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LA NANOMEDICINA

Nanomedicina = rappresenta la tecnologia farmaceutica di ultima generazione. Prevede l’uso di 2


sistemi:
Prevedono l’uso di forme farmaceutiche con dimensioni INFERIORI
- Nanoparticellari,
AL MICRON. Contengono il farmaco e lo portano nel sito d’azione.
- Nanomolecolari

Viene usata nella terapia antitumorale (capillari discontinui del tessuto patologico), nelle
vaccinazioni, nei problemi cardiovascolari, problemi infettivi, polmonari, nella rigenerazione dei
tessuti e nelle patologie del SNC.
Si avvale di strumenti, in particolare di VETTORI = (nanoterapeutici), ovvero sistemi
nanoparticellari che sono matrici che contengono il farmaco e lo portano nel sito d’azione, dove
serve.
Tali vettori sfruttano le caratteristiche del tessuto per posizionarsi in quel tessuto: nei tessuti con
capillari danneggiati e la discontinuità capillare, così le particelle nanometriche posizionano il
farmaco dove si può accumulare.
Differenza tra:
 Formulazioni CONVENZIONALI:
Nel sito di somministrazione, rilasciano il farmaco (pronto rilascio o rilascio controllato). Il farmaco
raggiunge il sito d’azione tramite la circolazione sistemica.

 Formulazioni NANOTERAPEUTICHE:
La nano-particella col farmaco raggiunge il sito d’azione, solo dopo che il carrier si accumula nel
sito dove ci sono discontinuità capillari e qui viene rilasciato il farmaco.
- Il farmaco non viaggia Direttamente nel sangue,
- Il carrier viaggia nel sangue, perché viene iniettato in vena, circola e si accumula dove trova
discontinuità di capillari e rilascia il farmaco.

La formulazioni Nanoterapeutiche sono nate per l’esigenza di  abbassare gli EFFETTI TOSSICI per
farmaci che han basso indice terapeutico (dose letale vicino a quella efficace) come
chemioterapici. Sono nati per i chemioterapici, ma anche per patologie che han tai discontinuità
capillari.

DIMENSIONI E CARATTERISTICHE DI VETTORI E VARIE TIPOLOGIE:

Le dimensioni sono INFERIORI al micron più piccoli sono e più si accumulano, anche se a volte
non è sempre possibile. Le dimensioni sono da 10 a 102 nanometri, cioè 0,1 micron (tra virus e
anticorpi).

LIPOSOMI: strutture vescicolari sferiche con dimensioni nanometriche

Varie tipologie
NANOSFERE E NANOCAPSULE

SISTEMI MACROMOLECOLARI: come micelle polimeriche, coniguati farmaco-


polimero e dentrimeri a stella

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COME SI ACCUMULANO I VETTORI:
L’accumulo si basa su DISCONTINUITA’ DEI CAPILLARI che si trovano in tessuti patologici, quei
tessuti con barriera endoteliale dei capillari alterata (divide compartimento plasmatico dai tessuti).
Si inietta il carrier nella circolazione venosa tramite Iniezione venosa questa circolazione porta:
- Carrier verso cuore,
- Poi ai polmoni,
- Ritorna al cuore diventando sangue arterioso,
- Poi abbiamo l’Aorta che porta sangue nell’organismo.

Il vettore circola d’appertutto e trova discontinuità capillari e si accumula lì. Per accumularsi tal
carrier deve avere dimensioni INFERIORI ALLE DISCONTINUITA’ (0,2 micron).
- Se noi abbiamo vettore di dimensioni inferiori a 0,1 micron Buone probabilità
d’accumulo,
- Più piccoli sono vettori e meglio è l’accumulo,
- Se il vettore ha dimensioni maggiori a 0,1 micron le discontinuità sono troppo piccole e
non si permette il passaggio dal compartimento plasmatico al tessuto.

Effetto COLLATERALE di tali carrier è di dare accumulo non solo nei siti patologici con di
scontinuità capillari, ma anche nei siti NON patologici con discontinuità naturali come Midollo
Osseo, Fegato e Milza (contengono già discontinuità fisiologiche). Nel caso di tali tessuti posso
sfruttare i vettori per veicolare il farmaco nel MO, Milza e Fegato che presentano magari
patologie.
DIREZIONAMENTO DEI CARRIERS, OVVERO IL TARGETING:
Tecnica con cui posiziono i vettori in alcuni organi e tessuti. Esistono 3 categorie di direzionamento
del carrier:
1. Targeting Passivo (si basa su dimensioni vettore che passa le discontinuità e rilascia il
farmaco senza intervento) suddiviso in:
a. Targeting polmonare,
b. Generale,
c. Chemioembolizzazione
2. Targeting Attivo (prevede sulla superficie un residui
direzionante che si lega al tessuto bersaglio,
aumentando l’efficienza di e l’accumulo)
3. Targeting sensibile agli stimoli (prevede il rilascio del
farmaco in seguito a destabilizzazione della matrice per stimoli esterni o interni).

TARGETING PASSIVO:
E’ una tecnica di posizionamento dei vettori nell’organo/tesssuto tramite una via di
somministrazione intravenosa. Si posizionano i vettori nel tessuto patologico dove ci dono
discontinuità, ma il problema è l’effetto collaterale visto prima. Si devono costruire vettori al
massimo di 0,1 micron, altrimenti non va bene.

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La differenza con il polmonare sono le dimensioni. Poi nel targeting passivo abbiamo LA
FUORIUSCITA DEL VETTORE dal compartimento plasmatico, perché si basa sulle discontinuità dei
capillari, il vettore ESCE.
Viene chiamato anche TARGETING PASSIVO DOVUTO ALL’EFFETTP EPR
(= aumentata permeabilità e ritenzione) i tessuti tumorali, infiammati,
infartuati presentano discontinuità, per cui ho:
- Aumentata permeabilità capillare: dovuta a discontinuità capillari,
- Aumentata Ritenzione: dovuta a diminuzione del drenaggio
linfatico,
- Abbassamento del pH.

Perché il vettore viene ritenuto in esso, perché il DRENAGGIO LINFATICO


NON FUNZIONA. L’effetto EPR è tipico dei tessuti tumorali, infiammati e infatuati, tessuti con
patologie che alterano le condizioni fisiologiche.

 Targeting Polmonare:
I polmoni han diametro massimo di 7 micron. Andando a preparare vettori di 7-8 micron, questi
carrier passano ma a livello polmonare si bloccano, perché le dimensioni dei capillari sono più
piccole. Il concetto è bloccarlo in un organo o tessuto.
Inoltre il vettore NON esce e rimane intrappolato quindi nella discontinuità capillare, così rilascia
il farmaco in seguito a degradazione o rilassamento. In questo modo il farmaco va a finire nei
tessuti circostanti e l’azione terapeutica è a livello Polmonare.

 Chemioembolizzazione:
I vettori si preparano con dimensioni più grandi per bloccarli nel
tessuto di una patologia. Il vettore è messo nelle arterie
direttamente di tal tessuto con CATETERE e non più tramite
iniezione venosa, in uno specifico tessuto che può essere tumorale
piuttosto che infettivo o infiammatorio.
- Individuo il vaso venoso vicino alla massa tumorale,
- Inserisco catetere con il vettore,
- Chemio-embolizzazione si posizionano nelle arterie più piccole e embolizzo, cioè
BLOCCO il flusso sanguigno, ma allo stesso tempo ho il rilascio del farmaco. Così ho un
Blocco del supporto nutritizio di ossigeno della massa tumorale per dare origine alla cura
data dal rilascio del farmaco, chemioterapia e embolizzazione (blocco nutrimento) per
originare l’eliminazione della massa tumorale o colonia batterica.

TARGETING CHE RISPONDE AI STIMOLI:


Si ha sempre un targeting passivo (diametro <0,1 micron), cioè accumulo del
vettore sfruttando le discontinuità arricchito con altri fattori, cioè è sensibile a
stimoli. Stimoli come variazioni pH, variazioni di temperatura o presenza di
enzimi. Sono presenti vettori, contenenti il farmaco, con dimensioni IN MODO
DA SUPERARE le discontinuità capillari dove si accumulano.

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Questi rispondono a stimoli che possono essere esterni rilassandosi e aumentandone l’efficienza di
rilascio. E’ comunque sempre un targeting Passivo.
Abbassamento pH: fa si che il materiale diventi instabile e rilascia il farmaco. Presenza enzimi:
come enzimi proteolitici, danno degradazione matrice e il vettore quindi con tali enzimi viene a
essere degradato e rilascia.

 Materiali Sensibili Al pH:


I Materiali sensibili al pH sono materiali che presentano una Matrice
Polimerica che contiene polimeri con unità ripetute con la presenza di 2
legami:
- IDRAZIONE –C=N-NH2 Il legame Idrazone a pH da 6 a 5 idrolizza
per attacco dell’acqua originando:
o Carbonile C=O,
o Idrazina N-N.
- ACETALE (ha struttura R-C-OR (2 legami eteri con 2 R diversi)-H Tali legami si trovano in
polisaccaridi come amido e cellulosa. Si idrolizzano per rottura del ponte O che aveva 2
molecole di glucosio con formazione:
o Alcol R-OH,
o 2 Gruppi ETERI.

