Conoscenze di base: Il

genoma e la cellula

Il genoma è l'insieme di tutto il materiale

genetico di una cellula che è la più piccola
unità capace di mostrare una caratteristica
speciale: la vita.
 Il genoma di una cellula detta il suo programma di sviluppo
Il genoma contiene tutte le informazioni su
come:​
• costruire una struttura
cellulare/subcellulare funzionale alle
attività da svolgere (acquisire ed utilizzare
energia, svolgere reazioni chimiche,
rispondere agli stimoli, autoregolarsi)​
• esplicare una specifica funzione
• replicarsi (il materiale genetico viene
fedelmente duplicato e il contenuto di
una "cellula madre" si distribuisce in due
"cellule figlie")​
• evolversi, cioè consentire l'emergere di
variazioni nelle informazioni genetiche
(mutazioni)
• autoeliminarsi -> la morte è una
proprietà di base della vita, infatti solo
un'entità vivente può avere questa
prospettiva. Esempio: l'apoptosi è il
programma di morte intrinseco che
elimina le cellule non più necessarie,
danneggiate o con un livello di mutazioni
tali da diventare tumorali.​

La complessità strutturale ed informazionale del genoma riflette la complessità funzionale della cellula
 Concetto di complessità biologica
Complessità in termini di ordine e di composizione:
più complessa è una struttura maggiore è il numero di Le attività cellulari possono essere
parti che devono trovarsi in quella precisa posizione; estremamente precise: la replicazione del DNA
minore è la tolleranza agli errori, maggiore è il ad esempio si verifica con meno di 1 errore ogni
controllo che deve essere esercitato per il 10 milioni di nucleotidi incorporati e la maggior
mantenimento del sistema. parte di questi errori viene rapidamente
Complessità a vari livelli:
corretta dai meccanismi di riparazione.
➢ gli atomi (1 Armstrong=0.1nm) si organizzano in
molecole piccole (molecola di H20 diametro di 0,4
nm; molecola di DNA diametro 2 nm)
➢ le piccole molecole si organizzano in polimeri
giganti

➢ Le diverse molecole polimeriche si organizzano in

complessi che a loro volta formano organuli
subcellulari

https://www.nature.com/scitable/content/the-relative-scale-of-biological-molecules-and-14704956/
 L'esistenza dei batteri suggerisce che l'essenza della vita si trova in organismi molto piccoli.​
La teoria evoluzionistica inoltre suggerisce che I principi base della vita possono essere applicati a tutte le form
e viventi.​

Le origini delle cellule e ASTROBIOLOGY

dei genomi vanno cercate nei

sistemi precellulari https://youtu.be/3HN_zx4JJfM
 I Cosmologi ritengono che l'universo abbia avuto inizio 14 miliardi di anni fa con la
gigantesca palla di fuoco primordiale chiamata "Big Bang"
• Nei primi 4 miliardi di anni le galassie si frammentano dalle nuvole di gas emesse dal Big
Bang: 4,6 miliardi di anni fa all'interno della nostra galassia la nebulosa solare si è
condensata a formare il sole e i suoi pianeti.
• La terra primordiale era ricoperta di acqua: in questo oceano planetario (anche detto
"brodo primordiale" dal biochimico russo A.I. Oparin nel 1924) sono apparsi i primi sistemi
biochimici, quindi la vita cellulare (che è uno stadio tardivo dell'evoluzione biochimica) è
stata preceduta da polinucleotidi autoreplicanti – progenitori dei primi genomi.
 Formazione delle
macromolecole biologiche

❖ EVOLUZIONE CHIMICA:
Esperimenti volti
a ricreare le condizioni dell'atmosfera primordiale
(il contenuto di ossigeno è rimasto molto
basso fino all'evoluzione della fotosintesi, i gas più ab
bondanti erano metano ed ammoniaca a
cui vanno aggiunti gas derivanti dall'attività vulcanica
CO2,CO,N2 )
hanno mostrato che scariche elettriche in una miscel
a metano-
ammoniaca danno luogo a sintesi chimica di una seri
e di amminoacidi tra cui alanina, glicina, valina ecc...
Si formano anche acido cianidrico e formaldeide che
partecipano a reazioni di formazione di altri ammino
acidi, purine, pirimidine e
in minor quantità zuccheri, tutti costituenti delle mac
romolecole biologiche (lipidi, carboidrati, proteine,
acidi nucleici).

https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0010854518306155
 Dal monomero alla
molecola biologicamente
funzionale
❖ EVOLUZIONE PREBIOLOGICA: le
biomolecole diventano sempre più
abbondanti e si combinano in modo
casuale.
L'ipotesi di W. Martin e M. Russel (2022)
sostiene che:
▪ La vita si sia originata nelle profondità
oceaniche e/o presso sorgenti idrotermali
dove lo scorrere di acqua calda fornisce una
fonte costante di energia e le molecole
semplici precipitate avviano la sintesi di
monomeri.
▪ Nelle acque più fresche i monomeri
sedimentano ed accumulandosi
formerebbero oligomeri
 Dai monomeri
al polimero

Il DNA è un polimero di deoossiribonucelotidi legati fra loro da un LEGAME

FOSFODIESTERICO ottenuto dalla reazione fra l'acido fosforico al 5' di un
nucleotide ed il gruppo ossidrilico al 3' dello zucchero del nucleotide
successivo, con eliminazione di H20
 Dai monomeri
al polimero

L'RNA è un polimero di ribonucelotidi

 Dai monomeri
al polimero

Le proteine sono polimeri di

amminoacidi
 Quali polimeri tra proteine, RNA e DNA hanno costituito il
PRIMORDIALE SISTEMA BIOCHIMICO IN GRADO DI
AUTOREPLICARSI?
Partendo dal presupposto che il passaggio da un insieme
casuale di molecole a un sistema ordinato che mostri almeno
alcune delle proprietà biochimiche che associamo alla vita non
è mai stato riprodotto sperimentalmente...
...proviamo a riflettere su alcuni aspetti:
- le proteine sono necessarie per catalizzare le reazioni
biochimiche ma non possono autoreplicarsi
- I polinucleotidi possono codificare la sintesi delle proteine e
autoreplicarsi ma non possono farlo senza l'ausilio delle
proteine
Prima conclusione: I polinucleotidi e le proteine sono entrambi
indispensabili per costituire un sistema biochimico
autoreplicante.

https://home.cern/news/series/lhc-physics-ten/recreating-big-bang-matter-earth
 Evoluzione biochimica
La delimitazione di un ambiente interno separato
dall'esterno, (indipendente, protetto, regolato) ha
permesso di selezionare specifiche reazioni
biochimiche.
Esperimenti volti a stimolare la formazione di legami peptidici
all'interno di miscugli di amminoacidi pre-riscaldati e poi raffreddati,
hanno permesso di osservare che i proteinoidi prodotti posti in
acqua tendono a circondarsi di goccioline:

➢ I coacervati (costituiti da polimeri in acqua) sebbene instabili

rappresentano la prima forma di compartimentazione
(formazione di una pellicola di separazione dall'ambiente
circostante)

Le attuali membrane cellulari sono formate prevalentemente da un

certo tipo di grassi: i fosfolipidi (grazie alle interazioni idrofobiche
dei lipidi presenti nel brodo primordiale questi tendono a disporsi
con orientamento testa-coda in doppio strato)
 Metà degli anni
In provetta le molecole di RNA sintetico possono catalizzare:
• La sintesi e la copia di molecole di RNA (autoreplicazione dell'RNA)
'80: scoperta
• Il trasferimento di un amminoacido legato all'RNA ad un secondo
amminoacido per formare un dipeptide (ruolo del tRNA nella sintesi
proteica)
l'attività
EVOLUZIONE BIOCHIMICA: Nuova Ipotesi
catalitica
• Le prime molecole di RNA si replicavano lentamente ed in modo casuale,
semplicemente fungendo da stampo per il legame di nucleotidi
complementari che polimerizzavano spontaneamente
dell'RNA
• Probabilmente il processo era poco accurato quindi ha portato a
tantissime varietà di sequenze ad RNA fra le quali sono state selezionate
naturalmente le catene ad RNA più lunghe, con un inizio di attività
autoreplicante sempre più accurato e capaci di formare strutture
complesse capaci di funzionalità catalitica sempre più sofisticata come gli
odierni introni di Gruppo I e gli RNA ribosomali.
• Questi protogenomi ad RNA, autocatalitici e capaci di dirigere reazioni
biochimiche (come ad esempio l'idrolisi del legame fosfato-fosfato nei
ribonucleotidi ATP e GTP) potrebbero essere state in seguito
compartimentalizzate all'interno di membrane lipidiche formando le
prime cellule.
• Non è noto come si siano formati i lipidi a lunga catena non ramificati ma
una volta presenti in grandi quantità in ambiente acquoso potrebbero
essersi assemblati spontaneamnete in membrane, incapsulando i
protogenomi e fornendo all'RNA un ambiente chiuso in cui dirigere
reazioni biochimiche controllate
Come si è evoluto il mondo a
DNA dal mondo ad RNA?
Facendo sgocciolare soluzioni di monomeri su sabbia,
argilla o rocce calde è stata osservata la formazione
abiotica di polinucleotidi e polipeptidi. RIGIDO APPAIAMENTO DI BASI NEL
TRANSIZIONE RNA-PROTEINE DELLA FUNZIONE RIPIEGAMENTO DELL'RNA: MOTIVI STRUTTURALI
CATALITICA RIGIDI
Lo sviluppo di enzimi proteici è stato selezionato
positivamente perché le proteine hanno una migliore e
più efficiente attività catalitica:
• I 20 amminoacidi hanno dotato le proteine di una
maggiore variabilità chimica rispetto ai 4
ribonucleotidi dell'RNA, permettendo agli enzimi
proteici di catalizzare una più vasta gamma di reazioni
biochimiche.
• I polipeptidi presentano una intrinseca flessibilità nel
ripiegamento più vantaggiosa rispetto alla rigidità degli
RNA che presentano appaiamento di basi.
MAGGIORE FLESSIBILITA' NELLE
RIBONUCLEOPROTEINE
Transizione RNA-proteine: l'RNA acquisisce
solo la funzione codificante e di
mantenimento dell'informazione di
sequenza
La funzione principale dell'RNA diventa quella di codificare per proteine.
La funzione di mantenimento dell'informazione genetica legata alla
sequenza dei nucleotidi però, è poco adatta all'RNA a causa dell'instabilità
del legame fosfodiesterico e del 2'-OH (L’idrolisi alcalina dell’RNA è
facilitata dalla presenza dell’ossidrile 2’ del ribosio, che
consente l’intermedio fosfodiestere ciclico, impossibile nel caso del DNA)
NUOVA IPOTESI: La funzione codifcante è passata al DNA a cui si arriva
considerando che la riduzione dei ribonucleotidi porta ai
desossiribonucleotidi:
• I desossiribonucleotidi potevano essere polimerizzati come copie dei
protogenomi ad RNA tramite una reazione catalizzata da una
trascrittasi inversa con 2 importanti accorgimenti:
• La sostituzione dell'uracile con il suo derivato metilato timina
(maggiormente stabile)
• La formazione di una struttura a doppio filamento che permette
di riparare i danni del DNA copiando l'altro filamento

I primi genomi a DNA sarebbero quindi stati costituiti da

molte molecole separate, ognuna codificante una singola
proteina e quindi equivalente ad un singolo gene
Vantaggio evolutivo
del sistema cellulare
primordiale
• Lo scenario più probabile, quindi, è che il
sistema predominante sia stato il primo a
sviluppare i mezzi per sintetizzare enzimi
proteici (che hanno garantito il più alto
potenziale catalitico) e genomi a DNA
(che ha garantito una replicazione più
accurata).
• Questo sistema avrebbe dato alle prime
cellule un significativo vantaggio rispetto
a quelle contenenti protogenomi a RNA.
 La cellula

https://www.nature.com/scitable/topicpage/eukaryotic-cells-14023963/
La più piccola unità morfologico-funzionale a poter essere considerata vivente

L'esistenza di due distinte classi di

cellule (eucarioti e procarioti) senza
nessun intermedio conosciuto
rappresenta una delle più notevoli
discontinuità evolutive del mondo
biologico.

Diametro: 0,3-2 um VS 2-25 um

 Cellule procariotiche:
Organismi unicellulari – tutte le diverse forme di
batteri (la forma di vita più abbondante sulla terra -
attenzione: sono unicellulari anche se formano colonie)
ed archeobatteri (si trovano in ambienti estremi come
laghi salate, sorgenti calde e crateri vulvanici marini).
Strutturalmente più semplici:
•la membrana plasmatica, parete e capsula
•privi di organuli citoplasmatici circondati da
membrana (gli enzimi necessari per le varie reazioni
sono localizzati sulla membrana plasmatica e sulle sue
ripiegature – i mesosomi- o nel citoplasma)
•Il citosol contiene i ribosomi 70 S (unità Svedberg,
misura della loro velocità di sedimentazione che è
funzione della forma e delle dimensioni)
•Il nucleoide è la zona dove si trova il cromosoma
batterico costituito da una singola molecola di DNA
circolare
•I Plasmidi sono piccole molecole di DNA circolare
aggiuntive, capaci di autoreplicarsi autonomamente e
utilizzati in ingegneria genetica.
Cellule eucariotiche:
Costituiscono organismi sia unicellulari (alcuni protisti)
sia pluricellulari (piante, funghi, animali la cui
diversa dimensione e funzione dipende dal numero e
dal tipo di cellule che compongono l'organismo)
Strutturalmente più complesse – caratterizzate da
una compartimentazione intracellulare e da un
sistema di endomembrane che definisce diverse zone
di specializzazione delle funzioni intracellulari:
•C'è un vero e proprio nucleo (eu-fatto bene)
delimitato da un involucro membranoso
caratterizzato da due membrane
concentriche attaversate da pori nucleari che
mettono in comunicazione il nucleo con il citoplasma
•Il nucleo contiene il DNA associato a proteine basiche
(istoni) ed acide a formare la cromatina che durante
la divisione cellulare si condensa a formare
i cromosomi.
•Il nucleo è caratterizzato da una zona specializzata
per la sintesi di RNA ribosomiale e per l'assemblaggio
dei ribosomi, chiamata nucleolo

Strutturalmente più semplici:
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/B978012802234400001X
Cellula procariotica:
• Flagelli batterici – appendici mobili formati da polimeri di 1 sola
proteina, la flagellina (diverse da ciglia e flagelli eucariotici che
sono formati da microtubuli)
• La capsula
• La parete cellulare è costituita dal peptidoglicano (polimero
complesso di 2 amminozuccheri legati a corti polipeptidi)
• Possono formare endospore – cellule "a riposo" - capaci di
resistere a condizioni ambientali avverse
• Sono caratterizzati da una riproduzione asessuata (si dividono per
scissione binaria di 1 cellule in due parti uguali e non c'è
il conseguente rimescolamento del patrimonio genetico dovuto al
contributo di due genitori)
• La riproduzione dei batteri è di tipo esponenziale: da una cellula
se ne formano 2, poi 4, 8, 16, 32, 64 ecc: in breve tempo ed in
determinate condizioni di coltura si ottiene una progenie
numerosa e geneticamente identica (clone).
• I batteri posseggono dei meccanismi di scambio di geni, che
sono: la trasformazione, in cui la cellula incorpora
dall'esterno DNA libero, nella trasduzione, è un batteriofago, cioè
un virus che infetta i batteri, e trasferisce porzioni di DNA da un
batterio ad un altro, nella coniugazione, invece, il trasferimento
di DNA si realizza attraverso il contatto fisico tra una cellula
batterica donatrice ed una cellula batterica ricevente.
• L’insorgenza di mutazioni è un evento relativamente raro ed
introduce variazioni nel genoma della popolazione batterica
responsabili di caratteristiche diverse e distinguibili (es.
Fotoresistenza)
 Cenni di Colture
cellulari batteriche
• In condizioni ottimali i batteri si
riproducono circa ogni 20 minuti ed il fattore
limitante della loro crescita è l'esaurimento
delle sostanze nutritive nel terreno di coltura
• Le cellule batteriche possono essere
utilizzate per il clonaggio molecolare al fine di
fare esprimere DNA esogeno ricombinante e
produrre proteine di interesse biotecnologico.
 Cellula eucariote
➢ Nel reticolo di membrane ripiegate ed interconnesse fra loro chiamato
"endoplasmatico" liscio avviene la sintesi dei lipidi, nel reticolo endoplasmatico
rugoso caratterizzato dalla presenza dei ribosmi avviene la sintesi delle
proteine che attraverso le vescicole di trasporto verranno trasferite nel Golgi
➢ Nelle sacche membranose anche dette cisterne dell'Apparato di Golgi le proteine
subiscono modificazioni chimiche per poi essere secrete all'esterno della
cellula, indirizzate ai lisosomi oppure alla membrana plasmatica
➢ I lisosomi sono vescicole a singola membrana a pH=5 che si generano dal Golgi e
contengono enzimi idrolitici deputati alla digestione intracellulare di corpi estranei
fagocitati dalla cellula oppure all'eliminazione di macromolecole e parti invecchiate
della cellula.
➢ I mitocondri sono le fabbriche di energia della cellula (ATP) delimitati da doppia
membrana separate da un'interspazio. La membrana interna caratterizzata da creste
mitocondriali che ne aumentano la superficie delimita la matrice interna del
mitocondrio dove si trova il DNA mitocondriale a doppia elica circolare. Alcune
proteine utilizzate dal mitocondrio sono codificate dal DNA nucleare, sintetizzate nel
citosol ed importate nel mitocondrio.
➢ Danni al DNA mitocondriale che codifica per tranferRNA, ribosomalRNA e proteine
mitocondriali, sono responsabili di gravi patologie ad eredità materna in quanto i
mitocondri dello zigote derivano solo dalle cellule uovo della madre (quelli del
padre, presenti nella coda dello spermatozoo vengono persi durante
la fecondazione).
➢ Nei mitocondri sono presenti anche i ribosomi 70S che effettuano la sintesi delle
proteine codificate dal DNA mitocondriale. La presenza del DNA e dei ribosomi 70S
pone la base dell'ipotesi dell'origine endosimbiontica dei mitocondri*
➢ Cloroplasti caratterizzano le cellule vegetali: similmente ai mitocondri hanno una
doppia e contengono una molecola di DNA circolare. All'interno della stroma le
membrane interconnesse tilacoidali contengono il pigmento verde, la clorofilla, che
capta l'energia luminosa necessaria per la fotosintesi ed assorbendo tutte le
lunghezze d'onda della luce eccetto la luce verde dà colore al
tessuto fotosintetizzante.

