire come funziona un farmaco è utile per:
1) capire la fisiopatologia dell’organismo e in questo
caso il farmaco è utilizzato come “tool”
2) per il “design “ di nuovi farmaci più potenti e/o
selettivi.
In questo caso il farmacologo collabora con il
chimico farmaceutico e all’industria è lasciato il
compito di produrli
La maggior parte dei farmaci per esplicare la sua
azione deve legarsi a componenti specifiche
cellulari di natura proteica dell’organismo.
Capire come l’associazione del farmaco al suo sito
di legame porti ad una risposta biologica significa
capire il meccanismo d’azione dei farmaci.

Siti proteici bersaglio del farmaco sono:


recettori
enzimi
molecole carriers
canali ionici

Altri legami a proteine come le proteine del plasma


restano senza effetto biologico. In tal caso si
definisce la proteina come molecola accettrice e il
legame non specifico
• I farmaci possono agire con
• azioni di tipo specifico (legame a strutture
proteiche) sono caratterizzate:
• da specificità chimica
• da specificità biologica
• da alta potenza: il farmaco è attivo nell’ordine del
10-8 moli/litro
• saturabilià
• La specificità è reciproca:
• classi specifiche di farmaci riconoscono certe
proteine e queste riconoscono solo quella classe
di farmaci
• azioni di tipo aspecifico sono caratterizzate :
• da assenza di specificità chimica. Molecole
organiche diverse come cloroformio o anestetici
generali possono funzionare in modo simile
• da bassa potenza: il farmaco è attivo nell’ordine
di 10-2 moli/litro
• Metodi di studio dei recettori
• Tecniche dirette
• 1) isolamento
• 2) clonazione

• Tecniche indirette
• a livello della risposta biologica: curve dose-effetto
• a livello del sito di legame: binding recettoriale
• a livello delle tappe di trasduzione: II e III messaggeri,
canali ionici aperti o chiusi
• Le tecniche dirette e le tecniche di binding consentono la
caratterizzazione delle proprietà fisico-chimiche e
localizzazione di un recettore senza evidenziarne l’effetto
biologico
• Il concetto di recettore nasce all’inizio del 900
con Erlich e Langley
• in seguito all’osservazione che un farmaco come
la nicotina applicata sul muscolo era in grado di
indurre un effetto analogo a quella della
stimolazione di nervi parasimpatici. L’effetto del
farmaco si aveva anche dopo la completa
degenerazione del nervo ed era bloccato da una
sostanza come il curaro.
• Il curaro bloccava anche l’effetto indotto dalla
stimolazione nervosa mentre non bloccava
l’effetto di contrazione dovuto alla stimolazione
diretta del muscolo.
• Queste osservazioni portarono a pensare
all’esistenza di un sito di riconoscimento
chimicamente specifico la cui occupazione
iniziava o inibiva la risposta biologica
• Il RECETTORE propriamente detto
• È una componente proteica presente sulla membrana
cellulare o dentro la cellula capace di riconoscere e
interagire selettivamente con una macromolecola
specifica (neurotrasmettitore, ormone o farmaco)
• Sul recettore un farmaco si può comportare come
agonista attivandolo o come antagonista e cioè
legandovisi senza però causarne l’attivazione
• Non si parla di agonisti e antagonisti, ma di attivatori o
inibitori per i legami a enzimi, molecole carriers o canali
ionici
• Quando il legame di un farmaco risponde alle
caratteristiche di un legame specifico includendo la
possibilità di antagonizzarne l’effetto con un altro farmaco
questo è indice di un legame recettoriale
L’esistenza di un tessuto ad alta concentrazione di proteina, l’esistenza di ligandi selettivi, e che
potessero essere marcati con alta AS , ha consentito l’isolamento del recettore nicotinico

