Capitolo 5 Metodi e strategie di ricerca Ablazione Sperimentale il principale metodo di ricerca, prevede la DISTRUZIONE di una parte del cervello

lo e la successiva valutazione del comportamento dell'animale. Nella maggior parte dei casi il tessuto non viene rimosso ma lasciato in situ. RESTA UNO DEI Pi IMPORTANTI METODI DI RICERCA. Valutazione degli effetti comportamentali del danno cerebrale Valutazione definita anche STUDIO DI LESIONE. L'interpretazione degli effetti del danno cerebrale sono molto complicati, per cui bisogna prestare attenzione, sopratutto perch NON ESISTE ALCUNE REGIONE CEREBRALE O CIRCUITO NEURALE PREPOSTO AD UN SOLO COMPORTAMENTO, QUINDI DIRETTAMENTE O INDIRETTAMENTE TUTTE LE REGIONI CEREBRALI SONO INTERCONNESSE. Esempio: Lesioni a livello dei lobi parietali (regioni sensoriali) provocano difficolt nel posizionare i numeri nello spazio e di conseguenza deficit nella capacit aritmetica; Lesioni a livello del setto aboliscono il comportamento materno nei ratti, la sua connessione molto vasta ed collegata con strutture ippocampali , causando un deficit di percezione spaziale materno. Produzione di lesioni cerebrali Lesioni Corticali Per arrivare a lesionare la corteccia si anestetizza l'animale, si uccide, rimuovendo lo scalpo e la dura madre. A questo punto si pu si pu usare uno strumento di SUZIONE per aspirare il tessuto cerebrale e provocare una lesione a livello CORTICALE. Si utilizza una pipetta di vetro collegata ad una pompa sottovuoto per permettere l'aspirazione. Lesioni sottocorticali Molto spesso si vogliono produrre lesioni sottocorticali, si possono effettuare attraverso un ELETTRODO con punta scoperta, il quale viene inserito in profondit (sotto corteccia) e attivato per produrre una lesione. Per poter utilizzare questa tecnica si utilizza LA CHIRURGIA STEREOTASSICA, la sonda dell'elettrodo produce radio frequenze elevate con conseguente innalzamento della temperatura e quindi distruggendo tutto ci con cui viene in contatto INCLUSI I CORPI CELLULARI E GLI ASSONI. Metodo pi selettivo- Lesioni eccitotossiche Implica l'utilizzo di aminoacidi eccitatori come L'ACIDO CAINICO stimolando i neuroni fino ad ucciderli. Si utilizza una cannula per poterlo iniettare, QUESTO METODO RISPARMIA GLI ASSONI UCCIDENDO SOLO I CORPI CELLULARI. Questo metodo pi selettivo permette di far capire se gli effetti della lesione sono causati dalla morte dei neuroni ivi localizzati o dalla distruzione degli assoni che passano nelle vicinanze. Lesioni con Radio frequenza di una regione del tronco encefalico aboliscono il sonno REM. ESISTONO METODI ANCORA Pi SPEICIFICI PER LA PRODUZIONE DI LESIONI LA 6-IDROSSIDOPAMINA

simile alle catecolamine NOREPINEFRINA E DOPAMINA permette che essa venga assorbita selettivamente da popolazioni di neuroni noradrenergici e dopaminergici . Uccidendo speicifiche popolazioni di neuroni . Confornto con i gruppi di controllo Lesioni Simulate Da precisaRE che UTILIZZANDO CANNULE E ELETTRODI SI PRODUCONO LESIONI CEREBRALI ADDIZIONALI INVEITABILI. Non possibile solo confrontare gli animali lesi con quelli sani del gruppo di controllo, il danno incidentale pu spiegare alcuni deficit comportamentali