https://www.nature.com/articles/nrg2071
Storia, prime osservazioni ed esperimenti
sul "materiale ereditario"
 La nascita della genetica: una rivoluzione
scientifica

La scienza potrebbe essere definita come l'insieme delle osservazioni

attente di fenomeni naturali, dell'elaborazione riflessiva di questi
fenomeni e della formulazione di ipotesi verificabili riguardante le loro
cause ed i loro effetti.
Il progresso scientifico dipende dal lavoro di ogni singolo pensatore che
introduce nelle discipline scientifiche idee radicalmente nuove.
➢ 1865 - Charles Darwin ed Alfred Wallace sviluppano la
teoria dell’evoluzione per mutazione casuale e basata sulla
selezione naturale dell'individuo più adatto
➢ 1858 - Gregor Mendel definisce i princìpi che regolano la
trasmissione dei caratteri ereditari ed ha postulato
l'esistenza di geni per spiegare come i tratti vengono
ereditati. Gli alleli, le forme alternative dei geni, spiegano
le differenze ereditabili tra gli individui
Osservazione,
elaborazione
riflessiva del
fenomeno

http://pollinowild.blogspot.com/2018/02/le-va riazioni-casuali-in-darwin.html
 Formulazione di ipotesi​ Evoluzione
per
verificabili mutazione
casuale

Iniziamo ad osservare una "variabilità" nella

popolazione:
Giraffe con collo corto e giraffe con collo lungo

Le giraffe con il collo lungo vengono "selezionate

positivamente":
- Trovano una nuova fonte di nutrimento
(diverso, più ricco...)
- Affrontano meglio un cambiamento
ambientale (es. Riduzione/distruzione del
sottobosco)
A) Il sistema riproduttivo di
un individuo con carattere
"collo corto" è la sede in
Il carattere emerso inizialmente cui si verifica un
nell'antenato come "mutazione casuale" cambiamento a carico delle
si "fissa" all'interno della popolazione "caratteristiche ereditabili"
(diventa un carattere ereditabile dalle
generazioni successive) (mutazione casuale).
Questo individuo produce
una progenie e viene detto
Qual è il meccanismo dell'ereditarietà? "antenato".
 "Numerosi attenti studiosi hanno dedicato parte della loro vita
a questo argomento con inesauribile perseveranza [...] tuttavia,
tra i numerosi esperimenti condotti, nessuno è stato eseguito in
modo da rendere possibile la determinazione del numero di forme
differenti in cui può apparire la progenie di incroci, o la
separazione di queste forme rispetto alle loro generazioni, o la
valutazione statistica delle loro relazioni."
Mendel commentò così il fallimento degli altri studiosi che avevano tentato di spiegare le modalità con cui vengono ereditate le
caratteristiche degli organismi nel paragrafo introduttivo del suo articolo pubblicato nel 1866 con il titolo "Esperimenti di
ibridazione nelle piante"
Prima che la genetica prendesse forma come disciplina si aveva solo una "comprensione intuitiva" del
fatto che durante la riproduzione qualche tipo di materiale era trasmesso dai genitori ai figli ed
influenzava le caratteristiche della progenie.
Ipotesi di materiale ereditario: costituisce un vero e proprio collegamento fisico tra genitori e figli
perché la progenie lo riceve dai genitori (spiega perché un genitore ed un figlio hanno la stessa forma
del naso o un colore simile degli occhi), ma presenta un paradosso: i figli non sono repliche esatte dei
loro genitori ed i fratelli non sono perfettamente identici fra loro...

Una delle ragioni del successo di Mendel è stata la scelta del materiale
sperimentale - il Pisum sativum – i petali dei fiori della pianta
scelta chiudendosi prevengono la dispersione dei granuli pollinici e l'entrata di
pollini estranei:

✓ Rafforzamento del sistema di autofecondazione: è possibile ottenere

singoli ceppi di pisello autofecondati, detti "linee pure", caratterizzati da un
livello bassissimo (praticamente nullo) di variabilità genetica fra una
generazione e l'altra. Ogni linea pura si distingue per una particolare
caratteristica (pianta alta VS bassa ; semme giallo VS seme verde ecc...)

L'aspetto innovativo delle osservazioni di Mendel fu quello di indirizzare

l'attenzione su un carattere per volta.
 Incroci tra monoibridi
E' possibile incrociare linee pure che si distingono per 1 sola
caratteristica, esempio:

➢ Prendere in considerazione uno specifico carattere, es. "colore del fiore"

➢ Incrociare due linee pure che presentano "forme" diverse per questo
carattere "Viola VS Bianco"

➢ Nelle piante, cellule specializzate "diploidi" nello stame e nel carpello

vanno incontro a meiosi producendo cellule spermatiche e cellule
uovo "aploidi"

➢ Rimuovere le antere dalla linea pura "fiore bianco" prima che il suo polline
(contenente cellule spermatiche) sia maturo evitando l'autofecondazione

➢ Applicare sullo stigma della linea pura "fiore bianco" il polline della linea
pura "fiore viola": nell'ovario avviene la fecondazione con produzione dello
zigote diploide che si sviluppa nell'embrione, parte del seme.

➢ Il seme germoglia portando allo sviluppo di tutte le cellule differenziate che

costituiscono la pianta, dando origine a nuove piante.
Incrociare piante di Pisum sativum che si distinguono per il
"colore del seme":
osservare e raccogliere i dati

P: generazione parentale – linea pura

F1: prima generazione filiale
F2: seconda generazione filiale
 Interpretare:
➢ Tutti i semi della F1 sono lisci (il carattere rugoso scompare dopo
l'incrocio di due linee pure)
➢ L'autoimpollinazione delle piante figlie dei semi lisci F1
producono semi rugosi in rapporto ¼ (il carattere "rugoso"
riemerge nella seconda generazione – evidentemente era
presente nei semi F1 ma non compariva come carattere visibile –
era probabilmente "mascherato" dall'altro carattere)
 Piante omozigoti
LL oppure ll

Producono
solo gameti
"L" con allele Producono solo
Legge della dominanza: dall'incrocio di due linee monoibride (pure per un dominante gameti "l" con allele
unico carattere) si ottengono tutti individui che mostrano la forma recessivo
dominante di quel carattere

I caratteri osservati da Mendel sembravano essere sotto il controllo di fattori

ereditabili (geni) in grado di esistere in due forme differenti (alleli) una Lo zigote che
si forma ha
"dominante" e l'altra "recessiva". fenotipo
liscio ma ha
genotipo
eterozigote
 Piante omozigoti
LL oppure ll

Producono
Legge della segregazione: quando un individuo produce gameti, le due solo gameti
"L" con allele
copie di un gene (cioè gli alleli) si separano, cosicché ciascun gamete dominante
Producono solo
gameti "l" con allele
riceve soltanto una copia del gene. recessivo

Mendel ipotizzò che in un individuo (detto diploide) i geni fossero

presenti in coppie (duplice copia): ciascuna delle linee parentali utilizzate
porta due copie identiche del gene (cioè le linee pure sono diploidi ed Lo zigote che
omozigoti). si forma ha
fenotipo
Durante la produzione dei gameti queste due copie del gene si riducono liscio ma ha
ad una = i gameti ottenuti dalla meiosi delle cellule diploidi riproduttive, genotipo
eterozigote
portano una singola copia del gene (o l'allele dominante o quello
recessivo) = aploidi.

Mendel arrivò alla conclusione che il numero genico diploide si

ristabilisce nella fecondazione della cellula uovo con lo spermatozoo a
formare lo zigote: se i gameti provengono da piante geneticamente
differenti, lo zigote eredita due alleli differenti - uno dalla madre ed uno
dal padre – viene detto eterozigote.
 Definizioni
➢ Prendere in considerazione uno specifico "carattere" significa considerare un singolo gene es:

❖ "forma del seme" -> trattasi dello specifico gene codificante per un prodotto che influenza la forma del seme
❖ "colore del seme" -> trattasi dello specifico gene codificante per il pigmento
❖ "altezza"
❖ "Colore del baccello"
❖ "Forma del baccello"

➢ Le "forme" diverse per ogni singolo carattere "seme liscio VS seme rugoso" corrispondono agli "alleli" di quello
specifico gene: Esistono
sequenze di
❖ Gene codificante il prodotto che influenza la "forma del seme" -> forma 1 = allele 1 = liscio DNA che non
-> forma 2 = allele 2 = rugoso codificano?
Il Genotipo è la parte codificante del Genoma cioè l'insieme delle informazioni contenute nelle sequenze
di DNA che codificano per determinate caratteristiche biologiche ed ereditarie visibili o evidenziabili
(fenotipo)

Il fenotipo è l'insieme delle caratteristiche biologiche visibili e/o evidenziabili che si manifesta per effetto
dell'espressione del DNA
✓ Osservare il tipo di incrocio
✓ Trovare le principali differenze
rispetto all'approccio visto
precedentemente
✓ Formulare un'ipotesi
sul meccanismo molecolare che
spieghi la relazione fra
genotipo e fenotipo nelle di
✓ A quale conclusione di carattere
scientifico siamo giunti con
questa analisi? Cosa possiamo
dimostrare?
 Prima che la genetica prendesse forma come disciplina si aveva solo una "comprensione intuitiva"
del fatto che durante la riproduzione qualche tipo di materiale era trasmesso dai genitori ai figli
ed influenzava le caratteristiche della progenie.

Pietre miliari
della Biologia ed
interconnessione
tra diverse
discipline CHIMICA James Watson e Francis Crick
hanno scoperto la struttura del DNA,
GENOMICA Il progetto Genoma Umano
GENETICA disciplina chestudia il ha portato alla determinazione della
una macromolecola composta da due
materiale che influenza le sequenza di nucleotidi nel DNA
catene complementari di nucleotidi. Il
modalità di sviluppo, di funzionamento dell'uomo. La sequenza di DNA di
DNA è il materiale ereditario di tutte le
e di comportamento degli organismi. un genoma fornisce dati per identificare
forme viventi, eccetto che di alcuni tipi
e catalogare i geni di un organismo
di virus, in cui è l'RNA
 Dai "caratteri ereditari"...ad una visione "cellulare"

Mendel dimostrò con prove convincenti che i caratteri

ereditari venivano determinati da fattori discreti o geni,
senza fare alcuna osservazione al microscopio.
• Attorno al 1880 alcuni biologi focalizzarono la propria
attenzione su un altro aspetto dell'ereditarietà: la sua
base fisica nell'ambito della cellula con l'utilizzo della
microscopia. Questi biologi pur non conoscendo il
lavoro di Mendel si resero conto che ciò che
determinava le caratteristiche ereditarie necessarie
per far nascere e crescere una pianta o un animale
doveva essere contenuta all'interno di una singola
cellula.

Ciclo cellulare e
mitosi
Sintesi di Proteine (Traduzione)
Sintesi del DNA
(Replicazione) e
Duplicazione dei
cromosomi
Uno dei motivi principali per cui le scoperte di
Mendel non furono originariamente riconosciute fu l'assenza
di evidenze concrete sul comportamento dei cromosomi dura
nte la mitosi e la meiosi.​
Le cellule somatiche si riproducono tramite un
procedimento chiamato mitosi. Da una cellula
madre nascono due cellule figlie identiche alla
madre, ciascuna con il suo stesso numero di
cromosomi. In questo modo il patrimonio genetico
di un organismo si trasmette in modo costante.
Sintesi di RNA (Trascrizione) e Proteine
(Traduzione)
La mitosi è un processo
conservativo
 Ciclo cellulare e
mitosi
Flemming intorno al 1880 rivelò che i
componenti citoplasmatici venivano localizzati
a caso nell'una o nell'altra cellula figlia a
seconda di dove compariva il solco di divisione
cellulare.

La cellula madre sembrava assicurare che i

componenti nucleari fossero divisi in modo
uguale tra le due cellule figlie.

https://www.youtube.com/watch?v=TnJL_8ZVbTI
 Durante la divisione
cellulare il contenuto
nucleare si organizza
in filamenti visibili che
sono chiamati
cromosomi ossia
"corpi colorati"
 Cariotipo umano

Un corredo cromosomico diploide contiene due copie di ciascun cromosoma,

che provengono una dal padre e l'altra dalla madre.
• Il cariotipo è l'insieme dei cromosomi contenuti in una cellula diploide ed in
citogenetica è la costituzione del patrimonio cromosomico di una specie dal
punto di vista numerico e morfologico: quello umano è costituito da 22 coppie di
cromosomi non sessuali che determinano le caratteristiche fisiche (cromosomi
somatici) (autosomi) e la ventitreesima coppia è quella che determina il sesso cioè
una coppia di cromosomi sessuali (44 autosomi + 2 cromosomi sessuali)
• Ogni coppia è composta da due cromosomi, chiamati omologhi, che hanno la
stessa struttura, forma simile e le stesse funzioni, in quanto le parti che li
compongono determinano gli stessi caratteri; un cromosoma è di origine paterna
e uno è di origine materna.
Gametogenesi e Negli stessi anni venne anche osservato il
fenomeno della fecondazione e descritto il
fecondazione ruolo dei gameti: sebbene più piccolo della
cellula uovo, lo spermatozoo fu
considerato ugualmente importante perché
aveva nucleo e cromosomi.

Nel 1883 il biologo van Beneden notò che

le cellule somatiche del nematode
Ascaris avevano 4 grandi cromosomi,
mentre i nuclei maschile e femminile che
si vengono a trovare nell'uovo subito dopo
la fecondazione (prima che i due nuclei si
uniscano) avevano solo 2 cromosomi
ciascuno.

Venne descritto il processo di meiosi che nel 1887 venne definita

"divisione riduzionale": nella gametogenesi il numero dei cromosomi delle
cellule diploidi riproduttive viene dimezzato. Se così non avvenisse l'unione di
due gameti raddoppierebbe il numero di cromosomi nelle cellule della progenie
e così di generazione in generazione.​ Cosa che non avviene.
Nell'uomo a partire da una cellula riproduttiva
diploide (oocita oppure spermatocita) con
corredo cromosomico completo (46
cromosomi), attraverso la meiosi si ottengono
cellule, ciascuna con corredo cromosomico
dimezzato (23 cromosomi).
 Meiosi e Variabilità
Prima che inizi il processo meiotico la duplicazione
dei cromosomi è già avvenuta (Interfase).​
All'inizio della meiosi ciascun cromosoma omologo è
costituito da 2 cromatidi fratelli e durante la profase i
cromosomi omologhi si appaiano a formare una
tetrade.

Durante la gametogenesi aumenta la variabilità genetica per due

motivi:

1. I cromosomi omologhi sono ereditati ciascuno da

ogni genitore: sebbene contengano gli stessi geni possono
contenere informazioni diverse (alleli diversi): es. l'allele 1 del
gene A ereditato dalla madre codifica per l'informazione
"capelli biondi", l'allele 2 dello stesso gene A ereditato dal
padre codifica per l'informazione "capelli castani" (ma
entrambi hanno l'informazione sui capelli)
 Meiosi e
Crossing over
2. L'appaiamento dei
cromosomi omologhi e la
formazione delle tetradi danno
luogo a crossing over in cui si ha
uno scambio di
materiale genetico, un vero e
proprio taglia e incolla tra due
cromatidi fratelli di due diversi
cromosomi omologhi.
La meiosi delle cellule diploidi riproduttive conduce alla
formazione dei gameti aploidi

E' un processo che

produce variabilità

https://www.youtube.com/watch?v=kQu6Yfrr6j0
 Sutton comprese che le coppie di
cromosomi omologhi correlavano
con le coppie di caratteri ereditari
scoperte da Mendel

Sutton seguì la formazione degli spermatozoi nella cavalletta che presenta il

vantaggio di avere cromosomi grandi facili da osservare.
Egli osservò che durante la gametogenesi avvengono due diversi tipi di
divisione all'interno della gonade maschile:
 Gli spermatogoni vanno incontro a divisioni mitotiche producendo
altri spermatogoni (queste cellule contenevano 23 cromosomi – 11
coppie di cromosomi simili a 2 a 2 per forma e dimensione + 1
cromosoma accessorio associato al sesso non associato ad alcun altro
cromosoma)
 Gli spermatogoni che entrano in meiosi portano alla formazioni di
spermatozoi: all'inizio della meiosi i componenti di ciascuna coppia
formavano un bivalente (si osservano 11 bivalenti formati
dall'associazione di cromosomi omologhi), poi si separano con la
prima divisione meiotica - ciò correla con la teoria di Mendel che
aveva ipotizzato che i caratteri erano presenti in doppia copia
nell'organismo e si dividevano all'atto della produzione dei gameti
I cromosomi omologhi mostrano parti
morfologicamente simili

Sutton tra Genetica e Citologia: i

cromosomi come portatori
dell'informazione genetica

Nel 1903 il biologo

americano Sutton,
utilizzando l'assunto che i
geni fossero parti di
cromosoma postulò che:

Durante la meiosi ciascun

Alleli diversi (nella figura
gamete riceve solamente
A ed a) di ciascun gene
un singolo cromosoma da
sono localizzati sui
ciascuna coppia di
cromosomi omologhi cromosomi omologhi
 Riguardo ai dati ottenuti da mendel Sutton
ipotizzò che:
• i geni "seme giallo" e "seme rugoso"
fossero portati da una coppia diversa di
cromosomi

Dei 4 cromosomi presenti in figura:

- 2 portano gli alleli per il seme liscio Gamete
(L) o rugoso (l) Gamete
prodotto: LG prodotto: lg
- 2 portano gli alleli per il seme giallo
(G) o verde (g)
In questo esempio un genitore è
omozigote dominante per entrambi i
Cromosomi omologhi con
geni (LG), l'altro genitore è omozigote
simile struttura morfologica
recessivo per entrambi i geni (lg).
si associano

Coppia di cromosomi omologhi sui quali c'è il gene

codificante la forma del seme (ogni cromosoma porta
l'allele liscio o rugoso).
 • Ogni cromosoma è costituito da una successione di geni o loci genici
• Un locus genico è la posizione che un gene occupa su un cromosoma
Qual è la posizione dei I geni sullo stesso cromosoma dovrebbero comportarsi come se fossero
geni sui cromosomi? collegati gli uni agli altri cioè dovrebbero far parte dello stesso gruppo di
associazione (linkage group) - ovvero migrare insieme nella stessa
cellula.
Riflettiamo insieme...
Mendel aveva esaminato la trasmissione di 7 caratteri
distinti e trovato che ciascuno di questi caratteri
veniva ereditato indipendentemente dagli altri...

