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Fisiopatologia del Segnale: Lezione 1 e 2.

Per trasduzione del segnale si riferisce al movimento dei segnali che vanno
dallesterno allinterno della cellula. Trasduzione, un termine che indica che la
natura dello stimolo che viene ricevuto da una cellula completamente diverso dal
segnale che viene generalmente rilasciato allinterno della cellula. La comunicazione
tra due cellule molto importante, per tanto necessario la sintesi di molecole
segnale per attuarla. Se noi consideriamo un organismo unicellulare, tutte le funzioni
sono svolte dallunica cellula, quindi non ha bisogno di comunicare. Ma se
consideriamo un organismo pluricellulare le vari funzioni: assorbimento , digestione,
escrezione sono affidate a popolazioni cellulari diverse che si possono distinguere in
tessuti e organi, quindi necessario che le varie popolazioni cellulari comunicano tra
di loro. Abbiamo bisogno di processi che permettano alle cellule anche molto distanti

tra di loro di comunicare. La comunicazione cellulare pu essere distinta in elettrica e


chimica.
I due tipi di comunicazione differiscono tra loro per contenuto dellinformazione, la
destinazione del messaggio e velocit di trasmissione. La comunicazione elettrica la
ritroviamo al livello delle cellule neurali, neuroni, dove abbiamo un segnale di natura
elettrica che induce una variazione di potenziale della membrana. In questo caso le
informazioni contenute nel segnale elettrico sono minime: o esiste il messaggio o non
esiste. Mentre nella comunicazione chimica ha un contenuto di informazioni
notevolmente superiore a quella elettrica, perche la comunicazione chimica si avvale
di moltissime molecole segnale, quindi il contenuto di tipo massimo: se arriva una
molecola significa una cosa se ne arriva un'altra significa un'altra cosa. Unaltra
differenza tra i due tipi di comunicazione la destinazione del messaggio, che in
quella elettrica poco versatile perch la cellula che invia il segnale deve avere un
contatto diretto con la cellule che lo riceve. Nella comunicazione chimica la
destinazione selettiva perche non tutte le cellule hanno la capacit di rispondere al
segnale, solo quelle dotate dei recettori specifici per quella dato neurotrasmettitore

rilasciato dalla cellula. In quella chimica quindi, non abbiamo bisogno di connessioni
strutturali. La velocit di trasmissione nella comunicazione elettrica molto rapida:
infatti la propagazione di un potenziale dazione avviene molto velocemente anche per
lunghe distanze. Mentre la velocit di trasmissione nella comunicazione chimica
molto lenta in quanto le molecole di segnale devono essere sintetizzate, devono
essere riversate allesterno della cellula che invia il messaggio e si devono diffondersi
verso la cellula che riceve il messaggio.

SEGNALAZIONE CHIMICA:
SEGNALAZIONE TRAMITE MOLECOLE DI MEMBRANA PLASMATICA:
Nella segnalazione di natura chimica abbiamo una cellula che invia un messaggio
un'altra che la riceve. E in alcuni casi per affiche ci sia la trasmissione del segnale le
due cellule devono essere molto vicine tra di loro, in questo caso parliamo di
comunicazione diretta. La comunicazione diretta si verifica quando la molecola
segnale si trova sulla superficie della membrana plasmatica e in questo caso la
molecola interagisce in modo diretto con i recettori presenti sulla superficie della
cellula che riceve il segnale come possiamo osservare dallimmagine qui sotto

riportata. Questo tipo di segnalazione particolarmente importante durante lo


sviluppo e nella risposta immunitaria. Un altro tipo di comunicazione che vede
LA SEGNALAZIONE ATTRAVERSO LE GIUNZIONI STRETTE

Questo tipo di segnalazione quella che avviene attraverso le gap juction, proteine
canali che permettono di formare un poro tra due cellule e mettere in comunicazione il
citosol di due cellule continue . In questo caso abbiamo che una molecola messaggera
come il calcio, composti ciclici pu andare da una cellula allatra abbastanza

rapidamente e risulta importante durante lo sviluppo embrionale ma la funzione


principale e quella di facilitare il comportamento di cellule adiacenti, ossia tutte le
cellule connesse tra di loro che quindi rispondo in maniera asincrona ad un messaggio.

SEGNALAZIONE TRAMITE MOLECOLE SECRETE

Segnalazione Paracrina: una molecola segnale che viene secreta dalla cellula che
invia il messaggio e le cellule in grado di recepire il messaggio sono cellule che si
trovano in uno spazio adiacente, sono vicine alla cellula che produce la molecola
segnale. A questo punto possiamo vedere che la segnalazione sinaptica chimica
una segnalazione
di tipo paracrina specializzata, perche la segnalazione
paracrina si verifica quando si ha il rilascio di una molecola segnale che
agisce sulle cellule adiacenti. Esempio: Al livello di una sinapsi chimica che
abbiamo al livello della cellula muscolare. La molecola segnale si estende per un range
ristretto. In questo caso le cellule che ricevano il messaggio sono diverse tra di loro.
Endocrina: La cellula sintetizza ormoni che sono riversati nel torrente circolatorio e
distribuiti per tutto lorganismo, solo le cellule capace di riconoscere lormone
innescano la risposta. Ci sono molte molecole segnale che possono agire sia al livello
endocrino e paracrino.
Autocrina: La cellula che invia il messaggio e che riceve il messaggio sono della
stessa natura, stessa tipologia, ci ha il vantaggio che si possono coordinare quelle
decisione di gruppo di cellule uguali tra di loro contemporaneamente, quindi il segnale
non agisce solo sulla cellula che lha inviata, ma il segnale pu agire anche sulle
cellule uguali a se stessa. In questo caso il messaggio rilasciato a cellule uguali.

INTEGRAZIONE CELLULARE:
Sulle cellule arrivano una miriade di messaggi, non arriva solo uno!Pertanto solo le
cellule che hanno i recettori daranno una risposta a quella molecola segnale. Per c
da considerare che un recettore deve essere dotato di una certa specificit e affinit
di legame per una specifica molecola.

La specificit la caratteristica di un recettore di riconoscere una sola


molecola tra le tante.
Per affinit intendiamo lavidit con cui il recettore lega la molecola segnale.
Questa avidit risulta essere diversa asseconda della tipologia di comunicazione
cellulare presa in esame.

Per esempio nel caso di una comunicazione paracrina, prendiamo il caso di una
sinapsi. Quando i neuro trasmettitori vengono rilasciati allesterno della sinapsi
essendo che lo spazio che separa la cellula pre-sinaptica dal quella post-sinaptica
minima, la concentrazione (n/v) rilasciata nello spazio sinaptico sar molto elevata! I
recettori di membrana della cellula post-sinaptica, presenteranno un affinit di legame
non molto alta per le molecole segnale perch il recettore entra in contatto con una
concentrazione elevatissima di ligando , quindi non necessit di una affinit molto alta
per legare la molecola in quanto molto abbondante. Mentre nel caso della
comunicazione di tipo endocrina, la concentrazione della molecola segnale diluita
nel flusso sanguigno. Per tanto il recettore di membrana deve avere un affinit pi alta
per legare la molecola.
Molecole:
Inizialmente si riteneva che potevamo dividere le molecole segnale in molecole
lipofiliche e idrofiliche. Le prime attraversano la membrana,quindi presentavano il
recettore allinterno della cellula. Le seconde non p attraversare la membrana allora
presentavano il recettore al livello superficiale. La seconda mi piace, fila allora
abbiamo una molecola idrofilica incapace di passare la membrana quindi ha recettore
sulla superficie, quindi la molecola segnale si trova allesterno della cellula. Ci
significa che il legame della molecola segnale con il recettore di membrana esterno
porter alla trasduzione di un secondo messaggero intracellulare.

Come possiamo osservare dallimmagine a destra,quando i recettori di membrana


legano la molecola segnale esterna nella cellula abbiamo un rapido incremento del
secondo messaggero la cui concentrazione aumenta repentinamente allinterno della
cellula, quindi la sua concentrazione superiore al primo messaggero ossia la
molecola segnale. Quando abbiamo un recettore superficiale questo succede: la
sintesi di un secondo messaggero. Inizialmente si pensava che solo quelle idrofili che
avessero un recettore di membrana! Quelle lipofiliche passavano attraverso il doppio
strado lipidico e trovavano il recettore allinterno della cellula e solo quando avveniva
il legame con questo si attivava una risposta cellulare. In questo caso le molecole
lipofiliche erano loro stesse a portare il messaggio allinterno della cellula. Negli ultimi
anni si scoperto che le molecole lipofiliche possono presentare sia recettori interni
ma anche sulla superficie della membrana plasmatica. Oggi i recettori di membrana
possono benissimo legare una molecola lipofilica. Una molecola che viene trasportata
allinterno della cellula trover un recettore allinterno della cellula. Si giunta a
questa conclusione in quanto si visto che:
1. Sulla membrana plasmatica sono presente delle proteine carrier, o
pretenie trasportatrici, che velocizzano il trasporto delle molecole
lipofiliche (acidi grassi) con minimo consumo di energia.
2. Ormoni tiroideei, sono ormoni hanno bisogno di specifici trasportatori
che ne favoriscono lingresso. Quindi ci sono recettori sia superficiali
che interni.
3. Gli ormoni steroidei che derivano dal colesterolo, presentano una
natura lipofilica ma presentano sia recettori allinterno della cellula e
allesterno di questa

LA INTEGRAZIONE DI SEGNALE:
Su una cellula arrivano numerosi segnali e la risposta cellulare dipende dalla presenza
simultanea di pi segnali che arrivano contemporaneamente sulla cellula. Su una
cellula devono arrivare tre segnali affinche possa sopravivere, se ne arrivano altri due
la cellula si dividera. Quindi la vita e il destino di una cellula dipende da quanti e quali
messaggi arrivano contemporaneamente. Se per esempio arriva:
A+B+C= SEGNALI PER LA SOPRAVIVENZA
(A+B+C+) + (D+F)= LA CELLULA SI DIVIDE
(A+B+C)+(F+G) = LA CELLULA SI DIFFERENZIA
LA CELLULARE SE NON ARRIVA NESSUN SEGNALE MUORE.
Quindi in base alla tipologia e numeri di segnale che giunge alla cellula questa
risponde con una definita risposta cellulare. Quindi la cellula ha necessit di multipli
segnale per sopravvivere, per differenziarsi o per dividersi. Assenza a specifici segnali
di sopravivenza porta a morte cellulare. Le risposte non dipendono solo da un
messaggio molto spesso la risposta cellulare deriva, il risultato dellintegrazione dei
segnali che arrivano sulla cellula. Per integrazione significa somma dei segnali che
giungono alla cellula. Esempio io ho un messaggio che stimola una via enzimatica
arriva contemporaneamente un messaggio che inibidisce la via enzimatica, quindi la
risposta sar data dalla somma di questi due segnali assieme. Quindi risposta di una
cellula ad un segnale dipende dalla presenza di altre molecole segnale. Quando
abbiamo a che fare con un recettore di superficie abbiamo varie tappe chiave che
sono:

Sintesi della molecola segnale dalla cellula produttrice

rilascio della molecola segnale

trasporto alla cellula bersaglio;

legame con specifici recettori;

evocazione di un evento cellulare; (risposta cellulare)

inattivazione
intracellulare.

della

molecola

segnale

anche

il

messaggero

Una stessa molecola segnale pu indurre una risposta cellulare diversa in


cellule bersaglio diverse. Prendiamo in esame laceticolina, questo neuro
trasmettitore al livello della muscolatura striata scheletrica determina una
contrazione muscolare. Mentre al livello del muscolo cardiaco determina un
processo inverso, ossia il rilassamento della mescolatura. In una ghiandola
salivari lacetilcolina induce la secrezione delle sostante. Ma da cosa dovuta
questa situazione allora?Allora se ho una stessa molecola messaggera ed ho
uno stesso recettore per due cellule, io posso avere una risposta diversa perch
le due cellule prese in esame sono di NATURA differenti, sono DIVERSE!Esempio
cellula cardiaca e secretoria: stesso recettore ma risposta diversa. Ma tra la
cellula muscolare scheletrica e quella cardiaca? In questo caso le due cellule
sono della stessa natura, condividono la stessa cellula segnale ma la risposta
diversa. Da cosa dovuto?Semplicemente dal fatto che il recettore di
membrana diverso! Quindi possiamo dire che la risposta cellulare indotta da
un secondo messaggero pu essere uguale o non uguale nelle cellule
asseconda della natura della cellula stessa e del recettore. Se cellule della
stessa natura presentano recettori diversi allora la risposta sar diversa, se
cellule di diversa natura hanno recettori uguali allora la risposta sar diversa.
Nella mescolatura scheletrica il recettore dellacetilcolina una proteina canale,
mente nella cellula muscolare caridaca il recettore non una proteina canale
ma una proteina metabotropa ossia associata alla proteina G. Quindi la
risposta di una cellula a una specifica risposta cellulare dipende da:

La risposta di una cellula ad una specifica molecola segnale


determinata da:
tipo di recettore espresso dalla cellula
via di trasduzione del segnale attivata dal legame dell' ormone con il
suo recettore
dalla specializzazione della cellula.

Affinit di legame:
R+LRL

Quando un recettore di membrana ha una definitiva affinit e


specificit per legare un ligando si crea il complesso ligandorecettore. Allequilibrio la velocit di formazione del complesso
ligando reccetore uguale alla velocit di dissocazione del
complesso. Supponiamo di avere un tott numero di recettori
quando io non ho ligando il recettore non legato, man mano
che aumento la concentrazione di ligando aumenta la quota di
recettore legato al ligando. Quindi man mano che aumento la
concentrazione
di
ligando
sar
maggiore
sar
la
concentrazione del complesso ligando recettore. Fino a
quando pu aumentare questo complesso?Fino a quando tutti
i recettori sono stati occupati. Guardiamo la linea verde, man
mano che aumento la concentrazione di legando aumenta il
complesso ligando recettore, per legarlo ci deve essere
chiaramente una concentrazione minima di ligando altrimenti
non si crea il legame e ci dovuto dallaffinit di legame.
Man mano che aumentiamo la concentrazione di ligando si ha
laumento della occupazione recettoriale e in questo caso
sullasse delle x abbiamo la concentrazione del ligando e
sullasse delle y la percentuale di occupazione. Man mano che
io aumento la concentrazione di ligando aumento la quota di
ricettori che si legano al ligando fin quando non si arriva alla
saturazione: tutti i recettori sono impieganti nel legame. La
costante di dissociazione la concentrazione di ormone che
allequilibrio che comporta loccupazione del 50 % dei
recettori. Nel grafico sono riportate tre curve, una rossa, una
verde e una blu. La curva blu ha una Kd pi bassa della verde
e della rossa, perch il cinquanta percento delloccupazione
recettoriale si raggiunge nel caso della linea blu con un
concentrazione di ligando pi bassa rispetto alle altre due
linee. Valutando il valore di KD della curva blu, possiamo
capire che in questo caso laffinit dei recettori, ci lavidit
con la quale un recettore lega un ligando, risulta essere pi
alta delle altre curve!La curva blu risulta essere pi affine,
perch la Kd inversamente proporzionale allaffinit. Perch
minore la Kd pi alta sar laffinit. Quindi se un recettore ha
un avidit di legame maggiore per un dato ligando la

concentrazione di ligando necessaria per occupare il 50%dei


recettori sar pi bassa.

KD inversamente proporzionale allaffinit, perch minore Kd pi


alta laffinit. In realt sono proprio il reciproco, in quanto -1/kd
la costante di affinit. Ora vediamo come calcolare laffinit di
legame!Come la quantifichiamo? Vediamo! Allequilibrio uguale a
(1) ossia il rapporto tra il prodotto tra la concentrazione di recettori

liberi e di ligando libera e il complesso recettore-ligando. Questa


la costante di
Il recettore non legato ottenuta tramite la differenza tra recettori
totali meno quelli legati. A questo punto sostituiamo R allinterno
della formula di partenza.
Successivamente andiamo a fare
semplicemente le operazione matematiche che ci portano a

arrangiare la formula. Quella che otteniamo un equazione di una


retta:

y=ax+b

a= coefficiente angolare della retta.


y=RL/L
x= RL
Io riesco dalla pendenza della rotte a calcolare -1/KD che laffinit!
Tanto maggiore sar la pendenza della retta tanto maggiore sar
affine il ligando. Un retta di questo tipo nella pratica si ottiene
quando hai solo un tipo di recettore che la lega una molecola
sempre allo stesso modo, con la stessa affinit. La cellula
dinamica se io ho tanto ligando la cellula dice basta ho capito che ci
sei, quindi anche io se aumento nel tempo questo ligando non che
la cellula mi risponde sempre. La cellula dinamica, risponde
dinamicamente al ligando: arriva il messaggio, la cellula risponde,
se la concentrazione di ormone rimane la stessa la cellula risponde
sempre di meno perch avviene una desensitizzazione recettoriale:
desentitizzare una cellula significa o rimuovere i recettori dalla
cellula o far si che i recettori che stanno sulla cellula perda affinit
per il ligando. Allora non ci possiamo aspettare una bella retta cos
nella maggior parte delle situazioni vedremo che abbiamo delle
curve, perch abbiamo i fenomeni di coperativita negativa e

positiva:quello che vogliamo capire due recettori se interagiscono


tra di loro cosa succede? Che il primo recettore ha legato il ligando,
ci pu modificare laffinit del secondo recettore. In questo caso si
parla di fenomeni di operativit positiva o negativa. Oppure un
recettore viene fosforilato dopo la risposta cellulare, che mi modula
laffinit del recettore per il ligando. Il recettore ha legato il ligando,
la cellula risponde attivando delle chinasi queste mi vanno a
fosforilare il recettore e fa perdere affinit per il ligando, diminuisce
la sua affinit quindi risponde meno. Perdere affinit significa che
per
avere di nuovo una risposta si deve aumentare la
concentrazione di ormone.
Lezione 2:Fisiopatologia.
Nella comunicazione paracrina, endocrina, ecc, laffinita per il
recettore per il ligando varia. In una comunicazione di tipo
endocrina poich viene lasciato al torrente circolatorio la
concentrazione dellormone bassa quindi i recettori presentano un
alta affinit per il ligando. Quindi appena vede il ligando lo lega.
Laffinit una caratteristica specifica del recettore. La formazione
del complesso recettore si ha quando il ligando e il recettore si
legano. Kd si misura in concentrazione molare. Io non riesco a
calcolare direttamente la concentrazione esatta della Kd ho biosgno
di convertire questa curva che otteniamo con una retta. Questa
conversione la facciamo con delle formule matematiche per

quantificare in questo modo la KD guarda su quaderno.