Tutte le volte che c’è un materiale con questi legami utilizzato per costruire una matrice per il
direzionamento sensibile agli stimoli. Gli stimoli che dan rilascio del farmaco sono abbassamento
del pH che IDROLIZZA IL MATERIALE così si ha il rilascio del farmaco, perché la matrice viene
destabilizzata.

 Materiali sensibili alla Temperatura:


2 Tipologie di materiali:
- LIPOSOMI= formati da fosfolipidi che han transizione di fase (diventano più FLUIDI a 38°C)
sopra i 37°C. La parete dei liposomi è formata da Doppio strato fosfolipidico che a T > 37°C
si destabilizzano, quindi la parete dei liposomi si Rompe e il farmaco esce. (Quando
diventano fluidi, diventano permeabili al farmaco e esce).
- PNIPA (Poli-N-Isopropil-Acrilamide) = polimeri costituiti da catena carbonio lineare con
gruppi COH ogni 2 carboni. La catena è C-C-C-O-NH2. All’aumentare della temperatura,
questo materiale PRECIPITA e rilascia il farmaco, mentre al diminuire temperatura
SOLUBILIZZA. Si comporta al contrario degli altri materiali. Ha temperatura di transizione
intorno a 32°C, per cui se si aumenta sopra i 38-39°C precipita. A 37°C tal sistema è
solubilizzato e disteso creando corona che circonda il farmaco tipo micelle, ma
all’aumentare della temperatura precipita collassando tutta la struttura, ovvero la micella
si contrae su sé stessa e il farmaco viene schizzato fuori. Il meccanismo di rilascio avviene
per CONTRAZIONE, il contrario di disaggregazione: il materiale implode, rilasciando il F.

 Materiali sensibili agli Enzimi:


Gli enzimi sovraespressi nei tessuti patologici han lo scopo di rimodellare il tessuto:
- Proteasi,

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- Metallo proteasi (lavorano con metalli come zinco),
- Fosfolipasi (dan idrolisi fosfolipidi),
- Glicosidasi (idrolisi legami glicosidici).

Usando tali materiali ottengo DEGRADAZIONE PIU’ SPINTA e


FAVORITA nei tessuti che sovraesprimono tali enzimi
concetto di rilascio stimolato da enzimi.

TARGETING, DIREZIONAMENTO ATTIVO:


E’ un perfezionamento del passivo, la base è la stessa. Sono presenti liposomi/vettori, contenenti il
farmaco, han dimensioni inferiori ai 0,1 micron da passare TRAMITE le discontinuità capillari e da
accumularsi nel tessuto patologico. In più han sulla superficie di questi vettori dei RESIDUI
DIREZIONANTI= molecole che sfruttano la presenza di RECETTORI specifici sulla superficie di
cellule dei tessuti patologici e presentano una SOVRAEPSRESSIONE di certi recettori rispetto ai
tessuti sani. Riconoscono il tessuto e si legano alla superficie, così si aumenta l’accumulo e la
captazione. Con questi ricettori vado a trovare la SPECIFICITA’ in un organo e tessuto.
Rispetto al targeting passivo ho un Effetto SUPERIORE:
- Accumulo superiore perché si legano ai tessuti.
- Captazione maggiore in quanto vengono risucchiati tali residui dal circolo sanguigno.
Aumenta la specificità in un organo e tessuto.

Es: doxorubicina legata al galattosio, perché nel fegato ho tali recettori sovraespressi.
Senza il residui, il farmaco può tornare indietro. Con l’attivo, il vettore si accumula ma NON torna
indietro.
I Recettori sovraespressi nei tessuti dove vogliamo direzionamento sono GLICOPROTEINE = han
parte oligosaccaridica e una parte proteica. Si legano a residuo direzionante che si trova sul
liposoma o sulla nanoparticella (vettore).
Nanoparticella che contiene il farmaco + residuo direzionante, negli altri ho solo la nanoparticella
che è libera possono rispondere anche agli stimoli e rilasciano più in fretta. Il residuo si lega al
recettore che si lega alla superficie della particella ed è specifico per tal recettore.

TIPOLOGIE DI RESIDUI PER IL TARGETING PASSIVO:


I Residui si chiamano “Ligandi” = qualcosa che legano il recettore che si trovano sulla cellula che
presenta la patologia.
 1° Gruppo sono le VITAMINE:
Sono piccole molecole a basso PM. Come Acido Folico e Biotina (residui direzionanti) che
riconoscono recettori specifici sovrespressi a livello della superficie delle cellule tumorali e si
attaccano. Legandosi alla superficie, blocca.

 2° Gruppo sono CARBOIDRATI:


Ricorda Acido Ialuronico e Mannnano.
- L’Acido Ialuronico = trova recettore sulle cellule tumorali e su cellule di tessuti infiammati.
Il recettore si chiama CD44 che serve per la rigenerazione del tessuto quindi nelle
patologie (infiammatorie e tumorali) ed è sovra-espresso. Si ottiene direzionamento attivo

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perché così si usa l’acido come residuo che riveste la nanoparticella contenente il farmaco,
esso si lega al CD44 e si ottiene direzionamento attivo.
- Mannano = è oligosaccaride del mannosio. Trova i suoi recettori nelle cellule dei sistema
immunitario (fagociti). Questi fagociti aumentano in caso di patologie (infiammazione o
tumore). Questo direzionamento non è diretto alle cellule del tessuto, ma alle cellule
immunitarie andate ad accumularsi nel tessuto ed è un modo per aumentare la
concentrazione del farmaco nel tessuto in sede di patologia (incremento macrofagi, cellule
dentritiche).
 3° Gruppo sono PROTEINE:
Le proteine riconoscono recettori sovraespressi su tessuti tumorali o infiammati.
 Transferrina = riconosce recettore transferrina (trasporta ioni ferro per metabolismo
cellulare) sovraespresso nei tessuti. In caso di proliferazione cellulare (patologie tumorali e
infiammatorie), c’è aumento di questi recettori. Se la lego al vettore direzionamento
attivo, perché aumento la concentrazione del vettore su tal tessuto.
 VEGF (fattori crescita endoteliale e vascolare) = “Vascular Epidermal Growth Factor” Si
lega al recettore e sono espressi nel tessuto tumorale. Questi residui si legano a recettori
specifici che servono a stimolare la proliferazione dei vasi, si direziona il sistema vettore +
residuo verso il tessuto interessato. Questi VEGF si trovano sui capillari dalla parte verso il
tessuto, essi devono rispondere a stimoli che mandano le cellule che gli dicono di
espandersi a ramo verso di loro.
 Integrine = si legano a proteine con sequenza RGD (Arginina-Glicina-Aspartato).
Sistemi per attaccare la cellula alla matrice extracellulare. Sono glicoproteine che
si attaccano alla fibronectina che ha attacco specifico per integrine (sono
sovraespresse in patologie).

 Fattori di Crescita Epidermico (Epidermal Growth Factor) = è una proteina che


si lega a recettori specifico, questi mandano segnali per la crescita in seguito a
insulti meccanici o riparazione di tessuti infiammati o presenza di batteri o
virus.

Tutte tali proteine si possono legare usando ANTICORPI MONOCLONALI (preparati in laboratorio
in modo specifico verso ogni molecola che voglio eliminare) perché gli anticorpi sono strutture
formate da zone che riconoscono certi recettori sulla superficie cellulare. Es anticorpo contro
recettore transferinna, VEGF, integrina ecc. Ci sono protocolli per cui esponendo le cellule del
sistema immunitario (linfociti B) esponendoli al recettore così’ le cellule del sistema immunitario
producono anticorpi specifici che si legano al recettore (antigene).
I recettori possono essere attaccati da ANTICORPI SPECIFICI (farmaci che terminano con MAB)
formati da:
1. Zona che lega l’antigene,
2. Zona che lega i macrofagi: cellule del sistema immunitario.

Qui gli Anticorpi non sono usati come farmaci, ma come CARRIER han nomi diversi perché
riconoscendo il recettore si legano al CARGO (nanoparticella con farmaco all’interno).

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L’anticorpo così riconosce l’antigene sulla superficie cellulare. Siccome il farmaco presente nel
cargo è presente in piccole quantità per avere azione terapeutica e ne serve poco per farlo
funzionare come residuo direzionante. Le terapie con anticorpi monoclonali sono tossici con
effetti collaterali importanti.

NUOVO APPROCCIO ALLA TECNOLOGIA DEI FARMACI- I CPP:


Oltre al cargo e residuo direzionante, si possono usare dei PEPTIDI che favoriscono la penetrazione
cellulare.
CPP (“Cell Penetrating Peptide”) = sono peptidi contenenti da 5 a 40 amminoacidi e favoriscono la
penetrazione tramite la membrana cellulare. Stimolando così la permeabilità delle membrane
cellulari formando dei PORI nella membrana o MICELLE INVERTITE. Entrano e penetrano anche
tramite un meccanismo di Endocitosi da Clatrina o Caveolina o Macripinocitosi.
Legandosi ai vettori favoriscono penetrazione del cargo/carriers + residuo direzionante così si
arriva alla cellula e si lega al recettore specifico. Il trasporto è più o meno facile, alcuni non
vengono trasportati, ma il sistema si concentra sulla cellula e prima o poi il cargo è rilasciato e il
farmaco si trova nel tessuto dove svolgere l’azione, anche se il CPP non pentra nella cellula, questo
cargo lascia il farmaco che svolge la sua azione.
Lo scopo ultimo ALTA CONCENTRAZIONE farmaco nel tessuto (dentro o fuori dalla cellula).
Mettendo oltre al cargo e residuo, il CPP- dalla situazione dove non avevo trasporto o era
minimo, passo a un trasporto all’interno della cellula. Il targeting attivo può essere reso efficace
legando “farmaco + sistema particellare + residuo direzionante” il CPP per favorire la
penetrazione.
- Il Residuo = serve a legare il sistema vettore alla superficie,
- Il CPP = a favorire penetrazione e degradare il sistema più velocemente. Quando sistema
entra nella cellula, viene degradato da tutto il compartimento dei liposomi e si accellera il
rilascio del farmaco.