per contrastare il problema possibile operare su animali quali produrre LESIONI SIMULATE. La tecnica consiste nel posizionare l'animale nell'apparato stereotassico e procedere con le stesse tecniche di lesione AD ECCEZIONE DI UN PASSAGGIO: QUELLO DI ACCENDERE L'ELETTRODO O PROCEDERE CON L'INFUSIONE, a questo punto il nostro animale del nuovo gruppo di controllo pronto. Se il comportamento degli aninali cerebrolesi uguale a quello di controllo si pu dedurre che il danno comprotamentale stato causato dalla lesione sperimentale. E' la stessa procedura dell'effetto PLACEBO utilizzata in farmacologia. PRODURRE LESIONI TEMPORANEE pu essere vantaggioso, ci si pu produrre attraverso ANESTESIA (muscimolo), iniettandolo nell'area d'interesse , l'anestesia blocca i potenziali d'azione degli assono in entrata/uscita , producendo una lesione temporanea. IL MUSCIMOLO STIMOLA I RECETTORI DEL GABA INATTIVANDO IL CERVELLO. Lesioni Temporanee con Criosonda Utilizza una sonda raffreddata con azoto e diossido di carbonio. CHIRURGIA STEREOTASSICA Stereotassi significa disposizione dei solidi, la capacit dilocalizzare gli oggetti nello spazio. L'APPARATO STEREOTASSICO formato da un ferma testa , un reggi elettrodo/cannula, con la possibilit di muoverlo nelle tre dispozioni spaziali Per effettuare un intervento di chirurgia stereotassica c' bisogno di consultare L'ATLANTE STEREOTASSICO. L'ATLANTE STEREOTASSICO Il cervello di due animali non mai completamente uguale. Il cranio costituito da varie ossa che crescendo insieme formano delle suture. Il BREGMA (fontanella bregmale nei bambini) la saturazione definitiva delle ossa craniche , l'atlante stereotassico contiene fotografie/disegni che corrispondo alle sezioni FRONTALI, ROSTRALI E CAUDALI DEL BREGMA. Ogni pagina fa riferimento alla distanza della sezione anteriore, posteriore al bregma. La griglia di ogni pagina indica le distanze delle strutture cerebrali in direzione DORSALE-VENTRALE/LATERALE-MEDIALE. Da precisare che le coordinate sono approssimative quindi necessario provare di volta in volta le coordinate: osservare l'effettiva localizzazione, colorare il tessuto

cerebrale, correggere i numeri. Metodi Istologici Dopo aver visionato il comportamento post -lesione dell'animale necessario prelevare il tessuto. Queste sono le seguenti fasi : PRELEVARE, FISSARE, SEZIONARE E COLORARE. PERFUSIONE : il tessuto viene sottoposto a una tecnica che consiste nella rimozione del sangue e la sua sostituzione con soluzione fisiologica. A questo punto, in assenza di sangue i risultati istologici saranno molto migliorati. FISSAZIONE: distruggere gli enzimi autolitici, ci si ottiene attraverso l'immersione del tessuto in un bagno fissatore, il liquido utilizzato comunemente la FORMALINA (soluzione acquosa del gas formaldeide) che blocca l'autolisi e permette l'indurimento del tessuto per poterci lavorare. Dopo aver fissato il cervello occorre colorarlo finemente per evidenziare i dettagli anatomici. LA SEZIONE VIENE EFFETTUATA TRAMITE IL MICOROTOMO formato da un bisturi, piattaforma dove montare il tessuto e un meccanismo per permettere l'avanzamento del bisturi. Questo dispositivo serve a TAGLIARE