Il coefficiente angolare della retta la costante di affinit.
Io in questo modo riesco a calcolare la costante di affinit.

(guarda quaderno). Per sappiamo che laffinita per un recettore per


il proprio legando pu variare in varie condizioni. Quando il ligando
lega il recettore si scatena una risposta cellulare, per questa
risposta cellulare non costante, nel senso una volta che la risposta
stata innescata arrivano dei processi che fanno si che la cellula
risponda differentemente al ligando. Se abbiamo una riduzione
dellaffinit del recettore, per avere la stessa occupazione
recettoriale, avr bisogno di una quantit di legando in pi. Per
rispondere allo stesso modo la cellula dovr avere una
concentrazione di ligando superiore a quella di prima. La cellula non
risponde alle varazioni assoluti di ormoni o di ligando ma risponde
alle varazioni relative, ci se io ho una concentrazione costante la
cellula risponde ma non in maniera forte, per avere una risposta
maggiore devi aumentare la concentrazione di ormoni. La cellula
non risponde esclusivamente ai livelli di ormoni ma alle varazioni
relative di ormoni. Allinizio la cellula non aveva lormone, lormone
arriva e la cellula risponde se questo ormone rimane in una cetra
concentrazione la cellula continua a rispondere ma in maniera
sempre meno forte, quindi andiamo incontro a una risposta
decrescente. Per farlo rispondere come la prima volta, abbiamo
bisogno di un incremento dello concentrazione di ligando/ormone.
Questa la prima possibilit, ossia il recettore cambia la sua affinit
dopo che si legato al ligando. La relazione lineare, ci la retta la
otteniamo quando abbiamo un solo tipo di recettore che lega una
sola molecola e la sua affinit sempre la stessa. Supponiamo da
avere sulla cellula due recettori che legano la stessa molecola. Uno
con affinit pi alta e laltro con affinit pi bassa cosa succede? Se
ho due classi di recettori a diversa affinit qual quello che viene
interessato nel legame con il legando per primo?Quello con
maggiore affinit e dopo quello a bassa affinit. Se ho due classi di
recettori uno ad alta affinit e laltra ad bassa affinit, quindi ho due
recettori diversi che si comportano in modo diverso. Quindi avr
uno con bassa affinit, quindi coefficiente angolare basso, mentre
alta affinit significa che avr un coefficiente angolare alto. Grafico
quaderno. Lanalisi che viene fuori una curva che tiene conto
dellanalisi dei due recettori individuali, quindi delle due rette: prima
quella ad alta affinit e poi a quella a bassa affinit. Analisi di
Scatchard non lineare il grafico che ti permette di analizzare le

affinit di un recettore per un ligando . Questo grafico pu essere


una sola retta quando abbiamo a che fare con un solo recettore che
ha sempre la stessa affinit per il ligando. Lanalisa di Scatchard
non li neanre si pu ottenere per due motivi:
ci sono pi recettori ad affinita diversa, uno ad affinit pi alta
e laltro ad affinit pi bassa
2)fenomeni di coperativita negativa o positiva.
Supponiamo di avere un recettore che lega un ligando con una
certa affinit. Il legame del ligando con il recettore pu influenzare
positivamente o negativamente il legame di una seconda molecola
di ligando ad un altro recettore. Chiaramente i recettori
interagiscono tra di loro, sono dimerici. Se noi abbiamo coperativit
negativa, abbiamo che laffinit del recettore diminuisce
allaumentare della concentrazione di ligando. Se io ho un processo
di coperativit negativa il legame del ligando al recettore e in grado
di influenzare negativamente il legame di una seconda molecola di
ligando al recettore,i due recettori devono interagire sono in forma
dimerica, in quanto allaumentare della quantit chiaramente i due
recettori devono interagire tra di loro, sono in forma dimerica e
sono uguali, sono le stesse proteine. Abbiamo una retta quando
abbiamo un tipo di recettore che lega sempre il ligando con la
stessa affinit. Avr una curva quando ho due recettori di classi
differenti, diversi tra di loro, che legano lo stesso ligando otteniamo
una curva. Abbiamo nuovamente una curva quando abbiamo lo
stesso tipo di recettore che lega il ligando con diversa affinit
asseconda della concentrazione di ligando, ci abbiamo fenomeni di
operativit positiva o negativa. Il legame del ligando al primo
recettore nei fenomeni di operativit porta a un cambio
conformazionale del primo recettore che induce un aumento o una
diminuzione dellaffinit del secondo recettore. Chiaramente i
recettori sono vicini.

Bound Hormone: concenctrazione ligando Bound/Free=


EC50:

Se linsulina lega il suo recettore sul muscolo vediamo che come


risposta cellulare induce il rilascio di glucosio(up take). Mettendo a
confronto questi due grafici, possiamo notare che la concentrazione
di insulina sullasse delle x diversa. Quindi significa che per avere
una massima risposta abbiamo bisogno di una concentrazione di
ligando pi bassa di quella necesaria per saturare i recettori.

Esempio: supponiamo che io ho la saturazione dei recettori a


10.000 ng/ml di insulina. Mentre per avere la massima risposta
biologica ho bisogno di una concentrazione di insulina pi bassa,
per esempio 200 ng/ml. Quindi da queste osservazione possiamo
capire che per avere la massima risposta biologica non necessario
la completa occupazione recettoriale. A questo punto definiamo
Ec50: la concentrazione di ligando tale che si ha 50% della
risposta massimale. E chiaro che ec50 molto pi piccola della Kd,
perch ho bisogno di meno ormone per arrivare la risposta
semimassimale rispetto alla quantita di ormone necessaria per
semisaturare i recettori. Perch quindi la Ec50 risulta essere pi
bassa della Kd?Perch mentre la Kd rappresenta semplicemente
un fenomeno che vede coninvolto il legame del ligando con
il recettore allequilbrio, ec50 vede coninvolti i processi a valle
dei legame con il ligando, infatti nella cellula abbiamo il processo di
amplificazione:sulla cellula arriva un messaggio extracellulare, un
ormone che non permia attraversa alla cellula quindi si lega su un
recetettore presente sulla membrana plasmatica, ci implica la
sintesi di un secondo messaggero per esempio AMP ciclico e i
livelli sono notevolmente superiori al primo messaggero perch
nella cellula abbiamo un processo di amplificazione. Ogni Amp
ciclico porta allattivazione di proteine chinasi che vanno
catalizzare pi reazione, per esempio non va a fosforilare un solo
canale ma tantissimi canali e quindi i processi sono
aplificati.Quindi Ec50 riflette gli eventi conseguenti al legame
del ligando sul recettore e questi dipendono dalla velocit di
reazione enzimatiche che variano indipendemente dalloccupazione
recettoriale in quanto abbiamo il processo di amplificazione.Ec50
100 volte minore di Kd. Portiamo su uno stesso grafico la
curva che ci permette di descrivere il livello di occupazione e quella
che ci descrive la risposta massiamle in funzioe della
concentrazione di ligando:

La
curva
a
punti
rappresenta
biologica,
verso
perch
chiaramente
otteniamo a

tratteggiata
la risposta
traslata
sinistra
la
una

concentrazione pi bassa di ligando rispetto a quella necessaria per


avere loccupazione dei recettori. A destra la linea continua quella
che mi rappresenta la curva di occupazione. Osserviamo la curva
della risposta biologica: osserviamo che la massiam risposta la
otteniamo alla concentrazione di ormone x tale concentrazione
sulla curva di occupazione corrisponde al 20% di occupazione dei
recettori. Quindi non sono stati occupati tutti i recettore per avere
una risposta, ma una piccola parte. Ora la domanda ma che c
ne facciamo dei recettori in eccesso?Che fine fanno? Questi
recettori prendono il nome di spare receptors e sono recettori che
aumentano la probabilit di legame del ligando con il recettore. Il
legame ligando recettore un evento del tutto causale, dovuto a
collissioni per questo la cellula presenta pi recettori in modo tale
da aumentare la probabilit di legame con il recettore e avere una
risposta biologica. Permettono di rispondere anche a basse
concentrazioni di ligando. Il numero di questi recettori in eccesso
finalizato ad aumentare la probabilit di legame ligando-recettero in
modo tale che la cellula possa rispondere, avere una risposta
biologica, anche a concentrazioni di ligando pi basse, ANCHE PIU
BASSE di KD. Se non ci fossero questi recettori in eccesso le due
curve, quella di occupazione e quella della risposta biologica si
soprappongono.

Dopo che il ligando ha legato il recettore otteniamo la risposta


biologica. Dopo possiamo ottenere un processi di desentitizzazione,
la cellula risponde meno allormone. La risposta si riduce perch
diminuisce laffinit del recettore per il ligando o per un altro
processo ossia i recettori vengono internalizzati. Se vengono
internalizzati succede che ci sono meno recettori ma ci sono ancora
a sufficienza per rispondere. Quindi gli spare receptors garantiscono
la presenza di recettori anche se questi sono internalizzati perch la
cellula ha gi risposta. Poich ho minore numero di recettori, per
avere la stessa occupazione di numero di recettori occupati ho
bisogno di pi ligando. Una risposta biologica dipende dal tipo di
recettore, dalloccupazione recettoriale che pu variare in funzione
dellaffinit del recettore a parti di ormone e da tutta una serie di
processi a valle del legame ligando-recettore . La risposta dipende
anche dal numero di recettori totali sulla cellula, maggiore il
numero di recettori pi alta la probabilit
di una risposta
cellulare. Quando vado eliminare i recettori dalla membrana
plasmatica la cellula risponde ancora perch io ho questi recettori in
eccesso, pero per avere la stessa probabilit di formare ligandorecettore devo avere una concentrazione di ligando sia pi alta.

Risposta cellulare: Lezione 3

Lezione4: Interrutori Molecolari.


Interrutori Molecolari: ci sono delle molecole importanti nella
trasduzione cellulare, queste sono protenine che si trovano latenti
in uno stadio inattivo e quando arriva il segnale diventano attive.

Per attivare queste proteine abbiamo bisogno che possano legare


uno ione o mediate un cambio della conformazione tramite
fosforolazione. Laggiunta di un gruppo fosfato un gruppo carico
negativamente pu creare delle repulsioni tra cariche dello stesso
tipo o attrazione tra cariche opposte modificando in questo modo la
conformaione della proteine. Possono essere quindi fosforilate o
defosforilate in seguito alla presenza di un segnale. La fosforilazione
mediata tramite un enzima, la proteina chinasi, che media
lidrolisa di una molecola di Atp con il rilascio di un gruppo fosfato e
di una molecola di ADP.La proteina dopo essere stata fosforilata
rimane cosi fin quando non viene un altro processo che la
defosforilla tramite la fosfatasi e la inattiva. Altri interrutori
molecolari sono le proteine G: che possono essere suddivise in
proteine trimeriche e monomeriche. Le prime sono formate da una
subunita alfa e una beta-gamma mentre quella monomerica
formata da una sola subunit ossia quella alfa che molto simile
alla subunit alfa della proteina trimerica. Queste due subunit
hanno la capacit di legare il GTP, quando sono attive, e GDP
quando non sono attive. Puo passare da una confomazione in cui ha
un fosfato in meno(GDP) a una in cui ha un fosfato in pi (GTP).
Anche in questo caso quello che vari la presnza di un gruppo
fosfato che non legato covalentemene alla proteina ma legato al
GDP o GTP. La proteina anche in questo caso cambia conformazione
per fosforilazione. La subunit alfa legano il GTP e
successivamente lo idrolizano. Quando la subunit alfa, delle
proteine trimeriche e monomeriche, lega il GDP ci troviamo in
forma inattiva. Il rilascio del GDP, per passare in questo modo alla
fase inattiva a quella attiv, non avviene spontaneamente nelle
cellule trimeriche e monomeriche G ma avviene tramite lintervento
di proteine che interagiscono con la subunit alfa di entrambi e
inducono il processo di rilascio del GDP. Solo a questo punto che la
subunita alfa di entrambe le proteine potr legare il GTP e quindi
passare da una fase inattiva a quella attiva. A questo punto il GTP
dovr essere idrolizzato. Ora lidrolisi del GTP dovuta da un attivita
GTPasica intrinseca della proteina G che necessit di essere
attivata. Ma se parliamo d proteine G trimeriche, precisamente di
alcune isoforme di questa ossila le proteine GS, vediamo che
lattivit catalitica intrinseca motlo alta ci significa che la loro

attivit di idrolisi non necessit lintervento di altre molecole


esterne, infatti da sole hanno la capacit di attivare da sole la loro
capacit intrinseca di idrolisi. Per esempio le GS, attivano
direttamente ladenilato ciclasi. Per le proteine monomeriche e altre
trimeriche abbiamo bisogno della presenza di proteine in grado di
indurre lattivit Gtpasica di queste proteine. Loro spontaneamente
c lhanno lattivit GTpasica ma molto bassa ecco perch hanno
bisogno di un supporto che sono proteine Gap, proteine che
attivano lattivit GTPasica delle proteine G.

Tipi di Complessi di Segnalazione intracellulare:

La trasmissione di un segnale allinterno della cellulla avviene


tramite i complessi di trasmissione cellulare. Questi complessi sono
formati dallunione di pi proteine di segnalazione che si occupano
della trasmissione del segnale dal recettore a valle della cellula.
Tale complesso pu essere di pi tipologie. La prima tipologia che
prendiamo in esame il caso del complesso di segnalazione
preformato. In questo caso nei pressi di un recettore viene ad
assemblarsi tutto il complesso di segnalazione formato da una
impalcatura, le proteine scaffold, proteina molto grande dove sono
ancorate tutte le proteine di segnalazione. Questo tipo di
segnalazione molto precisa, rapida( velocit di trasmissione
alta) ed effeciente e viene utilizzata dai lieviti. In questo caso

linterazione tra il recettore e il complesso di trasmissione avviene


solo quando il ligando si lega al recettore ci permette lo sviluppo
del sito di legame che permettere linterazione del complesso con il
recettore. Una seconda tipologia di complesso quello in cui non
abbiamo proteine scafford ma la sua funzione viene svolta dallo
stesso recettore. In questo caso infatti il complesso di segnalazione
si forma solo dopo che il recettore ha legato il ligando in quanto solo
a questo punto si formera il sito di interazione tra il recettore e le
proteine di segnalazione. Un esempio pu essere il recettoretirosina chiansi, infatti dopo che il ligando si lega al recettore i
residuidi di tirosina del recettore vengono fosforilati dando vita cosi
ai siti di interazione del
delle proteine segnalazione che
riconoscono i gruppi fosfati e si legando a questi ultimi
assemblando cosi il complesso. In questo tipo di segnalazione
avviene in modo molto pi lento rispetto al prima ma in compenso il
segnale viene amplificato.Il meccanismo di amplificazione il
seguente: arriva una prima proteina di segnalazione, questa
riconosce il recettore, si lega a questo e viene fosforilata e
successivamente si allonata in modo che possa arrivare un'altra
molecola segnale che possa essere fosforilata e che si possa
succesivamente allontanarsi.
Integrazione dei segnali: La cellula in alcuni casi pu rispondere
solo se due messaggi arrivano contemporaneamente su di essa. Per
esempio supponiamo che una proteina deve essere doppiamente
fosforilata per essere attiva e portare cosi il segnale a valle. In
questo caso la prima fosforilazione della proteina si verifica quando
ad un primo recettore si lega un ligando che attiva una prima via di
trasduzione che porta alla fosforilazione della proteina. Per se la
proteina fosforilata una sola volta non diventa attiva. Allora
necessario che arrivi un secondo segnale su un altro recettore che
permetta lattivazione di un'altra via segnalazione, con un'altra
chinasi, che porti alla seconda fosforilazione della proteina. Una
seconda tipologia di integrazione dei segnali si verifica quando per
esempio per avere la trasduzione del segnale a valle della cellula
necessario che una proteina, in forma dimerica, si assembli. Per fare
ci indispensabile che le due subunita siano fosforilate per tanto
necessario lintervento di due segnali che danno vita a due vie di

sengnalazione diverse che portano alla fosforilazione delle subunita


in modo tale che possano essere assemblate come possiamo
osservare dallimmagine.