Lee et al. 1970


• Il primo recettore isolato è stato il recettore nicotinico da Lee e colleghi nel 1970
grazie a:
• alla presenza del recettore in alta quantità nell’organo elettrico della Torpedine
• alla disponibilità di antagonisti come la alfa bungarotossina ( derivata dal serpente
Bungarus multicintus, una specie di cobra, ed altre alfa tossine derivate dal serpente
Naia- Naia che erano state marcate con alta attività specifica
• Nei processi di estrazione di un recettore se ne perdono le capacità di valutarne la
risposta biologica.
• Un recettore è proprio definirlo quando si è sicuri che esso media una risposta
biologica. Altrimenti è corretto definirlo sito di legame.
• Tecniche di inclusione dei recettori in liposomi: membrane di lecitine che trattate con
ultrasuoni formano dei sacchetti artificiali in cui è possibile includere componenti
essenziali della cellula, piu’ di recente tecniche di incorporazione dei recettori clonati
in oociti o di transfezione consentono di studiarne:
• 1) le caratteristiche di legame con il farmaco
• 2) la risposta biologica che rimane poi da essere verificata sull’organo
• Oggi i recettori si clonano:
• 1) in grandi quantità dopo isolamento
• 2) si ottengono da “libraries” di DNA
• La identificazione e classificazione dei recettori è utile per lo sviluppo di
composti dotati di specificità che possono essere selettivi su determinati
tessuti ed organi e non altri
• Nonostante “in vivo” la concentrazione del
farmaco sia soggetta a modifiche nel
tempo diversamente da quello che
avviene “in vitro”, la dinamica
dell’interazione fra farmaco e recettore
descritta sulla base degli studi “in vitro”
approssima quello che succede “in vivo”
• Clark 1920

• Interazione farmaco-recettore è regolata dalla legge di azione di


massa

• Come la concentrazione del prodotto è proporzionale alla


concentrazione dei reagenti
• [A] + [B] ----[AB] K1 = costante di associazione
---- K2 = costante di dissociazione
• Così il legame di un farmaco al recettore è proporzionale alla
quantità di farmaco (D= Dose) e al numero dei recettori (R)
• [D] + [R] ---- [DR] K1 = costante di associazione
• ---- K2 = costante di dissociazione
La EC50 misura l’affinità del’affinità dell’agonista per il
recettore
• Teoria dell’occupazione recettoriale di Clark
• L’effetto di un farmaco è proporzionale al
numero di recettori occupati dal farmaco e
l’effetto massimo di un farmaco risulta quando
tutti i recettori sono occupati per cui aumentando
la concentrazione del farmaco non si avrà un
aumento della risposta
• Teoria poi rielaborata da Stephenson e Ariens
• Le curve dose-effetto usualmente
vengono espresse come curve
semilogaritmiche dove l’asse delle ascisse
è in scala logaritmica e l’asse delle
ordinate è in scala lineare. Si ottiene così
una curva sigmoide
• La curva dose-effetto si esprime normalmente in scala
semilogaritmica ottenendo una sigmoide
• In scala log la distanza fra 1 e 10 è uguale a quella fra 10 e
100, 100 e 1000……..
• La affinità di un agonista può essere espressa anche dal
pD2 che è il log negativo della concentrazione molare del
farmaco che produce metà dell’effetto massimo
• Ex: pD2 = 6
• Più alto è il pD2 più affine è l’agonista
• 1M = 1 mole/litro
• 10-3 M = 1 mmole/litro
• 10-6 M = 1 umole/litro
• 10-9 M = 1 nmole/litro
• 10-11 M = 1 pmole/litro
• 10-15 M = 1 fmole/litro
• La Kd (costante di dissociazione) si ottiene da test di elaborazione
matematica (Scatchard plot) degli studi di binding ed è la costante di
equilibrio del complesso farmaco recettore cioè la concentrazione
molare a cui metà dei recettori sono legati e metà sono liberi e
secondo la teoria di Clark si ha metà dell’effetto massimo.
• La Kd è uguale alla KA
• La KA (costante di equilibrio) di un agonista si calcola con
l’equazione di Hill-Langmour ideata nel 1905 da Hill e nel 1916 da
Lagmour.
• Dove la KA esprime la concentrazione di farmaco a cui metà dei
recettori sono legati e metà sono liberi e secondo la teoria di Clark
si ha metà dell’effetto massimo.
• L’inverso della KA e della KD esprime la costante di affinità del
farmaco per il recettore
• Quindi esprimono lo stesso concetto:
• EC50
• PD2
• KD
• KA
LEGAME DEI FARMACI AI RECETTORI:

Il legame del farmaco al recettore è regolato


dalla legge di azione di massa.
Allo equilibrio della reazione ½ dei recettori
sono occupati e si ha ½ dello effetto massimo
(secondo la teoria occupazionale di Clark)
Maggiore è l’affinità del farmaco per il recettore,
minore è la concentrazione a cui si raggiunge la
saturazione dei recettori
• CONFRONTANDO QUINDI DIVERSI
AGONISTI:
• UN FARMACO E’ TANTO PIU’ AFFINE
PER QUEL RECETTORE QUANTO PIU’
LA SUA CURVA DOSE-EFFETTO E’
SPOSTATA A SINISTRA
• Agonista: un farmaco che si lega ai
recettori con una certa affinità e
provoca una determinata risposta
biologica
• Antagonista: si lega allo stesso
recettore cui si lega l’agonista
impedendone il legame o comunque ne
impedisce l’azione
Antagonismo Farmacologico può essere competitivo o
non competitivo

Le curve dose-effetto
in presenza di un
antagonista
competivo o non
competitivo sono
diverse
ANTAGONISMO COMPETITIVO
• L’antagonista si lega sullo stesso sito
dell’agonista
• L’inibizione può essere superata aumentando la
concentrazione dell’agonista
• Il complesso antagonista-recettore deve essere
dissociabile
• In presenza dell’antagonista competitivo la
curva si sposta a destra e l’affinita’
dell’agonista risulta apparentemente
diminuita
• Come si calcola l’affinità di un antagonista
• In presenza di d-tubocurarina 10-7 M l’effetto della nicotina è ridotto a
metà: occorrono concentrazioni doppie per avere lo stesso effetto:
• da 5x10-6 =5 µmoli/ litro a 10-5 = 10 µmoli/litro
• L’affinità di un antagonista è fornita dal valore di IC50: la
concentrazione molare di antagonista che riduce a metà l’effetto di
un agonista.
• Nell’esempio è 10-7 M
• L’affinità di un antagonista può anche essere fornita dal valore di pA2
• Il pA2 di un antagonista è il logaritmo negativo della concentrazione
molare dell’antagonista che riduce a metà l’effetto dell’agonista.
• Nell’esempio il pA2 dell’antagonista è uguale a 7
• Più alto è il pA2 più alta è l’affinità dell’antagonista
• Altra misura di affinità dell’antagonista è
data dalla KB che si ottiene
dall’equazione di Shild che viene plottata
in in grafico in cui (r-1) rappresenta il
numero di volte meno 1 di cui devo
aumentare la quantità di agonista in
presenza di una determinata
concentrazione di antagonista per avere lo
stesso effetto.
• A parità di concentrazione di agonista, possono
essere paragonati antagonisti diversi per la loro
affinità.
• Un antagonista sarà tanto più affine quanto la sua
IC50 sarà bassa o quanto il suo pA2 sarà alto.
• Valori diversi di affinità di un antagonista in tessuti
diversi suggeriscono che siamo in presenza di
recettori diversi nei diversi tessuti.
• La valutazione della affinità di un antagonista
mediante il calcolo di IC50 o del pA2 sono utili per la
classificazione dei recettori che a sua volta è utile
per lo sviluppo di farmaci selettivi.
• L’effetto di un antagonista “di per sè” fornisce la
prova che un agonista endogeno è liberato ed ha
una azione fisiologica in un determinato tessuto,
organo, organismo agendo su recettori specifici.
ANTAGONISMO COMPETITIVO
• L’antagonista si lega sullo stesso sito dell’agonista
• L’inibizione può essere superata aumentando la
concentrazione di agonista
• Il complesso antagonista-recettore è dissociabile
• L’antagonismo competitivo è infatti reversibile

• Caratteristiche della curva dose-effetto:


• si raggiunge sempre l’effetto massimo
• l’affinità dell’agonista per il recettore è apparentemente
ridotta
• ANTAGONISMO NON COMPETITIVO
• In presenza di un antagonista non competitivo la interazione
farmaco-recettore non procede in base alla legge di azione di
massa: pur aumentando la concentrazione di agonista non si può
più formare un corretto legame agonista-recettore tale da portare ad
una risposta biologica uguale a prima.
• La curva dose-effetto è infatti diversa: all’aumentare della
concentrazione dell’antagonista, siccome una parte del recettori è
bloccata in maniera non dissociabile la curva si appiattisce