A FETTE SOTTILI il tessuto da esaminare. Inoltre la piattaforma include un dispositivo per congelare il cervello. Infine il tessuto viene ricoperto di liquido trasparente, definito mezzo di montaggio. I coloranti Franz Nissl scopr un colorante definito BLU DI METILENE in gradi di evidenziare selettivamente i CORPI CELLULARI del cervello. Il prodotto finale che assorbe il colorante chiamata SOSTANZA DI NISSL che formata da DNA- RNA e Proteine associate , localizzate nel nucleo e disperse nel citoplasma. ALTRO COLORANTE: CRESIL VIOLETTO (originariamente utilizzato nel campo tessile) , da precisare che il colorante non selettivo e colora tutte le cellule allo stesso modo, sia neuroni che glia. ESAME AL MICROSCOPIO ELETTRONICO Per visualizzare strutture piccole come organelli, vescicole etc. occorre il microscopio elettronico a trasmissione. Lo strumento fa passare un fascio di elettroni nel tessuto e l'ombra di esso rimane impressa su una pellicola fotografica. PRODUCE MICROFOTOGRAFIE ELETTRONICHE riportando dettagli di POCHE DECINE DI NANOMETRI. MICROSCOPIO ELETTRONICO A SCANSIONE Permette un MINORE INGRANDIMENTO, ma produce immagini tridimensionali. Lo strumento passa in scansione il tessuto attraverso un fascio di elettroni in movimento. Le informazione sono percepite da un rilavatore , attraverso il computer si producono immagini tridimensionali estremamente dettagliate MICROSCOPIO CONFOCALE A SCANSIONE LASER Questo microscopio permette L'ESPLORAZIONE DI TESSUTI SPESSI, ANCHE MANTENUTI IN COLTURE. Oltretutto permette di visualizzare strati di

CERVELLO SUPERFICIALE IN VIVO ESPOSTO. Questa tecnica richiede che le CELLULE SIANO COLORATE APPOSITAMENTE CON UN COLORANTE FLUORESCENTE con TECNICA IMMUNOCITOCHIMICA. Es. I neuroni che producono un particolare peptide possono essere etichettati con colorante fluorescente. Un fascio di luce di un colore proiettato da un laser che passa tramite uno specchio, la luce riflessa dalle molecole viene letta da un altro specchio che produce immagini. Un'apertura a foro blocca tutta la luce emessa dal tessuto eccetto quella di una certa profondit. Modificando la localizzazione dell'apertura focale possibile ottenere numerose immagini di sezioni tessutali di varia profondit. Ci permette di trattare il tessuto in vivo. TRACCIAMENTO DELLE CONNESSIONI NEURALI Questa tecnica ci aiuta a scoprire le connessioni preposte alle strutture cerebrali. Tracciamento assoni efferenti- Marcatura anterograda (che si muove in avanti) In questa tecnica sono utilizzate sostanze chimiche che vengono assorbite dagli assoni fino ai bottoni terminali. Sono delle FIBRO PROTEINE in grado di legarsi a specifici complessi proteici LECTINE. LA LECTINA UTILIZZATA PER IDENTIFICARE GLI ASSONI EFFERENTI LA PHA-L. Essa viene iniettata nel nucleo d'interesse, dove vengono assorbite dai : Dendriti->Soma->Assoni->Bottoni terminali attraverso il trasporto assoplasmatico rapido. Dopo poco tempo dall'iniezione la sostanza si diffonde in tutte le ramificazioni. A questo punto si uccide l'animale , si prepara e seziona il cervello e lo si monta sui vetrini utilizzando tecnica immunocitochimica per rendere le molecole di PHA-L