In questo caso abbiamo parlato quindi di punti di integrazione di


segnale, dove i segnali sommano insieme per ottere una risposta.
Avvolte la cellula pu rispondere meglio o peggio ad un segnale
asseconda se sulla cellula gi arrivato un secondo segnale o no.
Supponiamo che la nora-adrenalina lega il suo recettore che un
recettore a sette segmenti transmembrana. Il recettore si attiva e
successivamente viene,la proteina GS. La proteina GS, aumenta la
concentrazione di Adenilato-ciclasi con conseguento aumento della
concentrazione di AMPciclico. In questo caso se precedentemente o
dopo era giunto sulla cellula un segnale di inibizione, lattivit della
nora-adrenalina sarebbe stata ridotta. Quindi tutte le proteine di
segnalazione che si incrociano con pi vie possono essere punti di
integrazione.
I domini Proteici: I domini proteci e una parte della proteina che
conferisce a quella proteina una data funzione. Due proteine con lo
stesso dominio, non hanno la stessa sequenza di amminoacidi,
questi domini sono strutture compatte simili ma non uguali
caratterizzate da una forma tridimensionale.I domini delle proteine
segnale sono molteplici abbiamo:
SH2:Domino che permette il riconoscimento di residui di tirosina
fosforilati sulle altre proteine
PTB: Riconosce anche questa i residui di tirosina fosforilati sulle
altre proteine.
PH: Questo dominio conferisce alla capacit di interagire con alcuni
lipidi di membra i fosfoinositidi fosforilati in posizione 3.Interagisce

con la membrana plasmatica, sul versante interno dove si trovano i


fosfoinositidi di membra.
SH3: Domini che sono in grando di riconoscere un motivo di
proliprolina. Sono caratteristiche delle proteine addatratrici, ossia
quelle che legano due proteine di segnalazione differenti. Esempio
per esempio nellinsulina ci sta una proteina GRB2 che ha due
domini SH3 E SH2.
Man mano che aumenta il numero di recettori attivati aumenta la
risposta. La risposta pu aumentare in modo lineare quando il
numero di molecole impegnate nella risposta cellulare minimo.
Per la risposta pu assumere un andamento non lineare, quando ci
troviamo in casi in cui il secondo messaggero un complesso
proteico formato da pi subunita che si devono assemblare. Se
devo formare una molecola complessa formata da pi subunita che
devono essere attivate, io avro questo complesso attivato solo
quando tutte le subunita del complesso saranno attivate e solo a
quel punto che il complesso si assembla e si innesca la risposta.La
risposta in questo caso una risposta soglia, per tanto non abbiamo
una relazione lineare tra occupazione recettoriale e risposta.
Il turnover: Durante lo sviluppo, segnali anche di breve durata
possono produrre effetti duraturi. Generalmente nei tessuti adulti
quando il segnale cessa la risposta scema. Nel momento in cui
abbiamo un segnale che induce questa risposta, nel momento in cui
cessa la risposta deve cessare anche il segnale. Questo possibile
perch i segnali extracellulari devono comportare una varazione
dellattivita di alcune molecole che sono sottoposte a un continuo
turnover. La velocit con cui una cellula pu rispondere ad segnale
dipende proprio dal velocit del turnover. Se io ho una molecola con
un turnover molto rapido, io posso rapidamente incrementare il
secondo messaggero al livello intracellulare in presenza dello
stimolo e altrettanto velocemente diminuire la concentrazione del
secondo messaggero se cessa il segnale.Queste sono le molecole
che generalmente sono ipegnate nella comunicazione cellulare. Un
secondo messaggero ha una elevata velocit di turnover.Per
esempio lAMPciclico ha un elevato turover infatti viene
velocemente formato e velocemente eliminato. Anche il calcio

nonostante sia un ione anche lui ha un turnover molto veloce in


quanto la concentrazione interna alla cellula risulta essere molto
bassa rispetto alla concentrazione esterna e nel reticolo
endoplasmatico. La presenza infatti delle proteine canale del Calcio
non appena si aprono permettono lentrata degli ioni.
Recettori a quattro segmenti a transmembrana:
Dove sono, cosa fanno e quali patologie portano se hanno
alterazioni.
Dove sono?:Sono proteine canali che troviamo in corrispondenza
sia della giunzione neuromuscolare o in altri tipi di sinapsi. La
sinapsi neuromuscolare una tipologia di sinapsi specializzata che
si crea tra un moto neurone e una fibra muscolare.E una struttura
molto sviluppata e che consente sempre la contrazione della fibro
cellula muscolare nel momento in cui nel moto neurone si formato
un potenziale dazione. Quindi tutte le cellule innervate dal moto
neurone andranno incontro alla contrazione. In altri tipi di sinapsi,
per esempio quella centra, due neuroni, non detto che il
potenziale del primo neurone possa evocare un potenziale dazione
nella cellula nervosa con cui prende il contatto.Sappiamo che per
questo necessario una sommazione spaziale e temporale del
segnale.
Sommazione Spaziale: Su un neurone giungono pi terminazione
provenienti da altri neuroni. Ciascuna terminazione viene
contemporamente stimolata e trasmette contemporaneamente i
segnali alla cellula. Questa allora li somma insieme per ottenere
un'unica risposta cellulare.
Sommazione Temporale: Su un neurone presente una
terminazione afferente proveniente da un altro neurone che invia
pi segnali sulla cellua a brevi intervalli di tempo. La cellula allora
somma tutti questi segnali che arrivano e crea una risposta. Nel
moto neurone ogni qualvolta si genera un potenziale dazione la
fibro cellula si contrae. Tutto ci dovuto a una serie di eventi che
portano alla formazione sul sarcolemma un potenziale dazione e da
questo si hanno gli eventi che portano alla contrazione muscolare.
La sinapsi tra motoneuore e fibrocellula muscolare altamente

specializzata perci che si verifica sempre la contrazione. Il


motoneurone al livello della teminazione si sfiocca, perde la mielina,
e forma delle terminazioni ossia i bottoni sinaptici. Abbiamo poi una
zona pre-sinaptica appartenente al moto neurone e una zona postsinaptica appartenente alla fibra muscolare. Al livello pre-sinaptico
la trasmissione del segnale avviene tramite la propagazione del
potenziale dazione lungo il sarcolemma che porta all apertura dei
canali del calcio voltaggio dipendente che favorisce l entrata degli
ioni di calcio nella cellula. Il calcio permette la fusione delle
vescicole contennti il neurotramettore con la membrana plasmatica
della cellula cos da permettere il rilascio del neurotrasmettitore
nello spazio post-sinaptico. A questo punto il neurotrasmettitore,
acetilcolina, si lega sui recettori della membrana plasmatica della
cellula post sinaptica. La membra plasmatica della cellula postsinaptica che entra in contatto con lacetil-colina, placca motrice,
presenta numerose invagginaizioni che permettono di aumentare la
superficie di contatto della cellula. Ogni plica dellinvaginazione
della membrana presenta sulla sua faccia apicale i recettori per
lacetil-colina, tali recettori sono recettori canali per ioni di sodio e
di potassio, e sono posti difronte alle zone attive della membrana
pre-sinaptica. Per zona attiva intendiamo il punto entro il quale sono
ancorare le vescicole contenenti lacetil-colina. Noi abbiamo un pull
di vescicole, protamente disponibile cio pronte a riversare
allesterno il loro contenuto non appena arriva il potenziale dazione
che attiva i canali di calcio e determina la fusione delle vescicole
che si trovano nella zona attiva.Quindi lacetil-colina subito trova in
questo modo il recettore e avendo la superfice anche aumentata
grazie alle plice rende la giunzione neuromuscolare molto efficiente.
Le vescicole sono prontamente gi posizionate nellaria di azione,
deve solo avvenire la fusione. A questo punto iniziano gli eventi
post-sinaptici: lacetil-colina si lega sui recettori presenti sulla faccia
apicale della membrana plasmatica, precisamente delle pliche
formata dallinvagginazione. Questi recettori altro non so che
proteine canali ligando dipendenti. Nel momento in cui si lega
lacetil-colia, questi canali si aprono e permettono il passaggio
specifico o di Na, o di K. Il sodio tendene ad entranre allinterno
della cellula spinto dalla sua forza spingente che pu essere tanto
una forza di natura chimica o elettrica. Contemporaneamente

allentrata di Na+, attraverso altri canali avviene la fuori uscita di


K+. Quindi lentrata di ioni di Na+ e la fuori uscita di K+ porta di
conseguenza ad una depolarizzazione della membrana ma
ATTENZIONE! Ma perch questo? Perch la forza spingende del Na+
maggiore rispetto a quella del K+ e quindi io avr sodio che entra
di pi rispetto al potassio che esce. Il flusso di sodio in entrata
prevale sul flusso di potassio in uscita portando alla
depolarizzazione. In questo caso il livello di depolarizzazione che si
crea al livello della membrana non permette di arrivare al valore
soglia, ossia il potenziale soglia, quindi sulla membrana non si
innesca un potenziale dazione. Perch addifferenza di quando si
innesca un potenziale dazione, nel nostro caso i canali Na+ e K+
sono contemporaneamente aperti! Quindi la conduttanza del Na e
del K simultanea non sfasate come nel caso del potenziale
dazione. Quando si innesca invece un potenziale dazione i canali
Na+ e K+ non sono mai contemporaneamente APERTI! Quindi
ricapitolando al livello post-sinaptico io ho canali che mi permettono
di far passare solo da cariche postive come Na+, K+, e una minima
quantita di Ca+( talmente piccola la quantita che trascurabile) e
che porta alla depolarizzazione della placca motrice, ci la zona di
contatto tra la parte della membrana muscolare che prendende
contatto con la zona pre-sinaptica del neurone. In questa zona non
ci sono i canali dazione, ossia i canali sodio e potassio coinvolti
nella genesi del potenziale dazione. Infatti sono presenti canali N+
e K+ che portano ad una depolarizzazione della membrana ma i
livelli di depolarizzazione raggiunti tramite la loro attivit non
permettono di superare il valore soglia e quindi non innescano
nessun il potenziale dazione. Quindi avendo anche una bella
depolarizzazione io non avr un potenziale dazione nella placca
motrice ma nelle zone adiacenti si!Perch? Perch nelle zone
adiacenti sono presenti i canali dazione, i canali sempre sodio e
potassio voltaggio dipendenti, che si attivono proprio perch c la
diffusione della depolarizzazione. Ricapitolando quindi lacetil-colina
si lega ai recettori presenti sui canali. Questi canali si aprono ed
essendo permeabili sia al sodio che al potassio permettono il
passaggio o delluno o dellaltro. Il sodio entra allinterno della
cellula e il potassio esce: la quantita di sodio che entra maggiore
rispetto alla quantita di potassio che esce perch la forza spingente

sul sodio maggiore di quella che agisce sul potassio e ci porta a


far entrare pi sodio rispetto al potassio che esce. Ci porta ad una
depolarizzazione della placca motrice senza innescare nessun
potenziale dazione in quanto sulla placca motrice non ci sono i
canali dazione. A questo punto la depolarizzazione generata sulla
placca motrice si propaga fino alla zona adiacenti alla placca dove
sono presenti i canali dazione del che portano ad una
depolarizzazione sopra-soglia scatta il potenziale dazione nelle
cellule eccitabili, nel nostro caso quella muscolare. Quello che
dobbiamo considerare che io ho bisogno sempre di una certo
potenziale detto potenziale di placca che sar capace di indurre il
potenziale dazione nelle zone adiacenti alla placca. Guarda disegno
quaderno. I potenziali locali si attenuano con la distanza, mentre i
potenziali dazione non si attenuano con la distanza. Quindi il
potenziale di placca si attenua leggermente ma capace di portare
a soglia la zona vicina e quindi innescare il potenziale dazione.
Tutto raccolto sul potenziale di placca, io ho sempre un insorgenza
di un potenziale dazione perche il potenziale della placca molto
ampio. Questo potenziale ampio dipende dal fatto che i canali sono
stati aperti dallaceteli-colina. Lacetil-colina immagazzinata nelle
vescicole tramite pompe specifiche che lo accumulano. Se io non ho
canali di Ca+ al livello presinaptico che non funzionano al 100% io
avr un flusso di calcio pi basso, che porta ad un rilascio pi basso
di acetil-colina e quindi si aprono meno canali post-sinaptici il
potenziale di placca pi piccolo. Lacetil-colina dopo che stata
liberata viene degrata dalla acetil-colinaesterasi. Se questo enzima
non ci sta si creano dei problemi al livello post-sinaptico in quanto
provoca una contrazione continua nel tempo perch il
neurotrasmettitore non viene eliminato e ci pu portare ad delle
modificazioni strutturali della placca. I posso avere tutti i recettori
canali che voglio ma se non si aprono quando si legano con lacetilcolina non succede nulla, non c risposta. Supposiamo che tipo la
placca subisca delle modificazione, dovute allalterazione della
morfologia della placca porta allallontanamento delle cellule
sinapsitiche e ci pu portare al diminuire della probabilit di
legame e quindi avr una depolarizzazione pi bassa. Tutte queste
cose portano a forme miastemiche, alterazioni della accoppiamento
eccitazione-contrazione muscolo dovuto allalterazione della placca.

Le miastemia possono essere che dipendono al livello della fessura


sinaptica, della cellula post-sinaptica o pre-sinaptica. La giunzione
neuro-muscolare ha una margine di sicurezza molto elevato, se tale
margine di sicurezza viene superato chiaro che la probabilit di
legame del ligando con il recettore diminuisce.
Lezione Cinque:
Ci soffermiamo sui vari eventi che si verificano al livello sinaptico
per capire come alterazione a vari step della trasmissione sinaptica
al livello della giunzione neuro-muscolare possono portare a forme
miastemiche. Nella trasmissione sinaptica noi possiamo distingure
tre eventi: eventi pre-sinaptici, quelli si verificano al livello della
fessura sinaptica e quelli che si verificano al livello post-sinaptico.
Per quanto riguarda gli eventi pre-sinaptici, il ruolo chiave svolto
dal calcio. Il potenziale dazione che si vine e a generare sul
motoneurore al livello terminazione assonale in grado di indurre
lapertuta dei canali per il calcio. E si sono fatti una serie di studi al
riguardo, sugli eventi pre-sinaptici che effetti avevano al livello
post-sinaptico si visto che avendo una depolarizzazione
soprasoglia, al livello della terminazione pre-sinaptica si registrava
una corrente in ingresso che inducive al livello post-sinaptico un
potenziale post-sinaptico eccitatorio. In realt si capito che tale
corrente in ingresso era dovuta dal calcio attraverso alcuni
esperimenti che consistevano nel
inibire i canali del calcio
aggiungendo un competitore del calcio. E si costatava che quando
si depolarizzava la membrana pre-sinaptica in un motoneurone in
realt non si registrava pi la corrente pre-sinaptica e non avevamo
pi un potenziale post-sinaptico. E quindi si capito che la corrente
in entrata era il calcio e che era fondamentale per la trasmissione
del segnale. Andiamo ad analizzare i vari eventi in successione.
Questo in immagine rappresenta un potenziale dazione che si
genera al livello del moto-neurone. Nella fase ascendente ho una
fase di deplorarizzazione che porta ad una corrente di entrata di
calcio.Il valore soglia quel valore al disopra del quale si ha
depolarizzazione nelle cellule eccitabili, ossia che presentano i
canali
dazione.

Nellimmagine qui riportata abbiamo tre curve:

Questo grafico ci descrivenono descrivino i potenziali dazione che


si generano al livello del moto-neurone. Esiste un cetro intervalo di
tempo tra linsorgenza del poteziale dazione della cellula presinaptica e in quella post-sinaptica, in quanto questo ultimo si pu
instaurare solo nel momento in cui viene rilasciato il
neurotramettitore. Il valore soglia quel valore di depolarizzazione
che si deve superare per innescare al livello di cellule eccitatorie,
dotate ci di canali dazione, un potenziale dazione. Un alterazione
del rilascio del neurotrasmettitore pu portare a forme
miastemiche. In realt il neurotrasmettiore rilasciao sottoforma di
quanti. Ossia il neurotrasmettitore viene rilasciato sottoforma di
pachetti ben definiti, quantita fisse ossia in dozzine o multipli di 12,
quindi un quantita multiple di questo pachetto. Il numero di quanti

rilasciati al livello della terminazione sinaptica uguale al numero di


quanti prontamente disponibili per la probiabilit che i singoli
quanti vengano rilasciati, quindi il rilascio avvenga:

Un quanto corrisponde al contenuto di una vescicola, quindi quello


che pu cambiare lampieza del quanto ossia il riempimento
vescicolare. Se abbiamo un problema nei sistemi che mi portano il
neurotrasmettitore allinterno di tutte le vescicole io avro che il
numero di neurotrasmittori rilasciati dalla vescicola non
corrispondera pi ad un quanto, ossia una dozzina o multipli di
questa, ma sar minore tipo una decina. Quindi il rilascio delle
vesciole avviene con la comparsa di un poro di fusione che le porta
a fondersi con la membrana plasmatica e determinare il rilascio del
neurostramettitore. Abbiamo un pull di vescicole di riserva e un pull
di vescicole pronta per esere esocitata quindi queste vescicole
sono presenti gi nella zona attiva, sono ancorate tramite delle
proteine presenti sulla vescicola e delle proteine presenti sulla
membrana pre-sinaptica che si avvolgono tra di loro. In particolare
quella sulla vescicola la sinaptobrevina interagisce con le proteine
di membrana pre-sinaptica quali la sintaxina e la SNAP-25
intrecciandosi con queste. Levento che permette la fusione delle
vesciocole e lentrata del calcio perch sulla membrana plasmatica
delle vescicole presente una proteina-sensore per il calcio, la
sinaptotagmina. Il legame del calcio con questa proteina facilit il
contatto della vescicola con la membrana plasmatica e il rilascio del
neurotrasmettitore. Quando il nerutrasmettitore rilasciato
necessario che venga eliminato il complesso che si occupava
dellattracco delle vescicole ossia il complesso SNARE, per fare
questo intervengono due proteine che sono SNAP e NSF(il fattore
solubile nucleotidico) si legano e disgregano il complesso. E una
reazione che chiede energia quindi avviene lidrolisi di ATP grazie al