In che modo i 7 caratteri di Mendel assortivano

indipendentemente? Erano tutti su differenti gruppi
di associazione, cioè su cromosomi diversi?

Indizio numero 1: Il Pisum sativum ha sette coppie

differenti di cromosomi omologhi
 In che modo i 7 caratteri di Mendel assortivano
indipendentemente? Erano tutti su differenti gruppi di
associazione, cioè su cromosomi diversi?

Indizio numero 2: Due caratteri (il colore del fiore e la forma

del polline) erano legati e si ottennero altre prove della loro
associazione cromosomica. Perché dai dati di Mendel
sembrano segregare indipendentemente?
 Morgan e l'Analisi genetica in Drosophila

Nel 1915 Morgan concentrò i suoi studi sulla selezione di

mutanti del moscerino della frutta, la Drosophila: tempo di
generazione dall'uovo alla maturità di 14 giorni, capacità di
produrre nel ciclo di vita 1000 uova.
Caratterizzò in 1 anno 85 mutanti con una grande varietà di
caratteri differenti dall'originale:
 evidenza del fatto che occasionalmente all'interno di un
gene può avvenire un cambiamento spontaneo
(mutazione) che modificava l'individuo in modo
permanente e si trasmetteva di generazione in
generazione (origine della variabilità e formazione
spontanea di nuovi geni).
 Le 85 mutazioni non assortivano indipendentemente
(non stavano su diversi cromosomi) ma appartenevano a
4 gruppi di associazione differenti corrispondenti ognuno
ad uno dei 4 cromosomi di Drosophila (conferma del fatto
che i geni risiedono nei cromosomi)
L'associazione fra alleli sullo stesso
cromosoma può risultare incompleta
Gli alleli di due differenti geni (ala corta e corpo nero) originariamente
presenti su un dato cromosoma non rimanevano necessariamente
insieme durante la formazione dei gameti ma potevano essere
rimescolati.

Due caratteri su uno

stesso cromosoma che
erano ereditati insieme
da un genitore, potevano
essere separati l'uno
dall'altro e finire in
gameti distinti
 Il crossing over può alterare l'associazione fra gli
alleli posti sullo stesso cromatidio (linkage
incompleto)

Prodotto meiotico non interessato da crossing over (i geni

AB e ab risultano associati come nel cromosoma parentale)

Prodotti meiotici ottenuti da cromatidi interessati da

crossing over. Questi prodotti hanno ricombinato i rapporti
originari di associazione del genitore in due forme nuove
chiamate tipi ricombinanti (Ab ed aB)

I geni sullo stesso cromosoma dovrebbero comportarsi come se fossero collegati gli uni agli altri cioè
dovrebbero far parte dello stesso gruppo di associazione (linkage group) - ovvero migrare insieme nella stessa
cellula – di fatto il crossing over ovvero la ricombinazione genetica è il meccanismo responsabile della
comparsa di discendenti (ricombinanti) con combinazioni inattese di caratteri genetici.
 Le frequenze di ricombinazione sono una misura
della distanza tra i geni su un cromosoma (mappe
geniche)
Il fatto che specifiche coppie di geni mostrassero sempre la stessa frequenza di ricombinazione portò a
pensare che la posizione dei geni sul cromosoma (locus) fosse fissa e che la frequenza di ricombinazione fra
due geni fosse proporzionale alla loro distanza (e quindi utilizzabile per mappare le posizioni relative di geni
lungo un dato cromosoma: fisicamente due geni lontani presentano una maggiore probabilità di essere
separati da un crossing over che si verifichi in qualsiasi punto nello spazio che li separa.

Geni strettamente vicini tendono a non

essere separati da eventi di crossing over
durante la sinapsi (risultano
frequentemente associati – linkage
completo).
 Proprietà del materiale ereditario
Alcuni aspetti del materiale ereditario (il modo in cui viene trasmesso, i meccanismi di regolazione,
la sua mutabilità e stabilità nel tempo) sono alla base delle differenze tra gli individui.

Capacità di
Trasmissibilità:
replicazione:
esistono meccanismi
meccanismi che
che consentono il
consentono la
passaggio del
produzione di più
materiale ereditario da
copie destinate ad
una generazione a
essere trasmesse dai
quella successiva
genitori ai figli

Contenuto
informativo: contiene
Mutabilità: capacità di
informazioni che
cambiare su tempi
guidano lo sviluppo il
lunghi
funzionamento ed il
comportamento

Qual è la natura del materiale genetico?

Qual è l'elemento che consente la trasmissione dei caratteri?
L'esperimento di
Griffith

• Osservare
• Dedurre
• Fare ipotesi
• Discutere i risultati
• Fare conclusioni
• Delineare punti di forza e
punti deboli

https://www.sciencedirect.com/topics/biochemistry-genetics-and-molecular-biology/griffiths-experiment
 L'esperimento di
Griffith

Streptococcus pneumoniae:
 il ceppo capsulato, grazie alla
capsula polisaccaridica che
circonda la parete batterica,
appare liscio nelle colture in
piastra Petri (S=smooth,
liscio), resiste alla
fagocitosi attivata dalla
risposta immunitaria
dell'ospite e causa la morte
dei topi per polmonite.
 Il ceppo non capsulato,
forma colonie ruvide in
piastra (R=rough=rugoso),
viene eliminato dal
sistema immunitario
degli ospiti che sopravvivono
all'infezione.

https://www.sciencedirect.com/topics/biochemistry-genetics-and-molecular-biology/griffiths-experiment
 Interpretazione
dell'esperimento di Griffith
La scoperta della trasformazione batterica nel 1928 ad
opera del medico inglese Frederick Griffith ha stabilito
che il DNA (principio trasformante) è il depositario
dell’informazione genetica.
• Esperimento:
 inoculò ad un gruppo di topi una miscela di batteri non-
capsulati vivi e di batteri capsulati morti, uccisi con il
calore. I topi in cui veniva iniettata tale miscela morivano e
dai loro tessuti era possibile isolare batteri di tipo capsulato
(L).
• Presenza di un controllo negativo:
 Il gruppo di controllo inoculato solo con gli pneumococchi
capsulati uccisi dal calore non si ammalava.
Formulazione dell'ipotesi conclusiva:
Il materiale genetico responsabile della sintesi della
capsula all'interno della miscela dei due ceppi batterici si
trasferisce dai batteri capsulati morti a quelli non-
capsulati vivi, conferendo a questi ultimi la capacità di
produrre la capsula.
 Qual è la natura del materiale genetico?
Qual è l'elemento che consente la trasmissione dei caratteri?
 Con l'esperimento
di Avery, MacLeod
e McCarty viene chiarita la
natura del "principio
trasformante"

https://www.sciencedirect.com/topics/biochemistry-genetics-and-molecular-biology/griffiths-experiment
 Con l'esperimento
di Avery, MacLeod
e McCarty viene chiarita la
natura del "principio
trasformante"

Esperimento: Stessa impostazione di Griffith

Gli estratti cellulari di batteri capsulati uccisi con il calore
vengono trattati con enzimi in grado di distruggere
selettivamente i singoli tipi di macromolecole, prima di
aggiungerli nelle provette contenenti colture di batteri del
ceppo non-capsulato.
RISULTATI OTTENUTI:
• Nei batteri non capsulati MISCELATI con estratti
di batteri capsulati in cui erano state eliminate
selettivamente o le proteine, o l’RNA, o i lipidi
oppure i polisaccaridi, la trasformazione di
batteri non-capsulati a capsulati avveniva
ancora
• Il trattamento dell’estratto di batteri capsulati
con un enzima (la DNAsi) che distruggeva il DNA
non dava più luogo a trasformazione.

Formulazione dell'ipotesi conclusiva:

La molecola necessaria per conferire la capacità di
sintetizzare la capsula, cioè il "Principio trasformante" è il
DNA.
https://www.sciencedirect.com/topics/biochemistry-genetics-and-molecular-biology/griffiths-experiment
Codice istonico, modificazioni epigenetiche e
differenziamento cellulare
 È per questo che, in base
all’assenza o alla presenza di tale
istone, si ottiene la fibra da 10 nm
o quella da 30 nm.

S
Caratteristiche delle PROTEINE ISTONICHE

Le proteine istoniche presentano una struttura conservata,

costituita da tre regioni ad alfa elica, denominata histone-
fold e da una regione (ossia una coda) N-terminale. La
struttura histone-fold media la formazione delle coppie
eterodimeriche di HA2 con H2B e di H3 con H4, mediante
un’interazione testa-
coda. Due coppie di
eterodimero H3 – H4, poi,
si associano a formare un
tetramero.

L’assemblaggio delle
proteine istoniche a
formare l’ottamero del
nucleosoma è un
processo ordinato, che ha
inizio con il legame al DNA
di un tetramero (H3-H4)2,
sul quale vengono poi
reclutati due eterodimeri
H2A-H2B, che
completano l’assemblaggio del nucleosoma.

S
Le code N-terminali degli istoni che sporgono all’esterno del nucleosoma, non sono in realtà
necessarie per la formazione ed il mantenimento della struttura dell’ottamero istonico:
infatti, la digestione con tripsina, che agisce unicamente sulle code N-terminali sporgenti
rimuovendole, lascia intatto l’ottamero istonico, cioè non altera l’interazione tra DNA ed
ottamero istonico.
 Le code N-terminali sono costituite
da 20-35 residui e sono regioni
bersaglio di una serie di reazioni
chimiche; costituiscono, infatti, il
substrato di modificazioni chimiche
che inducono un cambiamento
strutturale ed agiscono come
segnale per il legame di proteine
non istoniche.

Principalmente, ciò ha luogo

mediante acetilazione o
metilazione di lisine e
fosforilazione di serine, che
cambiano la carica netta della
molecola proteica, diminuendone
la basicità.

Le code N-terminali, nello specifico, possono essere:

- Acetilate sulle lisine

- Metilate sulle lisine ed arginine
- Fosforilati sulle serine e le treonine

Si risente, così, di un effetto sull’affinità degli isotoni per il

DNA e, dunque, sulla stabilità del nucleosoma; ciò ha un
ruolo nei processi di replicazione e trascrizione del genoma,
così come nel controllo epigenetico dell’espressione genica.

In più, nel caso della fibra da 30 nm, le code N-terminali degli

istoni contribuiscono anche alla formazione della fibra
stessa, mediando interazioni sotto forma di legami idrogeno
tra nucleosomi adiacenti. Difatti, in questo caso, la
digestione con tripsina, poiché degrada le code N-terminali,
impedisce la formazione della fibra da 30 nm.

Modificazioni epigenetiche
Modificazioni ereditabili che non alterano
la sequenza nucleotidica dei geni ma ne
alterano l’attività.
Le modificazioni post-traduzionali degli
istoni modificano il livello di
compattamento del DNA (superavvolto/
rilassato) e quindi la regolazione
dell'espressione genica:
➢ La cromatina trascrizionalmente attiva
è demetilata e iperacetilata
➢ I geni silenziati sono deacetilati sugli
istoni e presentano metilazione delle
citosine nel DNA
 Modificazioni post-
traduzionali degli istoni
e modulazione
dell’attività
trascrizionale della
cromatina:

Come appena accennato,

le code N-terminali degli
istoni non contribuiscono
alla struttura e alla stabilità del nucleosoma, ma hanno un ruolo fondamentale nella
modulazione della struttura e del grado di accessibilità della cromatina.

Esse, infatti, possono subire una serie di modificazioni post-traduzionali, mediate da

specifiche attività enzimatiche, che comprendono l’acetilazione e la metilazione delle lisine
(K) e delle arginine (R), la fosforilazione di serine (S) e treonine (T), l’ubiquitinazione e la
sumoilazione delle lisine.

Ad incrementare il livello di complessità di queste modificazioni, si consideri che ciascun

residuo di lisina può addizionare uno, due o tre gruppi metilici, mentre l’arginina può essere
mono o dimetilata.

Specifici pattern di modificazione degli istoni sono anche associati a dinamiche più generali
dello stato della cromatina. Queste osservazioni suggeriscono l’esistenza di un codice
istonico, per cui ad un determinato assortimento di modificazioni post-traduzionali
corrispondere una risposta funzionale indotta: specifiche modificazioni istoniche possono
attivare (o reprimere) la trascrizione.

Ogni modificazione che abbia luogo sulla struttura cromatinica, dunque, avrà un effetto sulla
stabilità del nucleosoma: per esempio, le acetilazioni e le fosforilazioni, diminuendo il
carattere basico degli istoni, rendono in genere meno stabile l’interazione tra l’ottamero
istonico e il DNA carico negativamente, favorendo così lo spostamento del nucleosoma
stesso e, dunque, l’espressione genica.

In altri termini, sembra evidente che – considerando che gli istoni siano proteine basiche
cariche positivamente (la carica dipende dalle catene laterali dell’amminoacido lisina),
fintantoché queste cariche positive non vengono neutralizzate da modificazioni chimiche, si
ha il massimo grado di compattamento del DNA.

Si noti che, ovviamente, le modificazioni istoniche sono tra loro connesse: ad esempio, una
certa modificazione su uno specifico residuo amminoacidico può avvenire solo se un altro
residuo è stato precedentemente modificato.

Le modificazioni degli istoni, ad ogni modo, non sono spontanee, ma richiedono l’intervento
di vari tipi di enzimi, tra cui:
- Le HAT(istone acetil transferasi) -> trasferiscono dal cofattore acetil-
CoAun gruppo acetilico sul gruppo amminico delle lisine degli istoni.

- Le HDAC(istone deacetilasi) -> consentono la rimozione del gruppo

acetilico.
- Le HAT (istone acetil transferasi) -> trasferiscono dal cofattore acetil-CoAun gruppo
- Le HMT(istone metiltransferasi)
acetilico sul gruppo amminico delle lisine degli istoni.

- Le HDAC (istone deacetilasi) -> consentono la rimozione del gruppo acetilico.

- Le HMT (istone metil transferasi)

Nel caso dell’acetilazione:

Gli enzimi HAT catalizzano il legame di un gruppo acetile alle code N-terminali che
protrudono dall'ottamero core del nucleosoma; l'acetilazione riduce l'affinità degli istoni per
il DNAe destabilizza la fibra cromatinica. In breve:

- L’acetilazione degli istoni determina un aumento dell’accessibilità del DNA agli

enzimi di restrizione ed ai fattori trascrizionali: tale modificazione, infatti, diminuendo
la carica netta positiva delle code, rende più debole l’interazione con il DNA, così da
rendere il sito più accessibile al passaggio dei fattori di trascrizione. L’istone acetilato,
in altri termini, non dispone più della carica positiva che riesce a “tirare” su di sé il filo
– il filamento di DNA– e dunque il gene può essere trascritto.

- Una deacetilazione, invece, è dunque associata alla repressione dell’espressione

genica.

Ciò equivale ad affermare che – per poter effettuare attivazione genica – sarà necessario
attivare gli enzimi di acetiltransferasi (HAT); mentre – per silenziare – sarà necessario
attivare gli enzimi deacetilasi (HDAC).

Solitamente, dunque, gli istoni dell'eterocromatina non sono acetilati, mentre i domini
funzionali ad ansa attivi trascrizionalmente risultano acetilati.

Le lisine acetilate degli istoni, ai fini del silenziamento genico, possono poi essere deacetilate
dagli HDAC che funzionano, per lo più, come corepressori della trascrizione. Infatti, lo stato
ipoacetilato delle lisine nelle code N-terminali degli istoni correla con la condensazione dei
cromosomi, il silenziamento di promotori e, dunque, con l’assenza di trascrizione in quelle
regioni del DNA.

Il controllo epigenetico dell'espressione genica stessa è operato proprio da modifiche post-

traduzionali della cromatina e, nello specifico, da acetilazione e deacetilazione, eventi che
come visto sono in grado di aumentare o diminuire l’accesso dei fattori di trascrizione al
DNA. Per modificazioni epigenetiche si fa riferimento a delle modificazioni ereditabili che
non alterano la sequenza del DNA, ma l’espressione dei geni. Nelle cellule di mammifero,
appunto, le modificazioni epigenetiche di maggior frequenza sono:

- A livello della cromatina, mediante appunto l’acetilazione e la deacetilazione degli

istoni

- Alivello del DNA, mediante la metilazione della citosina

Gli enzimi HAT, dunque, entrano a far parte del complesso di inizio della trascrizione, nei
meccanismi di riparo delle rotture del doppio filamento e lesioni causate dai raggi UV e nel
controllo del ciclo cellulare (che infatti è un altro aspetto della funzione di riparo del DNA, in
quanto il ciclo si arresta se il genoma è danneggiato in modo esteso).