• Caratteristiche della curva dose-effetto


• non si raggiunge l’effetto massimo
• l’affinità dell’agonista per il recettore risulta uguale
• ANTAGONISMO NON COMPETITIVO
• I) l’antagonista si lega sullo stesso sito cui si
lega l’agonista
• L’inibizione non può essere superata
aumentando la concentrazione dell’agonista
• Il complesso antagonista-recettore non è
dissociabile: l’antagonismo è irreversibile
• II) l’antagonista si lega a un sito diverso cui
si lega l’agonista
• L’antagonismo può essere irreversibile o
reversibile
• Esempio del recettore NMDA per gli aminoacidi
eccitatori cui si legano antagonisti competitivi e non
competitivi
• I) antagonisti competitivi come l’acido 4-
aminofosfovalerico sullo stesso sito cui si lega il
glutammato
• II) a) antagonisti non competitivi come lo MK 801, lo ione
magnesio, la fenciclidina si legano dentro il canale
• b) antagonisti non competitivi come l’acido chinurenico si
legano ad un sito allosterico o modulatorio del sito di
legame cui si lega il glutammato
• Alcuni preferiscono definire come antagonismo
non competitivo solo quando l’antagonista si lega
a siti diversi a quelli cui si lega l’agonista per cui
non ci può essere competizione, ad esempio
dentro un canale o a livello dell’accoppiamento
fra recettore e proteina G

• In tal caso quando il farmaco si lega sullo stesso


sito su cui si lega l’agonista, ma l’agonista non
riesce a spostare l’antagonista, l’antagonismo
viene definito competitivo irreversibile
• Oltre l’efficacia altro parametro che
caratterizza il legame farmaco-recettore è
l’attività intrinseca o efficacia che è
misurata nella curva dose-effetto dalla
capacità dell’agonista di dare un effetto
massimale
Attività intrinseca o Efficacia

• Agonista totale 1

• Agonista parziale fra 1 e 0

• Antagonista 0

Un agonista pieno è quello che induce il 100% dell’effetto che quella


cellula, tessuto, organo può dare. Un agonista parziale non dà il
100% dell’effetto ma un effetto parziale
• Un agonista parziale può arrivare a
comportarsi come un antagonista quando
non ha attività intrinseca ed occupando il
recettore impedisce il legame dell’agonista
• Secondo la teoria di Clark, il 100% dell’effetto si
ottiene quando sono occupati il 100% dei
recettori cioè a occupazione massimale
• Viceversa è stato sperimentalmente osservato
che esistono degli agonisti che anche a
occupazione massimale dei recettori non
riescono a dare l’effetto massimo. Questi
agonisti sono definiti parziali
• Si dice che un agonista totale ed un agonista
parziale hanno attività intrinseca (Ariens) o
efficacia (Stephenson) diversa
• Se un effetto massimo si ottiene a occupazione del 20 % di
recettori, l’altro 80 % sono recettori riserva.
• Il pool di recettori è più largo di quello necessario ad evocare una
risposta massimale.
• Si introduce così il concetto di “recettori di riserva” (Stephenson
1956)
• Il significato fisiologico degli spare receptors:
• In certi organi il numero di recettori è più ampio di quello necessario
a indurre una risposta massimale.
• Questo può rispondere ad un concetto di economia per cui
l’organismo tende a risparmiare recettori che possono essere
attivati in condizioni di emergenza. Gli spare receptors costituiscono
cosi una “riserva funzionale”.
• Un fenomeno che può rendere conto dell’esistenza di recettori di
riserva è quello per cui la trasduzione di un segnale persiste più a
lungo rispetto al legame agonista-recettore per cui il segnale iniziale
è amplificato. Grazie a questa amplificazione può essere
necessario attivare solo una frazione del totale dei recettori per
evocare una risposta massimale.
• E’ possibile raggiungere la risposta
massima anche dopo aver inattivato il 50
% dei recettori
• Esempio: un blocco della trasmissione
neuromuscolare con bungarotossina si
ottiene quando sono occupati più del 50%
dei recettori, l’altro 50% sono recettori di
riserva
• Le osservazioni fatte che:
• un agonista parziale pur occupando il 100% dei
recettori non dà un effetto massimo e
• che un agonista pieno può dare il massimo di
risposta anche non occupando il 100% dei
recettori
• indicano che la teoria occupazionale dei recettori
descritta da Clark non sempre descrive il
fenomeno della interazione farmaco-recettore
• Domande che nascono sono:
• Perché un agonista occupando lo stesso
numero di recettori non dà una risposta piena e
cioè si comporta come un agonista parziale?
• Perché un farmaco legandosi agli stessi recettori
si comporta come agonista e un altro come
antagonista?
• Cosa significa efficacia in termini fisici?
-I recettori esistono in uno stato di
riposo e in uno stato attivo. Lo stato
attivo è quello che induce l’effetto
-Legando lo stesso numero di
recettori, un agonista pieno è in grado
di spostarne un maggior numero nello
stato attivo rispetto ad un agonista
parziale.
-Un agonista parziale avrà quindi
una trasduzione del segnale meno
efficace.
-La parzialità di un effetto pur a
occupazione massimale dei recettori
può essere dovuta ad un
accoppiamento del recettore con
tappe di trasduzione del segnale
meno efficaci.
-Un antagonista pur legandosi ai
recettori non sposta l’equilibrio fra lo
stato attivo e quello di riposo.
Attività intrinseca o Efficacia