visibili. I METODI IMMUNOCITOCHIMICI Sfrutta la reazione immunitaria Il sistema immunitario produce anticorpi in risposta agli antigeni. Gli antigeni sono proteine (peptidi) presenti sulla superficie di batteri/virus . Gli anticorpi prodotti dai leucociti distruggono i microrganismi che invadono il corpo. Possono essere prodotti dai globuli bianchi. Le molecole anticorpali si attaccano a vari tipi di coloranti. Alcune reagiscono con altre sostanze chimiche colorando il tessuto di marrone. Altri coloranti sono fluorescenti e brillano se esposti a lunghezze d'onda specifiche. Per determinare il peptide/proteina il ricercatore immerge il tessuto in una soluzione che contiene anticorpi /coloranti, l'anticorpo si attacca all'antigene corrispondente . Con un microscopio a specifica lunghezza d'onda possiamo individuare l'antigene in questione anche di singoli neuroni. Le sezioni cerebrali sono trattate con anticorpi alla PHAL-L attaccato ad un colorante che lo rende marrone/rossiccio. TRACCIAMENTO DEGLI ASSONI AFFERENTI- MARACATURA RETROGRADA (che si muove all'indietro) Questa tecnica impiega sostanze che sono assorbite dai bottoni terminali->trasportate agli assoni->fino al corpo cellulare. Ci avviene sempre per mezzo del trasposto assoplasmatico, la procedura la stessa utilizzata per il tracciamento anterogrado solo che la lectina in questione NON PHA-L MA FLUOROGOLD. Attraverso ci si pu risalire alle regioni che mandano impulsi al tessuto esaminato. I METODI DI MARCATURA ANTEROGRADA E RETROGRADA

IDENTIFICANO UNA SINGOLA CONNESSIONE NELLA CATENA NEURALE MENTRE I METODI DI MARACATURA TRANSNEURONALE INDENTIFICANO UNA SERIE DI CONNESSIONI , QUESTA TECNICA UTILIZZA UN VIRUS DELLA PSEUDORABBIA (herpes virus del maiale indebolita). Si inietta nel tessuto cerebrale dove penetra nei neuroni e li infetta, prolifera con passando l'infezione ai neuroni con cui i primi formano connessioni sinaptiche. Alcune cellule muoiono altre sopravvivono PERMETTE DI TRACCIARE CIRCUITI IN DIREZIONE ANTEROGRADA CHE RETROGRADA. Una volta che il tessuto prelevato si ricerca una proteina prodotta dal virus attraverso metodi immunocitochimici. Queste tecniche ci permettono di IDENTIFICARE IL DIAGRAMMA DEI CAVI DI COLLEGAMENTO. Anterograda es. 1a iniezione di PHA-L nell'IVM 1b Osservare in seguito gli assoni e i bottoni terminali nelle PAG Retrograda 2a iniezione di fluorogold nell'IVM 2b osservare le cellule dell'amigdala mediale STUDIO DEL CERVELLO UMANO IN VIVO Tac (tomografia computerizzata) La prima tecnica sviluppata quella della TC (scansione tc). Si posiziona la testa del pz. In un grande anello che contiene un tubo a raggi x e dall'altra un lettore che legge i raggi x . Il fascio di raggi x attraversa la testa del pz. E il rilevatore misura la radiottivit che non viene assorbita. PRODUCE SCANSIONI SOLO NEL PIANO ORRIZZONTALE . RM (Risonanza Magnetica) La macchina della RM simile a quella della T C, MA NON UTILIZZA RAGGI X . INDUCE UN FORTE CAMPO MAGNETICO ATTRAVERO LA TESTA DEL PZ. Ci provoca la rotazioni di alcuni atomi corporei secondo orientamento particolare, se si passa un'onda di RF attraverso il corpo questi nuclei emettono radio frequenze proprie. LO