Nel caso della metilazione:

La S-adenosilmetionina (SAM) è il co-substrato donatore dei gruppi

metile nella metilazione di proteine. La metilazione delle lisine, in
questo caso, in realtà non altera la carica cationica, ma aggiunge
idrofobicità.

In particolare, se una lisina viene di- o trimetilata non solo si

aumenta l’idrofobicità, ma si incrementa notevolmente anche l’ingombro sterico, il che
influisce notevolmente sulle interazioni proteina-proteina.

Esistono delle metil transferasi specifiche per i diversi residui di lisina e arginina negli istoni
H3 e H4; in più, solo più recentemente, sono stati scoperti altri enzimi in grado di demetilare
i diversi residui modificati degli istoni (demetilasi).
È stato anche scoperto che metilasi e demetilasi possono fare parte dello stesso complesso
multiproteico; ciò suggerisce che la metilazione degli istoni sia il risultato di un equilibrio tra
attività enzimatiche che hanno effetti opposti.

Un elemento fondamentale, in tal senso, riguarda soprattutto l’equilibrio che esiste in

merito alla metilazione ed alla acetilazione; si tratta di un equilibrio specifico per ogni tipo
di cellula, in base alla sua funzione e a quali tipi di geni deve esprimere, concernendo il codice
istonico. Il rapporto è antagonista: un istone metilano non può essere acetilato, così come
uno acetilato non può essere metilato.
 Ogni sottotipo
cellulare presenta
un pattern specifico
di enzimi che
modificano gli
istoni

Il codice viene letto da un

complesso di lettura-scrittura

Il reclutamento
di questo
complesso
può propagare
lo stato di
condensazione
della cromatina

L'ereditarietà del tetramero H3-H4 parentale facilita

la trasmissione dello stato della cromatina
Negli eucarioti durante la sintesi (replicazione) del DNA non solo deve
essere copiato fedelmente il DNA (ereditarietà dell'informazione
genetica) ma deve essere anche rigenerata la struttura della cromatina
mantenendo lo stato di modificazioni epigenetiche identico fra
generazioni (ereditarietà del codice istonico). Durante l'apertura della
doppia elica di DNA i tetrameri H3-H4 rimangono legati all'uno o
all'altro filamento in maniera casuale mentre i dimeri H2A ed H2B
vengono rilasciati nel pool solubile e si mescolano con gli istoni di
neosintesi: nei filamenti neosintetizzati il 50% degli istoni è di tipo
parentale e porta le modificazioni epigenetiche ereditarie, mentre il
restante 50% è di neosintesi.

I complessi di lettura-scrittura consentono l'ereditarietà dei

nucleosomi e la corretta propagazione dello stesso stato di
modificazione sui due cromatidi fratelli
Le proteine del complesso di lettura riconoscono uno specifico stato di
modificazione epigenetica (ad es. gruppo acetile): recluta gli enzimi
"writers" es. Acetil trasferasi che effettuano l'acetilazione degli istoni
adiacenti.
Determinanti citoplasmatici e differenziamento cellulare

Ciò che contribuisce alla diversificazione fra diversi blastomeri è la

posizione delle cellule durante la segmentazione.
Successivamente ciò che determina se una cellula dell'ectoderma
diventerà nervosa o epidermica sono i determinanti citoplasmatici.
Nel modello animale Xenopus utilizzato negli studi di Biologia dello
Sviluppo, i determinanti citoplasmatici si distribuiscono dopo la
fecondazione:
➢ Importanza della localizzazione delle cellule: il punto di entrata
dello spermatozoo nell'oocito determina una specie di orientamento
nell'embrione e stimola la formazione del lato ventrale–> il
citoplasma grigio (e gli specifici determinanti in esso contenuti) si
sposta al polo animale dove si formeranno cellule con destino
differenziativo diverso (espressione di un pattern genico diverso)
(lato dorsale).
Modelli di rimodellamento della cromatina ed “accessibilità” alla sequenza di DNA
 La replicazione del DNA:
punti chiave e natura chimica delle interazioni
DNA/proteine
 Quali enzimi e proteine sono coinvolti nelle varie
fasi della replicazione?​ Quali forze di legame ed
interazioni entrano in gioco

 In che modo la replicazione è sincronizzata con il

ciclo cellulare ?​
In quale fase del ciclo cellulare inizia la replicazione del DNA?
 Fase S del ciclo cellulare negli
eucarioti:
La replicazione del DNA
La fase che intercorre tra una divisione e l'altra anche detta "Interfase" può
durare dalle 12 alle 24 ore nelle cellule che entrano nella fase attiva del ciclo
cellulare ed è ricca di attività in cui la cellula prepara tutto il necessario per
affrontare le successive fasi della mitosi: prevale
l'eucromatina (DNA funzionalmente attivo=espressione genica, sintesi dell'RNA
e produzione di proteine) e la cellula cresce di dimensioni.
L'Interfase è divisa in 4 step:
• G0 : fase di riposo - può essere transiente o permanente (es. I neuroni alla
fine del loro differenziamento smettono di dividersi)
• G1: la cellula aumenta di dimensioni, sintetizza RNA, produce proteine –
"G1 Chekpoint" - tutto deve essere pronto per la fase di Sintesi del DNA
• Fase S: Affinchè da una cellula si possano generare due cellule figlie
geneticamente identiche l'informazione genetica contenuta nel DNA deve
duplicarsi prima che avvenga la divisione cellulare.
• G2: Prima della Mitosi la cellula continua a crescere e a produrre nuove
proteine, soprattutto - "G2 Checkpoint"- verifica che tutto sia stato
correttamente effettuato
• Fase M – Mitosi – in un tempo molto più ridotto (1-2 ore circa) tutta
l'energia della cellula è utilizzata per permettere la complessa ed ordinata
serie di eventi che porta alla formazione di due nuove cellule figlie.
Modelli di replicazione del DNA:
Esperimento di Meselson-Stahl
Una coltura batterica di E.coli viene fatta crescere in un terreno contenente 15 NH Cl (cloruro di ammonio marcato con
4
isotopo pesante dell'azoto)

Le cellule vengono successivamente trasferite in un terreno normale (contenente 14 NH4 Cl) : dopo 1 divisione cellulare (20
minuti) e dopo due divisioni (40 minuti) vengono prelevati due campioni di cellule, viene estratto il DNA ed analizzato
mediante centrifugazione in gradiente di densità (il DNA contenente l'isotopo pesante si localizza più in basso nella
provetta):

 dopo una divisione cellulare appare solo una banda di DNA: tutto il DNA è caratterizzato da molecole contenenti
l'isotopo pesante;

 dopo due divisioni appaiono due bande che corrispondono al DNA ibrido (costituito da molecole con isotopo pesante
(filamento parentale) ed isotopo leggero (nuovo filamento).
 Bande di DNA "attese" dopo
centrifugazione in gradiente di
densità 20' 40'

Secondo il modello conservativo (viene

mantenuta la doppia elica originaria e
se ne genera un'altra del tutto
nuova) dopo 20 minuti dovrebbero
comunque apparire due bande
distinte per effetto dell'inglobamento
dell'isotopo leggero nella nuova
molecola.

Secondo il modello dispersivo, sarebbe

possibile ottenere un'unica banda dopo
20' perché entrambe le molecole di
nuova generazione sono costituite da
frammento di DNA parentale e
frammenti di DNA neosintetizzato… ma
anche dopo 40 minuti continua ad
essere così quindi comunque dovrebbe
esserci sempre una sola banda.

Il modello valido è quello della

replicazione semiconservativa
 Struttura delle
proteine e
loro funzione
nella Replicazione
del DNA
 Le proteine: polimeri di amminoacidi
Le proteine sono costruite a partire da 20 amminoacidi (composti polifunzionali – caratteristiche acide date
dal gruppo carbossilico e caratteristiche basiche conferite dal gruppo amminico – anfoliti) che presentano
gruppi –R diversi (struttura semplice – singolo atomo di idrogeno nella glicina; struttura grande – catena
aromatica complessa nella fenilalanina, nel triptofano e nella tirosina).

In natura, tutti gli

amminoacidi sono alfa-
amminoacidi, cioè il
gruppo amminico è
sempre legato al
carbonio alfa (carbonio
legato direttamente al
gruppo carbossilico).
La maturazione delle
proteine e la loro
modificazione mediante
aggiunta di nuovi
gruppi chimici
(acetilazione
e fosforilazione) amplia
la diversità chimica delle
proteine.
Le proteine vengono
costruite per gradi
attraversando 4 livelli
di struttura
Ciò che spinge la
progressiva formazione di una
struttura tridimensionale è la
diminuizione di entropia che si ha
quando le varie parti di una
molecola perdono "la loro libertà".
I legami e le interazioni deboli
che si formano tra le varie subunità
di una molecola compensano in
termini energetici la perdita di
entropia.
 Le proteine vengono
costruite per gradi
attraversando 4
livelli di struttura:
STRUTTURA PRIMARIA: sequenza di
amminoacidi uniti da legami peptidici
(formazione del legame ammidico) originati
per condensazione tra il gruppo carbossilico
di un amminoacido e il gruppo amminico di
un secondo amminoacido, con eliminazione
di una molecola d'acqua.
-legame tra amminoacidi consecutivi-
Le due estremità del polipeptide sono
chimicamente distinte:
 Estremità ammino-terminale (N-
terminale) - gruppo amminico libero
 Estremità carbossi-terminale (C-
terminale) - gruppo carbossilico libero
 Struttura
secondaria
delle proteine
Diverse conformazioni che può
assumere il polipeptide grazie alla
progressiva formazione di legami a
idrogeno che si instaurano tra i gruppi
C=O ed N-H di legami peptidici diversi
(la catena polipeptidica tende a formare
il maggior numero di legami a idrogeno-
di per sé sono interazioni deboli-ma in
gran numero contribuiscono a
stabilizzare la molecola nel suo
complesso).
- interazioni tra amminoacidi localmente
adiacenti -

I lunghi polipeptidi possono ripiegarsi in una serie

di strutture secondarie diverse
 Principali tipi di struttura
secondaria nelle proteine:
 α-elica: le unità peptidiche si dispongono a formare
un'elica – 3,6 unità di amminoacido per ogni giro d'elica:
ciascun gruppo ammidico forma legami a idrogeno con il
gruppo ammidico che lo segue al quarto posto, mentre le
catene laterali si estendono al di fuori dell'asse
dell'elica. Sono possibili soltanto le rotazioni attorno ai
legami adiacenti al carbonio alfa.
 Foglietto-β (a foglietto ripiegato): due tratti di catena si
collocano uno di fianco all'altro stabilizzati da numerosi
legami ad idrogeno fra il gruppo carbonilico e quello NH
di amminoacidi presenti sui due lati della struttura a
pieghe - le catene laterali si dispongono al di sopra o al di
sotto del piano formato da ogni foglietto.
 Struttura terziaria
delle proteine
Diverse forze chimiche stabilizzano progressivamente la
configurazione tridimensionale delle proteine:
 Legami a idrogeno tra singoli aminoacidi presenti sulle
diverse componenti della struttura secondaria ne
determinano il ripiegamento e la torsione
 Interazioni elettrostatiche tra gruppi R di amminoacidi
carichi negativamente (acido aspartico-acido glutammico)
e positivamente (lisina, arginina, istidina)
 Forze idrofobiche – spingono gli amminoacidi con gruppi
laterali non polari lontano dall'acqua cioè nelle regioni
interne della proteina
 Ponti disolfuro: legami covalenti (S-S) che coinvolgono i
gruppi SH di due amminoacidi cisteina in una reazione di
ossidazione
- interazioni fra residui molto lontani nella sequenza primaria
della proteina -
 Struttura
quaternaria delle
proteine
Caratterizza le proteine multimeriche cioè formate da
due o più polipeptidi avvolti in struttura terziaria.
 La formazione di ponti disolfuro rendono molto
stabile la struttura quaternaria
 Associazioni più deboli fra le diverse subunità -
legami a idrogeno e forze idrofobiche -
permettono una maggiore flessibilità necessaria
ad esempio se le esigenze funzionali della cellula
richiedono in un certo momento dello sviluppo
che in una proteina una subunità venga
sostituita da una subunità alternativa
Proteine che legano il DNA
ed interazione DNA-
proteine
Quali tipi di interazioni stabilizzano il
complesso DNA-proteina in modo tale da
permettere che la proteina:
• penetri nel solco maggiore/minore del
DNA
• Riconosca la sequenza nucleotidica nella
doppia elica del DNA
• Legga direttamente la sequenza
 Proteine che legano il DNA
ed interazione DNA-proteine
Quando si osservano le strutture delle proteine che legano il
DNA in maniera sequenza-specifica si osserva che ciascuno dei
motivi che legano il DNA è presente in un'ampia varietà di
proteine provenienti da organismi diversi.
Il motivo elica-giro-elica (HTH, helix-turn-helix) è caratterizzato
da due alfa eliche separate da un giro:
[object File]
Il giro beta costituito da 4 amminoacidi il secondo dei quali è
normalmente una glicina insieme alla prima alfa elica posiziona
la seconda alfa elica sulla superficie della proteina in un
orientamento tale da permettere a questa seconda alfa elica di
inserirsi nel solco maggiore del DNA fungendo quindi da elica
di riconoscimento.

Il motivo HTH è costituito da 20 amminoacidi (solo una piccola parte della proteina) - altre regioni della
proteina interagiscono con la superficie della molecola di DNA, stabilizzando l'interazione complessiva
ed assicurando il corretto posizionamento dell'elica di riconoscimento nel solco maggiore del DNA.
 I motivi a dito di zinco sono comuni nelle
proteine eucariotiche
Raro nelle proteine procariotiche, il dito di zinco è un motivo presente in
almeno 6 diverse versioni negli eucarioti.
Alcune volte sono presenti copie multiple del dito di zinco all'interno di
una singola proteina.
Nella versione "dito Cys2His2" ci sono in tutto 12 amminoacidi – tra cui 2
cisteine e 2 istidine – che formano un foglietto beta seguito da un'alfa
elica. Il foglietto beta e l'alfa elica costituiscono una struttura a forma di
dito che sporge dalla superficie della proteina. Nel mezzo c'è un
atomo di zinco, coordinato dalle 2 cisteine ed istidine, il
quale tiene nella corretta posizione reciproca il foglietto beta e l'alfa elica.
Funzioni delle strutture secondarie:
 Il foglietto beta determina il corretto posizionamento dell'alfa
elica interagendo con lo scheletro zucchero-fosfato del DNA
 L'alfa elica è la porzione del motivo che forma I contatti critici all'interno
del solco maggiore del DNA
 Esperimenti di ritardo su gel: EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assay)
localizzare il sito di legame di una
proteina sul DNA

La prima cosa che viene studiata di una

proteina che lega il DNA non è la sua identità ma
le caratteristiche della sequenza che riconosce:
- il DNA viene digerito con enzimi di restrizione:
otteniamo una collezione di frammenti di
restrizione che comprendono la regione di DNA
corrispondente al sito di legame della
proteina oggetto di studio
- viene aggiunto un estratto di proteine nucleari
- si carica su un gel elettroforetico il pool di
frammenti di DNA nudo ed il pool di frammenti
a cui sono state aggiunte le proteine
- se una proteina si lega ad un frammento di
DNA, quel complesso DNA-proteina avrà una
massa molecolare maggiore rispetto al DNA
nudo, cioè correrà più lentamente ovvero
risulterà più ritardato durante la corsa
elettroforetica.
 EMSA: applicazioni
Tecnica in-vitro comunemente
utilizzata per verificare il legame di una proteina
specifica con un tratto di DNA (sonda)

Questo saggio è utilizzato soprattutto per:

 lo studio di fattori trascrizionali che possono
essere aggiunti o puri o in forma
ricombinante, se già si ipotizza il loro legame
alla sequenza di DNA di interesse
 possono essere analizzati nel contesto
dell’estratto cellulare di appartenenza al fine
di identificare DNA binding proteins ancora
sconosciute:
 Si incuba il complesso DNA/estratto
proteico con un anticorpo che si
lega specificatamente ad una
proteina che si ipotizza possa legarsi
ad uno specifico frammento di DNA
 Se vi è legame antigene-anticorpo si
osserva un ulteriore "Supershift" di
quello specifico frammento
Footprinting con
la DNAasi I
10.3389/fmicb.2015.01049
 EMSA e DNA footprinting
Gli esperimenti di ritardo su gel (EMSA):
• Forniscono solo un'indicazione riguardo alla localizzazione di un
sito di legame di una proteina
• Non identificano con precisione il sito di legame della proteina sul
DNA:
• I frammenti ritardati sono lunghi alcune centinaia di basi,
mentre I siti di legame si estendono al massimo per
alcune decine di basi --> non c'è alcuna indicazione sulla
posizione del sito di legame all'interno del frammento
ritardato
• Se il frammento ritardato è lungo è possibile che contenga siti
distinti per più proteine
• Se il frammento di restrizione è corto si rischia di separare il sito di
legame su due frammenti adiacenti che da soli non sono in grado
di legare la proteina e di formare quindi una banda di ritardo.