I CPP sono peptidi da 5 a 40 amminioacidi. Sono carichi positivamente perché han alte
concentrazioni di 2 amminoacidi “Arginina + Lisina” e possono essere Antifilici.

Meccanismo d’azione dei CPP:


E’ legato alla carica positiva. Siccome le membrane cellulari han carica negativa e si è visto che nei
tessuti patologici la carica negativa aumenta su superficici. Avendo peptidi positivi e membrana
negativa c’è INTERAZIONE ELETTROSTATICA per spiegare tali meccanismi.

LEGAME DEL CARRIER AL CPP E AL RESIDUO DIREZIONANTE:


Ci sono “Ligandi-Etero-Bifunzionali” = sono molecole che da una parte legano il carrier e dall’altra
il residuo direzionante ecco perché sono bifunzionali.
Sono formati da Catene Lineare che funge da spaziatore e 2 molecole funzionali a cui si legano:
- Da una parte carrier,
- Dall’altra residuo direzionante.

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Ci sono 3 che sono i principali:
 MALEIMIDE:
Presenta doppio legame planare. Viene attaccata da gruppi come ammine, alcoli e gruppi SH
(tioli). Dal doppio legame, diventa un legame semplice creando “Legame Covalente”.
Questa molecola serve da Legante per gruppi nucleofili, cioè che attaccano i doppi legami. Quindi
il gruppo amminico della maleimide attacca C=C e tende così a diventare N+ per cessione del
doppietto, poi NH cedendo H e diventando Succinilimmide.

 IDROSSI-SUCCINIL-IMMIDE:
Dà attacco nucleofilo a acidi carbossilici attivati. E’ un buon gruppo uscente, perché l’ammina
attacca il C carbonilico e rimane il legame CO.

 LEGAME DISOLFURO:
Il ponte disolufuro si rompe (minor ingombro sterico), facendo uscire S con maggior ingombro.
In Base ai gruppi che presentano il carrier e residuo direzionante trovo 2 ligandi etero
bifunzionali giusti per formare il legame.
- Se il residuo presenta NH2 o OH si mette idrossicucinilmide estere e maleimide,
- Se il residuo ha SH allora si lega a meleimide, ma non idrossisuccinilimide.

La Maleimide è la più usata, in quanto è quella più facile da gestire perché lega tutti i gruppi. Tra
queste molecole è necessario mettere una catena lineare “PEG” che distanza le 2 molecole
“Spaziatore”.

Domanda Esame esempi di ligandi etere bifunzionali, a cosa servono e perché si chiamano
bifunzionali. Ricordare lo spazioatore. Quali sono i tipi di molecole che vengono legate?
Maleimide, Esteri idrossisuccinilimide e ponti disolfuro.
La Maleimide rimane, negli altri casi vengono eliminati e ponte disolfuro viene spezzato.

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FORMAZIONE DEI CARRIERS – NANOSISTEMS:
SISTEMI NANO-PARTICELLARI: forma definita e sono a forma
sferica (dimensione inferiore a 0,1 micron)

Si dividono in 2 classi
SISTEMI MACRO-MOLECOALRI: macromolecole con forma sferica e se sono
micelle han forma più o meno sferica, se sono dentriti. In ambiente acquoso,
questa macromolecola si aggrega su se stessa creando una forma che dipende
dalle caratteristiche del sistema stesso. Si han aggregati più o meno tra di loro e
ripiegati tra loro.

 SISTEMI NANO-PARTICELLARI:

Ci sono vari tipi:


1. Liposomi = sono vescicole con doppi strati fosfolipidici che membrane cellulari e creano
una sfera. Han testa Idrofila e 2 code Lipofile e creano doppio strato.
a. La superficie esterna è formata da teste idrofile,
b. All’interno = si crea una cavità interna da teste idrofile.
Al proprio interno han una o più cavità con acqua. Sono strutture formate da Bilyer
fosfolipidici con acqua o farmaci lipofili all’interno. Sono vescicole e possono incorporare
farmaci idrofili all’internoe farmaci lipofili nel bilyer. Sono sistemi semisolidi.
2. Nanoparticelle-Nanosfere solide-Lipidiche = è una matrice solida con farmaco disperso.
3. Nanocapsule = han zona esterna solida e zona interna che contiene un liquido (lipofilo o
idrofilo come acqua + alcool in glicole o oli vegetali) dove c’è il farmaco.
4. Lipoproteine ricostruite = vescicole create da fosfolipidi che contengono all’interno
trigliceridi + farmaco. Es Chilomicroni LSL-HDL. Sono formate da unica struttura di
fosfolipidi con triglicerdi e farmaco all’interno.
Nei liposomi c’è l’acqua, mentre qui anche i trigliceridi con il farmaco all’interno.

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 SISTEMI MACRO-MOLECOLARI:

Ci sono vari tipi:


1. Coniugati Farmaco Polimero = c’è un polimero con farmaco legato con “Legame
Covalente”. C’è catena polimerica C-C o proteina con amminoacidi e catene laterali.
Contiene il farmaco legato.
2. Micelle Polimeriche= abbiamo macromolecole formate da 2 parti: idrofobica e idrofilica.
Quando sono in acqua si aggregano creando micelle polimeriche create da catene lunghe
con core idrofobico di grande dimensioni (matrice lipofila) + porzioni idrofiliche che
rendono in acqua solubile la molecola.
3. Dentrimeri= molecole a stella o ramificate che partono da un unico centro core. Quando
messe in acqua si comportano da “matrice gelificata” che intrappola il farmaco. Si usano
molecole lunghe, articolate, una volta messe in acqua intrappolano il farmaco.

Obbiettivo creare NANOSISTEMI che incorporano più farmaco possibile e direzionarlo dove c’è
la patologia e il trasportare si deve destabilizzare per rilasciare il farmaco.
FORMAZIONE DI LIPOPROTEINE RICOSTITUITE (NANOPARTICELLLARI);
In Natura abbiamo Chilomicroni (VLDL, LDL, HDL). La
densità aumenta quando diminuisce il carico
trigliceridi. Man ano che trigliceridi diminuiscono
(vengono eliminati) e ci sono + esteri del
colesterolo passano da BASSA densità ad ALTA
densità.
Si usano per formare sistemi nanoparticellari le LDL
e HDL in quanto sono LE PIU’ PICCOLE per i nostri scopi.
Come si ricostruiscono?
Prevede l’uso di PROTEINE (che si trovano in tali lipoproteine)
e si legano a cellule per TRASPORTARE trigliceridi.
Ricostruendo le lipoproteine, con proteine specifiche:
- Tipo A e E per HDL,
- Tipo B per le LDL

Abbiamo un targeting a cui si legano lipoproteine per trasportare triglicerdi.

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Questi recettori sono aumentanti in cellule con alterato METABOLISMO es cellule del tessuto
patologico. Queste lipoproteine ricostruite:
1. Si comportano da carrier per targeting passivo,
2. Han proteine che si legano a cellule per trasporto dei trigliceridi e quindi vengono assorbite
di più dai tessuti patologici rispetto ai sani (targeting attivo). (Le LDL trasportano trigliceridi
nella cellula su cui ci sono presenti recettori LDL.

Ricostruendo le LDL abbiamo già carrier naturali con il farmaco all’interno che trasportano già
tutte le cellule, ma per permeabilità capillare o patologie tumorali oltre al trasporto naturale, c’è
trasporto incrementato da intervento delle discontinuità capillari e dal fatto che i recettori sono
sovresppressi.
Ricostruendo le HDL Le HDL si legano a recettori cellulari per prendere colesterolo (arrivano
vuoto e si caricano di colesterolo).
Questo è un sistema per usare targeting passivo che è ANOMALO, perché va dapperttutto, ma
posso aumentare con discontinuità capillari e sovraespressione recettori. Uso sistemi NATURALI.
Useremo farmaci meno tossici, perché c’è distribuizione anche agli altri tessuti.

POLIMERI PER LA FORMAZIONE NANOSFERE (SOLIDI) E NANOCAPSULE (solidi esterno e liquido


all’interno):
Si preparano usando POLIMERI Sintetici e Naturali.