NSF, che una ATPasi solubile. Quando avviene il rilascio dellacetilcolina nello spazio sinaptico questa va a interagire con i suoi
recettori nicotinici o puo diventare substrato dallacetilcolinaesterasi
che lo metabolizza, questo enziama rende la cellula post-sinaptica
nuovamente eccitabile. La colina liberata viene recuperata dalla
terminazione pre-sinaptica, grazie ad un trasportatore, ad alta
affinit per la colina, che porta la colina allinterno della cellula. La
colina va a reagire con lacetato e si avr la formazione dellacetilcolina pi in la. La reazione catalizzata dallacetilcolina
transferasi. A questo punto lacetil-colina viene immagazzinato
allinterno delle vescicole. In realt limporto dellacetilcolina
allinterno nelle vesciole dipende da un cotrasporto di protoni. I
protoni vengono trasportati dallinterno allesterno della cellula
seguendo gradiante di concentrazione liberando cos energia
necessaria per trasportare contro gradiante di concentrazione
allinterno della vescicola. Quindi abbiamo un trasporto attivo di
tipo secondario. I protoni sono accumulati allinterno della vesciola
tramite una pompa protonica sulla vescicola, una pompa ATPasica
ossia una pompa che attua un trasporto di tipo attivo primario, che
idrolizza ATP per generare energia trasportare i protoni contro
gradiante allinterno della vescicola. Se io ho una varazione di
questi sistemi ho una variazione dellampienza del quanto, sono
questi meccanismi che regolano lampiezza del quanto. Al livello
invece post-sinaptico abbiamo la genesi del potenziale di placca
quando lacetilcolina lega il recettore che un canale. Questo
potenziale di placca un potenziale locale, quindi con la distanza si
attenua. Ma il potenziale di placca si crea perch c un flusso
ionico che attraversa la membrana, ossia una corrente di placca. La
corrente di placca, quindi il flusso di ioni, si genera perch abbiamo
una differenza di potenziale e una buona conduttanza, ossia la
facilit con cui questa membrana si lascia attraversa dagli ioni.
Deve diminuire la resistenza al passaggio degli ioni, la resistenza e
conduttanza sono uno il reciproco dellaltro, quindi la membrna
plasmatica per essere una buona condutrice di elettricit deve
presentare una resistenza molto bassa al passaggio delle cariche.
Questa non altro che la legge di Ohm:
V=R x i

che dice ogni quallvolta io applico una differenza di potenziale su


un circuito, se presente una resistenza avremo che in quel circuito
presente una corrente i che dipende dalla differenza di
potenziale applicato e la resistenza del circuito stesso. Quindi io
avr che la corrente sar uguale alla forza che spinge questi ioni,
che la differenza tra il potenziale di membrana e il potenziale
dequilibrio di questi ioni, e la conduttanza. Quindi gli ioni si muove
perch c una forza che lo spinge, che la differenza tra il
potenziale di membrana e quello dellequilibrio dello ione. Quindi la
nostra corrente di placca dipende dal fatto che si sono aperti i
canali, quindi c una conduttanza, e una differenza tra il potenziale
della membrana plasmatica e il potenziale dequilibrio di questi
ioni. C un flusso di Na+?Si ma perch? Perch la membrana
permeabile al sodio e perch il Na+ non lequilibrio quindi c una
differenza di potenziale ai capi della membrana e il potenziale
dequilibrio del sodio. Quali sono gli ioni coninvolti nella corrente di
placca?Quelli del Na+ e del K+. Quindi la corente di placca data
dalla somma della corrente portata dal sodio pi quella del potassio.
La corrente del sodio data dalla conduttanza del sodio per la forza
che lo spinge(potenziale di riposo di membrna potenziale
dequilibrio del Na+). Il potenziale di riposo di membrana per il
muscolo -90 per il sodio il potenziale dequilibrio +70 e facendo
questa somma si avr che la corrente di Na+ meno -160 per la
conduttanza. La stessa cosa si fa per il K+ per vediamo che la
corrente del sodio opposta a quella del potassio perch? Perch il
sodio entra e il potassio esce. Per poiche la conduttanza al sodio
simile a quella del potassio perch lo stesso canale, quindi
uguale, signigifica che la corrente entrante di sodio maggiore
rispetto a quella uscente del potassio e quindi avremo una
depolarizzazione. Riprendiamo la nostra forumuala: la corrente di
placca uguale alla forza spingente per la conduttanza. La forza
spingente non pu cambiare molto, quello che pu varirare
proprio la conduttanza che provoca quindi la corrente di placca. Gli
ioni gi stanno la,la a membrana gi polarizzata a -90, io con
lacetil-colina non vado a fare altro che aprire i canali ed variare la
conduttanza. Quindi la conduttanza indotta dallacetil-colina
uguale al numero n di canali per la conduttanza di ogni singolo
canale. Quindi dipende da quanti canali sono aperti per la

conduttivit di ogni canale ha. Allora la condutanza totale dipende


da quanti canali sono aperti e da come ogni canale si lascia
attraversa dagli ioni . Quindi la conduttanza indotta dallacetil-colina
data dalla conduttivit per il numero di canali che sono aperti. Il
numero di canali che si aprono dipende da quanti canali ci sono per
la probabilit che lapertura dei canali si verifichi. La probabilit che
il canale venga aperto dipende da quanta acetil-colina liberata che
dipende a sua volta dalla quantita di calcio liberata e dal
rempimento vescicolare. Quindi attenzione, io ho che lampiezza del
potenziale di placca dipende dalla corrente di placca che a sua volta
dipende dal numero di recettori per lacetil-colina per la pobabilit
che si aprano questi canali che a sua volt tale probabilit dipende
dalla quantita di acetil-colina liberata in base alla concentrazione di
calcio e del rempimento vescicolare. Il recettore dellacetil-colina
formato da 5 subunita. Ogni subunit formata da una cantena
peptidica che attraversano quattro volte la membrana plasmatica.
Queste subunit sono disposte a cerchio, creando cosi un poro e di
conseguenza il canale. Lestremita rivolta verso lesterno molto
sviluppata e presenta i siti di legame per lacetil-colina,
precisamente due siti che portano a cambi conformazionali che
portano allapertura del canale. In particolare distinguiamo due
subunit alfa dove si trovano i siti di legame per lacetil-colina, una
subunit beta, gamma e delta. Ogni subunit formata da una
catena peptidiche che passa per bene quattrovolte allinterno della
memmbrana plasmatica formando quattro segmenti. Tali segmenti
peptidici sono numerati da M1 a M4. M2 molto importante in
quanto porta alla formazione del canale, infatti sono rivolti tutti
verso il centro. Al livello del canale passano solo cariche positive,
K+, Na+ e una piccola quantit di Ca+, sono aspecifici. Il fatto che
comunque passano solo cariche positive dovuto alla presenza di
cariche negative vicino al filtro di selettivit o di cariche negative
presenti sul vestibolo, quello che volge verso lesterno della cellula,
che tendono ad attirare quelle positive. La filtro di selettivit un
area del canale che si restringe che permette la selettevit del
canale anche in questo caso abbiamo dei resididui di amminoacidi
che presentano una parziale carica negativa come per esempio
serina, treonina che hanno il gruppo OH. Nella regione di uscita
troviamo dei residui carichi negativamente per attirare le cariche

positivi. La zona 1 attira il Na+ mentre il potassio attirata dalla


zona 2. Ricordiamo o passa il sodio o il potassio. Lapertura del
canale avviene grazie al segmento M2. Questo segmento non
lineare ma spezzato, nel momento in cui si lega lacetil-colina tutti
i segmenti effettuano una rotazione in senso orario che porta
allaumentare della distanza. Anche in questo caso necessario il
20% delloccupazione recettoraile per avere un potenziale di placca
e di membrana. Il numero di quanti uguale a :
Numero di quanti rilasciati= NUMERO DI QUANTI PRONTAMENTE
RILASCIABILI X LA PROBABILIT che avenga levento DI RILASCIO
La giunzione neuromuscolare una sinapsi molto efficiente, ossia
basta che si genera un potenziale dazione della cellula presinaptica per determinare la contrazione nelle fibrocellule muscolari
ossia che si generato un potenziale dazione sul sarcolemma.
Significa che il potenziale di placca sempre in grado di portare a
soglia la zona adiacente alla placca. E c in relat un margine di
sicurezza, che significa che io per portare a soglia il sarcolemma ho
bisogno di far si che la membrana da -60 arrivi a -40, ci vogliono
circa 20 millivolt di differenza, la depolarizzazione portata dal
potenziale di placca molto pi ampia, quindi invece di
depolarizzare la membrana di 20 millivolt la depolarizza di 40,
significa che ho un margine di sicurezza molto grande.

Il margine di sicurezza della trasmissione neuromuscolare


rappresentato dalla differenza tra lampiezza attuale del
potenziale di placca e lampiezza del potenziale di placca
necessaria per evocare un potenziale di azione nella fibra
muscolare
Quanto mi basta di potenziale di placca? 20 millivolt? Quello
necessario per
il potenziale , invece ne ho 40 micrivolt di
depolarizzazione. Il margine di sicurezza compresso quando ho
problemi pre-sinaptici, post-sinaptici o al livello della fessuna
sinaptica ci porta allinsorgenza di disturbi miastenici. Quindi io
ho un disturbo miastemico se ho un problema al livello del rilascio

quantico, un problema al livello dellampienza del quanto o


problemi dovuti agli eventi post-sinaptico indotti dallacetil-colina.
Ora valutiamo gli eventi post-sinaptici che possono portare ad un
alterazione del margine soglia. In queso caso la geometria della
placca cambia, viene alterata e ci porta alla formazione di
sindromi miastemici. Per c da sottolineare che sindromi
miastemiche si verificano anche quando ci sono problemi al livello
dellacetilcolina-esterasi. Infatti la mancata azione dellacetilcolinaesterasi non determina la degradazione dellacetil-colina in colina e
acetato e quindi non permette la formazione di un nuovo potenziale
e ci pu portare a una contrazione prolungata allinterno del
muscolo, anche questa una forma miastemica. Un altro problema
al livello post-sinaptico una ridotta densita dei recettori dellacetilcolina oppure una diversa probabilit che questi canali si aprano
intrinseca nel recettore, tipo la presenza di una mutazione che non
permette la sua apertura, oppure la conduttivit del canale che pu
essere pi bassa. Tutti quei fattori che abbiamo visto nella
formuletta, sono tutti quei fattori che mi alterno la conduttanza
totale della placca motrice attivata dacetilcolina se ha problemi
sfocia in sindrome miastemiche. Quindi possiamo avere varie forme
di miastemia la cui maggior parte derivano da difetti al livello postsinaptico. Le forme miastemiche si verificano per il 79% da
fenomeni post sinaptici, 7% difetti pre sinaptici, 14% al livello della
fessura sinaptica dove coinvolta lacetilcolia-esterasi. Quindi i
difetti al livello pre-sinaptico sono: se io non ho un adeguato
riempimento vescicolare, una riduzione dampiezza del quanto,
posso avere una deficienza dellcolina-acetil-transferasi ci lenzima
che mi sintetizza proprio lacetil-colina.

Sindrome di Albert Eaton.


Una sindrome che si verifica accausa di disturbi pre-sinaptici la
sindrome di Albert Eaton. Questa un disturbo miastemico dovuto
al fatto che in soggetti che ne sono affetti sono presenti dei

anticorpi anti-canali del calcio voltaggio dipendenti. Questi anticorpi


si legano ai canali del calcio al livello pre-sinaptico non permettendo
cosi la loro apertura quando arriva un potenziale dazione. Questa
sindrome porta ad una riduzione del rilascio del neurotrasmettitore
e anche un ridotto potenziale di placca,quindi il margine di
sicurezza viene compromesso. Questo tipo di sindrome
generalmente associato al calcinoma polmonare a piccole cellule.
Queste cellule cancerose presentano dei canali del calcio voltaggiodipendente, quindi il nostro organissimo reagisce creando degli
anticorpi per reagire con questi canali ma gli sforzi sono inutili in
quanto gli anticorpi non riescono a riconoscere i canali del calcio in
queste cellule cancerose e quindi gli anticorpi prodotti vanno a
legarsi sui canali del calcio delle cellule pre-sinaptiche dei
motoneuroni. Quindi lacetil-colina rilasciata in quantita minori e
quindi si ha formazione di un potenziale di placca pi basso e quindi
il margine di sicurezza compromesso quindi la membrana postsinaptica non raggiunger la soglia. Poi abbiamo un altro tipo di
sindrome miastemica congenite dovuto ad un defict di vescicole, il
potenziale di placca sar ridotto perche il numero di vescicole
ridotto. Vediamo che cosa si verifica quando abbiamo a che fare con
sindromi miastemiche dovute allalterazioni dellacetil-colina
esterasi. Se io ho il recettore colina occupato per un tempo
maggiore la corrente si manterra per un tempo maggiore anche la
depolarizzazione, quindi il potenziale di placca si esaurisce pi
letamente nel tempo. Nel caso in cui abbiamo un paziente
miastemico avr un potenziale di placca pi basso e pi lento a
ritornare a valori iniziale, si protae per pi tempo. I potenziali di
placca di un paziente miastemico sono a pi lento decadimento.
Questo perch ho lacetil-colina non viene metabolizzata e il legame
dellacentil-colina si protae per pi tempo. Lampiezza pi bassa
perch se il recettore lega continuamente lacetil-colina, il recettore
viene desenzibilizato viene internalizzato. E ci porta ad avere
meno recettori sulla membrana. In realt abbiamo anche un altro
fenomeno che importante: quando lacetil-colina lega per molto
tempo il recettore abbiamo che la corrente di placca si mantiene
per pi tempo quindi abbiamo che la placca si sopracarica di
cariche positive che entrano e quindi abbiamo un eccesso di cariche
postive, sopracarico di cationi, che sovraccarica la placca portando

ad un danno alla placca. Quindi da una carenza di un enzima


abbiamo un danno alla placca in quanto abbiamo un sopracarcio
della placca dalle cariche positive. Inoltre in casi in cui abbiamo
sindromi congenite miastenica causata da difetti dellenzima acetilcolina esterasi si verifcia una compensazione, ossia le terminazioni
presinaptiche diventano pi piccole e lontane in modo da ridurre la
probabilit di interazione dellacetil-colina con il recettori della
membrana post-sinaptica. Perch possiamo andare incontro a
sindrome di questo tipo?Lacetil-colina esterasi agisce al livello della
fessura sinaptica, quindi per agire qui deve essere ancorata alla
matrice extracellulare tramite fibre di collagene. Queste fibre di
solito sono tre, si spiralizzano le une sulle altre formando cosi una
specie di eliche ad aspirale. Ed una parte di questa fibra di collage
si ancora alla matrice extracellulare mentra una parte, preciamente
quella ammino-terminale, lega lacetilcolina-esterasi. Precisamente
ogni fibra di collagene lega bene 4 molecole di acetilcolina-esterasi.
Tutta la struttura legera 12 molecole di acetil-colina esterasi. Sulla
fibra
di
collagene
troviamo
tre
zone:
una
estremita
carbossiterminale, quella che permette linterazione dellacetilcolina
esterasi con la matrice extracellulare. Mentre la zona centrale,
chiamata dominio di interazione con altre molecole di collage,
permette linterazione con le altre fibre di collagene e formazione
dellelica, ed infine la zona ammino terminale che lega lacetilcolina esterasi. Quello che si visto che ci possono essere delle
mutazioni al livello del collage che possono interessare lestremita
carbossiterminale, in questo caso il collagene non interagisce con la
matrice extracellulare e quindi lacetil-colina esterasi non viene pi
ancorata nel sito dove deve agire. Altra possibile mutazione al
livello della terminazione ammino termianle, quindi lacetil-colina
non riesce a legarsi. Oppure ci sono mutazioni al livello del dominio
centrale della fibra, ossia al sito di interazione con le altre fibre, e
ci non porta alla formazione del complesso ad elica e quindi solo 4
acetilcolina esterasi possono essere ancorate e non pi 12. Tutto ci
porta ad una riduzione della concentrazione di acetilcolina esterasi
presente nella fessura sinaptico e ci pu portare allinsorgenza di
forme miastemiche. Inoltre si possono verificare mutazioni anche al
livello dellacetilcolinaesterasi che modificano la loro attivit
catalitica e quindi e tutto ci porta a forme miastemiche.

Criteri per identificare se una malattia autoimmune:vedi


slide.