Gli studi di ritardo forniscono un'analisi preliminare, ma per ricavare

informazioni più dettagliate sono necessarie altre tecniche:
Gli esperimenti di protezione da modificazione si basa sul fatto
che se una molecola di DNA è legata ad una proteina parte della sua
sequenza nucleotidica sarà protetta da eventuali modificazioni.
 EMSA e DNA
footprinting
• Gli esperimenti di protezione da modificazione
utilizzano un approccio sperimentale chiamato
footprinting (da footprint=orma) si basa sul fatto che se
una molecola di DNA è legata ad una proteina parte della
sua sequenza nucleotidica sarà protetta da eventuali
modificazioni:
• Trattamento con una nucleasi che taglia tutti I legami
fosfodiesterici tranne quelli protetti dalla proteina
legata
• Esposizione ad agenti metilanti come il DMS dimetil
solfato che aggiunge gruppi metilici ai nucleotidi G ->
tutte le guanine protette dal legame con la proteina
non verranno metilate
 EMSA e DNA
footprinting
FOOTPRINTING CON LA NUCLEASI:
Il frammento di DNA da esaminare viene:
 marcato ad un'estremità
 Unito alla proteina di legame (estratto nucleare o proteina purificata)
 Trattato con la desossiribonucleasi I (DNasi I)
 Devo evitare che la DNasi I tagli tutti I legami fosfodiesterici nei frammenti
altrimenti ottengo frammenti troppo piccoli difficili da sequenziare:
 Il trattamento con DNasi I è eseguito in condizioni limitanti -
bassa temperatura oppure scarsa quantità di enzima – in modo che
in media ciascuna copia del frammento di DNA sia soggetta ad un
singolo attacco cioè solo un legame fosfodiesterico viene rotto
per tutta la lunghezza del frammento
 La DNasi non riesce a rompere I legami fosfodiesterici protetti
dal legame della proteina su uno specifico sito di legame sul
DNA
 Viene rimossa la proteina
 Si esegue una elettroforesi della miscela di frammenti tagliati ed in virtù
della marcatura si visualizzano le posizioni relative dei vari frammenti sul
gel: otteniamo una successione di bande che corrispondono a
frammenti che differiscono in lunghezza per un nucleotide:
 Questa successione è interrotta da un'area vuota in cui non si
osservano bande marcate
 Quest'area vuota "footprint" corrisponde alle posizioni dei legami
fosfodiesterici protetti nel DNA dal legame con la proteina
 Legame DNA-proteine:
la sequenza nucleotidica ha effetti indiretti
sulla conformazione globale dell'elica e
fornisce informazioni strutturali alle
proteine di legame per l'identificazione del
corretto sito di legame sul DNA
• Il DNA è strutturalmente polimorfico: le
configurazioni A,B,Z e gli intermedi tra l'una
e l'altra coesistono all'interno di una singola
molecola di DNA, definendo regioni
strutturalmente e quindi funzionalmente
diverse - perchè diversamente
accessibili dalle proteine
• Questi cambiamenti conformazionali
dipendono dalla sequenza nucleotidica,
dall'impilamento ed appaiamento delle basi
azotate che influenzano il grado di rotazione
attorno ad una coppia di basi
• Alcuni cambiamenti conformazionali possono
interessare regioni localizzate del DNA in
cui la sequenza nucleotidica (gruppi di
adenine ripetute intervallate da 10-11
nucleotidi) provoca la curvatura del DNA https://www.youtube.com/watch?v=bWaXJfyXfCQ
che influenza il legame di una proteina.
 Interazioni tra
DNA e proteine
 Sono di tipo non covalente
 Nel solco maggiore si formano legami a
idrogeno tra le basi nucleotidiche e i gruppi R
degli amminoacidi presenti nel dominio di
riconoscimento della proteina
 Nel solco minore sono più importanti le
interazioni idrofobiche
 Sulla superficie dell'elica di DNA (cariche
negative dei gruppi fosfato dei nucleotidi) si
instaurano:
 Interazioni elettrostatiche con le cariche
positive dei gruppi R di amminoacidi come la
lisina e l'arginina
 Legami a idrogeno direttamente con le
proteine
 Legami a idrogeno mediati dalle molecole di
acqua
 Interazioni tra
DNA e proteine
 La maggior parte delle proteine che
riconoscono sequenze specifiche sul DNA è in
grado di legarsi in maniera non specifica ad
altre regioni del DNA: in realtà le
proteine trascorrono la maggior parte del
tempo legate in maniera non specifica al
DNA (considerare che la quantità di DNA è
enormemente più grande rispetto alla piccola
concentrazione in cui sono presenti le
proteine di legame)
 La peculiarità è che il legame specifico è
termodinamicamente più stabile rispetto al
legame non specifico:
 Per raggiungere questa stabilità
termodinamica il processo di legame
specifico deve coinvolgere il maggior
numero possibile di contatti DNA-proteine:
le interazioni DNA-proteina causano
cambiamenti conformazionali nell'uno o
nell'altro partner aumentando ulteriormente
la complementarietà tra le superfici di
interazione con conseguente formazione di
legami addizionali.
Meccanismo chimico
della Replicazione del
DNA
Chimica della Replicazione del DNA
• 4 dNTP (Adenina, Guanina, Timina, Citosina)
• Complesso di innesco-stampo: a doppia elica, con 3’-OH libero per l’aggiunta di dNTP
complementari in direzione 3’, con innesco molto più corto dello stampo a singolo filamento
La reazione di sintesi avviene grazie all'idrolisi
del pirofosfato
Step 1) Selezione di una coppia di basi
complementari
• Per catalizzare il legame
fosfodiesterico la DNA
polimerasi utilizza un solo
sito attivo per i 4 diversi
dNTP: conta solo la
geometria delle coppie di
basi, identica per AT e GC
(stesso ingombro sterico)
• Selettività Cinetica: Basi non
corrette vengono
incorporate ad una velocità
10.000 volte minore
• Discriminazione fra dNTP e
rNTP: i ribo-nucleotidi sono 10
volte più concentrati dei dNTP,
ciononostante, il 2’-OH trova
l’ingombro sterico
dell’amminoacido
“discriminatore” per cui gli rNTP
vengono incorporati a velocità
1000 volte inferiore.
• Esperimenti volti a sostituire
l’amminoacido discriminatore
con uno più piccolo mostrano
che la DNA polimerasi aumenta
la capacità di incorporare rNTP
riducendo la capacità selettiva.
 Struttura 3D della DNA polimerasi
L’enzima ha 3 domini strutturalmente correlativi alla forma di una mano destra:
• Il “palmo” corrisponde al sito catalitico associato al DNA neosintetizzato.
• Le “dita” piegano lo stampo di 90° al livello del legame fosfodiesterico posto subito prima del sito catalitico: in questo
modo solo la prima base dello stampo è esposta nel sito attivo. Il DNA stampo non attraversa i domini “dita” e “pollice”
• Il “pollice” non ha funzione catalitica ma mantiene l’innesco in posizione interagendo con il filamento di nuova sintesi

I contatti fra DNA Pol e

DNA sono
principalmente nel
solco minore e
indipendenti dalla
natura delle basi.
Step 2) Chiusura delle dita attorno alla coppia di
basi complementari
Quando si lega il substrato, la DNA
polimerasi subisce un cambiamento
conformazionale: alcuni residui a
livello del dominio delle dita si
spostano aumentando la loro
interazione con la base azotata del
dNTP entrante, coordinando il
gruppo trifosfato con gli ioni
metallici, facilitando così
l’incorporazione del nucleotidi.
Step 3) posizionamento ottimale degli ioni
metallici per catalizzare la formazione del
legame fosfodiesterico

• Ione A (Mg2+ o Zn2+) dissocia

il protone H+ dal 3’-OH dello
zucchero
• Ione B (Mg2+ o Zn2+) si
coordina ai 3 O dei gruppi
fosfato e stabilizza il pirofosfato
favorendo l’attacco nucleofilico
dell’O- al 3’ sul fosfato alfa del
dNTP entrante.
 L’appaiamento corretto
delle basi:
- dipende dall’ingombro sterico
all’interno del sito catalitico
della polimerasi
- aumenta l’affinità per il 3’OH
in crescita
- aumenta l’attività catalitica e
la velocità di sintesi
La forma tautomerica della citosina viene
appaiata all’Adenina generando
un’alterazione della sequenza nucleotidica
Il non corretto appaiamento delle
basi:
-riduce l’affinità per il 3’OH in crescita
- riduce la velocità di sintesi
- aumenta l’affinità per l’attività esonucleasica: il
nucleotide non correttamente appaiato viene rimosso
Proteine coinvolte
nelle diverse fasi
del processo di
replicazione del
DNA
L’azione coordinata di tutte
queste proteine permette che
la replicazione avvenga una
sola volta per ciclo cellulare, in
modo controllato, con velocità
appropriata, accuratezza e
completezza.
 Caratteristiche dei siti di
inizio della replicazione
Si tratta di segmenti di DNA che contengono brevi sequenze ripetute multiple
riconosciute da proteine multimeriche specifiche, che giocano un ruolo
chiave nell’attivazione dell’origine e nel successivo assemblaggio della DNA
polimerasi.
• Siti di legame per proteine regolatrici (proteine iniziatrici e/o complessi di
pre-replicazione e/o di selezione/attivazione):
• E. coli (4 sequenze di 9 paia di basi vengono riconosciute e legate dalla
proteina iniziatrice Dna A)
• S. cerevisiae (l’iniziatore è una proteina esamerica Origin Recognition
Complex -ORC- che rimane permanentemente attaccata ai domini A e
B1, lega ATP e recluta altre proteine

• Sequenze di DNA facilmente denaturabili (regioni ricche in AT):

• E.coli (regioni di 13 pb - prima la Dna A denatura una sequenza di 20pb e
poi recluta altre proteine iniziatrici)
• S.cerevisiae (l’esamero ORC recluta la proteina ABF1 -ARS binding
protein 1- nel sub-dominio B3 - questo legame genera la denaturazione
(melting) nel sito B2.
Forcella replicativa: zona di separazione della doppia elica
di DNA dove avviene la contemporanea replicazione dei 2
nuovi filamenti
Poiché il DNA è costituito da due filamenti polinucleotidici
antiparalleli e la DNA polimerasi aggiunge nucleotidi
all'estremità 3'OH (direzionalità 5'-3'), la replicazione è:
• continua sul filamento guida
• discontinua sul filamento ritardato
La Primasi è l'enzima che viene reclutato per generare un
innesco ad RNA con un 3'OH libero:
• Viene reclutata 1 sola volta sul filamento guida
• Viene reclutata centinaia di migliaia di volte sul filamento
ritardato man mano che la forcella replicativa avanza
Sul filamento ritardato si generano centinaia di migliaia
Frammenti di Okazaki, intermedi di replicazione a DNA che
vengono sintetizzati dal 3'OH del primer ad RNA che si forma
in prossimità dell'apertura della forcella replicativa fino al
terminale 5' del frammento che è stato sintetizzato
precedentemente: questi frammenti verranno poi uniti
covalentemente in un filamento continuo.
Replicazione del
DNA: Overview
DNA Elicasi e Single Strand
Binding proteins
L'Enzima Elicasi ha una struttura esamerica ad
anello capace di avvolgere un singolo filamento
di DNA e consumando ATP provoca la rottura dei
legami ad idrogeno e l'apertura della forcella
replicativa
• L'elicasi associata al filamento lento scorre in
direzione 5'-3'
• non modifica la struttura primaria
(covalente) del DNA, ma solo quella
secondaria (legami a H fra le catene)
Le SSBP si legano tramite interazioni
elettrostatiche con i gruppi fosfato e
impilamento con le basi (senza legami a H) in
maniera cooperativa e sequenza-indipendente
con la funzione di mantenere distesi I singoli
filamenti che vengono separati facilitando la loro
funzione di stampi per la sintesi dei nuovi
filamenti
La replicazione del DNA: punto critico

 Il problema topologico mette in discussione la struttura

a doppia elica del DNA ed il modello di replicazione
semiconservativo: è necessario svolgere la doppia elica
per copiare i due polinucleotidi.
Lo svolgimento del DNA è accompagnato da una rotazione
della molecola sul proprio asse: la doppia elica compie 1
giro ogni 10 pb – la replicazione dell'intero cromosoma 1
umano, lungo 250 Mb richiede 25 milioni di rotazioni del
DNA cromosomale nel ristretto volume del nucleo. Quale
possibile meccanismo per il rilassamento della struttura?
Nella molecola circolare di DNA i due filamenti non possono essere separati se
non per rottura di almeno 1 legame fosfodiesterico
Numero di legame Lk = numero di volte che un filamento passa attraverso l’altro = somma di due componenti geometriche, il
numero di twist Tw (n. di giri di un filamento attorno all’altro) e il numero di writhe Wr ( n. di superavvolgimenti della doppia
elica, che si ottiene quando l’asse della doppia elica si ripiega su se stesso).
Nella maggior parte delle cellule il superavvolgimento ovvero la densità-numero di giri-
di superelica per giro della doppia elica assume un valore negativo di energia libera tale da favorire
una parziale denaturazione locale della doppia elica che permette le reazioni di replicazione del
DNA e trascrizione del DNA.

 Nelle fasi di inizio di queste attività intervengono diversi enzimi deputati a far ruotare il DNA,
svolgere l'elica, effettuare tagli e proteggere le estremità tagliate fino a nuova saldatura.
Es. Le topoisomerasi facilitano il rilassamento della struttura di DNA mediante un meccanismo di
taglio, svolgimento d'elica e risaldatura.
 Le topoisomerasi contribuiscono a
risolvere il problema topologico
Il DNA (sia nel caso che sia circolare oppure vincolato
alle estremità) man mano che la forcella replicativa
avanza non riesce ad eliminare I superavvolgimenti
positivi per semplice rotazione.
Negli eucarioti le DNA topoisomerasi costituiscono la
maggior parte della matrice nucleare (rete simile ad una
impalcatura che attraversa tutto il nucleo): non
svolgono essere stesse la doppia elica ma
controbilanciano il superavvolgimento
positivo permettendo alla doppia elica di essere aperta
come una chiusura lampo senza bisogno che la
molecola ruoti ma grazie ad un taglio ed ad
un superavvoglimento negativo.
 Sono noti due tipi di Topoisomerasi: entrambe tagliano,
rilassano la struttura tridimensionale e risaldano le rotture
- non modificano la struttura primaria (covalente) del DNA,
ma solo quella terziaria (superavvolgimenti)
Topoisomerasi I: introducono una incisione
in un filamento e passano l'altro attraverso la
lacuna che è stata formata (modifica di 1
unità il numero di legame cioè il numero di
volte che un filamento incrocia l'altro)
Topoisomerasi II: taglia entrambi I filamenti
per permetterne il passaggio attarevrso
l'apertura: cambia il numero di legame di 2
unità e consuma ATP.
L'estremità del polinucleotide tagliato viene
legato covalentemente all'amminoacido
tirosina presente nel sito attivo della
topoisomerasi assicurando che una
estremità venga mantenuta ferma e l'altra
manipolata.
 La replicazione del DNA
in procarioti ed eucarioti
 Procarioti Eucarioti
• la duplicazione del DNA e la divisione cellulare avvengono contemporaneamente
• la duplicazione del DNA viene effettuata molto prima della divisione della
cellula (Fase S dell'interfase)
• Il genoma batterico è un'unica molecola circolare con una singola origine di
replicazione • Il genoma umano contiene 10 000 origini di replicazione
• Dimensione cromosoma: 2x106 pb (velocità di duplicazione: 10 volte superiore
a quella eucariote) • Dimensione cromosoma 1 umano: 2,5 x 10 9 (bassa velocità - durata fase S:
6-8 ore) ->l'apertura della doppia elica avviene in più punti detti repliconi
• Presenza di nucleosomi
Filamento figlio
• Presenza dei telomeri

Forcella di
replicazione

Forcella di replicazione

Filamento parentale

Sia le cellule procariotiche che eucariotiche contengono parecchie DNA polimerasi diverse che hanno
ruoli distinti nella replicazione e nella riparazione del DNA.
Tutte le DNA polimerasi hanno 2 proprietà fondamentali:
1. Sintetizzano DNA soltanto in direzione 5’-3’, aggiungendo dNTP al gruppo 3’OH libero di una catena in
crescita
2. Necessitano di un primer e non sono in grado di iniziare una nuova catena utilizzando solamente il
filamento stampo
 Proteine
coinvolte
nella
Replicazione
del DNA
Replicazione del
DNA: Overview
DNA Elicasi e Single Strand
Binding proteins
L'Enzima Elicasi ha una struttura esamerica ad
anello capace di avvolgere un singolo filamento
di DNA e consumando ATP provoca la rottura dei
legami ad idrogeno e l'apertura della forcella
replicativa
• L'elicasi associata al filamento lento scorre in
direzione 5'-3'
• non modifica la struttura primaria
(covalente) del DNA, ma solo quella
secondaria (legami a H fra le catene)
Le SSBP si legano tramite interazioni
elettrostatiche con i gruppi fosfato e
impilamento con le basi (senza legami a H) in
maniera cooperativa e sequenza-indipendente
con la funzione di mantenere distesi I singoli
filamenti che vengono separati facilitando la loro
funzione di stampi per la sintesi dei nuovi
filamenti
L'apertura del DNA genera dei
superavvolgimenti della
doppia elica
Il problema topologico mette in discussione la
struttura a doppia elica del DNA ed il modello di
replicazione semiconservativo: è necessario
svolgere la doppia elica per copiare i due
polinucleotidi.
• Lo svolgimento del DNA è accompagnato da
una rotazione della molecola sul proprio asse: la
doppia elica compie 1 giro ogni 10 pb – la
replicazione dell'intero cromosoma 1 umano,
lungo 250 Mb richiede 25 milioni di rotazioni del
DNA cromosomale nel ristretto volume del
nucleo. Quale possibile meccanismo per il
rilassamento della struttura?
Nella molecola circolare di DNA i due filamenti non possono essere separati se
non per rottura di almeno 1 legame fosfodiesterico
Numero di legame Lk = numero di volte che un filamento passa attraverso l’altro = somma di due componenti geometriche, il
numero di twist Tw (n. di giri di un filamento attorno all’altro) e il numero di writhe Wr ( n. di superavvolgimenti della doppia
elica, che si ottiene quando l’asse della doppia elica si ripiega su se stesso).
Nella maggior parte delle cellule il superavvolgimento ovvero la densità-numero di giri-
di superelica per giro della doppia elica assume un valore negativo di energia libera tale da favorire
una parziale denaturazione locale della doppia elica che permette le reazioni di replicazione del
DNA e trascrizione del DNA.