• Agonista totale o pieno 1

• Agonista parziale fra 1 e 0

• Antagonista 0

Agonista inverso pieno o parziale fra 0 e -1

Un agonista pieno è quello che induce il 100% dell’effetto che quella


cellula, tessuto, organo può dare. Un agonista parziale non dà il 100%
dell’effetto ma un effetto parziale.
Agonisti inversi sono ad esempio le β carboline
• Mentre il flumazenil è un antagonista ideale a
efficacia 0
• Le βcarboline pur antagonizzando l’effetto del
diazepam, differentemente dal flumazenil, non
sono prive di effetto, ma hanno un effetto
inverso al diazepam da cui la terminologia di
agonisti inversi.
• Un agonista inverso come una βcarbolina può
essere definito un farmaco a efficacia negativa
• Le benzodiazepine sono modulatori
allosterici del recettore GABAA: aumentano
l’affinità del sito del GABA per il GABA
stesso potenziandone l’azione
• L’importanza dello sviluppo di farmaci
agonisti parziali e agonisti inversi è quella
di avere dei composti che in determinati
tessuti possano avere un effetto parziale e
in altri tessuti maggiore o pieno.
• Questo consente di poter avere sostanze
con selettività di azione e minori effetti
indesiderati
Nel modello a due stati del
recettore, l’agonista inverso
avrà così una maggiore
affinità per lo stato inattivo del
recettore
Un agonista inverso
manifesta la sua azione in
seguito a mutazioni
recettoriali sia indotte da
malattie o manipolazioni
sperimentali tali per cui anche
lo stato così detto inattivo del
recettore anche in assenza di
ligande risulta attivo. Si dice
che il recettore è in uno stato
di attivazione costitutiva. Cosi’
un agonista inverso
riducendone l’attivazione avrà
un effetto opposto a quello di
un agonista.
• Antagonismo fisiologico si esplica su siti recettoriali
diversi: per esempio due agonisti che hanno un effetto
diverso come la noradrenalina che vasocostringe per
effetto sugli αrecettori e la istamina che vasodilata per
effetto sugli H1 recettori hanno fisiologicamente effetti
antagonisti sulla pressione.
• Antagonismo chimico antagonismo non recettoriale
Esempio: il dimercaprolo chela i metalli pesanti come il
cadmio formando così un complesso inattivo riduce la
tossicità del cadmio
• Antagonismo farmacocinetico
Il fenobarbital induttore enzimatico induce un aumentato
metabolismo di se stesso e di molti altri farmaci. Per
esempio riduce l’affetto anticoagulante della warfarina
• Metodi di studio dei recettori
• Tecniche dirette
• 1) isolamento
• 2) clonazione