Sindrome Miastemica Gravis:


In questa sindrome ci sono degli anticorpi per il recettore per
lacetilcolina, precisamente per i recettori nicotinici prensenti sulla
placca della membrana plasmatica della cellula post-sinaptica. Gli
anticorpi legano i recettori e lo blocca in una forma inattiva oppure
lo stesso anticopo pu portare ad indurre a diminuire il numero di
recettori perch lanticorpo lega il recettore e aumenta la velocit di
internalizzazione del recettore. Le caratteristica preculiari della
Miastemia Gravis la paresi molto frequente che si genere in
mancanza della contrazione muscolare, e questa paresi tende a
peggiorare nel corso di una giornata. Una caratteristica della
Miastemia Gravis e che non ci sono segni clinici di una
denervazione, perch se abbiamo una denervazione il problema
che la cellula muscolare non invernata. E poi la paresi migliora,
cio
cede
quando
vengono
somministrati
gli
inibitori
dellacetilcolinaesterasi. Sulla immagine sono rappresentati i
potenziali evocati, ossia una misura elettrica di tutta una serie di
cellule
che
stanno
funzionando,
quindi
esami
come
leletroncefalogramma o cardiogramma misura lattivit eletrica
delle cellule dell cuore o del cervelo nel complessivo. Quindi
nellimmagine non sono riportati potenziali di azione ma sono dei
potenziali evocati!Cio dei potenziali che rappresentano lattivit
globale del muscolo nel nostro caso. Quindi significia che questi
potenziali posso, se i do una stimolazione al muscolo, nel tempo
ridursi di ampiezza. Il potenziale dazione non si riduce mai di
ampiezza, o si verifica o non si verifica! La legge del tutto o del
nulla. Il potenziale evocato che si riduce nel tempo significa che
quando ho una prima stimolazione un certo numero di cellule
riescono a rispondere. Se do unaltra stimolazione non detto che
tutte le cellule riescono a rispondere quindi non in tutte le cellule

muscolari riescono a rispondere.Quindi non in tutte le cellule si


formato il potenziale dazione. Linsieme di tutti i potenziali dazione
generati nelle singole cellule muscolari contribuiscono a
determinare il potenziale evocato.Allora il potenziale evocato e la
somma di tutti i potenziali dazione evocati nelle singole cellellue
muscolari, esso mi permette quindi di valutare lattivit eletrica del
muscolo nella sua totalit.
Quello che si visto quindi
sullimmagine sono i poteziali evocati che si sono stati ottenuti
attraverso degli stimoli ripetuti distanziati tra di loro da un tot di
millesecondi, un certo tempo. Che cosa si verifica quando abbiamo
a che fare con soggetti che hanno la Miastemia Gravis. Vediamo che
il potenziale evocato sono di ampiezza pi bassa fin dallinizio e che
si attenuano nel tempo. Quindi questo significa che seguito ripetute
stimolazione un numero sempre minore di fibrocellule muscolari
saranno interessate dallinsorgenza del potenziale dazione, la cui
insorgenza dipende da quello che succede nella placca. Significa
che in questi soggetti il margine di sicurezza compromesso.
Quindi chiaro che per valutare una forma miastemica andiamo ad
effettuare un tipo di analisi che consiste nel valutare lattivit
eletrica del muscolo nella sua globalit dopo numerose stimolazioni.
Se si attenua nel tempo lampiezza del potenziale evocato significa
che c molto probabilmente una forma di miastemia gravisi quello
che importante capire che se io per inibisco lacetil colina
esterasi io ho un miglioramento, certo non ho le condizioni di
normalita pero ho un miglioramento. Perch? Aumenta la probabilit
di legame dellacetil-colina con i recettori aumentando la
concentrazione del ligando. Se io do un inibitore dellacetil-colina
esterasi aumento la probabilit di legame del ligando con il
recettore. Anche nella Miastemia Gravis, anche in questo caso la
morfologia della placca cambia questo perch in realt il fatto che si
ha una reazione antigena-anticorpo da vita ad un sequenza di
reazione che porteranno alla lisi focale e quindi un alternazione
proprio della struttura conseguenti al fatto che ci sono degli
anticorpi. Unaltra cosa da considerare che quando si lega
lanticorpo al recettore per lacetil-colina si formano proprio dei
classer e la velocit di endocitosi recettoriale aumenta e anche il
turn-over del recettore rallenta, quindi se un turn-over normale di
un recettore per lacetilcolina di cinque o sette giorni questo viene

aumentato. Signficia che ho questi recettori che vengono endocitati


e ci vuole un po' di tempo prima che vengono nuovamente esposti.
Quando si ha il blocco della trasmissione nella giunzione
neuromuscolare? Gurdiamo al grafico, vediamo che in alto un
soggetto norame dove ci sta lampeizza dei potenziali di placca e
sotto lampienza il potenziale evocato. Quello si verifica che
quando ci troviamo in una ondizione di manca malattia, normale,
abbiamo un fattore di sicurezza molto ampio, quindi lampiezza del
potenziale evocato sar sempre della
stessa ampiezza, non
cambia. Invece quando si presenta un fenomeno di miastenia
vediamo che quando ho che il margine di sicurezza superato avr
una certa risposta ma quando il margine di sicurezza
compromesso la risposta tende a diminuire.In questa forma
miastemica gravis inoltre io avr un allontanamento della
membrana pre sinaptica da quella post sinaptica. Questo comporta
che lacetil-colina quando viene liberata abbiamo una riduzione
della probabilit di legame dellacetil-colina con il recettore.

Lezione n6: Analizziamo


transmembrana

recettori

sette

segmeti

Questi recettori sono quelli pi rappresentati, infatti il 5% di tutto il


genoma umano codifica per questi recettori e quindi significa che
questi recettori sono stati selezzionati positivamente durante
levoluzione. Ma perch proprio sette segmenti? Perch abbiamo
una proteina ben ancorata nella membrana che ha struttura tale
che pu permettere tramite modificazioni confomazioli direttamente
la trasmissione dallesterno allinterno della cellula determinando
lattivazione delle proteine G. Ma come fai ad attivare le proteine G?
Attraverso una trasfomazione confomazionale tale da poter indurre
il rilascio del GDP della proteina G trimerica. Diciamo che sette
segmenti sono importanti per le funzionalit di questo recettore.
Sette segmenti dispari, significa che N terminale e C terminale sono
al lato opposto. Ossia la terminazione amminica rivolta allesterno
della cellula mentre la terminazione carbossilica rivolta allinterno
della cellula. N terminale deputa al legame con il ligando. La parte

pi variabile tra i vari recettori proprio la parte N terminale. A


questa famiglia appartengono recettori in grado di legare ligadi di
natura completamente diverse.Quindi la parte pi variabile
proprio la zona NH3 terminale che permette quindi di classificcare
differenti tipologia di recettori in base alla tipologia di ligando che
legano. Poi abbiamo i sette segmenti trasnmembrana, significa che
atraversa sette volte la membrana la catena peptidica, e questi
segnmenti sono collegati tra di loro tramite lup intracellulari e dei
lupi extracellulari. Poi abbiamo il segmento COOH, che volge verso
linterno della cellula. Allora io mi aspetto sicuramente che
allinterno della cellula sulla catena peptidica interna ci sono dei siti
che mi permetteranno di regolare lattivit recettoriale. I recettori
dopo che hanno legato il ligando ed hanno attivato una via che
porta alla trasmissione del segnale, pu ridurre la propia affinit del
ligando o possono essere endocitati affinch questo si verifichi il
recettore subira dei processi tipo di fosforilazione. Quindi diciamo
che lestremita C terminale abbiamo dei siti che sono coinvolti nella
desensibilizzazione del recettore, sono quindi siti che verrano
fosforilati. La parte del recettore importante per linterazione con la
proteina G il terzo loop intracellulare importante per il legame
con la proteina G. Mi aspetto che che il loop in conessione
extracellulare siano impiegati con il legame del ligando. Diciamo
che i ligandi possono essere completamente diversi, possono essere
piccole ammine, peptidi, calcio, glicoproteine. Quello che variera
la terminazione N terminale in base alla tipologia di ligando quindi,
se abbiamo a che fare con le catecollamine, cio adrenalina e
noradrenalina, il sito di legame si forma propio sul recettore, un
cuore idrofobico che permette alladrenalina di adagiarsi in questo
core idrofobico e in questo caso il sito di legame formato da tutta
una serie di amminoacidi che sono presenti nei loop di connessione
extracellulare e anche nei primi amminoacidi dei segmenti di
trasnmembrana. La molecola essendo piccola si adagia, quindi il
sito di legame lo trova proprio nei primi amminoacidi dei segmenti
di transmembrana e dei loop extracellulari. Per quanto riguarda i
ligandia basso peso molecolare come il glucagone o ACTH i siti di
legame di questi peptidi localizzato sulla estremita N terminale e
anche sul loop di connessione esposti sul versante extracellulare.
Per quanta invece per gli ormoniglicoproteici che sono molto grandi

come TSH, LH, FSH sono prodotti dallipofisi anteriore, questi ormoni
legheranno principalmente lestremina N terminale, questo significa
che lestremita N terminale molto sviluppata e si protrae
nellambiente extracellulare in maniera significativa. Dopo che il
ligando ha legato lestremita N terminale si ha proprio una
modificazione conformazionale che avvicina il ligando al recettore.
Anche il calcio un ligando adesso la concentrazione di Ca+ extra
cellulare ha un ordine di grandezza 10^-3,10^-4 rispetto
allambiente intracellulare. Come fa un recettore a percepire le
variazioni di calcio? In realt quello che si verifica che il recettore
lega il calcio ma lestremit N terminale funge da chelante a bassa
affinit: che cosa un chelante? Una sostanza che lega a bassa
affinit gli ioni. Lestremita N terminale si comporta come un
chelante a bassa affinit, ossia lega a bassa affinit il calcio: se
fosse ad alta affinit la concentrazione del calcio alta, quindi il
calcio sarebbe sempre legato quindi non potrebbe mai essere a alta
affinit. Il fatto che un chelante a bassa affinit permette a questo
dominio N teminale di poter legare il calcio in funzione delle sue
oscillazioni perch un chelante a bassa affinit che cosa fa nel
momento in cui la concentrazione aumenta lega altro calcio non
appena la concentrazione diminuisce si stacca. In questa tipologia
di reccettori il sito di legamen N-terminale non funge anche da sito
per il ligando, ma servere per formare il ligando stesso! Infatti
quando il calcio si lega allestremit N-terminale, questa ultima
subisce un cambio confomazionale a molla, che lo porta ad
diventare lui stesso nel complesso il ligando, che poi dopo si
avvicina al sito di legame del ligando presente sul recettore e
innesca la risposta. Quindi quello che si verifica che il calcio lega
questa estremita N terminale che funge da chelante a bassa
affinit, chiaramente quando la concentrazione del calcio
incrementata, cos si ha una modificazione conformazionale a molla
della terminazione N terminale che si avvicina al sito di legame per
il ligando, quindi si ha lattivazione del recettore solo nel momento
in cui si forma il complesso calcio-nterminale, quindi funge da autoligando. Il chelante a bassa affinit ha la capacit di determinare il
distacco o lattracco del calcio asseconda della sua concentrazione:
quindi se alta si lega, se bassa si stacca. In realt non il calcio
in se che mi induce il cambio confomazione del recettore e quindi la

trasmissione del segnale, ma il calcio legato allestremita nterminale che porta a un cambiamento confomazionale a molla di
questa estrmit n terminale, quindi il ligando vero e proprio altro
non che il complesso formato dallunione, compressione del calcio
pi lestremit n-terminale. Lestremita n-terminale associata al
calcio diventa ligando stesso, quindi funge da autoligando. Quindi la
funzione del calcio quella di attivare il legando endogeno. Al livello
funzionale ti permette di percepire le variazioni di calcio molto
elevate allesterno della cellula. Infine abbiamo i recettori attivati da
proteasi, come per esempio la trombina una proteasi in grando di
idrolizzare il legame peptidico tra la serina e larginina.
Naturalmente non tutti i legami peptidici ma solo alcuni che sono
presenti in uno specifico contesto amminoacilico. Quindi non che
qualsiasi legame serina-arginina viene attaccato ma solo in specifici
contesti. Quello che si visto che la trombina pu arrivare dei
recettori a sette segmenti. La tombrina una proteasi, quindi ci
chiediamo come fa ad attivare il recettore? Ma semplicimente va a
idrolizzare il legame serina-arginina sullestremit N terminale.
Attenzione lestremit N terminale una parte della proteina, se io
ho un taglio proteolitico al livello dellestremit N-terminale un
frammento del recettore lo perdiamo, si stacca. In realt quello che
succede che quando agisce la trombina successivamente
abbiamo la formazione di un framento proteico che funge da
ligando per un altro tipo di recettore a settesegmenti! Perch?
Perch si forma un peptide, che va a regire con il recettore GPCR
specifico, ci quello che reagisce con gli amminoacidi. Ora la nuova
estremit N-terminale che si creata fungera da auto-ligando,
andando ad attivare il recettore stesso da cui si formato.
Organizzazione strutturale di questi recettori identica quello che
vari la N-terminazione. Quello che varia i meccanismi di rezione
sono diversi, ma soprattutto come legano il ligando. Se io per ho a
che fare con un reccetore GPCR dopo che stato attivato va
incontro a un fenomeno di endocitosi e di degradazione di questo
attraverso i lisosomi. Quindi per far si che la cellula risponda
nuovamente devo sintetizziare di nuovo i recettori. Esistono cinque
famiglie di GCPR, la loro classificazione asseconda della sequenza
amminoacidi.(Vedi Siide). Questa un immagine che mi piace molto
c una particolarit che non c nelle altre , vediamo che il

recettore pu legare un agonista o un antagonista. Quando lega


lagonista in grando di attivare la proteina G.Lagonista stabilizza
il recettore in forma attiva, ma che significa? Significa che il
recettore in forma attiva quando in grado di trasmettere il
segnale nella cellula, quindi nel nostro caso il recettore risulta
essere attivo nel momento in cui riesce a reagire con la proteina G,
quindi significa che ha una conformazione tale da permettergl di
reagire con la proteina G trimerica e di attivarla. Lantagonista non
me lo permette, quindi fa in modo che il recettore non attivi la
proteina G. Quindi lagonista mi lega la forma attiva, mentre
lantagonista mi lega la forma inattiva. Adesso quante proteine G
conosciamo: le trimeriche e le monomeriche. Quelle trimeriche ci
sono vari classi. In realt conosciamo le GS e le GP. Le proteine G tri
meriche sono formata da tre subnit, alfa, beta e gamma, ma beta
e gamma insieme si comportano come un'unica subunit. Chi che
da al nome alla proteina G?E la la subunit alfa. Allora abbiamo la
proteina GS, perch la subunit alfa alfa s; si chiama proteina
GQ, perch la subunit alfa alfa q si chiama GI perch la
subunita alfa i, si chiama si chiama proteina G12 perch la
subunit alfa 12. Abbiamo G-OLF, perch la subunit alfa si
chiama Olf e la ritroviamo nel tessuto olfattivo. G 11/12 perch la
subunit alfa si chiama 11/12. Adesso quelle beta/gamma che sono
molto conservate. Le proteine G trimeriche si trovano sulla
membrana plasmatica nei pressi del recettore. E quindi la sia
subunita alfa che beta-gamma queste proteine devono subuire una
modificazione post traduzionale che le permette lancoraggio alla
membrna plasmatica, a queste proteine viene aggiunto un gruppo
idrofobico che gli permette lancoraggio alla membrana. Quali sono
i classici effettori ossia gli enzimi che vengono attiva dalle subunit
alfa e dalla subunit beta-gamma?Le beta-gamma sono subunit in
grado di inattavirare la proteina G, ci che quando una proteina G
attiva lo perche la subunit alfa si dissociata dalla betagamma, che sta li pronta per riassociarsi con la subunit alfa. Allora
in il ruolo delle beta-gamma non solo mantentere inattiva la
proteina G, ci diventare trimerica e bloccare lattivit della
subunita alfa, in realt quando avviene la disocciazione la subunit
alfa avra i suoi enzimi effettori e anche la subunita beta-gamma
avra i suoi.Notare bene che non devono essere proprio degli enzimi

ma possono essere anche dei canali. Quali sono gli enzimi delle
subunit alfa s?Ossia i suoi effettori? Abbiamo adenilatociclasi, che
un effettore sia per la subunit alfa s che la subunit alfa i
solo che la s lattiva mentre la i linattiva. Poi abbiamo la alfa Q che
sicuramente che attiva la fosfolibasi c in forma B, e poi abbiamo
alfa 12/13 che in grando di attivare un fattore di scambio delle GTP
catteristico delle proteine G monomeriche RO. In questo caso la
subunit 12/13 attiva RO che una proteina G monomerica,
inducendo lo scambio del GDP con il GTP. Quindi una subunit
trimerica mi attiva una monomerica. Ancora le subunit Betagamma hanno i propi enzimi effettori oltre che hanno i canali ionici.
Gli enzimi effettori sono: adenilatocilclasi, fosfolipasi-c, hanno pi
enzimi effettori e attivano pi vie. Quando parliamo di pi enzimi
effettori diciamo sempre in un certo momento dellattivazione della
via di trasduzione la beta-gamma pu attivare un certo tipo di
effettore in un momento successivo ne pu attivare altre quindi non
attiva tutti contemporaneamente. In questa sequenza come viene
mostrato dallimmagine quello che viene sottolineato come la
proteina G viene attivata. Il recettore reagisce con la subunit alfa,
precisamente il terzo loop di connessione intracellulare che
interagisce. Quindi interagisce con la subunit alfa e induce il
rilascio del GDP dalla subunit alfa. Quindi il recettore ha il ruolo di
indurre il rilascio GDP e quindi lo scambio di GDP con GTP, quindi
un fattore che induce uno scambio. Le proteine G monomeriche
sono molto simili come comportamento di attivazione alle subunit
alfa della G trimerica. Anche per la subunit alfa abbiamo bisogno,
come per le G-monomeriche, un induttore del rilascio del GDP
altrimenti queste proteine non sono attive. In questo caso il
recettore ha proprio il ruolo dellinduttore dello scambio del GDP
con il GTP. Quindi si legher GTP quindi la subunit alfa non
interagisce pi con le beta-gamma e quindi abbiamo la
dissociazione e vediamo che lalfa legando il GTP andra ad attivare i
suoi effettori e anche la subunit beta-gamma, ormai dissociatasi,
andr ad attivare i suoi effettori. Ad un certo periodo di tempo per
si verifica che il GTP viene idrolizzato quindi il gruppo fosfato si
allontana e il GDP resta legato alla subinit alfa, ci comporta il
riassemblaggio della proteina G trimerica. Lattivit GTPasica della
subunit alfa di una proteina G-trimerica pu essere molto variabile