 Nelle fasi di inizio di queste attività intervengono diversi enzimi deputati a far ruotare il DNA,
svolgere l'elica, effettuare tagli e proteggere le estremità tagliate fino a nuova saldatura.
Es. Le topoisomerasi facilitano il rilassamento della struttura di DNA mediante un meccanismo di
taglio, svolgimento d'elica e risaldatura.
 Le topoisomerasi contribuiscono a
risolvere il problema topologico
Il DNA (sia nel caso che sia circolare oppure vincolato
alle estremità) man mano che la forcella replicativa
avanza non riesce ad eliminare I superavvolgimenti
positivi per semplice rotazione.
Negli eucarioti le DNA topoisomerasi costituiscono la
maggior parte della matrice nucleare (rete simile ad una
impalcatura che attraversa tutto il nucleo): non
svolgono esse stesse la doppia elica ma
controbilanciano il superavvolgimento
positivo permettendo alla doppia elica di essere aperta
come una chiusura lampo senza bisogno che la
molecola ruoti ma grazie ad un taglio ed ad
un superavvolgimento negativo.
 Sono noti due tipi di Topoisomerasi: entrambe tagliano,
rilassano la struttura tridimensionale e risaldano le rotture
Topoisomerasi I: introducono una incisione
in un filamento e passano l'altro attraverso la
lacuna che è stata formata (modifica di 1
unità il numero di legame cioè il numero di
volte che un filamento incrocia l'altro)
Topoisomerasi II: taglia entrambi I filamenti
per permetterne il passaggio attraverso
l'apertura: cambia il numero di legame di 2
unità e consuma ATP.
L'estremità del polinucleotide
tagliato viene legato covalentemente
all'amminoacido tirosina presente nel sito
attivo della topoisomerasi assicurando che
una estremità venga mantenuta ferma e
l'altra manipolata.
Forcella replicativa: zona di separazione della doppia elica
di DNA dove avviene la contemporanea replicazione dei 2
nuovi filamenti
Poiché il DNA è costituito da due filamenti polinucleotidici
antiparalleli e la DNA polimerasi aggiunge nucleotidi
all'estremità 3'OH (direzionalità 5'-3'), la replicazione è:
• continua sul filamento guida
• discontinua sul filamento ritardato
La Primasi è l'enzima che viene reclutato per generare un
innesco ad RNA con un 3'OH libero:
• Viene reclutata 1 sola volta sul filamento guida
• Viene reclutata centinaia di migliaia di volte sul filamento
ritardato man mano che la forcella replicativa avanza
Sul filamento ritardato si generano centinaia di migliaia
Frammenti di Okazaki, intermedi di replicazione a DNA che
vengono sintetizzati dal 3'OH del primer ad RNA che si forma
in prossimità dell'apertura della forcella replicativa fino al
terminale 5' del frammento che è stato sintetizzato
precedentemente: questi frammenti verranno poi uniti
covalentemente in un filamento continuo.
 La DNA polimerasi III - Oloenzima nei procarioti
In E.coli sono presenti 5 DNA polimerasi:
DNA polimerasi II, IV e V (meccanismi di riparazione)
Pol I -> coinvolta sia nella riparazione del DNA, sia
nella replicazione
(rimuove i primer attraverso la sua attività esonucleasi
ca 5’-3’ e li sostituisce con frammenti di
DNA sfruttando la sua attività polimerasica)
La Pol III è il principale enzima della replicazione che
lavora su soltanto 2 forcelle di replicazione (che vanno in
senso opposto sul DNA circolare e terminano in
posizione opposta all'ORIC) come componente di un
grande complesso – oloenzima.
L’oloenzima è costituito da 17 subunità e consiste in:
 due core replicativi α-ε-θ,
 due β-clamp, che aumentano la processività della
replicazione,
 un complesso γ, il cui compito è favorire l’associazione
dei due core al DNA, legandoli ai β-clamp.
All’oloenzima si associano le proteine con funzioni
accessorie per la replicazione (DNA elica, DNA primasi,
SSBP)
 • Affinché i core replicativi della Pol
possano legarsi ad entrambi i filamenti
stampo (leading e lagging) e lavorare con il
giusto orientamento 5'-3' è necessario che
il filamento lagging si ripieghi a formare
un’ansa di DNA a singola catena.
• Lo spostamento della polimerasi da un
primer di innesco ad un altro al termine
della sintesi di un frammento di Okazaki è
mediato dalla subunità τ del complesso
Dna-gamma, che sfrutta l’energia prodotta
dall’idrolisi di una molecola di ATP per
determinare l’apertura del β clamp ed il
distacco del core in modo che possa
legarsi al nuovo primer.
Nell’oloenzima i due core replicativi, formano un dimero asimmetrico grazie all’azione del
complesso Dna-gamma, costituito da:
 un dimero di τ (5 domini: 3 domini con funzione ATP-asica e di oligomerizzazione;
dominio di legame alla elicasi DnaB e sito di legame alla subunità alfa del core)
 subunità γ (funzione ATP-asica e di oligomerizzazione)
 altre subunità accessorie δδ’χψ
L'attività ATP-asica fornisce l’energia necessaria ai cambiamenti conformazionali del
complesso Dna-gamma che guidano l’assemblaggio con il DNA ed il coordinamento
degli spostamenti del core
Nuovo modello di oloenzima - Trimerico
La presenza di un terzo core libero
aumenterebbe la velocità di
replicazione del filamento
ritardato, riducendo il divario di
velocità rispetto al filamento
guida:
Prevede che la sintesi di un
nuovo frammento di okazaki
possa iniziare non appena la
primasi sintetizza un primer e
prima che sia terminata la
sintesi del precedente

La DNA pol III è un enzima
processivo grazie al β-clamp
Sebbene il core sia in grado di replicare un filamento di DNA
in presenza di un primer pur in assenza delle altre subunità
dell’oloenzima, il legame al β-clamp risulta fondamentale
per consentire la replicazione dell’intero cromosoma.
Il β clamp è un anello dimerico costituito da due protomeri,
ciascuno formato da tre domini globulari, uniti da un legame
testa-coda.
Al centro dell’anello le pareti del canale sono costituite da α
eliche cariche positivamente in grado di ospitare un
filamento di DNA a doppia elica e consentirne l'ampio
scivolamento interno.

β-clamp: una proteina ausiliaria a

forma di pinza scorrevole, che
scivola sul DNA senza mai
dissociarsi e mantenendo la Pol
associata all’innesco-stampo.

Lo scorrimento è facilitato dalla presenza di 1-2 strati di molecole

d’acqua fra proteina e DNA
 Saldatura dei Nick
Il legame fosfodiesterico fra due basi contigue appartenenti all'estremità 5' di un frammento di
Okazaki (nel quale la DNA polimerasi I ha eliminato il primer ad RNA e sintetizzato il DNA) e
l'estremità 3' del frammento di Okazaki sintetizzato successivamente viene catalizzato dalla DNA
ligasi
 Negli eucarioti la replicazione del DNA
avviene contemporaneamente a partire da multipli punti di inizio della replicazione (ne esistono da 20.000
a 50.000).
Ogni cromosoma eucarotico è una doppia elica di
DNA lineare - lunga circa 10^8 pb
La velocità di replicazione è di 2 kb/minuto = la
replicazione di un cromosoma richiederebbe in
media 35 giorni

ORI eucarioti:
-asincrone (non vengono attivate tutte
contemporaneamente)
- repliconi diversi
localizzate in siti specifici
- lunghezza variabile
- mentre i mammiferi non mostrano sequenze
consensus (caratterizzate da diverse combinazioni
di elementi di sequenza) in S. cerevisiae si trovano
invece origini di replicazione con sequenza
consenso chiamata ARS (sequenza che si replica
autonomamente) di 11 bp.
 L’estensione di una bolla di replicazione
adiacente ad un’origine e la presenza di DNA
neosintetizzato impedisce l’attivazione di un’ORI
 Complesso di pre-replicazione:
seleziona/attiva una specifica
sequenza (sito)
• Fase G1: produzione di proteine accessorie (Cdc6 e Cdt1) che legano
ORC e reclutano le elicasi della famiglia MCM.

L’attività di Chinasi
dipendenti da cicline
(CdK) influenza la
dissoluzione dell’involucro
nucleare in assenza del
quale le proteine del
complesso di pre-inizio
hanno accesso ai siti
di inizio.
Le CdK regolano la
formazione e l’attivazione
dei complessi di pre-
replicazione
 CDK fosforila le
proteine del complesso
di pre-replicazione nel
passaggio alla fase S,
blocca la formazione di
nuovi complessi di pre-
replicazione, attiva
i complessi pre-RC
già assemblati
e assicura la
replicazione soltanto
una volta per ciclo
cellulare.

In cellule non trasformate questo

meccanismo controlla il numero
delle copie di genoma replicate
DNA elicasi: anello esamerico che facilitano l'apertura del doppio
filamento utilizzando l’energia dell’ATP per separare i due filamenti della
doppia elica del DNA
RPA (Replication protein A): proteine SSB che destabilizzano la
doppia elica ed impediscono ai singoli filamenti di riappaiarsi

Legame cooperativo:
aumenta l'affinità di
legame man mano che si
legano
Fase S: Attivazione del complesso pre-RC
- i caricatori delle elicasi (Cdc6 e Cdt1)
vengono rilasciati e degradati
Su entrambi i filamenti vengono reclutate:
•la polimerasi alfa: ha attività primasica,
bassa processività e manca di attività proof-reading (viene
implicata soltanto nelle fasi iniziali)

•Le polimerasi delta ed epsilon hanno

alta processività (interagiscono con la PCNA = pinza beta)
ed attività di proof-reading sono quindi coinvolte nella
replicazione delle due eliche stampo

•la pinza beta PCNA e il posizionatore della pinza (RF-C)

: In presenza di ATP, RFC (il “caricatore della pinza”) apre
l’anello del PCNA, passa il DNA dentro l’anello e lo richiude.
Le DNA polimerasi eucariotiche
(•pol γ (replicazione e riparazione del DNA mitocondriale) Riparazione ad alta fedeltà
• pol β e pol η Riparazione incline all’errore
•pol ζ, pol θ, pol ι, pol κ, pol λ, pol µ, pol v)

• pol α (innesco della sintesi del DNA durante la replicazione e la

riparazione) :

Negli eucarioti, l’RNA primer è sintetizzato dalla DNA polimerasi α e

dalla sua attività primasica associata (pol α /primasi): 10 nt di RNA
seguiti poi da 20-30 basi di DNA.
(in E.coli la primasi era una RNA polimerasi)

• pol δ (replicazione del DNA del filamento leader durante la

replicazione e la riparazione) :
Sul filamento leader è reclutata la DNA polimerasi δ e la sintesi è
continua
• pol ε (replicazione del DNA del filamento ritardato durante la
replicazione e la riparazione):
Sul filamento ritardato è reclutata la DNA polimerasi ε. Sono richiesti
cicli ripetuti di passaggi dalla DNA polimerasi α alla DNA polimerasi ε
ogni volta che si inizia un filamento di Okazaki.
 La DNA polimerasi corregge il proprio lavoro man mano
che sintetizza il DNA: attività esonucleasica di correzione di
bozze (funzione assente nella pol-a)
• L'estremità 3’ del nuovo filamento resta nel sito attivo della polimerasi fino a che vengono
aggiunti nucleotidi corretti.
• L’incorporazione di una base male appaiata provoca la fusione del DNA a doppia elica di nuova
formazione. La polimerasi fa una pausa e l’estremità 3’ del nuovo filamento è trasferita al dominio
esonucleasico, dove la base male appaiata viene escissa e rilasciata come dNMP.
Scambio delle
polimerasi
Il PCNA (antigene nucleare delle cellule
proliferanti ) agisce da “pinza scorrevole” in
grado di:
 permettere alla polimerasi di lasciare e
riprendere la presa, impedendone il
distacco
 posiziona rapidamente la polimerasi ad
ogni nuovo filamento di Okazaki sul
filamento ritardato
 aumenta la processività delle DNA
polimerasi: favorisce lo scambio delle
polimerasi da quella meno processiva alla
più processiva
Caricatore della pinza e
PCNA
In presenza di ATP, RFC (il “caricatore della
pinza”) apre l’anello del PCNA, passa il DNA
dentro l’anello e lo richiude.

Si dissolve ogni volta che la pinza è caricata sul

DNA.

Sul filamento ritardato il caricatore della pinza

rimane in forcella di replicazione vicino alla
polimerasi, pronto ad assemblare una nuova
pinza all’inizio di ogni nuovo filamento di
Okazaki
Processivita' della DNA polimerasi
Corrisponde al numero di basi aggiunte al secondo ed
influenza la catalisi che è un evento rapido (1000 basi /s nei
batteri):

•Non dipende dalla velocità di sintesi (che è sempre la stessa

(1 base/ms)), ma dalla diversa probabilità di distacco della
DNA Pol dallo stampo, in quanto la velocità di (ri)
complessazione è il passaggio più lento (1 / s).
•dipende dalla facilità di scorrimento della DNA polimerasi
sul DNA: avviene in modo sequenza-indipendente, grazie
alle interazioni elettrostatiche fosfati- pollice e solco minore-
palmo.
L’incorporazione di una base provoca un parziale rilascio
dell’enzima (rottura dei legami a H nel solco minore), che
permette un rapido avanzamento di una bp.
•è fortemente aumentata dall’interazione fra la DNA Pol e una
proteina a forma di anello, che circonda il DNA durante la
sintesi.
 Ruolo dell'endonucleasi FEN-1:
mantenimento dell'accuratezza
della replicazione
 Si associa al complesso della DNA polimerasi delta al 3'
di ciascun frammento di Okazaki
 Non riesce a degradare il primer ad RNA del
frammento adiacente a partire dall'estremità 5'
occupata da un gruppo 5' trifosfato
 La DNA pol delta scosta il frammento di Okazaki
mentre estende il frammento di Okazaki adiacente
 Fen1 riesce a tagliare nel punto di ramificazione
(attività endonucleasica 5'-3' che rompe il legame
fosfodiesterico tra ribonucleotide e
desossiribonucleotide)

Probabilmente tutto il DNA sintetizzato (non solo il primer)

dalla DNA pol alfa (che manca dell'attività di correzione di
bozze 3'-5') verrebbe in questo modo eliminato, lasciando
che sia la polimerasi delta a risintetizzare il DNA copiando
fedelmente lo stampo.
Telomeri: regioni terminali del cromosoma caratterizzati da DNA altamente
ripetuto, che non codifica per alcun prodotto proteico: copie multiple di una breve
ripetizione (es- eucarioti superiori 5'-TTAGGG-3') presenti in poche centinaia di
copie come ripetizioni in tandem a ciascuna estremità di ogni cromosoma.
La presenza del DNA telomerico impedisce che ad ogni ciclo di
replicazione ci sia perdita di informazione genetica.

PROBLEMA: La DNA polimerasi non è in grado di replicare il

cromosoma fino alla sua terminazione sul filamento lagging – in ritardo:
1) Se la posizione del sito di innesco per l'ultimo frammento di Okazaki
si trova oltre la fine dello stampo, l'estremità 3' del filamento lagging
potrebbe non essere copiata (ad ogni ciclo di replicazione la copia del
filamento lagging risulta sempre più corta)
2)Se il primer dell'ultimo frammento di Okazaki è posto all'estermità 3'
del filamento lagging non ci sarà nessun filamento adiacente che
consentirà di continuare la replicazione del DNA scalzando questo
innesco di RNA primer. La perdita di informazione sarà ridotta perché
relativa solamente all'innesco.
1) L'ultimo frammento di Okazaki non può essere
L'ultimo frammento di
innescato Okazaki dovrebbe
I frammenti di Okazaki sono sintetizzati sul filamento lagging a una essere innescato oltre la
distanza di 200 pb l'uno dall'altro. Se non c'è questo spazio non c'è terminazione.
posto per un altro sito di innesco e quindi il segmento mancante del
primer non verrà copiato:
La molecola figlia avrà un'estremità 3'
sporgente e quando verrà a sua volta
replicata darà origine a una molecola più
corta rispetto a quella di origine.
 2)Il primer per l'ultimo
frammento di Okazaki è
all'estremità 3' del filamento
lagging
Il primer ad RNA dell'ultimo frammento di
Okazaki potrebbe posizionarsi esattamente
all'estremità 3' del filamento lagging: mentre tutti
gli altri inneschi sul filamento lagging vengono
rimossi e duplicati per effetto dello spostamento
della DNA polimerasi che stava duplicando un
frammento adiacente, l'ultimo innesco ad RNA
non potrebbe essere sostituito da DNA.
Anche in questo caso la molecola figlia
risulterebbe accorciata.
 L'enzima Telomerasi
estende i Telomeri
La telomerasi è un complesso RNA-
proteina in cui:
- la parte enzimatica è una reverse
trascriptase: enzima che polimerizza DNA
utilizzando uno stampo ad RNA
- l'RNA di 9 basi: 3’-AAT-CCC-AAT-5’, si ̀
appaia alla sequenza telomerica 5’-TTA-GGG-
3’, con formazione di un innesco stampo
- l'attività RNA:DNA elicasica permette lo
scivolamento dell'enzima sullo stampo che
permette la replicazione ripetuta del DNA
telomerico
 Strutture del DNA
telomerico
Questa sequenza di nucleotidi che è
caratteristica dei vertebrati può variare in
diverse specie di organismi ma la peculiarità è la
presenza di blocchi di guanine sul filamento
terminante al 3’ (e quindi di citosine sul
complementare).

L'estremità 3' sporgente forma una struttura

secondaria a forma di loop che protegge
l'estremità dei cromosomi.