SCANNER DELLA RM PREPOSTO A RILEVARE RADIAZIONI EMESSE DALLE MOLECOLE DI IDROGENO. PRODUCE SCANSIONI LUNGO IL PIANO SAGITTALE, FRONTALE E ORIZZONTALE. REGISTRAZIONE E STIMOLAZIONE DELL'ATTIVIT NEURALE. Lo studio del cervello tramite registrazione o stimolazione di alcune regioni serve perch diverse percezioni e risposte comportamentali implicano differenti attivazioni cerebrali. REGISTRAZIONE DELL'ATTIVIT NEURALE EEG Gli assoni producono potenziali d'azione e i bottoni terminali sollecitano potenziali

post sinaptici sulle membrane delle cellule su cui formano sinapsi. Questa serie d'attivit pu essere REGISTRATA TALI MODIFICAZIONI DELL'ATTIVIT BIOELETTRICA CI POSSONO FAR CAPIRE QUALE REGIONE GIOCA UN RUOLO CARDINE IN VARI COMPORTAMENTI. SI Pu REGISTRARE : ALLA PRESENZA DELLO STIMOLO, IN FASE DECISIONALE E DURANTE IL COMPORTAMENTO. LE REGISTRAZIONI POSSONO ESSERE: CRONICHE, ossia effettuate ad lungo periodo di tempo , di solito dopo intervento chirurgico; ACUTE: effettuate in un periodo breve, mentre l'animale SOTTO ANESTESIA. PER LO Pi LE REGISTRAZIONI ACUTE FANNO RIFERIMENTO ALLO STUDIO DELLE SOLE VIE SENSORIALI dato che l'animale sotto anestesia non pu attuare comportamenti motori. REGISTRAZIONI CON MICROELETTRODI Ad esempio possiamo constatare che farmaci che modificano l'attivit dei neuroni serotoninergici e noradrenergici influenzano il sonno REM. Per registrare l'attivit di questi neuroni utilizziamo MICROELETTRODI, essi possiedono una punta sottile che riesce a registrare L'ATTIVIT DI OGNI SINGOLO NEURONE. Si impiantano tramite chirurgia stereotassica, al risveglio l'animale viene collegato all'apparecchio, solo che i segnali rilevati devono essere amplificati e registrati su un OSCILLOSCOPIO e immessi nella memoria di un computer. SI MONITORIZZA LA VELOCIT DI DEPOLARIZZAZIONe. Durante la fase del sonno REM notiamo che l'attivit dei neuroni noradrenergici e serotoninergici quasi azzerata. REGISTRAZIONE CON MACROELETTRODI A DIFFERENZA DELLA TECNICA PRECEDENTE, I MACROELETTRODI REGISTRANO L'ATTIVIT DI INTERE POPOLAZIONI DI NEURONI. Quindi rilevano migliaia di potenziali post sinaptici. Di solito si presentano come fili non appuntiti . La registrazione viene effettuata tramite lo scalpo , utilizzata sopratutto per la valutazione di focolai epilettici, questi strumenti vengono collegati ad uno oscilloscopio (poligrafo) che indicano grandi voltimetri che procedono avanti e indietro in risposta al segnale elettrico. Le registrazioni sono definite (EEF) ELETTROENCEFALOGRAMMA -TRACCIATO GRAFICO DELL'ATTIVIT CEREBRALE-. MAGNETOENCEFALOGRAFIA L'attivit neurale produce campi magnetici molti piccoli. Grazie agli SQUID Dispositivo superconduttore di interferenza quantistica rileva campi magnetici molto piccoli (1 miliardesimo del campo terrestre) Per effettuare la magentoencefalografia c' bisogno di un NEUROMAGNETOMETRO apparecchio che contiene una SERIE DI SQUID orientati in modo che il computer possa esaminare i dati e calcolare la fonte dei segnali prodotti dal cervello. Pu ESSERE IMPIEGATA PER LOCALIZZARE