• Tecniche indirette
• a livello della risposta biologica: curve dose-effetto
• a livello del sito di legame: binding recettoriale
• a livello delle tappe di trasduzione: II e III messaggeri, canali ionici
aperti o chiusi
• Le tecniche dirette e le tecniche di binding consentono la
caratterizzazione delle proprietà fisico-chimiche e localizzazione di
un sito di legame senza evidenziarne l’effetto biologico. Identificano
così siti di legame ma non recettori propriamente detti
• RICHIESTE PER GLI STUDI DI BINDING
• avere un ligande specifico e affine
• avere un ligande che non sia metabolizzato
• avere un ligande che abbia attività specifica sufficientemente alta

Preparazione delle membrane
• Omogenizzazione del tessuto
• Centrifugazione 1000 x g x 20 min
• Centrifugazione 17000 x g x 30 min
• Risospensione del precipitato in una soluzione fisiologica a
composizione del liquido extracellulare
• Incubazione con un ligande radioattivo
• Filtrazione o centrifugazione del tessuto
• Aggiunta del liquido di scintillazione
• Lettura della radioattività al contatore di scintillazione
Dalla elaborazione matematica
dei dati di binding con lo
Scatchard plot si ottiene una
retta che alla intersezione con
l’asse delle ascisse dà il valore di
Bmax che esprime in moli/ mg di
proteina di tessuto il numero dei
recettori e
dalla pendenza della retta si
ottiene il valore di KD (costante
di equilibrio o di dissociazione) in
concentrazione molare che
esprime l’affinità dell’agonista
per il recettore
L’inverso della KD fornisce la
costante di affinità
• Le stesse curve possono essere ottenute con tecniche di
• Autoradiografia “in vitro” ad “in vivo”
• Fettine di organo
• Incubate con un ligande radioattivo
• Seccate sotto corrente dia aria secca
• Esposte a emulsione fotografica che è impressionata
dalla radiattività per circa 6-8 settimane a 4° C
• Viene sviluppato l’autoradiogramma con lettura al
microscopio su griglia calibrata che consente la
numerazione dei grani autoradiografici
• PET “positron emission tomography”
• Nell’animale “in vivo” vengono iniettati ligandi
radioattivi che sono isotopi emittenti positroni a
corto tempo di dimezzamento
• La distribuzione della radioattività è elaborata da
uno scanner di immagini computerizzato che
trasforma la radioattività in densita’ di colore
• Altre tecniche che consentono la determinazione quantitativa e
qualitativa di proteine (recettori o enzimi) sono le tecniche di
immunoistochimica
• Vengono preparati usualmente nel coniglio o nel topolino
anticorpi contro un determinato recettore (o enzima)
• Il tessuto solitamente fettine di organo sono incubate con
anticorpi e il complesso proteina –anticorpo che si forma viene
colorato con tecniche istochimiche di colorazione
• Vengono preparati usualmente nel coniglio o nel topolino
anticorpi contro un determinato recettore (o enzima)
• Il tessuto, solitamente fettine di organo, sono incubate con
anticorpi e il complesso proteina –anticorpo che si forma viene
colorato con tecniche istochimiche di colorazione e può essere
quantificato con appositi programmi al computer. Può inoltre
qualitativamente essere identificato su tipi cellulari diversi.
• Tecniche di colocalizzazione con anticorpi diversi usati
contemporaneamente (per esempio contro un recettore e contro
un epitopo di un determinato tipo cellulare), permettono di
definire su quale tipo di cellula quel recettore è presente.
• Da qui figure tolte
• Come si calcola l’affinità di un antagonista
• In presenza di propanololo 10-7 M l’effetto dell’isoprenalina è ridotto a
metà: occorrono concentrazioni doppie per avere lo stesso effetto:
• da 5x10-6 =5 µmoli/ litro a 10-5 = 10 µmoli/litro
• L’affinità di un antagonista è fornita dal valore di IC50: la
concentrazione molare di antagonista che riduce a metà l’effetto di
un agonista.
• Nell’esempio è 10-7 M
• L’affinità di un antagonista può anche essere fornita dal valore di pA2
• Il pA2 di un antagonista è il logaritmo negativo della concentrazione
molare dell’antagonista che riduce a metà l’effetto dell’agonista.
• Nell’esempio il pA2 dell’antagonista è uguale a 7
• Più alto è il pA2 più alta è l’affinità dell’antagonista