 Polimeri SINTETICI:
Di questi ricordiamo ACIDO LATTICO E GLICOLICO che polimerizzati danno acido polilattico o
poliglicolico o copolimeri di acido lattico-acido glicolico. Struttura acidi:
- Acido Lattico è un ALFA-Idrossi-Acido formato da COOH, CH, OH, CH3 e in alfa ha un OH
rispetto al gruppo carbossilico.
- Acido Glicolico è un ALFA-Idrossi-Acido perché in alfa ha gruppo carbossilico con
idrossilico. Questo ha un CH2 anziché un CH3 in alfa.
- Acido Polilattico sarà polimero (molecole alto peso molecolare costituite da monomeri)
con unità di acido lattico. Si polimerizza legando gruppo carbossilico con OH di un'altra
molecola creando elgame Estero. Quindi è polimero con legame estereo.
- Acido Poliglicolico polimero con legame estereo.
- Copolimeri acido lattico-glicolico dove nella catena c’è sia acido lattico sia acido glicolico,
avere anche blocchi di acido lattico e blocchi di acido glicolico.

Per preparare NANOSFERE e NANOCAPSULE i polimeri più usati sono POLIMERI ACIDO LATTICO
E GLICOLICO E CO-POLIMERI DEI 2 (ho entrambi nella stessa catena).
Sono polimeri con varie caratteristiche:
- IDROFOBICI che permettono la diffusione del farmaco nella matrice e rilasciano il farmaco
per diffusione passiva,
- BIODEGRADABILI l’acqua penetra internamente nel polimero e gli idrolizza. Quindi
degradazione OMOGENEA della matrice e il farmaco è rilasciato nell’ambiente di
direzionamento.

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Devo usare materiali idrofobici, perché se uso idrofilici i sistemi NON ARRIVANO a destinazione,
ma devono circolare integri fino a che non trovano discontinuità capillari.
Se faccio nanosfera idrofilica in acqua si solubilizza e non arriva a livello della patologia.

 Polimeri NATURALI:
Se la matrice è TROPPO IDROFOBICA, in mezzo metto POLIMERI IDROFILICI = sono polimeri
naturali per rendere la matrice stabile durante la circolazione e permettere targeting. Poi facilitano
così il processo degradazione e aiutano l’acqua a entrare e sono polimeri Naturali. Sono:
 Acido Ialurico,
 Chitosano,
 Acido Algidico.

(no struttura, non sono proteine!). Questi polimeri naturali idrofili sono POLISACCARIDI, polimeri
di zuccheri. La differenza tra i vari tipi è che:
- Acido Ialuronico e Algidico sono polissacaridi con gruppi carbossilici quindi acidi,
- Il Chitosano contiene gruppo amminici e quindi è POLIGLICOSAMMINA.

Se scelgo miscela di tali da integrare nella struttura vado a REGOLARE LE CARATTERISTICHE DI


SOLUBILITA’ per facilità l’ingresso in acqua. La degradazione (potrebbe avvenire dopo mesi,
perché si sono inserti sottocutanei formati da acido lattico e glicolico che si degradano in mesi)
viene velocizzata tramite l’uso di polimeri naturali. Posso far anche discorso Acido-base e gioco su
tanti parametri (chitosano ha proprietà basiche, acido ialuronicoe algidico han caratteristiche
acide). Importanti per regolare IDROFOBIA della matrice, solo troppo copolimero acido lattico e
glicolico provocherebbero una degradazione troppo lenta.

METODI CHIMICI-FISICI PER PREPARAZIONE NANOSFERE e NANOCAPSULE:


I Metodi sono diversi, 5 metodi.
Si parte dal CO-POLIMERO acido lattico e glicolico. Quali sono i metodi?
- Precipitazione: Evaporazione, Estrazione Desolvatazione del solvente. Abbassamento
temperatura e complessazione.
- Reticolazione,
- Polimerizzazione.

PREPARARE EMULSIONE
Si parte dall’emulsione che contiene polimero (copolimero acido-lattico e glicolico) in fase esterna
e STABILIZZO globuli dell’emulsione, trasformando il polimero da soluzione a stato solido.
Quindi il polimero, all’interno dei globuli dell’emulsione, si trova in soluzione nel SOLVENTE
ORGANICO che forma la fase interna dell’emulsione. Il polimero è già sferico.
La fase interna dell’emulsione presenta POLIMERO (in soluzione) + FARMACO. Il globulo
dell’emulsione è un solvente ORGANICO (CH2-Cl ed è un globulo) immiscibile in acqua, ma
contiene polimero solubilizzato con farmaco. Eliminando il solvente tramite fase acquosa cosa
accade? Il polimero precipita e forma una sfera sferica del globuli. Dal globulo, si ottiene
precipitato che ingloba il farmaco e il problema è di estrarre il solvente per farlo precipitare.
Quindi Emulsione e precipitazione.

12
1° METODO DI ESTRAZIONE (PRECIPITAZIONE) DEL SOLVENTE:

La precipitazione come avviene: Evaporazione solvente, Estrazione solvente, Complessazione,


Variazione temperatura Desolvatazione.

 Evaporazione del SOLVENTE:


Il solvente lo scelgo apposta per essere facile da evaporare deve
essere:
- Immiscibile in acqua,
- Basso bollente: facile da evaporare

Per cui faccio riscaldamento, evaporazione e SPONTANEA


solidificazione per precipitazione del polimero. Raccolgo nanosfere (particelle solide). Per averle
piccole uso un TENSIOATTIVO = danno globuli piccoli e omogenei, non basta agitazione
meccanica. (Diverso da distillazione perché separo e raccolgo).

 Estrazione del solvente:


Non aumento la temperatura. Metto Co-solvente per estrarre il
solvente. Se ho il cloruro di metilene da estrarre all’acqua,
aggiungo co-solvente ALCOL ISOPROPILICO che è miscibile con
acqua e rende affine al solvente organico. Così abbasso la
polarità dell’acqua.
La miscela acqua + alcol (< 1% in acqua) i rende acqua + affine
al cloruro di metilene e così si estrae facilmente.
Così per estrazione il globulo si impoverisce del solvente e precipita. Attenzione:
- Non deve essere più dell’1%,
- Rapporto fase interna e esterna da 1 ml a 500 ml

Maggiore è il volume fase estraente (rispetto a volume fase estratta) e maggiore è l’efficienza e
forza di estrazione. Per estrarre il solvente uso COSOLVENTE ALCOL ISOPROPILICO (atossico)
ALL’1%. Se ho 500 ml di acqua il co solvente rimane solo in acqua perché è grande il volume
acquoso e di alcool ne è poco, ma aumenta potere estraente dell’acqua.

 Desolvatazione del solvente:


Aggiungo alla fase acquosa del CLORURO SODICO così faccio evaporare ciò che si trova in acqua.
Qui il polimero è in acqua e per cui ho:
- Globuli (olio in acqua) con farmaco: olio vegetale + farmaco.
- Il polimero è all’esterno in fase acquosa.
- Aggiungendo cloruro sodicofaccio precipitare polimero introno a globuli dell’emulsione e
ottengo capsule.

E’ una PRECIPITAZIONE attorno ai globuli, perché il


polimero si trova in acqua.

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Se faccio precipitare ottengo le capsule di un polimero solubile in acqua e quando lo somministro
si scioglie (dovrebbe essere insolubile).
Le capsule vanno incontro a ulteriore processo di stabilizzazione come Reticolazione chimica,
ma è comunque una fase per preparare capsule (guscio attorno a fase liquida interna).
Uso quindi:
 Polimero Idrofilo,
 Tal polimero precipita intorno ai globuli dell’emulsione,
 L’emulsione contiene solvente biocompatibile che raccolgo, perché c’è presenza di cloruro
sodico,
 Stabilizzo l’emulsione con reticolazione.

Perché il Cloruro sodico fa precipitare il polimero? Fa il SALTING OUT (= disidratazione del


polimero). Sono polimeri con solubilità in acqua NON elevata, ma vicino alla saturazione. Basta che
metto il sale (cloruro sodico molto solubile), prende le molecole d’acqua, si circonda di esse e il
polimero precipita.
Salting Out = aggiungere Sali solubili in acqua per far precipitare altra cosa che è solubilizzata in
acqua, perché è vicina alla saturazione.

 Abbassamento della Temperatura:


Abbassando la temperatura per alcuni polimeri io ottengo la
precipitazione.
- Prendo polimero
- Solubilizzo ad alta temperatura,
- Abbasso la temperatura
- Faccio avvenire la precipitazione.

Quindi facciamo la sostanza + polimero + solvente (non miscibile in acqua) ad alta temperatura
sciolgo polimero, abbasso temperatura e la solubilità del polimero diminuisce e ottengo SISTEMI
SOLIDI.
La temperatura deve essere > 37°C per farlo precipitare, perhcè non va solubilizzata.

 Complessazione:
Abbiamo formazione di complessi tra POLICATIONI.
Ci sono matrici sferiche di alginato + polilisina e ottengo poli-
complessazione tra polilisina (policatione) e alginato (polianione) e si
crea complesso tra polimero carica positiva e polimero carica negativa
che creano COMPLESSAZIONE POLI ELETTROLITI CON LA
FORMAZIONE DI GEL STABILE. Esempio:
- Prendiamo Chitosano (gruppi amminici ovvero policatione) e polilisina,
- Combiniamo con polianioni come Alginati
- Si creano interazioni elettrostatiche tra le 2 cariche e si creano COMPLESSI DI POLI-
ELETTROLITI: dando origine a matrici gelificate non solubili in acqua, perché i polimeri sono
intrecciati tra loro, l’acqua può entrare ma la matrice non districa.