asseconda della proteina G presa in considerazione. Tipo la subunit


alfa s, della proteina trimerica GS, ha un attivit GTPasica intrinseca
molto alta e non necessit di fattori che inducano lattivare questa
attivit GTPasica. Quindi dopo che si legato GTP, induce lidrolisi di
questa da sola. Per se noi vogliamo modulare la risposta cellulare
ad un ligando, se noi abbiamo degli induttori dellattivit GTPasica,
vediamo che la cellula risponde in un tempo pi breve al ligando.
Nel nostro caso questo un processo che avviene spontaneamente,
nelle proteine GS avviene in un tempo abbastanza breve per se noi
vogliamo modulare la risposta cellulare variando il tempo in cui la
proteina G attiva basta attivare ulteriolmente lidrolisi del GTP,
quindi ci sono delle proteine dette induttori della attivit GTPasica
che sono capaci di attivare ulteriolmente lattivit GTPasica delle
subunit alfa s. Il legame del ligando con il recettore funge da gess,
fattore di exchange del GDP con GTP. Mentre le proteine gap, sono
proteine in grado di attiviare lattivit GTPasia cella proteina G. Se
abbiamo a che fare con la Gq, vediamo che una volt che informa
dissociata lattivit GTPasica non molto forte, per essere attivat
importante che la subunit alfa-q abbia gi attivato lenzima
effettore. Ci siginifica che tra quel enziama effettore che
interagendo con lalfa-q attiva lattivit Gtpasica dellalfa-q. E chiaro
che in questo modo linattivazione della Gq si verifica e in
particolare della subinit alfa, si verifica solo dopo che la subunit
alfa stata in grado di interagire con leffettore e quindi di attivarlo.
Per la Gs invece dopo che viene attivata non hai bisogno che la
subunit gs abbia gi attivato leffettore enzimatico. Quindi il
meccasimo di regolazione sono diversi. Allora un'altra cosa che
dobbiamo sottolineare e che il recettore in una certa confomazione
mi attiva una proteina G, per esempio la GS, ma se il recettore
cambia conformazione, sempre legato al ligando, potrebbe attivare
unaltra proteina G, per esempio una proteina Gq, attenzione per
deve essere sempre legato al ligando. Come possibile questo?
Allora come possibile influenzare la confomazione di un recettore?
Prima di tutto deve essere in forma attiva il recettore altrimenti le
proteine G non le attiva, deve essere legato al ligando. Per noi
abbiamo detto che il legame del recettore con il ligando induce un
cambio conformazionale che porta il recettore ad interagire con una
proteina G ed attivarla. Dopo che quindi ha attivato una prima

proteina G possibile che successivi cambi confarmazioli indotti da


particolari eventi possono portarla ad attivare una seconda proteina
G e attivare una nuova via. Ma cosa succede in realmente? Un
evento che ha portato il recettore ad un ultreriore cambio
conformazionale del recettore che lo ha porta ad interagire con
unaltra proteina G attivandola. Questo fenomeno si chiama switch
funzionale, ossia un cambiamento dellaccoppiamento funzionale di
un dato recettore con differenti proteine G. Questo si verifica solo e
soltando quando il ligando legato al recettore! Quindi significa che
per far avvenire un fenomeno di switch la concentrazione del
ligando deve essere bella ampia, non deveno essere piccole
variazione, perch la permanenza del legame con il ligando deve
essere maggiore e come si pu verificare? Prima di tutti noi
sappiamo che quando il recettore lega il ligando, determina
lattivazione di una via di traduzione e abbiamo una risposta
cellulare, sar proprio la risposta cellulare che in qualche modo mi
influenza il legame del recettore con la proteina G. Com possibile?
Se noi attiviamo una via di trasduzione del segnale e come risposta
ho un attivazione di una chinasi, la chinasi va a fosforilare il
recettore, il gruppo fosfato bello carico, quindi porta a una bel
cambio confomazionale del recettore che perde affinit per la
proteina G che aveva attivato e cambia rotta, ossia va ad attivare
una nuova proteina G, quindi significa che che aumenta la sua
affinit per un'altra proteina G. Quindi significa che quando noi
abbimo uno switch funionale ci una recettore dallattivazione di
una proteina G passa allattivazione di un'altra proteina G abbiamo
una seconda risposta cellulare in questo modo dovuta al cambio
formazionale indotto dalla prima risposta sul recettore che porta
questo a perdere affinit per la prima proteina G e quindi andare ad
attivare un'altra, attivando cosi una nuova risposta. Attenzione per
la risposta B non pu mai precedere la risposta A,in quanto
indotta dalla risposta A.

1)Ligando si lega con il recettore


2) Cambio confomazionale recettore
3)Attivazione della proteina G

4)Attivazione da parte della proteina G attivata dei suoi enzimi


5) Trasduzione del segnale ed elaborazione della risposta A: mi
forma un secondo messaggero che porta l attivazione delle chinasi
6)Chinasi fosforilla nuovamente il recettore legato al ligando
7)Nuovo cambio confomazionale del recettore
8)Perdita di affinit della prima proteina G, attivazione di una
seconda proteina G.(Switch)
9) Nuova Risposta B, indotta dalla seconda proteina
Ricorda che per avere la seconda via, e quindi lo switch, io devo
avere una concentrazione di ligando superi un certo livello: se io ho
una certa concentrazione avr una risposta, se io ho una
concentrazione di ligando aumenta io ho la risposta A e B. Qui ci
sono un po' di risposte fisiologiche che seguono una stimolazione di
un GPCR, ttua una serie di ormoni e molecole segnali attivano
recettori GPCR su vari organi e la risposta cellulare dipendera dal
tipo tessuto e cellula. Sono giusto rappresententa per farvi capire
fisiologicamente quello che succede. E chiaro se che sono ligandi
per recettori GPCR. I GPCR sono lipoproteine, hanno subito la
modificazione post-traduzionale che ha portato allaggiunto un
acidograsso a questo recettore. Quando io ho per dico queste cose
dipende sempr dal tipo di recettore, dal contesto cellulare, in linea
guida generali. A che serve laggiunta del gruppo idrofobo? Noi
abbiamo prima di tutto vari meccanismi che sono implicati nella
aggiunta di un gruppo idrofobico a una proteina. Allora abbiamo la
(vedi slide). Tutti questi processi aggiungono queste cantene laterali
molto idrofobiche alle proteine e ne permettono allancoraggio della
proteina alla membrana. Per quello che si veifica per questi
processi, la prenilazione e mirisoilazione che questi processi sono
irreversibili. Una volta che si verificato poi non vengono pi
rimossi questi gruppi che sono aggiunti. Quindi significica che io
non posso regolarlo come processo. Se invece noi aggiungiamo un
acido grasso tipo il palmitato a 16 atomi di carbonio la
palmitoilazione, un processo reversibile. Questo un processo di
tioesterificazione, quindi a un residuo di cisteina viene aggiunto un
acido-grasso. Per laggiunta di in gruppo idrofoboco mi permette

lancoraggio della proteina alla membrana plasmatica. C ne sono


tantissime di proteine che hanno queste modificazioni posttraduzionali che permettono lancoraggio sulla membrana. Adesso
mi chiedo un recettore GPCR a sette segmenti di trans membrana,
pi lungo di lui non c nessuno attraversa sette volte la membrana
ancoratissimo, allora perch ha bisogno di questo gruppo? In
realt se noi aggiungiamo un acido-grasso a lunga catena
allestremita C terminale che cosa fa? Non svolazza verso il citosol!
E idrofobico! E come se si formasse un quarto loop, perch tu
aggiungi un acido-grasso a lunga catena che per non va interagire
con lambiente idrofilico del citosol, quindi avremo una sorta di
quarto loop.Ma a che serve? Questo nuovo loop che si viene a
creare come se facilitasse linterazione tra il recettore e i domini
idrofobici delle proteine bersaglio, ossia la proteina G. Quindi se ci
sono dei domini idrofobici, laggiunta di un acido-grasso a lunga
catena permette un interazione tra il recettore e il gruppo idrofobico
presente sulla proteina G,quindi facilit linterazione. Poi dobbiamo
dire per che non tutti i recettori presentano il sito di palmitilazione.
Quindi sicuramente questo ci fa pensare che la palmitilazione non
importante per la localizzazione sulla membrana plasmatica ma
soltato solo un processo che mi consente di modulare lattivit
recettoriale, nel senso che mi permette migliore interazione con le
proteine G. In realt quello che si visto che in alcuni casi
mutazioni del recettore che fanno si che il recettore non sia
palmoilato, ma pu diventare iperfosforilato. Se noi abbiamo una
iperfosforilazione del recettore in alcuni casi noi possiamo avere la
desentitizzazione recettoriale. La fosforolazione di un recettore pu
indurre uno switch funzionale cellulare ma questa solo una delle
possibilit. Il recettore infatti dopo essere stato fosforilato dopo
essere stato attivato puo essere in alcuni casi endocitato o in altri
casi riduce la sua affinit verso il ligando. Quindi la fosforilazione del
recettore in siti diversi molto importante per lattivit recettoriale,
per riuolo. Perch quando fosforilato il recettore potrebbe non
legare pi il ligando con la stessa affinit oppure la fosforilazione
del recettore potrebbe essere importante per il processo di
internelizzazione del recettore. Quello che si visto che in alcuni
casi la iperfosforilazione del recettore pu consentire la
desentitazzizaione del recettore. Per esempio in alcuni casi dopo

che la proteina chiansi A fosforila il recettore puo indurre un


processo che viene chiamato desentititizzazione di tipo etereloga.
La cosa interessante da considerare e che la palmitilazione
reversibile quindi posso regolare questo processo. Quindi laggiunta
di questo gruppo, dellacido grasso a lunga catena, potrebbe
facilitare linternazione con la proteina G, potrebbe far si che la
proteina chianasi A non vada a fosforilare il recettore e non lo
desintetizza, ma se io rimuovo questo gruppo posso invece ridurre
linterazione del recettore con la proteina G e posso fare in modo
che la proteina chinasi A me lo vada ad inattivare, quindi i processi
sono finementi regoalti. Non tutti i recettori presentano siti di
plamolitazione, sicuramente questo ci fa pensare che la
palmolitazione non importante per la localizzazione sulla
membrana plasmatica, ma un processo che mi consente di
modulare lattivit recettoriale, nel senso mi permette un migliore
interazione con le proteine G, oppure per la fosforilazione del
recettore? In realt come si visto, che in alcuni casi mutazioni del
recettore fanno si che il recettore non possa essere palmoilato.,
fanno si che il recettore diventi iperfosforilato. Se noi abbiamo
iperfosforilazione del recettore in alcuni casi possiamo avere da
desentitizzazione recettoriale. Prima che cosa abbiamo detto, che la
fosforilazione di un recettore pu indurre uno swithc funzionale del
recettore alle varie proteine, ma questa una delle possibilit
perch dopo essere stato fosforilato, chiaramente deve essere
attivo, il recettore pu essere endocitato o perdere affinit per il
ligando. Quindi la fosforilazione del recettore in siti diversi
naturalmente molto importante per lattvit recettoriale proprio
per il ruolo che assuemra, perch quando fosforilato potrebbe non
legare il ligando con la stessa affinit oppure potrebbero la
fosforilazione del recettore potrebbe essere importante per il
processo di internalizzazione del recettore. Quello che si visto e
che in alcuni casi liperfosforilazione del recettore pu consentire la
desentitizzazione recettoriale, per esempio la proteina chinasi A
quando fosforila il recettore induce un processo di desentitizzazione
di tipo eterologa e poi andiamo a studiarla(vedi le slide nuve). La
palmolitazione reversibile, quindi posso regolare questo processo,
quindi laggiunta di questo acido grasso a lunga catena potrebbe
facilitare linterazione con la proteina g, potrebbe far si che la

proteina chiansi a non vada a fosforilare il recettore e la


desentitetizza. Ma se elimino questo gruppo diminuisce
linternazione tra il recettore con la proteina G e quindi che la
proteina chiansi vada ad intattivarlo. Non tutti i recettori sono
palmoilati, quindi significa che non tutti i siti GPCR presenti sul
recettori il sito di palmoilati, proprio per questo motivo che si
capito che il sito di palmolitazione non necessario per lancoraggio
sulla membrana. Ma in alcuni casi si visto che si non serve per
lancoraggio, ma se io il recettore non lo vedo palmoilato non me lo
trovo sulla membrana, questo dovuto principalmente al fatto che
le vescicole che contengono il recettore poi non si vado a fondere
con la membrana perch se una proteine di membrana viene
sintentizata nel reticolo endoplasmatico, poi le vescicole vengono
inviate al golgi e dal golgi alla membrana plasmatica. Unaltra cosa
che non sapete e che un recettore GPCR lo trovate anche in forma
dimerica, molto spesso avete studiato che i recettori a singolo
segmento trasn-membrana devo dimerizzare, i recettori tirosinachiansi oppure come quelli per linsulina ch sono gi in forma
dimerica per farvorire la trasmissione del segnale. Anche i recettori
GPCR possono essere dimerizzati, ma a che serve la dimerizzazione
del recettore? In alcuni casi si visto che i reccitori GPCR, per
esempio il gaba, possono formare eterodimeri o omodimeri. Avvolte
quello che si riscontrato per esempio e che se il recettore per
essere funzionale deve per esempio essere in forma eterodimerica
per essere funzionale, se la cellula esprime uno solo dei due dimerii
o il recettore rimane localizzato nel reticolo endoplasmatico oppure
lo troviamo sulla membrana ma non funzionale quindi vediamo
che leterodimerizzazione importante per il trasporto del recettore
sulla membrana plasmatica. Quindi diciamo che in alcuni casi la
dimerizzazione importante per il coretto posizionamento del
recettore sulla membrana. In altri casi la dimerizzazione pu essere
importante per la capacit del recettore di legare il ligando. Cio per
i processi come ho spiegato laltra volta di coperativit. La
dimerizzazione pu permettere un processo di coperativit positiva
o negativa del legame del ligando con il recettore. Il legame del
ligando al recettore pu influenzare il legame di una seconda
molecola di ligando ad un altro recettore con cui prende contatto.
La dimerizzazione importante per i processi si coperativit

positiva o negativa. Ancora se visto che recettori in forma


omodimerica attivano un certo tipo di proteine G mentre in foma
eterodimeriche attivano altre proteine G. Com stato possibile
studiare le regioni funzionali di un GPCR, sono stati utilizzati degli
studi con proteine chimerica, una proteina che nasce dalla fusioni di
diversi domini proteici, stato possibile identificare quali sono i
domini proteici. Proprio grazie allutilizzo di recetori chimerici
stato possibile identificare quali sono i domini funzionali del
recettore, sono stati creati delle proteine che hanno dei domini
appartententi a un tipo di recettore e domini appartenenti ad un
altro tipo di recettore. E stato possibile capire i domini funzionali,
per esempio se io ho un recettore per FSH, in una cellula che
esprime questo recettore, quando FSH lega questo recettore io avr
una risposta cellulare indotta dallormone, suponiamo di avere un
recettore per LH, LH lega il suo recettore e la cellula da una risposta
caratteristica indotta dal LH. Se io per formo una proteina
chimerica che ha lestremita n terminale per FSH e tutto il resto del
il recettore lega LH che cosa succedera? Succedera che la cellula
lega FSH e la risposta cellulare la risposta caratteristica del LH,
quindi lestremita N terminale quella deputata al legame con il
ligando ma poi sar il resto della proteina che si occuperara,
idurrera una risposta specifica. Questo stato lapproccio
sperimentale che ha permesso di studiare i domini funzionali del
recettore. Sono entrambi, sia LH che FSH, hanno una stessa natura,
sono glicoproteine. Hanno usati recettori appartententi alla stessa
famiglia, quindi sono molti simili, perch hanno sequenze
amminoacidi con similutide per circa il 25%, per creare la proteina
chimerica, quindi sono molto simili quindi noi cambiamo solo la
estremit terminale e il recettore si attiva lo stesso. I fattori in grado
di influenzare la segnalazione del GPCR, ossia quali sono i fattori
che possono influenzare lattivita del recettore indipendetemente
dal legame al ligando?Guarda punto due :
1) La natura del ligando, se agonista o antagonista e quanto
concentrato
2) La fosforilazione, palmolitazione, la dimerizzazione
3) Il numero di recettori.
4) Le proteine G possono influenzare la segnalazione, possono
abbandondare con le proteine G ed pi facile la

segnalazione, oppure posso esprimere piu o meno proteine


Gap, oppure posso avere lespressione di proteine RGS,
proteine in grado di regolare la segnalazione delle proteine G o
attivano lo scambio del GTP oppure attivano lattivit GTPasica
della proteina G.
Questa immagine mi pu sottolineare che abbiamo tantissimi
recettori GPCR che sono detti orfani, perch non si conoscono i
ligandi, significa che la ricerca in questo campo apertissima.
Lezione 7:
Prima di tutto possiamo in genere schematizzare la trasduzione
associa ai recettori a settesegmenti a transmembrana in questo
modo: abbiamo un segnale esterno, il ligando, il recettore, un
trasduttore(proteina G) ed un effettore primario, ossia enzima
accoppiato la proteina G. Grazie alleffettore si genera un secondo
messaggero che pu attivare delle tappe intracellulari mediati da
effettori secondari, ci proteine intracellulari. Quello che varia sono i
vari enzimi effettori di ogni proteina G. Quali enzimi conosciamo?
Ladenialto ciclasi, la fosfolipasi ma anche la fosfolipasi
A2.Ladenilato ciclasi quando viene attivato genera AMPciclico che
come secondo messaggero dar luogo allattivazione delle proteine
chinasi. Attenzione questo uno scema generale, ma pu
presentare altre funzioni come per esempio inibizione di canali o
attivazioni di questi. La fosfolipasi c invece, associata alla proteina
GQ e alle GO possono essere accoppiate alla fosfolipasi c. Dalla sua
attivazione abbiamo la genesi dellinsolitolotrifosfato e di
acetilglicerlo che si vengono a formare dal precursore
fosfatidilinositolodifosfato e vediamo poi che linositolotrifosfato
porta alla liberazione del calcio dal reticolo endoplasmatico e tale
processo porterra allattivazione della proteina chinasi C che ha tutti
una serie di bersagli specifici. La fosfolipasi A2 una proteina
localizata sulle membrana ed una fosfalipasi, quindi un enzima
che si trova nei pressi del substrato che sono gli acidi grassi di
membrana, infatti li idrolizza i fosfolipidi di membrana in una
posizione diversa dalla fosfolipasi c. E particolare la fosfolipasi A2
quando agisce libera acido arachidonico che da luogo a tutta una
serie di messaggi intracellulari. Partiamo dalladenilato ciclasi, un

enzima di membra che formato da due strutture che si ripetono.