FOCOLAI EPILETTICI E MISURARE L'ATTIVIT CEREBRALE durante compiti cognitivi/comportamentali. REGISTRAZIONE DELLattivit METABOLICA E SINAPTICA DEL CERVELLO Lattivit neuronale quando sottoposta ad un lavoro eccessivo AUMENTA la propria attivit metabolica a causa della sollecitazione delle pompe ioniche. LAUMENTO METABOLICO Pu ESSERE MISURATO CON 2 DEOSSIGLUCOSIO (2DG) RADIOATTIVO INIETTATO. E molto simile al glucosio per cui assorbito dalle cellule, in maggior misura da quelle pi attive . ESSO NON pu ESSERE METABOLIZZATO. Dopo averlo iniettato e propagato si uccide lanimale, si rimuove il cervello e lo prepariamo per LAUTORADIOGRAFIA (produrre un tracciato con le proprie radiazioni) le molecole si evidenziano come granuli argentati. LE REGIONI + ATTIVE SI PRESENTANO + SCURE ALLINTERNO DELLEMULSIONE. ALTRO METODO: GENI PRECOCI IMMEDIATI si attivano quando i neuroni comunicano tra di essi, si legano a loro volta a PROTEINE SPECIFICHE di seguito si congiungono a CROMOSOMI NUCLEARI questo fattore indica che la cellula stata appena attivata. UNA PROTEINA NUCLEARE PRODOTTA DURANTE LATTIVAZIONE CELLULARE LA FOS. REGISTRAZIONE DELLATTIVAZIONE NEURALE METABOLICA NEGLI UMANI , SI UTILIZZA LA PET (TOMOGRAFIA A EMISSIONE DI POSITRONI) Si inietta nel pz. 2DG RADIOATTIVO dopo si inserisce lo stesso pz.. in un apparecchio simile alla TAC, quando 2DG si scindono emettono POSITRONI rilevate dallo scanner . Il pc indica le zone che ne hanno assorbito di pi (indica maggiore attivit metabolica). LEMIVITA DEL 2DG 110 MIN. ALTRA SOLUZIONE UTILIZZATA IN QUESTA TECNICA LACQUA RADIOATTIVA CON EMIVITA DI 2 MIN . Queste molecole sono prodotte al momento in un ACCELERATORE DI PARTICELLE ATOMICHE (CICLOTRONE) LA PET RILEVA OGNI SOSTANZA RADIOATTIVA fRM RISONANZA MAGNETICA FUNZIONALE MISURA IL METABOLISMO REGIONALE RILEVA I LIVELLI DOSSIGENO NEL SANGUE HA UNA MAGGIORE RISOLUZIONE DELLA PET, INFORMAZIONI + DETTAGLIATE. MISURAZIONI DELLE SECREZIONI CEREBRALI Tecnica utilizzata per rilevare NEUROTRASMETTITORI-NEUROMODULATORI in determinate regioni. Si utilizza un tubicino per effettuare la MICRODIALISI

pompando attraverso esso un liquido in piccola quantit, simile al liquido extracellulare, lo stesso scorre in un secondo tubicino da cui aspirato e analizzato, permettendo di rilevare il liquido extracellulare delle cellule nervose che passando attraverso una membrana permeabile selettiva e d la possibilit di rilevare neurotrasmettitori e metaboliti rilasciati dai bottoni terminali. ES. rileviamo da uno studio che durante il sonno REM aumenta il rilascio di acetilcolina , prelevata dal liquido bulbare grazie alla micro dialisi. Grazie a questo neurotrasmettitore possiamo rimanere immobili durante questa fase del sonno mentre sogniamo. STIMOLAZIONE DELLATTIVIT NEURALE Serve per stimolare determinate aree e osservare leffetto sul comportamento . LA STIMOLAZIONE Pu ESSERE EFFETTUATA CON FILO METALLICO O STIMOLAZIONE CHIMICA ATTRAVERSO AMINOACIDO ECCITATORIO( acido glutammico/cainico) LA STIMOLAZIONE CHIMICA ATTIVA I CORPI CELLULARI E NON GLI ASSONI DEI NEURONI VICINI, PRODUCENDO EFFETTI PIU LOCALIZZATI. USIAMO LA MICROIONTOFORESI per valutare leffetto di una sostanza sullattivit di una singola cellula. Si utilizza una micro pipetta con un elettrodo associato che rileva