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- Si creano matrici gelificate NON solubili, anche se riempite d’acqua. Questi geli posso
usarli, per farmaci che han una certa idrofilia e rimangono intrappolati lì finchè il sistema
non è direzionato.

Si ha complessazione tra POLIMERI POSITIVI E NEGATIVI.

Preparazione Poli-Elettroliti:
Si prepara un’emulsione, perché NON c’è solvente
organico. Es combino chitosano e acido ialuronico
(polimero idrofili) e si combinano e si crea struttura
sferica colata nella soluzione acquasa. Si ha un ago immette delle gocce del polimero in acqua in
soluzione acquosa di altro polimero e si chiama complessazione di poli-elettroliti tra due cariche.
Quindi:
- Chitosano in acqua, viene gocciolato nella soluzione che contiene acido ialuronico che è
negativo.
- Ora si ha la miscelazione a seconda della viscosità:
o All’interno si mette acido ialuranico e le 2 cariche si stabilizzano e si ha
stabilizzazione delle sfere.
o Oppure si può avere la stabilizzazione sulla superficie (complessazione
interfacciale): all’interno ho cariche positive del chitosano, il chitosano che si trova
in superficie interagisce con cariche negative acido ialuronico e ho complessazione
solo superficiale. Ho un guscio stabile e dentro ho carica positiva.
o Se la viscosità lo permette posso avere all’interno la miscelazione.

Quello che faccio colare rimane all’interno, posso scegliere in base al farmaco che ho. Alginato più
polilisina, la polilisina crea superficie di rivestimento.
Ricorda tra Policationi:
- Chitosano (non cheide struttura), chiede tipologia Polisaccaride formato da
glucosammina ed è un polisaccaride con gruppi amminici.
- Polilisina amminoacido con gruppo carbossilico, gruppo amminico e catena laterale (C4-
NH2). E’ un policatione perché ha gruppo amminico,
- Gelatina è proteina con policatione a pH fisiolgoico. A pH fisiologico prevalgono gruppi
NH3+ rispetto a COO-.

Ricorda tra Polianioni:


- Acido ialuronico: (origine animale) polisaccaride con gruppi carbossilici,
- Alginati (estratti da mondo vegetale, alghe): sono polisaccaridi con gruppi carbossilici,
- Derivati della cellulosa (sintetici): carbossi-metil-cellulosa (eccipiente più usato in
preparazioni solide convenzionali) è un polimero del glucosio con legami beta 1-4 glicosidici
e sul OH in C6 abbiamo un carbossi-metile con carica negativa,
- Polifosfati: polimeri acido fosforico, con cariche negative perché han POO e OH libero e a
pH fisiologico sono anioni.
Questi sono quelli da ricordare, si usano per i POLI-ELETTROLITI e rendere un po’ più idrofili la
miscela dei polimeri dell’acido lattico e glicolico.

15
2° METODO RETICOLAZIONE/CROSSLINKING CHIMICA E TERMICA:

Si preparano i sistemi nano-particellari tramite la


RETICOLAZIONE DEL POLIMERO: cioè il polimero ha gruppi
che permettono reticolazione.
Reticolazione = formazione legami covalenti tra gruppi
carbossilici e gruppi che attaccano i carbossilici ovvero OH,
amminici, sulfidrilici (nucleofili).
Processo:
 Il polimero che contiene sia gruppi carbossilici sia
gruppi nucleofili lo metto ad alta temperatura,
 Si combinano e si crea reticolazione,
 Il polimero diventa da solubile in acqua a insolubile in acqua e ottengo matrice solida di
sferica.

Parto da emulsione che contenga il polimero nella fase interna dell’emulsione, vado a reticolare e
il polimero diventa solido. Il polimero contiene gruppi carbossilici, amminici, OH e SH che
attaccano i COOH se aumento la temperatura, induco ponti reticolazione si crea matrice
solida.
Reticolazione chimica = polimeri con gruppi che si legano tra loro e polimeri solubili in acqua e si
applica generalmente alle PROTEINE.
Si usa albumina del siero si fanno emulsioni Acqua in Oli (vegetali: ad alta temperatura 100°C
resistono) albumina si trasforma in solido prende forma di globulo precipitano lavo con
acetone per pulire superficie da olio e ottengo matrici solide.
L’acqua viene fatta evaporare, generalmente sono anidre. Poi le carico con il farmaco, il farmaco
non si carica prima, perché siamo ad alta temperatura (da 100-°C a 170°C a seconda della
concentrazione che metto) ottengo delle matrici e le metto in acqua contenenti il farmaco.
 Metto le matrici in acqua con il farmaco: perché l’albumina reticolata in acqua si rigonfia
(prende acqua all’interno, perché idrofila) e trascina il farmaco dentro.
 Si prende la struttura, viene essicata: si ottiene prodotto finito da iniettare.

Nella reticolazione termica quindi bisogna ricordare


che le particelle, nanosfere, si preparano VUOTE,
SCARICHE SENZA FARMACO e il farmaco si carica
successivamente con processo di caricamento
SOAKING (=inzuppamento) l’acqua penetra nella
struttura trascinando il farmaco e si ha essicamento.
Così posso preparare le capsule se parto da doppia
emulsione: O/A/O in questo caso i globuli sono
formati da acqua (che contiene polimero: albumina), ma ho anche globuli di olio (emulsione
doppia). Aumentando la temperatura, matrice diventa solide, ma le goccioline rimangono
intrappolate nella matrice e ottengo nanocapsule.
Ottengo nanocapsule quando ho la necessità di mettere il farmaco nell’olio, così l’olio ha la
capacità di aumentare la solubilità del farmaco.
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Col metodo della reticolazione preparo:
- Microsfere: quando parto dalla reticolaizione O/A;
- Nano-capsule: quando parto da reticolazione O/A/O.

Questo vale per la reticolazione chimica, questa è la reticolazione termica con aumento
temperatura (al di sopra di 100°C).
Se faccio la reticolazione chimica lavoro a 25°C NON danneggiando il farmaco, ma metto
reticolanti chimici ovvero aldeidi o chetoni (butadione o formaldeide ma eliminata) che reticolano
i gruppi amminici. Si creano sempre legami di reticolazione a 25°C se ho A/O ottengo nanosfere,
altrimenti O/A/O ottengo nanocapsule. In questa si può mettere il farmaco prima.
Se è possibile si preferisce la termica, perché non uso reticolanti chimici.
Il metodo di soaking non dà caricamenti elevati di farmaco, ma metto più farmaco quando lo
incorporo durante la preparazione, ma ad alte temperature non si fa con nessun farmaco, perché
viene danneggiato, si ricorre alla chimica quando devo incorporare grande quantità di farmaco.

3° METODO POLIMERIZZAZIONE:

In questo caso NON partiamo dal polimero ma partiamo dal


MONOMERO.
Prepariamo il polimero, durante la preparazione del sistema nano
particellare.
- Monomero + sostanza (farmaco),
- Facciamo emulsione,
- Polimerizzazione:
o Può avvenire dentro il globulo (polimerizzazione
omogenea), dentro il globulo si forma la nano-sfera, perché il monomero si
trasforma in polimero e il globulo diventa matrice solida che ha la forma stessa del
globulo. Prima si faceva con reticolazione o precipitazione, qui con
polimerizzazione. Questa dà delle nanosfere.
o Può avvenire in modo interfacciale, sulla superfice in questo caso ottengo delle
capsule: perché la parete solida si fa solo sulla superficie, dentro rimane liquido
della nostra fase interna dell’emulsione. Questa dà delle nanocapsule.

La polimerizzazione è di 2 tipi si ha: Poliaddizione e Policondensazione.

 POLIADDIZIONE:
Ha bisogno di doppi legami + INIZIATORE (radicalico, anionico o cationico). In questo modo ho:
 L’inizio con formazione di altro radicale;
 Propagazione: radicale che attacca altri doppi legami (monomeri);
 Terminazione: quando 2 radicali si combinano tra loro. Il problema della terminazione è
quando la polimerizzazione è radicalica si ha polimerizzazione dei radicali, quando è
anionica per bloccarlo devo metter il catione, mentre quando è cationica metto un anione.
Devo terminarla IO.

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Se decido di fare una poliaddizione quali sono i metodi?
1. Polimerizzazione in emulsione facciamo emulsione con intervento di tensioattivi, perché
voglio particelle piccole. Metto iniziatore e andiamo a fare polimerizzazione omogenea,
dentro, che darà matrici solide molto piccole di dimensioni nanometrici con creazione
nanosfere. Qui si ha la possibilità del tensioattivo che rimane INTRAPPOLATO sulla
superficie delle particelle formate. Se si crea tensioattivo compatibile è un vantaggio
perché ho la superficie idrofila.
I monomeri possono essere solubilizzati nel solvente o essere liquidi, quando sono liquidi
(monomeri vinilici) si usano senza solvente (vinile idrossi-etilico). Il liquido è il globulo della
fase interna dell’emulsione in acqua. Metto tensioattivi e iniziatore, il monomero si
trasforma in polimero solido, aggiungendo il tensioattivo può rimanere attaccato alla
superficie, rimangono bloccati da solidificazione del globulo.
2. Poliaddizione in Sospensione se non uso il tensioattivo, ho in questo caso globuli
(liquido immiscibile in acqua) più grossolani non solubili in acqua, li mantengo separati con
agitazione magnetica. Metto sempre l’iniziatore e ottengo polimerizzazione con particelle
più disomogenee di polimero e non c’è bisogno del tensioattivo.