Abbiamo due domini M, due domini C, ecc come se fosse una
duplicazione guarda sulle slide. I domini M hanno il compito di
ancorare l proeina alla membrana, mentre quelli C1A E C2A sono
deputati a formare il sito di legame per lATP, ossia il sito catalitico
perche lega lATP che viene trasformato in Cmp. Inoltre questi sono
proprio i siti C che sono deputati allinterazione con la subunit alfa
della proteina G, in particolare vedremo che questi domini C sono in
grado di interagire sia con alfa s di una proteina GS che con una alfa
i di una proteina G i. Da sole la proteina ingrado di clicizzare
lAtp,per proprio linterazione con la proteina GS che ne aumenta
notevolmente lattivit. Un altro fattore che pu aumentare lattivita
delladenilato ciclasi la fosfolina, una piccola proteina che
interagisce con ladenilato ciclasi e da azione sinergica con la GS.
Questa enzima ha una certa attivit anche se non interagisce con
una GS, per in questo caso molto bassa ecco perch interagisce
con una GS e una fosfolina, perch insieme permettono di
aumentare la sua attivit. Questa immagine la situazione tipica,
uno schema. Quando diciamo che ladenilatocilcasi attivata da
una GS, perch tutto dipende da quali isoforme di adenilato ciclasi
stiamo considerando e vediamo che non solo una GS pu
attivarmela,ma anche il Calcio mi pu attivarla oppure nei sistemi di
fosforilazione delladenilatociclasi: quindi sono tutti eventi che
possono inflenzare lattivit delladenilatociclasi. Diciamo che
asseconda delle isoforme, non le chiede, dobbiamo capire quello
che succede. Noi abbiamo lisoforma, 2.4.7. che sono
tranquillamente attivate da una subunina alfa S di una Gs, per
anche B-gamma di una Gi possono attivare ladenilatocilcasi.
Ancora per esempio anche beta-gamma di una Gq hanno un azione
stimolatoria
sulladenilatociclasi.
Quindi
noi
facciamo
lindentificazione generale, ossia che nella maggior parte la
proteina GS, per la situazione molto diversa perch dipende dalle
isoforme e non solo le subunita alfa possono influenzare
ladenilatociclasi ma anche le beta-gamma. Attenzione, diciamo che
le beta-gamma che mi attivano le adenilato-ciclasi non sono quelle
di una Gs! Ma sono quelle attivate da altre proteine G. La quantita
di beta-gamma necessaria per attivare un adenilato-ciclasi
maggiore rispetto alla subonit alfa-s. Quindi che significia? Io se

voglio avere un attivazione tramite le subunit beta-gamma devo


avere una concentrazione di beta-gamma attive maggiore rispetto
alla subunit alfa. Io devo andare quindi ad attivare pi subunit
beta-gamma, quindi pi vie contemporaneamente. Quindi per
attivare ladenilato ciclasi tramite le beta-gamma, pi segnali
contenporanemante devono essere arrivati sulla cellula. Quindi
ladenilato-ciclasi un punto di integrazione dei segnali. Anche il
calcio pu attivare ladenilatociclasi: come? Dipende prima di tutto
dalle sue forme, tipo quella 5-6 che viene inibita dal calcio, ma
lisofomata 1-3-7 invece viene attivata dal calcio ma non
direttamente come ione calcio bensi il legame calcio-calmodulina
che consentira lattivazione di queste isoforme. Quindi uno stesso
ione il calcio se agisce da ione interagisce con lisoforma 5-6 e me
la va inibidire, mentre in altri processi cellulare dove sono presenti
isfoforme 1-3-7 pu attivare queste isoforme associandosi solo alla
calmodulina. Generalmente la Gi va inibire con la subunit alfa,
direttamente lisoforma cinque,6,1,3,8 ma con le beta-gamma mi va
ad attivare le altre, 2-4-7. Quello che deve essere chiaro che
questo enzima attivato sicuramente dalle proteine G, interagendo
con le subinit della proteina G attive o la alfa o la beta-gamma
sicuramente lalfa s quella attiva. Mentre la alfa i quella che pu
inibidire, mentre la beta-gamma possono attivare anche. Il calcio in
quanto ione va inibidire alcune isforme, se legato a calmodulina pu
attivare altre isoforme. Anche il processo di fosforilazione possono
influenzare lattivit delle adenilato ciclasi, per esempio una Pkc che
un proteina chinasi-c attivata dalla via che vede interagire un
recettore con la fosfolipasi-c(vedi sopra). Quando in alcuni contesti
abbiamo un incremento della proteina chinasi-c attiva pu andare a
fosforilare ladenilato ciclasi e aumentarne lattivit. Questo
significa che se arrivato un messaggio sulla cellula che ha
comportato lattivazione di una proteina chiansi-c
la proteina
chinasi mi va a fosforilare e attivare ladenilato-ciclasi che cosa si
verifica? Si verifica che la cellula diventa pi responsiva ad un altro
ligando che poi mi attiva la via delladenilato-ciclasi legando
chiaramente il recettore che a sua volta attiva la proteina G che a
sua volta attiva l enziame effettore. Ricorda che la responsivit di
una cellula per un ligando dipende dalla

concentrazione di ligando
dal numero di recettori
da tutte le vie di trasduzione assocciate al recettore
come per esempio lattivazione della proteina G,
ladenilato ciclasi ecc.
Quindi se io attivo gi di base pi adenilatociclasi nel momento in
cui arriva il ligando io trovo gi una situazione favorevole, quindi
attenzione la risposta cellulare ad un ligando dipende da
numerosi fattori (elecati sopra) in particolare le vie di
trasduzione del segnale assocciate al recettore sono importanti per
la risposta cellulare. Basta che io aumento un enzima chiave della
via di trasduzione del segnale che rendo pi sensibile la cellula a
quella via e quindi al ligando che ti attiva quella la via. Ladenilato
ciclasi catalizza la formazione di AMPciclico, che si forma dallATP e
che porta alla liberazione del pirofosfato. Soffermiamoci su
AMPciclico, vediamo che una molecola con pi gruppi funzionali,
abbiamo un residuo di adenina, abbiamo un gruppo fosfato che
aggiunge una carica, abbiamo lo zucchero. E proprio la presenza di
pi gruppi funzionali che gli permette di interagire con i siti
bersaglio, in modo che pu interagire con pi parti della molecola
ed ha come principale bersaglio la proteina chinasi A, in realta
capace di reagire con le subunita regolatorie della chinasi A in modo
che le subunit catalitiche di questa proteina si dissociano. La
chinasi A formata da due subunita regolatrici e due subunit
catalitiche. Quando i livelli Amp-ciclico sono basse, le subunit
regolatorie interagiscono con quelle catalitiche, perch le subunit
regolatotrici assumono una conformazione tale da esporre un
domino pseudo-substrato, ma che cosa ? Un dominio pseudosubstrato una parte della proteina che strutturalmente simile ai
bersagli della proteina stessa, in questo caso i siti catalitici delle
subunit catalitiche. Quindi la subunit regolatoria presenta un
pseudo-substrato, ossia un dominio molto simile ai siti catalitici
delle subunit catailitich che sono degli enzimi. Quindi che cosa
pu succedere? Quando ho una confomazione tale che proteina
regolatrice presenta il pseudosubstato esposto, questo ultimo
interagisce con il dominio catalitico della proteina non effettuando
nessuna catalisi, come un serpente che mordesse la propia coda,

naturalmente tiene occuppato la bocca. Lenziama, ossia il dominio


catalitico, impiegato a interagire con il sito pseudosubstrato,
quindi non pu Interagire con il bersaglio. In realt la proteina
chinasi A, formata da due subunita regolatorie e due subunit
catalitiche e la diretta interazione tra le due avviene attraverso
proprio il sito del pseudosubstrato. Quando i livelli di AMPciclico
aumento, lega la subunit regolatoria e in particolare due molecole
regolano una subunit regolatoria, quindi essendo due abbiamo
bisogno 4 molecole per legare le de subunit regolatorie. E da tale
legame abbiamo un cambio confomazionale tale che le subunit
catalitiche si dissociano dalle subunit regolatorie. Dobbiamo dire
che le subunit catalitiche sono attive quando sono dissociate e in
forma monomerica. Nel momeno in cui abbiamo la dissociazione tra
le due subunit, ossia regolatoria e catalitica, si verifica che la
subunit regolatoria perder affinit per AMPciclico che a sua volta
si dissocia. Questo importante perch il segnale si spegna, questo
possibile andando a diminuire i livelli di AMPciclico in modo che
possano tornare ai valori di riposo dopo un certo tempo.Quindi una
volta che quella regolatoria si dissociata dalla catalitica,
successivamente perde affinit per AMPciclico che si pu staccare, il
processo non rapidissimo. A questo punto ampciclico diventa
substrato dellenzima fosfodiesterasi che mi traforma AMPciclico in
5-Adenosina mono fosfato, c da ciclico diventa lineare.
Chiaramente linearizza tutto Ampciclico presente anche quello sulle
subunit regolatorie rendendolo cosi intattivo. Queste altre
immagine vanno a vedere in dettaglio la sequenza pseudosubstrato
e vi mette in evidenza che la sequenza del pseudosubstrato molto
simile alla sequenza nonsenso che riconosce il domonio catalitico
sul substrato bersaglio. La risposta allinterno di una cella pu
essere localizzata, ci si verifica solo in un area della cellula ci per
esempio un aumento di AMPciclico pu far si che ci sia una risposta
cellulare localizzata, che si trova in un area particolare della cellula.
Un esempio valido sono alcune cellule immigranti che appunto sono
in grado di muoversi in una direzione e per farlo hanno bisogno di
emettere psdeudopodi, quindi abbiamo una riorganizzazione del
citoscheletroco in un area della cellula che completamente
diversa da quella nellarea opposta. Questo quello che succede
quando una cellula si deve muovere. Generalmente la dinamica del

citoscheletro si verifica solo nella porzione apicale dove vengono


emessi pseudopoidi e solo in quella zona che abbiamo bisogno di
effettura una certa risposta. Queste risposte sono generalmente
indotte da alti livelli di AMPciclico, quindi possiamo avere delle
risposte nella cellula localizzate. Ma come facciamo a localizzare
una risposta cellulare? In realt abbiamo delle proteine che sono
chiamate di ancoraggio e la proteina Acap in grado di ancorare la
proteina chinasi A nei pressi dei bersagli. Allora se io ho una
proteina di ancoraggio che mi lega la proteina chinasi A, che cosa
succede? Che se io ho alti livelli di Ampciclico andr a lavorare dove
sta la proteina chinasi. Se la proteina chinasi A localizzata in una
zona specifica io avro una risposta in quella zona. Queste proteine
che sono state identificate come Acap, proteine di ancoraggio della
proteina chinasi A.Pero attenzione Acap una proteina di
ancoraggio della proteina chiansi A ma hanno la capacit di
ancorare anche altr proteine. Quali sono i bersagli classici della
proteina chinasi A? La proteina chinasi A viene attivata dall
Ampciclico, la classica via di attivazione la descriviamo qui dopo il
punto. Questa attivazione avviene tramite la trasmissione del
sistema simpatico che permette il rilascio delladrenalina che
interagisce ed attiva i recettori beta-adrenergicici che sono
associato a una GS che a sua volta attiva la sua subunita alfa s che
si occuperara di attivare ladenilato ciclasi che si occupa di creare
AMP ciclico. Se io ho lattivazione del sistema simpatico, devo
lottare o fuggire, si crea una condizione di stress per esempio vedo
il leone o lotto con il leone. In ogni caso in quel momento non devo
pensare a immagazzinare le riserve energetiche ma le devo
liberare, quindi devo liberare il glicogeno e quindi deve essere
demolito per liberare glucosio. Quindi mi aspetto che nel muscolo ci
siano quei processi che mi permettono di avere il glucosio dalla
scissione del glicogeno. E la proteina chinasi A proprio capace di
attivare questi processi. In realt affinche il glicogeno venga
demololito la glicogeno fosforilasi deve essee attiva.Questo enzima
fa si che che dal glicogeno si forma il glucosio 1-fosfato. E chiaro
che se questo enzima deve essere attivato mi aspetto che la
proteina chinasi A mi vada ad attivare questo processo. La proteina
chinasi A una chinasi, quindi mi va a fosforilare degli enzimi
bersagli. Quindi la glicogeno fosforilasi se fosforilata diventa attiva.

In realt non la proteina chinasi A che va a fosforilare


direttamente la glicogenofosforilasi. Infatti la proteina chinasi A va
prima a fosforilare e quindi attivare un enzima che attiva il
glicogenofosforilasi che a sua volta fosforilla la glicogenofosforilasi.
Quindi abbiamo tutta una serie di patway che vengono attivate
prima che sia lenzima finale a essere attivato. Ma perch non va
direttamente a fosforilare lenzima che mi va a liberare il glucosio?
Per amplificare il segnale. Succede che Pka fosforila un enzima che
diventa cosi attivo che va a fosforilare tutta unaltra serie di enzimi,
quindi io amplifico il segnale. E infatti quello che si verifica che io
ho la proteina chinasi A che va a fosforilare la fosforilasi-chinasi ci
quella che mi va a fosforilare la glicogenofosforilasi. Quindi la
glicogenofosforilasi deve essere in forma attiva per formare glucosi,
quindi la proteina chinasi mi permettere di attivare quel patway che
mi permette non in modo diretto di attivare la protiena
glicogenofosforilasi.
Se io devo liberare glucosio non devo
depositarlo quindi la patway opposta, ossia quella che mi porta
alla deposizione del glucosio sottoforma di glicogeno deve essere
inibidita e infatti la glicogeno sintentasi mi viene inibidita dalla
proteina chinasi. Limportanta di avere patway prima di avere quella
finale, quindi pi tappe, ci permette di avere lamplificazione del
segnale. L'adrenalina o epinefrina ( Epinefrina una dicitura americana mentre
adrenalina Europea) attiva una via che porta come secondo messaggero ad un incremento
delladenilato ciclasi. Gi al livello delladenilato ciclasi abbiamo un amplificazione, in quanto
questo catalizza molte reazioni che portano alla sintensi di Amp cilcico. Il legame del Amp ciclico
con la proteina chinasi A non una tappa di amplificazione, ansi! Perch quattro molecole di Ampc
interagiranno con due subunit regolatori si liberanno due subunit catalitiche. Queste lunica
tappa che non provede amplificazione. La proteina chinasi A avr tutta una serie di substrati e non
catalizzer solo una reazione, quindi fosforila pi molecole di sub-strati e avremmo un
amplificazione e gli enzimi attivati andranno a loro volta ad effettuare pi reazioni. Vediamo come il
segnale in questo modo viene amplificato e la risposta pi rapida. Queste sono risposte che non
sono mediate dal nucleo, nel senso che lattivazione di questi processi vede coninvolto
semplicemente lattivazione di proteine pre-esistenti, in realt viene attivata pKa andra a fosforilare
enzimi bersaglio gi presenti nella cellula che modula lattivit. Quello che abbiamo visto fino ad
ora sono gli effetti legati alla pKa che vede coinvolto proteine pre-esistenti. In realt lattivazione
della pKa pu anche modulare la trascrizione genica, in questo caso il processo pi lento. Quindi
se io scappo o combatto devo attivare e spegnere altre velocemente, quindi una reazione di stress
leffetto di attivazione di vede su proteine gi presenti! Non si deve aspettare la sua sintesi. Se
voglio per degli effetti pi duratori posso aumentare il numero di proteine e in questo caso il
processo sar pi lungo. E infatti in questo caso abbiamo lattivazione della trascrizione. Per
attivare la trascrizione genica abbiamo bisogno di fattori di trascrizione che vengano attivati. I
fattori di trascrizione sono fattori capaci di modulare la trascrizione genica perch reclutano
coattivatori. Legano il DNA e possono reclutare co-attivatori e delle proteine che permettono di

modulare lattivita di trascrizione. Nel caso in cui abbiamo pKa attiva, si pu verificare che venga
attivato un fattore di trascrizione che si chiama Kreb, ossi un proteina sub-strato della pKa che
viene quindi fosforilato dalla pKa. Quindi Kreb, fosforilato, va a interagire degli elementi di risposta
presenti in alcuni nei promoter dei geni bersaglio. Quindi Kreb fosforilato pu andare a modulare la
trascrizione genica non da solo, reclutando coattivatori. Diciamo che la pKa va a operare delle
fosforilazioni ma su quali residui amminoacidi: serina e tirosina. Una volta che kreb stato
fosforilato come facciamo a spegnere il segnale? Attraverso lattivazione al livello nucleare di
fosfatasi, che vanno a defosforarlo e renderlo inattivo. Quando parliamo di questo tipo di vie se la
fosforilazione mi attiva o mi spegne perch per esempio la glicogeno sintetasi se viene fosforilata
si inattiva. Quindi lattivazione o inattivazione degli enzimi attraverso la fosforilazione sono eventi
reversibili, quindi parallelamente allevento che mi porta allattivazione della via vengono anche
attivati eventi che mi portano allo spegnimento del segnale. Quindi in realt se una proteina viene
fosforilata ed ha una certa attivit enzimatica, dopo un po' di tempo viene defosforilata perch
vengono attivati sempre i processi anche opposti, se no la cellula sarebbe stimolata allinfinito.
Quando parliamo di Adenilatociclasi, le risposte indotte dallAmpciclio indotto dallattivita
delladenilatociclasi possono essere di natura diversa. La risposta cellulare dipende a questo punto
dalla specializzazione della cellula. Il recettore sar sicuramente diverso pero io ho alla fine ho
AMPciclico nella cellula, il ligando che mi ha fatto si che il Ampciclico si incrementassero pu
essere stato diverso ma io alla fine io nella cellula ho alti livelli di Ampciclico. La risposta cellulare
adesso mediata da un incremento di Ampc dipende dalla cellulla, dalla specializzazione cellulare.
E infatti vediamo questa tabella che semplicemente che mi riassume qual la risposta metabolica
di una cella ad un incremento di un ormone che mi pu aver portato come risultato un aumento di
Ampc nella cellula.