La Telomerasi è una polimerasi specializzata per

aggiungere alle estremità cromosomiche
blocchi ripetuti della sequenza telomerica
consentendo all'apparato replicativo di copiare
tutta l'informazione genetica.
Regolazione della
sintesi del DNA
telomerico
L'attività della telomerasi viene controllata
affinchè ciascuna estremità dei cromosomi
venga estesa per una lunghezza appropriata:
 La proteina TRF1 lega le ripetizioni
telomeriche ed induce la formazione di una
struttura ripiegata che impedisce l'accesso
alla Telomerasi.
 Quando il telomero si accorcia diminuisce la
quantità di proteine TRF1 legate, la cromatina
si apre e la telomerasi può avere accesso
 Man mano che la telomerasi permette
l'allungamento dei telomeri le proteine TRF1
si riattaccano inducendo la formazione del
loop: si innesca così un segnale di feedback
negativo ovvero un circuito autoregolativo
negativo
Replicazione dei
telomeri da parte
della Telomerasi
1) la telomerasi riconosce il sito di inizio per la replicazione dei telomeri
grazie alla presenza di un RNA endogeno di 9 basi 9 basi: 3’-AAT-CCC-
AAT-5’
2) una porzione di questo RNA facente parte della nucleoproteina
telomerasi si appaia complementarmente alla sequenza telomerica 5’-
TTAGGG-3’ che funge da primer per la sintesi del DNA telomerico
3) una seconda parte dell'RNA della telomerasi funge da stampo per
la replicazione della sequenza telomerica

Il filamento 3’ allungato dalla telomerasi viene usato come stampo dal

normale apparato replicativo per la sintesi di ulteriori frammenti di
Okazaki: il risultato è che il DNA cromosomale non si accorcia.
 Attività RNA:DNA elicasica : scivolamento
della telomerasi e sintesi del filamento
ricco in GGG
 Il filamento ricco in CCC viene sintetizzato
dal normale apparato replicativo: viene
innescato con un primer ad RNA ed
allungato dalla DNA polimerasi
 Il filamento ricco in CCC risulterà
comunque mancante di una estremità
(quella equivalente al suo innnesco ad
RNA): ma la cosa importante è che questa
perdita non è relativa al DNA
cromosomale ricco di informazione
genetica, si tratta di DNA telomerico
ripetitivo che non codifica per alcun
prodotto proteico.
Telomeri, senescenza e cancro
• La telomerasi non è attiva in tutte le cellule di mammifero: l'enzima è
funzionale nello stadio precoce di sviluppo dell'embrione – dopo la nascita
è attivo solo nelle cellule riproduttive e nelle cellule staminali (cellule
progenitrici che continuano a divisersi durante tutta la vita di un
oganismo permettendo il mantenimento degli organi e la funzionalità dei
tessuti.
• Le cellule che mancano di attività telomerasica subiscono un accorciamento
dei cromosomi ad ogni divisione cellulare fino al punto di perdere geni
essenziali.
• La presenza di ripetizioni terminali che fungano da siti di attacco delle
proteine TFR è necessaria per formare un "cappuccio" protettivo alle
estremità dei cromosomi: le estremità non protette vengono erroneamente
unite da enzimi coinvolti nei meccanismi di riparazione del DNA
L'accorciamento dei telomeri
e la senescenza cellulare
• La senescenza si osserva nelle linee cellulari: normali
cellule messe in coltura hanno una vita limitata – dopo
un certo numero di divisioni le cellule entrano in uno
stato senescente in cui rimangono vive ma non possono
dividersi (il ciclo cellulare sarebbe deregolato-quindi
viene bloccato).
• Con alcune linee cellulari di mammifero (es. Fibroblasti –
tessuto connettivo) la senescenza può essere ritardata
modificando geneticamente le cellule in modo che
continuino a sintetizzare una telomerasi attiva e
funzionale.
• La Discheratosi congenità è una malattia legata
all'invecchiamento cellulare precoce causata da
mutazioni nel gene che specifica la sequenza ad RNA
della telomerasi o in geni che regolano l'espressione
della telomerasi – meno telomerasi =telomeri
progressivamente più corti = invecchiamento precoce
• Approccio terapeutico: riattivando la telomerasi ed
allungando i telomeri è possibile ringiovanire le cellule
del paziente in vitro.

https://penntoday.upenn.edu/news/penn-team-identifies-
strategy-reverse-disease-dyskeratosis-congenita
 La riattivazione della telomerasi ed il tumore
• Le cellule tumorali sono in grado di
dividersi indefinitamente: nelle linee
cellulari tumorali in coltura e nel cancro in
un organismo la telomerasi è iperattiva -
i telomeri diventano più lunghi del normale
- causa o effetto del tumore?
• Approccio terapeutico: la telomerasi diventa
il bersaglio farmacologico – l'inattivazione
causata dal trattamento indurrebbe la
senescenza delle cellule tumorali,
prevenendo la proliferazione incontrollata

https://www.abbviepro.com/it/it/oncology/hemat
ology/beclose2hematology/Wave1.html
 Mutabilità e
riparazione del DNA
 Un basso tasso di mutazione è un requisito
essenziale per il mantenimento del materiale
genetico.
Il tasso di errore è di 1 nucleotide errato su
10 7 incorporati.

Se la frequenza di mutazione fosse

troppo alta, l'incidenza tumorale
sarebbe catastrofica e non compatibile
con la vita.
Se invece il materiale genetico
venisse trasmesso con assoluta fedeltà
verrebbe a mancare quella variabilità
genetica necessaria all'evoluzione e per la
comparsa di nuove specie.
 Mutazione
La struttura del DNA è la base della trasmissione dei caratteri
ereditari: la sua stabilità garantisce la conservazione
dell'informazione iniziale, mentre la sua instabilità determina
delle modificazioni note come mutazioni.
Le mutazioni possono essere il risultato di:
• un attacco da parte di un agente esterno (mutazioni
indotte da agenti mutageni)
• errori che si verificano casualmente
(mutazioni spontanee):
• nel processo di duplicazione del DNA (3 miliardi di
coppie di basi devono essere replicate ad ogni
divisione cellulare, in un periodo di 2-3 ore. Con una
velocità di circa 100.000 bp/sec. Avvengono
casualmente degli errori) o durante i processi cellulari
di:
 Ricombinazione Processo fondamentale per generare
“diversità biologica”, a causa della struttura di
particolari regioni genomiche, è un’altra fonte di
possibili errori.
 Segregazione Processo finale della mitosi e della
meiosi. Possono avvenire casualmente degli errori che
portano ad una errata ripartizione dei cromosomi
 Ruolo delle
mutazioni
Le mutazioni spontanee (es. l'appaiamento non corretto
di due basi azotate durante la replicazione), hanno
un ruolo importante in fenomeni biologici quali:
 l'evoluzione -> gli alleli cioè le forme alternative di
uno stesso gene presentano una o più
differenze nella sequenza del DNA e possono
pertanto codificare per varianti di una
stessa proteina, con conseguente ampliamento
delle funzionalità cellulari e delle capacità
di adattamento di un organismo (variabilità)
 La cancerogenesi
 L'invecchiamento
 Malattie autoimmuni e neurodegenerative
Classificazione delle mutazioni
In base a :
 Tipo cellulare da cui hanno origine:
 Mutazioni somatiche: compaiono nelle cellule somatiche (non
destinate alla riproduzione gamica) perciò sono visibili
direttamente nell'individuo in cui si sviluppano: possono avere
effetti sul fenotipo. Si trasmettono solo alla progenie cellulare di
quella cellula. Non sono ereditabili/trasmissibili: scompaiono con
la morte dell'individuo.
 Mutazioni ereditarie: colpiscono le cellule sessuali quindi
modificano il patrimonio genetico trasmesso dal gamete in cui è
avvenuta la mutazione. La mutazione è ereditata da tutte le cellule
figlie e può manifestarsi quindi nella progenie.
Classificazione delle
mutazioni
In base a :
 Causa: spontanee o indotte da agenti mutageni
chimici o fisici
 Estensione della regione colpita:
 Mutazioni geniche (o puntiformi): sostituzione,
inserzione o delezione di una singola base
nucleotidica = SNP single nucleotide
polymorphism
 Mutazioni cromosomiche: causano un
cambiamento nella struttura dei cromosomi
 Delezione
 Duplicazione
 Inversione
 traslocazione
 Mutazioni genomiche
 Il codice genetico
La sequenza di basi del DNA dirige la
produzione degli RNA (trascrizione) e delle
proteine (traduzione) che determinano le
funzioni cellulari e definiscono l'identità
cellulare.
L'informazione genetica viene trasferita dalla
sequenza lineare della catena
polinucleotidica, formata da un alfabeto di 4
lettere, al linguaggio di 20 amminoacidi
della catena polipeptidica.
Il codice genetico è un codice a triplette,
dette "codoni": ogni tripletta è composta da
una sequenza di tre basi azotate dell’RNA
messaggero (mRNA) e codifica per uno
specifico amminoacido.
La traduzione dell'informazione genetica
In ciascuna posizione della tripletta (codone nell'mRNA) si può
in sequenze amminoacidiche avviene sui trovare uno dei 4 nucleotidi = combinazioni possibili = 4x4x4 = 64
ribosomi ed è mediata da TransferRNA (t- permutazioni
RNA) che riconoscono sull'mRNA gruppi di 3
nucleotidi consecutivi (codoni).
 Traduzione delle
proteine ed ipotesi del
vacillamento del tRNA
L’informazione dell’mRNA è decodificata dall'appaiamento
dei codoni sull'mRNA con gli anticodoni del tRNA a cui è
legato uno specifico ammonoacido.
Il numero di tRNA è inferiore ai 61 codoni di senso – quindi non
c'è un tRNA per ogni codone:

 Crick propose che uno stesso tRNA potesse riconoscere più

di un codone e avanzò l’ipotesi del vacillamento (wobble)
della terza base: le somiglianze maggiori tra i codoni che
specificano per uno stesso aminoacido risiedono nei primi
due nucleotidi, mentre il terzo nucleotide può eventualmente
cambiare cioè presenta variabilità. (Es., i 16 codoni che
terminano per U: se U è sostituito da C, viene specificato lo
stesso aminoacido. Similmente, un cambiamento tra A e G
sulla terza base, non ha effetti sulla codificazione
dell’aminoacido).

 L’ipotesi del vacillamento suggerisce che mentre i requisiti

sterici tra l’anticodone e il codone sono molto forti nelle
prime due posizioni, essi sono più flessibili per la terza
posizione; questa caratteristica permette un appaiamento
delle basi meno preciso in quest’ultima. Come risultato, due
codoni che specificano per lo stesso aa possono essere
riconosciuti dallo stesso tRNA.
 Il codice genetico
 Universale -> ciascun amminoacido è codificato
dalle stesse triplette in ogni organismo vivente e
in tutti gli organismi studiati, dai virus all'uomo,
non è stata raccolta alcuna prova di qualche
modificazione evolutiva nel significato dei 64
codoni possibili
 Ridondante/degenerato -> molti amminoacidi
sono codificati da triplette diverse. Le triplette
che codificano lo stesso amminoacido sono in
genere molto simili, differiscono solo per l’ultima
delle tre basi e sono anche detti "codoni
sinonimi".
 Si è evoluto per rendere minimi gli
effetti deleteri delle mutazioni -> la
ridondanza del codice genetico lo rende meno
vulnerabile alle mutazioni casuali: un codone
quattro volte ridondante (in cui qualsiasi
nucleotide nella terza posizione codifica lo
stesso amminoacido) può subire qualsiasi
mutazione alla sua terza posizione senza che
l’amminoacido da esso espresso (e di
conseguenza la proteina sintetizzata) cambi.
La vita e la biodiversità dipendono da un giusto equilibrio tra
l'insorgenza di nuove mutazioni e la capacità di ripararle
In tabella vediamo le 64
permutazioni del codice genetico:
61/64 codificano per un
amminoacido; 3 codoni sono
segnali di terminazione della catena
polipeptidica.

Molti amminoacidi vengono

specificati da più di un codone: la
presenza di certi cambiamenti di
sequenza all'interno della tripletta è
tollerata = viene codificato lo stesso
amminoacido.
Il codice genetico si è evoluto per
rendere minimi gli effetti deleteri
delle mutazioni
Il codice genetico:
universale e
degenerato
Il codice genetico si è
evoluto per rendere minimi
gli effetti deleteri delle
mutazioni:

 Le mutazioni della prima

posizione portano a
specificare un
amminoacido simile
Dato che le transizioni da A:T a G:C o da G:C ad A:T
sono il tipo più comune di mutazione puntiforme ad una
variazione nella seconda posizione corrisponderà la
sostituzione di un amminoacido con un altro di
caratteristiche simili:
• I codoni con pirimidine (C,U) nella seconda posizione
spesso codificano per amminoacidi idrofobici
Dato che le transizioni da A:T a G:C o da
G:C ad A:T sono il tipo più comune di
mutazione puntiforme ad una variazione
nella seconda posizione
corrisponderà la sostituzione di un
amminoacido con un altro di
caratteristiche simili:

I codoni con purine

(G,A) nella seconda
posizione
spesso corrispondono
ad amminoacidi polari
• Quando le prime due posizioni
del codone sono entrambe
occupate da G o C qualunque sia
uno dei 4 nucleotidi nella terza
posizione sarà specificato lo stesso
amminoacido (prolina alanina
arginina o glicina) -> differenze
(alterazioni)
nell'appaiamento della terza base
sono più tollerate]
Ciò è probabilmente dovuto al fatto
che l'interazione fra la coppia di
basi GC è forte = determina cioè
una specificità di sequenza
stabile: se le prime due basi
formano degli appaiamenti forti
CG, differenze (alterazioni)
nell'appaiamento della terza base
sono più tollerate.
L'interazione fra la coppia di
basi AT è meno forte (l'errore di
lettura rischia di essere maggiore).
• Al fine di ridurre al minimo
gli errori di lettura, quando le
prime due posizioni sono
occupate da A o da U, il terzo
nucleotide determina una
differenza = una alterazione
nel terzo nucleotide di per sè
non è tollerato= specifica un
amminoacido diverso spesso
con caratteristiche simili.
L'attribuzione di un potenziale effetto Primo approccio allo
cancerogeno a una sostanza
chimica richiede molto tempo e denaro.
Si effettua preliminarmente agli studi in vivo,
studio dell'effetto delle
un test in vitro partendo dal presupposto
per cui la maggior parte degli agenti
mutazioni: Test di Ames
cancerogeni ha la capacità di causare
mutazioni (alterazioni dell'informazione
genetica).

Il test di Ames analizza la capacità delle

sostanze chimiche di indurre mutazioni
nel batterio Salmonella typhimurium –
ceppo mutato – contiene
una mutazione missenso o
un frameshift (variazione del modulo di
lettura) in uno dei
geni necessari alla biosintesi
dell'amminoacido istidina = le cellule
batteriche non riescono a crescere su un
terreno privo di istidina.
 Test di Ames
Le cellule vengono trattate con differenti sostanze
chimiche oggetto di studio (delle quali se ne voglia
saggiare l'effetto mutageno):
Una o più di queste sostanze possono indurre
mutazioni tali da far recuperare al batterio la
capacità di crescere su un terreno di istidina.
Si osserva la crescita di alcune colonie in cui il tipo di
mutazione indotta dalla sostanza chimica ha
causato una reversione della mutazione originale.
Maggiore è il numero delle colonie revertanti e
maggiore è il potenziale mutageno della sostanza
in esame.
Alcune sostanze chimiche che causano il cancro
all'inizio non sono mutagene – dopo essere state
Le sostanze che risultano positive al test
metabolizzate nel fegato acquistano proprietà
di Ames (cioè causano mutazioni che
mutagene => nel test di Ames si trattano le
rendono i batteri capaci di vivere in un
sostanze in analisi con una miscela di enzimi epatici
terreno privo di istidina) vengono poi
in modo da mimare il metabolismo del fegato.
testate sugli animali.
 Gli effetti delle mutazioni
 Diretti -> conoscendo la struttura e l'espressione del gene è possibile prevedere l'effetto di una mutazione sul
funzionamento del genoma:
 non ha alcun effetto sul funzionamento del genoma -> le mutazioni silenti sono localizzate nel DNA intergenico e nelle
regioni non codificanti dei geni (circa il 95% del genoma umano)
 può dar luogo ad un un cambiamento sinonimo quando il nuovo codone codifica lo stesso amminoacido del codone
originale – quindi il gene mutato codifica la stessa proteina del gene non mutato
 Gli effetti delle mutazioni
 Può dar luogo ad un cambiamento non sinonimo o mutazione missenso quando il codone alterato codifica un amminoacido diverso
il quale può causare cambiamenti conformazionali e quindi anche funzionali all'interno della proteina (la maggior parte delle proteine
può tollerare un piccolo numero di cambiamenti amminoacidici senza effetti visibili sulla funzionalità)
 Può interrompere prematuramente la catena polipeptidica quando un codone codificante viene convertito in un codone di stop: la
mutazione nonsenso produce una proteina tronca che solitamente non è funzionale (dipende dalla lunghezza del tratto
di polipeptdie che viene a mancare)

Normale
traduzione
 Gli effetti delle mutazioni
 Può convertire un codone di stop in un codone codificante per un amminoacido: la proteina risulta più lunga per effetto
della prosecuzione della lettura oltre il segnale di terminazione (readthrough), potrebbero esserci difficoltà nel ripiegamento e
quindi si osserva una riduzione dell'attività.