No solvente organico, perché sono liquidi non miscibili, se


metto comunque il solvente organico (non miscibile con acqua
come cloruro metilene), solubilizza monomero, metto
iniziatore ottengo polimero solido, ma devo eliminare tracce
solvente andando ad essiccare (non è conveniente). Se
monomero solubilizzo da solo è più conveniente.

 POLICONDENSAZIONE:

Si crea un legame covalente tra 2 gruppi che si combinano tra loro: gruppo
amminico + carbossilico. Es amminoacidi che si combinano per creare
proteine.
Si usano di-cloro formiati, diacil cloruri e di-isocianati (gruppi carbossilici)
vengono attaccati da gruppi amminici.
- Scelgo un monomero come (nucleofili) di-ammina, di-alcol o un
bifunzionale con alcol + ammina;
- Lo combino con altro monomero ovvero di-cloruro acilico 2 gruppi funzionali che si
combinano: CO-Cl da un lato e un CO-Cl dall’altro e così si forma che l’OH reagisce e l’NH2
reagisce sull’altro Cl-CO e si forma il polimero.
- Devo scegliere 2 monomeri con 2 gruppi nucleofili e 2 gruppi elettrofili. Le catene in
mezzo possono essere catene alchiliche o gruppi acilici.

Le funzioni elettrofile possono essere cloruri acilici (Cl-CO), iscianati (attaccati e diventa NH) o di-
cloro-formiati (Cl-CO-O: se né va Cl- e si ha l’attacco su CO).

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Il Dicloroformiato con gruppo amminico viene attaccato e si forma (CON) il gruppo amminico
attacca e si forma un’Urea. Gli isocianati prendono H diventa NH-CO e quello che rimane attaccato
su CO, manda doppietto verso l’azoto e si prende H+.
Ricorda:
Sono esempi di monomeri elettrofili e poi ci sono esempi di monomeri nucleofili. Tutti monomeri
gruppi amminici, SH, OH e si combinano sistemi bifunzionali per formare delle catene polimeriche.
Es condensazione interfacciale: fase acquosa con diammina e fase esterna con dicloruro acilico: c’è
interfase che si forma (gruppo amminico su cloruro acilico) polimero con legame ammidico.

- Formazione di Nanocapsule se ho un monomero nella fase oleosa e un monomero in


fase acquosa, ognuno solubile nella sua fase.
- Formazione di Nanosfere se i 2 si possono miscelare, ovvero il cloruro si ripartisce in
fase interna.
Quando ho la polimerizzazione per condensazione, generalmente si usa nell’interfacciale per
produrre nanocapsule, così si sfrutta differente solubilità.
Se voglio la formazione di sfere dovrò far in modo che vada dentro e scegliere un monomero
tale da avere una certa partizione nella fase interna dell’emulsione senza che il monomero vada
fare. Devo scegliere 2 solventi adatti e 2 monomeri adatti.
Importante è che si crei l’emulsione prima che vado a formare la sfera, ma NON posso miscelare
perché altrimenti si forma una massa informe.

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4° METODO PER PREPARARE NANOSFERE E NANOCAPSULE CON FLUIDI
SUPERCRITICI
Questa tecnica non si applica sempre, ma solo usando “Fluidi Super-Critici” = gas sotto pressione
che ad alta pressione diventano liquidi. Questi liquidi poi solubilizzano la maggior parte dei
polimeri, principalmente lipofili (come poliglicolico, polilattico, polimeri tra lattico e glicolico) usati
in questi sistemi.
Come si preparano?
- Prendo come fluido supercritico la CO2 perché NON è infiammabile, NON è tossica e ha
bassa reattività.
- La metto in una bombola.
- Alzando la pressione la CO2 si espande e apre la valvola (da gas diventa liquida) e crea il
nebulizzato.
- A questo nebulizzato aggiungo Polimero e farmaco in soluzione.
- IL nebulizzato evapora e lascia il polimero precipitato si raccoglie e crea le nano-
particelle.

Vantaggi della CO2:


 Ha una bassa viscosità e alta diffusività (come i gas) questo fluido si comporta come
liquido, ma con i vantaggi del gas perché ho viscosità bassa e elevata diffusività.
 Densità Alta (come gas) è vantaggio per la manipolazione,
 Solubilizzano bene il polimero.

Quando apro la valvola, ho l’espansione del gas, ma siccome la viscosità è bassa e diffusività alta
vuol dire che quando lascia il polimero, esso NON interagisce più e precipita rapidamente creando
matrici che sono omogenee e compatte.
Se NON ho completa solubilizzazione del farmaco nel fluido, posso aggiungere un Solvente che
mettendolo nel fluido supercritico facilita la solubilizzazione del polimero ALCOLI (metanolo,
etanolo in poche quantità). Quando ho l’espansione evaporerà insieme la gas.

20
FORMAZIONE DI NANOCAPSULE E NANOSFERE SOLIDE/ LIPIDICHE (SLN):
Le SLN = sono sempre Nanocapsule e Nanosfere ma con la matrice formata da trigliceridi. Come
preparo tali sistemi?
 Creazione di EMULSIONI di Trigliceridi in Acqua (O/A) per creare NANOSFERE:
I trigliceridi han una temperatura di fusione alta (70°C) che dipende dalla catena lipofila sul
glicerolo. Come creo l’emulsione:
- Fase interna: Trigliceridi (+ farmaco),
- Fase esterna: acqua.

Pongo i trigliceridi in acqua, agito e successivamente ABBASSO la temperatura, così da ricavare le


SLN con all’interno il farmaco.
Ci metto i tensioattivi per far si che le particelle NON si aggreghino nell’ambiente acquoso, in
quanto ho bisogno che la superficie sia idrofoba.
Importante anche che le SLN solide siano a temperatura ambiente per essere ben conservate.

 INVERSIONE di FASE per creare NANOCAPSULE:


Parto qui dall’emulsione A/O a temperatura ELEVATA, poi abbasso la temperatura e usando
miscele di tensioattivi a trigliceridi ottengo “Inversione di Fase” dove la fase lipofila si aggrega
creando la fase interna dell’emulsione, mentre l’acqua quella esterna.
Durante l’inversione di fase, le nanocapsule lipidiche che si creano intrappolano parte di acqua
all’interno per creare le SLN di tipo nanocapsulare.
*Differiscono dalle particelle polimeriche in termini di velocità di rilascio.

21
CARATTERISTICHE DEI LIPOSOMI:
Liposomi = sono strutture vescicolari dove abbiamo un doppio strato (idrofilo esterno, lipofilo e
idrofilo interno) fosfolipidico che circonda una zona interna contenente acqua. Sono “imitazioni”
delle membrane cellulari. Sono dei doppi strati che s’incurvano creando parete costituita
all’interno e esterno da fila di teste idrofile.
Sono usati nella nanomedicina per creare formulazioni convenzionali a rilascio controllato, topico
e in ambito cosmetico.
- Sono versatili come trasportatori: perché incorporano sia farmaci lipofili (s’inseriscono nel
doppio strato) sia idrofili,
- Si legano facilmente a dei residui direzionanti.

La loro superficie può esser variata perchè creata da fosfolipidi aventi una testa idrofila con
fosfo-esteri (fosfatidilcolina, fosfatidil-etanolamina ecc..). Questa tesa ha tante funzioni, si può
legare a vitamine, oligo-poli-saccaridi, proteine o anticorpi monoclonali con leganti bifunzionali.
Classificazione dei liposomi:
1. Convenzionali: presentano superficie non modificata.
2. Stealth o a Lunga Circolazione sulla superficie ci sono catene di PEG (idrofile) che legano
l’acqua e li rende invisibili al sistema immunitario. In quanto a seconda della loro superficie
liposomiale e delle loro dimensioni a volte possono stimolare il sistema immunitario, per
cui aggiungendo il PEG questo non accade, perché circonda l’acqua e fa si che stabilizzi il
sistema liposomiale impedendo la fusione tra le vescicole.
3. Immunoliposomi presentano anticorpi monoclonali per il targeting attivo.
4. Cationici vengono resi positivi sulla superficie usando fosfolipidi cationici sintetici. La
carica positiva né facilita l’ingresso sulla superfice cellulare.

Molto spesso i liposomi devono essere spinti dentro la cellula, ma la superficie cellulare è negativa; quindi se i liposomi hanno una superficie
positiva ciò facilita il loro ingresso. In più servono a veicolare gli oligonuclueotidi, che sono “nuovi farmaci” per il gene delivery.
Gli oligonucleotidi a catena corta sono dei pezzetti di RNA con carica totale negativa (sono infatti costituiti da fosfati). L’mRNA, in certe patologie,
iper-produce proteine, per bloccare la sovra-espressione proteica si usano questi micro RNA.
Il gene delivery corrisponde al rilascio degli ODN (= oligo-desossi-nucleotidi, ovvero i micro RNA, prodotti in laboratorio).
Gli ODN però, una volta iniettati, vengono subito degradati (nel giro di 15-30min) dalle nucleasi che li identificano come materiale estraneo; per cui
devono essere veicolati da vettori che possano circolare, andare nel sito patologico e lì rilasciati.
I cationici veicolano questi micro RNA: sulla loro superficie sia esterna che interna (dove sono disposte le teste polari cariche positivamente)
attaccano, legano i micro RNA che hanno invece carica negativa. In questo modo i ODN riescono a raggiungere il sito terapeutico senza essere
riconosciuti dalle nucleasi dell’organismo.
I micro RNA prodotti dal nostro organismo veicolano gli mRNA. In certe patologie io posso provocare la degradazione proteica o aumentarla:
spingere l’effetto del micro RNA o bloccarlo; allora costruisco in laboratorio altri micro RNA che devono bloccare i micro RNA endogeni. I micro RNA
che uso regolano l’espressione genica; sono degli oligo-anioni somministrati assieme a delle strutture cationiche (liposomi cationici).