Adrenalina, glucagone, la ACTH, TSH comportano un incremento dellidrolisi dei trigliceridi oppure
una riduzione delluptake degli amminoacidi. Un esempio pratico prendiamo in considerazione un
follicolo dove agisce FSH ed LH, mi porteranno a un incremento della sintesi di progesterone ed
estrogeni e questi effetti completamente diverse sono mediati da alti livelli di AMP ciclico. La
risposta cellulare dipende anche dalla specializzazione della cellula. Ma lazione del CMP sono
tutte mediate dalla proteina chinasi A? No, in realt lAmp ciclico pu anche andare ad attivare dei
canali ionici oppure pu andare ad attivare indirettamente delle proteine G monomeriche, perch?
Come facciamo ad attivare una proteina G monomerica? Per attivare una proteina di questo

genere io bisogno di attivare il fattore che mi induce lo scambio del GDP con il GTP. Se il CMP
lega e attiva un fattore che induce lo scambio del GDP con GTP per una proteina G monomerica
abbiamo attivato indirettamente la proteina G monomerica. Quello che si visto che il CaMP pu
andare ad attivare Epac, proprio un fattore di scambio attivato da Camp. Questo lega epac e il
complesso formato interagisce con una proteine G monomerica che si chiama Rap che presente
sulla membrana di organelli ed importante per lattivazione dellattivita piastrinica, inducendo cosi
lo scambio del GDP con il GTP quindi in grado di attivare indirettamente una via che vede
coinvoliti le G monomerica, quindi non tutti gli effetti sono mediati dalla pKa. Le azione del camp
sono anche legate al probabilit che una volta che CMP lega una proteina canale il canale si pu
aprire o chiudere. I canali infatti esistono in due stadi: aperto e chiuso. La transazione dallo stadio
aperto a quello chiuso viene detto gameting del canale, linterazione del canale con il camp pu in
qualche influenzare lapertura del canale ed proprio importante per lepitelio olfattivo. In realt
quello che si verifica che i recettori olfattivi sono proprio cellule specializzate per la recezione del
messaggio. Queste molecole odoranti hanno una natura chimica quindi queste cellule in grado di
conoscere gli odori presentono sulla loro membrana proprio dei recettori a sette segmenti a tran
membrana che appunto legano la molecola e vanno a attivare una proteina g particolare, ossia la
G olf perche si trova nellepitelio olfattivo. Attiva quindi una subunit alfa olf e quindi pu andare ad
attivare ladenilato-ciclasi che forma Amp-ciclico che va ad interagire con proteine canale e le apre.
Adesso voi sapete che un recettore deve trasdurre uno stimolo di varia natura, in questo caso
chimico, in una variazione del potenziale di membrana, questo il ruolo di un recettore olfattivo.
Una cellula recettore olfattivo deve far si che il segnale di natura chimica viene trasdotto, perch le
cellule recettori sono trasduttori di segnali, in un segnale di natura elettrica. Adesso nel caso
dellepitelio olfattivo la cellula recettoriali presenta recettori ossia proteine di membrana che legano
in maniera specifica molecole odoranti di natura chimica. Quindi il GPCR legano la molecola, si ha
la trasduzione del segnale, genesi di Camp e adesso il segnale deve essere trasdotto di un
segnale di natura elettrica infatti si pare il canale si fa passare da Na+ e Ca+ ed io ho una
depolarizzazione di membrana. Quindi abbiamo visto come da un legame di un recettore con una
molecola segnale il messaggio venga poi trasdotto in una risposta cellulare. Adesso per abbiamo
analizzato un solo enzima effettore, ladenilato ciclasi. Quello che mi interessa adesso e che
quando il segnale cessa la risposta della cellula deve andare a terminare. In realt la segnalazione
che si verifica attraverso i reccettori GPCR si dice che autoterminante. E un tipo di
sengnalazione che pu essere regolata istante per istante. La sengnalazione pu terminare con il
processo di desentitizzazione recettoriale. In realt come si capito questo? Se io metto una
cellula ad incubare con adrenalina e noraadrenalina che mi consentono di alti livelli di Ampc ciclico
se io aggiungo un agonista alla cellula cio ladrenalina, e vado a valutare nel tempo i livelli di
Ampciclico quello che si verifca che io ho un incremento di Ampc dopo due, tre minuti dopo di
che questi torno ai livelli basali aumentando nel tempo. Quindi nel tempo prima ho un incremento e
poi ritornano al livello noramale. Affianco abbiamo lattivita delladenilato ciclasi,lenzima che
sintetizza Ampciclcio, e vediamo che paralellamente abbiamo dopo due minuti il picco dellattiva
che corrisponde poi al picco dei livelli di AMPc e subito dopo circa 4 minuti quasi tornata alla
norma, quindi si verifica la stessa cosa per i livelli di Ampc. Perch si verifica questo? Perch la
segnalazione autoterminante e in realt abbiamo un processo importante che quello di
desentitizzazione recettoriale. Diciamo che lo stesso il legame del ligando con il recettore che
attiva la rapida attenuiazione della responsibilit recettoriale . Il ligando ladrenali, si lega al
recettore e da una risposta per con il passare del tempo la cellula risponde di meno al ligando.
Perch vari processi possono portare ad una risposta cellulare pi bassa e come posso ridurre la
risposta cellulare ad un ligando? Posso fosforilare il recettore e fargli perdere affinit per il ligando
o oppure possono rimuoverlo della membrana oppure il recettore non vada ad interagire pi con la
sua proteina G. Quello che abbiamo e che pi processi che portano alla desentitizzazione del

recettore: possiamo avere un disaccoppiamento del recettore dalla proteina G, posso avere un
internalizzazione del recettore, posso avere una variazione dellaffinit del recettore per ligando e
posso avere a lungo termine una endocitosi del recettore oppure modulare la sintesi del recettore.
Come avviene la desentitizzazione recettoriale ? Allora vediamo due esempi nellimmagine in uno
abbiamo il recettore accoppiato a una GS, classica che attiva ladenilato ciclasi. E poi abbiamo un
recettore accoppiato alla GQ che attiva una fosfolipasi c beta, queste sono le classiche. Quello
che si verifica che delladenilato ciclasi, abbiamo avisto che il ampciclico porta alla allattivazione
della Pka mentre con la fosfolipasi c si attiva la Pkc. In ogni caso noi abbiamo attivazioni di chiansi,
ma queste chinasi riconoscono delle sequenze consenso di proteine bersaglio e anche il recettore.
In questo caso quindi il recettore pu perdere affinit per il ligando ma pu verificarsi che il
recettore quando fosforilato non reagisce pi con la proteina G con cui si associata e quindi
dissaccoppio il recettore dalla proteina G associata, spegnendo la segnalazione. Questo succede
sempre? No solo in alcuni contesti cellulari, dipende dal tipo di recettori, quindi questo che
abbiamo visto solo una generalizzazione che facciamo che per far capire quello che si verifica.
Quindi la fosforilazione di un recettore indotto dalla proteina chinasi A, potrebbe semplicemente
disaccoppiare il recettore alla proteina g ma non modificare laffinit per il ligando, dipende dal tipo
di recettore e dal contesto cellulare in cui noi siamo. Se consideriamo semplicemente il
disoccoppiamento del recettore della proteina G, la fosforilazione indotta dalle kinasi A e c
suffuciente per far avvenire il disaccoppiamento, tutta vai ci sono altri recettori in cui una modo
fosforilazione non sufficiente per far avvenire il disaccoppiamento del recettore dalla proteina. Ci
sono alcune kinasi, le GRK ossia chiansi del recettore acchioppiati alla proteina G. Queste sono
proteine Kinasi SPECIFICHE! Ossia presenta solo un bersaglio, ossia i recettori di membrana a
sette segmenti di membrana. Queste GRK una volta attivate possono fosforilare il recettore in pi
siti, quindi effettuano una plurifosforilazione recettoriale. Quando il recettore plurifosforilato
richiama una proteina, la beta-arrestina, una proteina scaffold, quindi enorme ed ingombrante che
arriva interagisce con il recettore e crea un ingombro sterico tale che il recettore venga
disaccopiato dalla proteina G. Rispetto alla condizione precedente di Pka e Pkc fosforilano il
recettore, in questo caso ho bisogno di una plurifosforilazione e lintervento della beta-arrestina.
Adesso mentre la Pka e Pkc riconosco il recettore in forma attiva o inattiva (quindi se ha legato o
non legato il recettore). Invece la GRK riconosce solo il recettore informa attiva, quindi in questo
caso necessario la continua occupazione recettoriale per attuare la fosforilazione da parte della
GRK. Solo i recettori che sono attivi quindi possono prendere parte alla desentitizzazione mediata
dalle GRK. Questo tipo di desentitizzazione viene detta omologa. Mentre quelle mediata da Pka e
Pkc detta desentitizzazione eterologa, in quanto non vanno ad inattivare e quindi la via del
recettore che ha comportato la loro attivazione ma anche altri che non erano impegnati con il
legame del ligando, rendo cosi la cellula meno responsiva agendo in questo modo anche su altri
recettori non solo su quelli impiegati con il ligando. Io ho una serie di recettori, 90% non
impiegato con il legame con il ligando, quindi pKa non andr solo a fosforilare il recettori che prima
erano impiegati con il legame del ligando o che lo sono ancora. Ma va anche a fosforilare altre,
perci si dice desensibilazione eterologa. Mentre in quella omologa vede coinvolte le GRK,che
sono specifiche , che per disaccoppiare il recettore dalla proteina G hanno bisogno dellintervento
della beta-restina. Questi meccanismi di desentitizzazione attuati dalle pKa, pKc e GRK sono a
breve termine. Mentre quelli a lungo termine vedono coinvolte il processo di internalizzazione del
recettore oppure una down-regolation che possono vedere una riduzione della trascrizione genica,
tipo larrivo di un ormone che pu diminuire la trascirzione di un recettore e modulare in questo
modo la sua sintesi. Quella a lungo termine prevede lendocitosi recettoriale ed avviene sempre a
concentrazione continua dell ligando, quindi significa che tu non riesci desentitizzare il recettore se
ancora legato, quindi maggiore sar la concentrazione di ligando maggiore sar probabilit che
si formi il legame.

Vediamo ora le tipologie di GRPk. Sempre se consideriamo la via


classica recettore beta-adrenergico, il cui ligando ladrenalina, che
porta quindi allattivazione di una proteina GS, che porta a sua volta
grazie alla sua subunit alfa alla sintesi di un enzima che porta alla
sintesi di un secondo messaggero e lattivazione della proteina
kinasi a. Quello che mi interessa e che una volta che ladrenalina si
lega alla recettore e viene attivato, a sua volta va ad attivare la GS
che si dissocia in alfa s che far qualcosa e betagamma. Ci sono
delle GRK vengono reclulate nel pressi del recettore dopo che
stato attivato, per permane loccupazione recettoriale da parte del
ligando.Questo possibile perch quando si dissociato la subunit
alfa da quella beta-gamma, il recettori quindi attivo, le betagamma reclutano delle proteine Bark, che sono chiansi specifiche
dei recettori beta-adrenergici. Le beta-gamma reclutano queste GRK
specifiche perch? Perch sono libere, in forma dissociata quindi
significa che il recettore attivo. Quindi solo dopo che il recettore
ha attivato la proteina G, che questa si dissociata in alfa e betagamma, le bark possono interagire con le beta-gamma.Quindi il
recettore sar attivato, la proteina G viene attivata, si attiva il
processo di trasduzione e a questo punto vengono reclutate le
proteine Bark perche interagiscono con le Beta-gamma e vanno a
plurifosforilare il recettore. Il recettore da solo non c la fa pi ad
attivare la proteina G, quindi abbiamo il coninvolgimento della betaarrestina che determina il disaccoppiamento del recettore dalla
proteina G. Quindi diciamo si ha la desentitizzazione recettoriale
dopo che la proteina G stata attivata in questo caso ed un
processo che pu essere finemente regolato. Ci sono altri tipi di
metodi che permettono di ancorare le GRK alla membra questo

dipende dal tipo di isoforma GRK che consideriamo. Quelle che


vogliamo sottolineare e che esistono due isoforme che presentano
un dominio di legame delle beta-gamma, quindi vengono reclutate
dopo che il recettore ha legato il ligando e dopo che ha attivato la
proteina G. Ci sono anche altre GRK che sono legate a gruppi
idrofobici, che ne permettono lancoraggio con la membrana. Per
questi gruppi vengono legati alle GRK mediante dei processi di
tioestreficazione che possono essere reversibili e quindi in caso
moduliamo lancoraggio delle GRK alla membrana. A questo punto
dobbiamo capire una cosa, a che serve lendocitosi di un recettore?
Questo processo avviene quando ha legato il ligando, altrimenti non
si verifica. Il recettore per essere endocitato deve essere prima
desentitizzato e disaccopiato dalla proteina G attraverso il processo
che vede coninvolto la beta-restina. Questo significa che il recettori
che hanno attivati una via vengono fosforilate dalle GRK, viene
reclutata poi la beta-restina.Sono questi che vanno incontro a un
processo di endocitosi, quindi diciamo che lendocitosi recettoriale
preceduta dalla fosforilazione del recettore operato dalla GRK e dal
legame della beta-restina con il recettore e preceduta da questo.
Adesso a qual la finalit dellendocitosi del recettore? Se io
internalizzo un recettore riduco il numero di recettori sulla cellula,
quindi lendocitosi mi serve sicuramente per ridurre il numero di
recettori presenti sulla cellula e che sono disponibili per il legame
con un ligando. Diciamo che per quello che si visto e che ci sono
alcuni recettori che se non sono endocitati la cellula non pi
responsiva. Quindi lendocitosi un processo che serve per la
riattivazione del recettore. Il processo di endocitosi pu essere un
processo finalizzato alla defosforilazione del recettore per renderlo
nuovamente attivo. Oppure se noi abbiamo un recettori che stato
impegnato con il ligando ed il ligando era una trombina, in questo
caso il recettore non pu legare pi nessun ligando e quindi
lendocitosi finalizata proprio alla degradazione del recettore in
questo caso. In realt quello che si verifica e che in alcuni se non si
ha la desentitizzazione recettoriale, abbiamo una ridotta
responsivit perch la cellula per un certo tempo non riesce a
riciclicare i recettori gi presenti. Il processo di endocitosi
recettoriale preceduto dalla fosforilazione del recettore GRK e
reclutamente della beta-restina. La beta-restina una proteina

scaffold grande e le proteine scaffold svolgono la funzione di


reclutare a se tutta una serie di proteine. Quindi non solo il
recettore che viene a interaggire con la beta-restina ma abbiamo
anche delle proteine dette adattine dette AP2 e la clatrina. La
clatrina una proteina particolare che ha una forma molto
particolare al livello tridimensionale che forma quando polimerizza
una sorta di canestro intorno ad una vescicola e quindi permette
lendocitosi delle vescicole, dette pero vesciole ammantate ci
ricoperto dalla clatrina( rivedi). La clatrina viene reclutata anche
essa al livello della beta-restina e si ha la formazione di una
vescicoletta ma come? I recettori si trovano nei pressi di piccole
fossette dove vengono indirizzati i recettori quando hanno legato il
ligando e hanno legato la beta-arrestina. Quindi che cosa si verifica?
Che si vengono a formare queste piccole fossette e intorno a queste
fossette inizia la polimerizzazione della clatrina. Ora la
polimerizzazione della clatrina, come vi dicevo prima, importante
perch la forma della clatrina detta atrischedio, a tre braccia che
vanno nei tre assi x,y,z. La polimerizzazione permette di formare
questo
scheletro,
gabbia
intorno
alla
vescicola
grazie
allinterzazione con AP2, ossia denomianta adattina. Ladattina
importante perche interagisce sicuramente con un recettore GPCR,
con la beta-restina, fosfolipidi di membrana,ci mi permette
appunto di interagire con pi fattori che poi riesco a formare questo
canestro intorno alla mia vescicola. Questa vescicola coperta di
clatrina si affonda nel cistol e poi si strozza. Abbiamo la strozzatura
della vescicola che si affonda nel citolos e perde la clatrina. Adesso
cerchiamo di capire come si verifica: prima di tutto perch la
clatrina polimerizza solo al disotto della membrana? E poi la
vescicola dopo che si formata e affonda nel citosol e va verso il
profondo perch perde lo strato di clatrina? Lipotesi sono pi di una
ma si visto che la clatrina polimerizza quando ci sono basse
concentrazioni di calcio, diciamo meglio che alte concentrazioni di
calcio inibiscono la formazione del complesso. Ma quante alte? Poco
alte. Io a questo punto mi aspetto che al disotto della membrana
plasmatica la clatrina forma il canestro quindi le concentrazione di
calcio devono essere pi basse rispetto a quelle delle parti pi
distali citosoliche. Sulla membrana plasmatica io ho le pompe del
calcio, dei microdomini che mi permettono di estrudere ossia

rilasciare allesterno il calcio quindi significa che sotto la membrana


ho concentrazioni pi basse di calcio mentre andando pi in
profondita nel citosol ci saranno pi alte concentrazioni di Ca+. In
questa condizione io avro la formazione del canestro sotto la
membrana plasmatica e il suo diassemblamento allinterno della
cellua. Ora quando si formata la vescicola deve strozzarsi, la
strozzatura e quindi il rilascio dela vescicola nel citosol avviene
grazie una proteina la dinamina che polimerizza intorno alla
vescicola e provoca la strozzatura.