lattivit di una cellula . Viene iniettato un neurotrasmettitore/modulatore, il ph (acido-base) della soluzione permette di IONIZZARE le molecole quando lelettrodo si attiva e rilascia corrente, in questo modo tutte le molecole si depositano verso lesterno. Possiamo dedurre attraverso lelettrodo se quella cellula possiede recettori per la sostanza che andiamo ad iniettare. EFFETTI COMPORTAMENTALI DELLELETTROSTIMOLAZIONE CEREBRALI LINTERPRETAZIONE DIFFICILE perch LA STIMOLAZIONE ARTIFICIALE NON Pu MAI DUPLICARE I PROCESSI NEURALI NATURALI. Il pattern spaziale e temporale normale abolito con la stimolazione specifica di una regione. TALVOLTA USATA PER PRODURRE LESIONI TEMPORANEE, spesso queste stimolazioni possono PRODURRE MODIFICAZIONI ORDINATE DEL COMPORTAMENTO, si verifica quando le stimolazioni avvengono in REGIONI MODULATORIE DEL CERVELLO. STIMOLAZIONE MAGNETICA TRANSCRANICA Utilizza una bobina (COIL) da posizionare sulla sommit cranica, GLI IMPULSI PRODOTTI INVIANO CAMPI MAGNETICI ALLA CORTECCIA ATTIVANDO I NEURONI, stimolazioni a livello della corteccia associativa visiva alterano il rilevamento di stimoli visivi in movimento. Utilizzata anche per trattare la depressione.

METODI GENETICI STUDI SUI GEMELLI Un metodo importante per stimare linfluenza ereditaria la PERCENTUALE DI CONCORDANZA inerente al tratto in questione su coppie di gemelli omozigoti e eterozigoti. MONOZIGOTI (IDENTICI somiglianza genica) DIZIGOTI (SOMIGLIANTI AL 50%). Se entrambi i gemelli hanno ricevuto la stessa diagnosi si definiscono CONCORDANTI se invece la diagnosi riguarda un solo membro della coppia si definiscono DISCORDANTI. La concordanza sar pi alta nei gemelli monozigoti, per il cui fattore derivante come tratto ereditario. STUDI SULLADOZIONE Si confrontano le persone adottate in et precoce con i loro genitori e adottivi e biologici. I COMPORTAMENTI sono influenzati da fattori biologici e ambientali e dalla loro interazione . Quelli ambientali possono riguardare natura sociale o biologica . Se il bambino stato adottato dopo la nascita la maggior parte dei fattori post natali saranno associati fattori AMBIENTALI post natali CORRELATI AI GENITORI ADOTTIVI, mentre quelli genetici AI GENITORI BIOLOGICI. I FATTORI POSSONO ESSERE COMBINATI , quindi i fattori ambientali (genitori adottivi) e quelli biologici (genitori biologici) possono presentarsi promiscuamente. MUTAZIONI MIRATE Sono GENI MUTATI prodotti in laboratorio e INSERITI NEI CROMOSOMI DI TOPO, SONO GENI DIFETTOSI E NON RIESCONO A PRODURRE UNA PROTEINA FUNZIONALE. Il bersaglio un enzima che controlla una reazione chimica. OLIGONUCLEOTIDI ANTISENSO Questo metodo prevede LA PRODUZIONE DI MOLECOLE CHE BLOCCANO LA SINTESI DI PROTEINE CODIFICATE DI PARTICOLARI GENI UTILIZZANDO OLIGONUCLEOTIDI ANTISENSO. CONSISTE IN PARTICOLARI MOLECOLE DI DNA/RNA CHE SI LEGANO A SPECIFICHE MOLECOLE DI mRNA impedendo la loro sintesi proteica . Una volta che le molecole mRNA sono intrappolate , vengono distrutte da enzimi presenti nelle cellule. Questi nucleotidi antisenso contengono sequenze di basi complementari a quelle contenute nel m RNA . Questo metodo somiglia a quello utilizzato per libridazione in situ