In base alla loro struttura si classificano in:


1. Small Unilamellar Vesicles (SUV) = una sola lamella e son piccoli (30-100 nm),
2. Large Unilamellar Vesicles (LUV) = superano 100 nm,
3. Multilamellar Vesicles (MLV) = formati da doppi strati concentrici,
4. Multivesicular Vesicles (MVV) = strato esterno con all’interno
formazioni più piccole.

22
METODICHE PER PREPARAE I LIPOSOMI:
Abbiamo 8 metodiche:
- TLE “Thin Layer Evaporation “ (= strato sottile ottenuto per evaporazione);
- REVs “reverse-phase evaporation vesicles”,
- FUVs “Fusion Unilamellar vesicles”,
- FATMLV “frozen and thawded ovvero congelato e scongelato”,
- DRV “disidratazione e reidratazione”,
- VETs “extrusion membrane”,
- FPVs “french press”,
- EI “ethanol injection”.

TLE “Thin Layer Evaporation”:


Prevede diverse fasi:
 Prendo miscela di fosfolipidi e li sciolgo in solvente organico (cloruro di metilene o alcol
etilico),
 Pongo tutto in evaporatore rotante il solvente evapora mentre si gira,
 Ottengo strato SOTTILE di fosfolipidi sul vetro,
 Reidrato questo strato con TAMPONE FOSFATO acquoso.
 Ottengo così la spontanea formazione di vescicole “liposomi” più o meno grandi, uni o
multi lamellari, disomogenee o omogenee (dipende dal solvente usato e dalla miscela di
fosfolipidi ecc..).

Lo strato sottile serve per far si che si creino strati, attaccati al vetro, dove i fosfolipidi si
mettono coda contro coda per creare tali strati che vengono reidratati.
L’evaporazione lenta fa si che i fosfolipidi si connettono uno contro l’altro creando film e
appena li reidrato le lamelle si staccano e si curvano creando vescicole. Se invece metto subito la
miscela di fosfolipidi in acqua, questi NON han il tempo di orientarsi coda-coda e ottengo
sospensione con struttura interna disordinata. Ricorda che quando aggiungo l’acqua ottengo
strutture Non omogenee simili a gel e devo omogenizzare per:
- Sonnicazione: sonde a ultrasuoni dove tramite l’uso di energie si spezzano le vescicole in
strutture più piccole,
- Estursione: con alta pressione, le vescicole si rompono e han dimensioni più piccole.

REVs “reverse-phase evaporation vesicles”:


 Prendo fosfolipidi e li pongo in solvente organico,
 Aggiungo l’acqua e creo emulsione A/O
 Dando energia (con agitatore meccanico) creo l’emulsione e si formano globuli di acqua nel
solvente.
 Faccio evaporare con un solvente basso bollente e miscibile con acqua (no alcol etilico)
questo porta a diminuzione del solvente e precipitazione delle code lipofile solubilizzate
nel solvente.
 Così si aggregano code lipofile con creazione di un gel e all’interno c’è l’acqua,
 Lavorando con il solvente le code si separano originando liposomi dove l’acqua crea la
fase esterna di ciò che è rimasto.

23
L’evaporazione del solvente organico ha aggregato progressivamente i fosfolipidi, permettendo il giusto orientamento dei fosfolipidi. Queste
strutture si compattano sempre di più fino ad assumere la minor energia possibile ovvero una forma sferica dove l’acqua rimane all’esterno e
all’interno.
I farmaci, se sono lipofili si mettono nel solvente organico insieme ai fosfolipidi, se sono idrofili si mettono nella fase acquosa. In quest’ultimo caso
posso usare farmaci idrofili perché, tutto sommato, la fase acquosa è in bassa percentuale rispetto a tutto il quantitativo di solvente e fosfolipidi →
la REVs mi dà una buona incorporazione di farmaci idrofili. Quindi il farmaco idrofilo rimane dentro i liposomi, ma in parte anche fuori con l’acqua
che fa da fase esterna.
Con questa tecnica di inversione di fase posso regolare la concentrazione di fosfolipidi nel solvente organico:
o Se il solvente è poco concentrato mi aspetto di ottenere degli unilamellari
o Se è molto concentrato facilito, durante l’evaporazione del solvente, il multistrato e quindi mi aspetto di ottenere dei multilamellari

Nei liposomi (siano essi uni o multi lamellari) c’è sempre l’acqua: negli unilamellari è sia fuori che dentro, nei multilamellari è presente tra una
lamella e l’altra.

FUVs “Fusion Unilamellar vesicles”:


 Parto dai liposomi small con superficie piena di gruppi carbossilici,
 Li pongo in presenza di SALI DI CALCIO il calcio fonde i liposomi e creano aggregati,
 Gli aggregati li tratto con EDTA che rimuove il calcio e si creano strutture a chiocciola che
corrispondono a liposomi col calcio,
 Rimuovendo calcio con EDTA creo liposomi giganti uniclamellari.

Serve per le applicazioni topiche dove ho bisogno di grandi liposomi per incorporare quantitativi
superiori di farmaco idrofilo.

FATMLV “frozen and thawded ovvero congelato e scongelato”:


Si preparano liposomi con la TLE o REVS poi effettuo:
- Congelamento istantaneo con AZOTO LIQUIDO e ciò blocca il doppio strato fosfolipidico e
lo fa passare da solido-gel a solido,
- Scongelo in acqua a 37°C rompe il doppio strato fosfolipidico che crea fessure che
permettono all’acqua di entrare.
- L’acqua entra, carica il farmaco e aumenta il caricamento del farmaco nel liposoma.
Viene praticata per 8 volte a seguito di stabilizzazione e destabilizzazione e ottengo liposomi più
carichi di farmaco.
DRV “disidratazione e reidratazione”:
- Prendo liposomi e li liofizzo ovvero li pongo a congelamento e sublimazione dell’acqua a
bassa pressione.
- L’acqua se ne va dai liposomi che raggrinziscono perché perdono acqua.
- NON perdono la struttura del doppio strato, per cui reidratandoli immediatamente si
aumenta il caricamento col farmaco.

VETs “extrusion membrane”:


Vengono preparati per estrusionevengono passati con FILTRI con porosità controllata per avere
caratteristiche morfologiche-strutturali che dipendono dai pori usati.

FPVs “french press”:


Funziona sullo stesso principio della “VETs”: liposomi ottenuti tramite estrusione con filtri.
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EI “ethanol injection”:
 Sciolgo fosfolipidi in etanolo e li vado ad iniettare in acqua,
 L’etanolo viene rimosso in quanto è immiscibile con acqua,
 Rimangono fosfolipidi che danno AGGREGATI AMORFI e si aggrega in liposomi.

Serve per creare vescicole in modo veloce, ma hanno una variabilità forte. Infatti molto materiale
diventa amorfo e nella preparazione finale ho sempre la traccia di etanolo usato.

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DA COSA SONO COSTRUITI I LIPOSOMI E LORO CARATTERISTICHE
I liposomi sono costituiti da fosfolipidi, che cosa sono i
fosfolipidi?
I fosfolipidi sono esteri del glicerolo che hanno legata una
testa fosfato polare dove abbiamo un sostituente che può
essere:
- Colina, avente un gruppo quaternario
- Etanolammina, che ha un gruppo amminico
- Serina, amminoacido avente catena laterale con OH
- Glicerolo
- L’OH semplicemente
- L’inositolo.

Per convenzione a pH 7.4:


 il fosfato è già ionizzato,
 la colina ha il suo gruppo quaternario fisso
indipendentemente dal pH
 l’etalonammina si considera prevalentemente
ionizzata
 la serina si considera il gruppo COO- nella catena
 OH, inositolo e glicerolo sono neutri.

I liposomi se sono preparati con:


 Fosfatidilcolina sono neutri (fosfato+colina)
 Etanolammina sono neutri (perché si considera sempre neutra)
 Fosfatidilserina, la serina ha una carica negativa, col fosfato avrà una carica
complessivamente negativa
 Glicerolo, OH e inositolo la carica saranno negativi (perché rimane solo il fosfato che ha
carica negativa).

Quindi non ci sono in natura fosfolipidi carichi positivamente, possono darci liposomi o neutri o
carichi negativamente.
Se vogliamo preparare liposomi carichi positivamente, da utilizzare nel gene delivery, dobbiamo
usare prodotti sintetici, che siano ad imitazione dei fosfolipidi naturali, molecole costituite da 2
catene lipofile (generalmente si usa acido oleico o esteri dell’acido oleico che è C18 con doppio
legame in posizione 9-10). Queste due catene vanno ad esterificare glicoli o glicerolo e che
contengano una testa polare carica positivamente (non ci dev’essere il fosfato). Sono quindi
molecole sintetiche che mimano i fosfolipidi con uno scheletro simile al glicerolo a cui sono
attaccate 2 catene lipofile legate ad una testa carica positivamente che porta un gruppo
ammonico quaternario. Perché proprio l’acido oleico? Perché è un liquido ed avendo un doppio
legame è più facile da maneggiare.
Come esempio di molecole cationiche per la preparazione di liposomi bisogna ricordarsi la
struttura generale, come ad esempio DOTAP = di-oleoil-oxy-trimetil-ammonio-propano (da sapere
la sua struttura!)
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Vediamo che sul propano abbiamo il trimetil-amonio e poi c’è il dioleoiloxy, cioè un estere
dell’acido oleico (2 ossidrili del glicole propilenico)

Strutture ANFIFILICHE: molecole che hanno 1 testa polare con 1 o più code lipofile. Per sapere se
quella molecola mi formerà delle micelle o dei liposomi o dei doppi strati planari o delle micelle
inverse devo calcolarmi il parametro critico di impaccamento. Se uso dei fosfolipidi so già che
preparerò dei liposomi, però se uso molecole sintetiche, anfifiliche io potrei ottenere diverse
forme.
Il parametro critico di impaccamento è P= v/a*l
V= volume occupato da ciascuna molecola nella struttura
assemblata. Metto la molecola incognita in acqua e guardo il
volume assemblato, il tipo di assemblaggio sub-molecolare
che dà.
Se il volume occupato da questa struttura assemblata ha un
certo valore (verificandolo con metodi fisici che noi non
stiamo a fare) lo paragono a:
- a = area della testa della molecola non assemblata
- l= lunghezza di ciascuna molecola non assemblata

io ho la molecola di cui non conosco le caratteristiche,


quando è in acqua si assembla, ma se non è in acqua non
subisce aggregazioni perché ha delle parti idrofobiche, è
come completamente distesa e stabilizzata in un solvente
ideale. Allora questa molecola avrà una certa lunghezza ed area → a*l è il volume non assemblato.
Quando la metto in acqua la molecola mi si assemblerà in qualche modo che però io non conosco;
con questo metodo riesco a prevedere il volume che ogni molecola occupa nello stato assemblato.
Il parametro critico di impaccamento della micella corrisponde al volume assemblato (quello
misurato dentro la micella) /volume non assemblato (a*l, che corrisponde nel disegno al cilindro)
quant’è? È 1:3, si dà come dato di fatto che quando il parametro di impaccamento è 1/3 o
inferiore ad 1/3 allora avremo una micella.
Quando ho una situazione per cui ho 1 testa idrofila e 2 code lipofile che mi formano un doppio
strato planare (come nella membrana cellulare) allora il parametro critico di impaccamento sarà
uguale a 1.
I nostri liposomi sono a metà tra il planare e la micella in quanto la parete dei liposomi è un
doppio strato curvo dove il volume assemblato che è a metà tra un cilindro ed un cono → tronco
di cono. Quindi il valore è compreso tra 1 ed 1/3, però come parametro di accettazione viene dato
1/2 – 1 (il parametro critico di impaccamento dev’essere inferiore a 1 e superiore ad 1/2)
Quando è superiore a 1 abbiamo le micelle inverse poiché la struttura espansa è maggiore di
quella libera

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RIMOZIONE FARMACO DA PARTE ACQUOSA
Come possiamo rimuove il farmaco rimasto nella parte acquosa?

 DIALISI:

Lo strumento per la dialisi è formato da tubi di acetato di cellulosa trasparenti


che possono far passare piccole molecole e non macromolecole (→ fanno
passare solo il farmaco, non i liposomi).
Prendo questo tubo, lo riempio della mia sospensione liposomiale (i liposomi
sono rappresentati in figura come pallini rossi) e il farmaco che però non è tutto
nei liposomi, ma in parte è rimasto fuori.
A questo punto metto il tubo in un altro contenitore con altra acqua così che il farmaco possa
diffondere attraverso la membrana della dialisi verso l’acqua esterna. Questo processo si
verificherà fin quando non avrò eliminato tutto il farmaco all’interno del tubo (cambiando l’acqua
ogni 12h così da aumentare il gradiente → il farmaco infatti andrà per osmosi, per gradiente di
concentrazione nell’acqua esterna alla membrana).
Stiamo parlando di farmaci a basso indice terapeutico da somministrare con la nanomedicina: non
posso dare al paziente una preparazione con il farmaco non inglobato nei liposomi, non sarebbe
accettabile.

 CENTRIFUGAZIONE:

Attraverso l’ultra centrifugazione ad alta velocità, il farmaco si


separa dalla preparazione liposomiale che viene raccolta in pellet
nel fondo della provetta. Rimane in soluzione la fase acquosa col
farmaco idrofilo. Si rischia però che i liposomi si fondano tra loro
destabilizzandosi, è importante perciò mettere sulla superficie il PEG. Il PEG mi dà una superficie
acquosa sui liposomi contenenti il farmaco/i pellet → non si aggregano

 GEL-FILTRAZIONE:

Abbiamo geli porosi che vengono messi in colonna e lasciano passare i liposomi nei
loro spazi vuoti, mentre assorbono le molecole piccole (di farmaco).
In questo modo raccolgo subito i liposomi che sono stati depurati dal farmaco
esterno.

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LE MOLECOLE MACROMOLECOLARI E COME SI FORMANO:

 MICELLE POLIMERICHE

Sono polimeri aventi una porzione idrofobica ed una idrofilica. Stiamo


parlando di materiali tipo tensioattivi che sono grandi polimeri.
La porzione idrofobica può essere costituita da polimeri usati per la preparazione delle nanosfere
e delle nanocapsule (acido polilattico e acido poliglicoli e polilattico con glicolico) o qualsiasi altro
polimero idrofobico e biocompatibile. Mentre la porzione idrofila è costituita da PEG (materiale
idrofilo e biocompatibile).
Questi materiali che formano le micelle sono POLIMERI A BLOCCHI ovvero aventi un blocco
idrofobico ed uno idrofilico con 2 pesi molecolari diversi.
Quando metto la micella polimerica in acqua le parti idrofobiche si assemblano e le parti
idrofiliche (le catene PEG) mi rimangono all’esterno.
Il farmaco va nella forma idrofobica (le micelle polimeriche servono proprio per farmaci idrofobici,
li intrappolano all’interno).
In alcuni casi posso legare il mio farmaco al polimero → incorporazione fisica/non covalente:
incorporo il farmaco nella porzione idrofobica del polimero.
L’aggregazione delle unità lipofile avviene spontaneamente
l’una con l’altra.
Un esempio potrebbe essere polilattico + PEG

Se prendo un polimero col farmaco già legato al suo


interno. In questo caso non abbiamo il polilattico o
poliglicolico perché non hanno gruppi con cui poter legare il
farmaco; parliamo piuttosto dell’acido poliaspartico che mi
darà una catena con dei gruppi carbossilici che vado a
legare al mio farmaco.
Il mio farmaco, essendo lipofilo, favorisce l’aggregazione
delle porzioni lipofile → incapsulazione covalente. Un esempio è poliaspartico (è un polimero
dell’acido aspartico che contiene gruppi carbossilici liberi leganti il farmaco) + doxorubicina.

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 CONIUGATI FARMACO-POLIMERO

Nei coniugati farmaco-polimero ho dei polimeri legati


covalentemente a dei farmaci. Per esempio: l’acido ialuronico
(è il mio polimero che costituisce la catena principale, è un
polisaccaride con gruppi carbossilici) lo lego covalentemente
al mio farmaco (cerchiati in rosso in figura come la
doxorubicina).
I farmaci sono idrofobici ed insolubili in acqua, essi vengono
legati a catene idrofiliche come acido ialuronico,
poliaspartico o poliglutammico o albunima o proteine.
Il principio è avere il polimero idrofilo (acido ialuronico)
legato covalentemente al mio farmaco idrofobo → succede
che ho un’aggregazione di tipo folding, un piegamento della
catena polimerica. Infatti quando metto in acqua il farmaco
questo tende ad aggregarsi, l’aggregazione è farmaco-
farmaco mi dà una struttura, che se è ben direzionata, può
essere usata per il targeting.
Lo scopo è ottenere un folding che dia origine ad una
struttura più o meno sferica che va, per targeting passivo,
attivo o stimolato, nel tessuto patologico rilasciando il
farmaco.

 DENDRIMERI

Sono delle macromolecole uniche: un sistema è un'unica molecola.


Si parte da un di-ammino-acil-cloruro che reagisce con altri
diacilamminecloruro dando origine a ramificazioni successive.
È come una polimerizzazione in cui però si formano tanti rami.
Sul COCl si lega un gruppo aminico che contiene altri 2 COCl, si
ramifica così questa struttura pian piano, fino ad ottenere un
dendrimero (un core centrale con attorno tutti i rami) che si
comporta come un gel al cui interno c’è l’acqua.
Il farmaco viene intrappolato nel gel e si comportano come i sistemi visti finora, ma
macromolecolari! Qui non abbiamo una matrice, sono delle macromolecole che si strutturano in
maniera diversa.

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