Readthrough
->

Normale codone di STOP

Proteina più lunga mal ripiegata

Proteina normale

 Può causare un frameshift o

scivolamento della fase di lettura
quando avvengono inserzioni o delezioni
di uno o più amminoacidi
 Errori spontanei della replicazione: Mismatch o errori di appaiamento

La tautomeria cheto-enolica e quella amino-iminica delle basi azotate a

seguito di spostamenti elettronici altera l'accoppiamento delle basi:

 La forma aminica (normale) dell'adenina si appaia con la timina, la forma

iminica (rara) si appaia con la citosina
Forma aminica Forma iminica  il tautomero chetonico (normale) della timina si accoppia con l'adenina,
mentre quello enolico (raro) si accoppia con la guanina

2) Il filamento di neo-sintesi contiene un

mismatch -la guanina- che va corretto
Forma chetonica Forma enolica

3) Il tautomero raro della timina torna al suo stato normale e si

appaia correttamente con l'adenina in una delle molecole figlie

4) La guanina rappresenta il mismatch

cioè l'appaiamento non corretto
Forma chetonica Forma enolica

1) L'enol-timina nel filamento 5) Se il mismatch non è corretto nella

stampo si appaia con la guanina doppia elica figlia del primo ciclo di
Forma aminica Forma iminica
replicazione, una delle molecole prodotte
porterà una versione permanente della
mutazione su entrambi i filamenti
Il danno al DNA può
presentarsi come:

1)cambiamenti di singole
basi,

2)distorsione strutturale,

3) danno all'ossatura del

DNA
Tipi di mutazioni (cambiamenti
nella sequenza nucleotidica di
una breve regione del genoma)
• Mutazioni puntiformi: sostituzione di un
nucleotide con un altro
 4 Transizioni (più frequenti): cambiamento
di una purina con un'altra purina
(A>G;G>A) o di una pirimidina con un'altra
pirimidina (C>T;T>C)
 8 Trasversioni: cambiamento di una purina
con una pirimidina o di una pirimidina con
una purina (A>C; C>A; A;T; T>A;
G>C;C>G;G>T;T>G)
 Fedeltà del meccanismo di replicazione e correzione degli
errori spontanei
L'appaiamento tra le basi complementari di per sé non è particolarmente preciso: il tasso di
errore della reazione chimica di sintesi del DNA-templato dipendente senza l'ausilio di enzimi (che
non avviene spontaneamente in provetta) sarebbe del 5-10% (5-10 nucleotidi sarebbero mutati ogni
100 posizioni) -> tasso inaccettabile per la replicazione del genoma.
Migliorano la fedeltà del meccanismo di
replicazione i meccanismi di:
1) discriminazione del nucleotide errato
2) proof-reading: attività esonucleasica 3'-5' di
correzione di bozze -> tasso di errore grazie ai
meccanismi della DNA-polimerasi = 1 errore ogni
107
Gli eventi di tautomeria delle basi azotate
causano un errato appaiamento fra le basi anche se
la DNA polimerasi "sembra" aggiungere il
nucleotide "corretto".
Il tasso di errore complessivo della replicazione di E.coli è solo di 1 errore ogni 1010/1011 grazie al
sistema di riparazione dei Mismatch che esamina il DNA neosintetizzato alla ricerca di basi
male appaiate e corregge gli errori.
 Sistemi di
Riparazione del
DNA
I meccanismi di riparazione del danno al
DNA si sono evoluti per correggere le
alterazioni del DNA e ripristinare
l'informazione di sequenza originale
anche detta "wild type". I difetti nei geni
codificanti le proteine che agiscono nei
meccanismi di riparazione caratterizzano
un fenotipo cellulare che sta alla base
della neurodegenerazione, della
carcinogenesi (trasformazione cellulare) e
dell'invecchiamento.
 Attivazione dei meccanismi di risposta al danno
La cellula che subisce un danno al
DNA può attivare 3 processi:
- fedele correzione del danno
- blocco della replicazione del DNA e
morte cellulare
- replicazione/correzione a bassa
fedeltà del DNA danneggiato
(preferendo la mutagenesi alla morte
cellulare) => inattivazione dei geni
oncosoppressori, attivazione
degli oncogeni ed innesco del
processo di carcinogenesi.

https://www.sciencedirect.com/science
/article/pii/S0002929719302307
 Le mutazioni possono derivare anche da effetti dannosi dei mutageni – agenti
di natura chimica o fisica a cui il DNA è costantemente esposto (di natura endogena o
esterni), che reagiscono con il DNA e ne cambiano la struttura:
 Radiazione di fondo: radiazioni ultraviolette (UV) e radiazioni ionizzanti (IR). Mentre gli UV-C sono assorbiti dall'atmosfera, le
radiazioni UV-A ed UV-B causano fotolesioni alterando la struttura dell'elica del DNA e sono alla base dello sviluppo del melanoma.
Le radiazioni con lunghezza d'onda pari a 260nm sono fortemente assorbite dalle basi: ne deriva la fusione fotochimica di due
pirimidine che occupano posizioni adiacenti sulla stessa catena polinucleotidica.
 La fusione di due timine consecutive porta alla generazione del dimero di timina: forma molecolare che consiste in un anello ciclobutanico
generato dai legami tra gli atomi di carbonio 5 e 6 delle timine adiacenti.
 La fusione della timina adiacente ad una citosina porta ad un addotto timina-citosina in cui il carbonio 6 della timina è legato al carbonio 4 della
citosina.

 Queste basi dimerizzate sono incapaci di formare

legami ad H con le basi complmentari e portano la DNA
polimerasi ad arrestarsi durante la replicazione.

 Le radiazioni gamma ed i raggi X (radiazioni ionizzanti) producono rotture a doppio filamento nel DNA, difficili da riparare.

Questo tipo di radiazioni:

 attaccano direttamente il desossiribosio dello scheletro del DNA

 Agiscono in maniera indiretta generando le specie reattive dell'ossigeno.

 Sfruttando la loro natura clastogena (in grado di generare rotture) le radiazioni ionizzanti ed i farmaci come la bleomicina che
provocano rotture del DNA, vengono utilizzate come antitumorali per uccidere le cellule caratterizzate da elevata proliferazione –
le cellule devono possedere cromosomi intatti per replicare il proprio genoma ed andare avanti nel ciclo cellulare-.
La fotoriattivazione
è un sistema di riparazione diretto del danno al DNA: in E. coli il meccanismo coinvolge la DNA fotoliasi che
cattura dal sole l'energia necessaria per rompere i legami covalenti che uniscono pirimidine adiacenti (dimeri
di Timina)
Le radiazioni o i mutageni chimici possono provocare
la rottura della doppia elica: le due estremità Double Strand Break
libere vengono legate dalle elicasi KU con lo scopo
di cercare zone di micro-omologia e creare due
giunzioni innesco-stampo usate da una DNA-
polimerasi per ristabilire la continuità. Ciò
comporta, in ogni caso, delezione di alcune basi,
con spostamento della griglia di lettura (mutazione
di frame-shift) che, se fondamentali, inducono un
grave danno fenotipico. Questo meccanismo nei
mammiferi si chiama NHEJ/ Non Homologus
Ended Joining.
A questo proposito, esiste anche un altro meccanismo
di riparazione simile, definito HR/ Homologus
Recombination riguardante le cellule diploidi. Si
basa sul ricopiare le informazioni dall’allele
normale su quello in cui è presente un DSB, tramite
un fenomeno di ibridazione e ricombinazione.
NHEJ/
Non Homologus
Ended Joining
RICOMBINAZIONE OMOLOGA:
 La fosforilazione di ATM ne aumenta l'attività chinasica: fosforila
ed attiva le proteine coinvolte nella riparazione del DNA (BRCA1) e
nel controllo del ciclo cellulare (p53; proteina che sopprime i tumori).
 Presso i siri di rottura si localizzano il complesso MRN - Mre11
esonucleasi 3'-5'-Rad52-Nbs1-
 Rad 51 riconosce il DNA a singolo filamento
 Rad54, Rad55, Rad57, BRCA1 e BRCA2 sono coinvolte nella
ricombinazione omologa
 Alcune condizioni endogene di stress possono favorire la sintesi nella cellula di
sostanze chimiche come i perossidi che agiscono come mutageni diretti.
 ROS – specie reattive dell'ossigeno e radicali libeli prodotte dalla respirazione cellulare mitocondriale e dalle reazioni di Fenton a
base di metalli : superossido, perossido di idrogeno, radicali iodrossilici, ossigeno singoletto possono ossidare le basi azotate e/o
legarsi all'anello del desossiribosio causando rotture a singolo filamento nel DNA => la produzione di 8-ossi-guanina è un
esempio di modificazione ossidativa della base azotata – 8oxoG è utilizzato come biomarcatore dello stress ossidativo.
 Altri agenti che possono provocare mutazioni nel DNA
 Genotossine endogene metaboliche prodotte dai ROS endogeni -
la perossidazione dei lipidi produce malondialdeide che reagisce con le basi azotate del DNA e forma degli
addotti voluminosi che bloccano la replicazione o la trascrizione ; la perossidazione degli acidi grassi polinsaturi nelle
membrane cellulari genera un'aldeide che reagisce con tutte e 4 le basi azotate in particolare con la guanina.

 Agenti chimici ambientali ed Agenti deaminanti (Acido nitroso e bisolfito di sodio)

 Paraddossalmente anche l'acqua può provocare mutazioni spontanee nel DNA – il danno idrolitico genera la
deamminazione delle basi (la citosina dà uracile che normalmente non è una base naturale del DNA) oppure la
depurinazione (la guanina in seguito all'idrolisi spontanea del legame N-glicosidico genera nel DNA un sito senza
base). Diversamente dagli errori di replicazione le reazioni idrolitiche portano a modificazioni non naturali del DNA.
 Analoghi delle basi vengono utilizzati erroneamente come substrati durante la sintesi di un nuovo filamento

l 5-bromouracile è un analogo della Timina e si può sostituire ad essa appaiandosi all'adenina.

• L'effetto mutageno insorge perché la forma enolica è maggiormente presente e si appaia con G piuttosto che con A
dando origine ad una mutazione puntiforme.
I mutageni causano mutazioni:
 Interagendo direttamente con il
DNA causandone un cambiamento
strutturale – alterazione strutturale del
nucleotide che ne influenza la capacità di
appaiamento

Sebbene la rimozione di un gruppo

amminico per idrolisi avvenga
spontaneamente il tasso
di deaminazione di adenina,
citosina e guanina è aumentato
dall'acido nitroso e dal bisolfito
di sodio che agisce solo sulla
citosina:
La deaminazione dell'adenina produce ipoxantina che si appaia con C anziché con T;

la citosina dà uracile;
la guanina porta alla produzione di xantina la quale non dà effetto mutageno bensì blocca la
replicazione;

la timina non ha il gruppo amminico e quindi non può essere deaminata

I due principali meccanismi di riparazione del
DNA danneggiato sono:
A) (BER) Riparazione per escissione di basi (l'enzima glicosilasi riconosce e rimuove la
base danneggiata idrolizzando il legame glicosidico tra la base danneggiata e lo
zucchero)
Le cellule sono dotate di diversi enzimi glicosilasi – ognuno riconosce una lesione
specifica – la specificità delle diverse glicosilasi determina la gamma di nucleotidi che
possono essere riparati dal meccanismo di escissione di basi [riparazione di basi
deaminate come l'uracile (citosina deaminata), l'ipoxantina (adenina deaminata), basi
metilate come la 3-metil-adenina, 7-metil-guanina, 2-metil-citosina]
La DNA glicosilasi è in grado di scorrere lungo il solco minore del DNA: grazie
all'incredibile flessibilità del DNA la base danneggiata è ribaltata all'esterno della
doppia elica e diventa substrato del sito attivo dell'enzima:
- la glicosilasi specifica per riconoscere sul filamento stampo l'Oxo G (prodotta
dall'ossidazione della guanina) elimina l'adenina erroneamente appaia sul nuovo
filamento – l'adenina in sé non è danneggiata ma viene riconosciuta come l'elemento
da eliminare perché è la glicosilasi che riconosce l'Oxo G come l'effetto del danno
ossidativo sulla guanina;
-l'uracil glicosilasi è specifica per riconoscere l'uracile che si è formato
per deamminazione della citosina

B) (NER) Riparazione per escissione di nucleotidi (non riconoscono alcuna particolare

lesione ma riconosce solo delle distorsioni della conformazione della doppia elica
come quelle causate dal dimero di timina o dalla presenza su una base di un grosso
addotto chimico)
L'uracil glicosilasi :
1) idrolizza il legame glicosidico
che permette la rimozione
dell'uracile, lascia un sito AP
(apurinico oppure apirimidinico
in base al tipo di base rimossa)
2) l'endonucleasi AP taglia lo
scheletro del DNA in posizione 5'
rispetto al sito AP lasciando
un'estremità 3'-OH;
l'esonucleasi taglia al 3' del sito
AP lasciando un 5'-fosfato
3) l'interruzione è riempita dalla
DNA pol I (procarioti) o dalla
DNA polimerasi beta (nei
mammiferi) o delta (nel lievito).
4) La DNA ligasi catalizza il
legame fosfodiesterico alle
estremità dell'oligonucleotide di
nuova sintesi
Riparo per escissione della base negli eucarioti (C deaminate ad U
oppure Oxo-G)
Riparo per escissione di nucleotidi (NER).
Può riparare forme di danno più estreme
rispetto al BER come i legami crociati sullo
stesso filamento (crosslink) e basi
modificate da gruppi chimici ingombranti
– corregge i dimeri ciclobutilici al buio in
organismi come l'uomo che non hanno un
sistema di fotoriattivazione
1) A differenza del BER non c'è la
rimozione selettiva delle basi, il
meccanismo individua una caratteristica
più generale del danno al DNA come la
distorsione della doppia elica. Ciò
determina la rimozione di un segmento di
DNA a singolo filamento che racchiude la
lesione
2) La regione a singolo filamento viene
riempita usando l'elica non danneggiata
del DNA come stampo dalla DNA
polimerasi che ripristina la sequenza
originale
Il meccanismo di escissione di nucleotidi (NER) In E. coli coinvolge le proteine del sistema UVR:
• UvrA ed UvrB cercano distorsioni del DNA
• Il rilascio di UVrA permette ad UVrC di legarsi e formare un dimero con UvrB che apre la
doppia elica del DNA.
• UvrC taglia il DNA 8 nt a monte e UVrB taglia dopo 4 nt a valle [riparazione a tratto breve –12
nucleotidi- "short patch" - esiste anche la riparazione "long patch" che similmente al sistema
eucariotico agisce su regioni dove sono stati modificati gruppi di nucleotidi piuttosto che singole
basi].
• L’elicasi UvrD toglie il frammento tagliato
• La DNA Pol effettua la sintesi del filamento mancante utilizzando l'altro filamento di DNA come
stampo
•La DNA ligasi salda i nick

Il meccanismo di escissione di nucleotidi negli eucarioti porta alla sostituzione di 24-29

nucleotidi e coinvolge un complesso di almeno 16 proteine tra cui TFIIH (ha attività elicasica)
uno dei componenti chiave del complesso di inizio della trascrizione associato alla RNA
polimerasi II: si tratta di un meccanismo di riparazione accoppiata alla trascrizione che ripara
alcune forme di danno in modo specifico nei geni attivamente trascritti.
La Riparazione dei Mismatch
A differenza dei meccanismi di riparazione diretta (per escissione di basi e di nucleotidi) che riconoscono ed agiscono sui danni al DNA causati dai
mutageni attraverso la ricerca di strutture anomale (nucleotidi modificati, dimeri ciclobutilici, legami crociati tra nucleotidi dello stesso filamento), il sistema
di riparazione dei mismatch corregge gli appaiamenti sbagliati che emergono da errori di replicazione della DNA polimerasi individuando l'assenza
di appaiamento dei nucleotidi.

Proof-reading post sintetico/ Mismatch Repair

(MMR) in E. coli è attuato da una serie
di proteine MUT che agiscono a livello del
filamento neo-sintetizzato, prima che esso sia
sottoposto a metilazione (meccanismo di
regolazione della trascrizione).

Mut S riconosce la presenza del Mismatch-si

chiude intorno al DNA e ne induce una curvatura
- specificità: la presenza di un mismatch rende
la struttura del DNA pù propensa alla
distorsione. Mut S recluta MutL.

MutL si inserisce nel filamento stampo in

corrispondenza di un sito metilato vicino al
mismatch e a MutS. MutL attiva MutH.

L'endonucleasi MutH forma un nick sul

filamento neo-sintetizzato tagliando un legame
fosfodiesterico, interviene l'eslicasi UVrD e a
seguire una esonucleasi eliminerà la porzione di
filamento contenente il nucleotide male
appaiato.

La DNA polimerasi III risana il gap e la ligasi,

ricostruisce la sequenza corretta.

Gli eucarioti hanno omologhi di MutS (hMSH2,

hMSH3 e hMSH6) e MutL ( hMLH1 e PMS1)
 La riparazione deve essere eseguita nel polinucleotide figlio perchè
Come avviene la discriminazione tra il f è proprio in questo filamento che si è verificato l'errore.
ilamento parentale e quello di
nuova sintesi (errato)?

In E. Coli la Dam metilasi metila

i residui di A su entrambi I filamenti
nella sequenza 5'-GATC-3' ampliamente
rappresentata lungo il genoma.
Quando passa la forca di replicazione
su questi siti metilati il filamento di
DNA neosintetizzato rimane per alcuni
minuti non metilato.
La molecola di DNA a doppio filamento
appena replicato risulta emimetilata: il
filamento figlio è marcato perchè
manca dei gruppi metilici e quindi
viene riconosciuto come il filamento da
riparare. Mut H si lega ai siti metilati
ma viene attivata solo se si attiva il
complesso MutL-MutS.
In E. coli lo stato di metilazione a livello della
sequenza GATC permette di distinguere il filamento
parentale da quello di nuova sintesi.
Mismatch Repair negli eucarioti
Sebbene le cellule eucariotiche siano
dotate di un sistema di riparazione dei
mismatch (utilizzando proteine omologhe
a quelle MUT), sono prive di MutH e del
meccanismo di emimetilazione.
Estratti di cellule eucariotiche sono in
grado di riparare i mismatch presenti su
stampi artificiali che contengono un nick-
simile all'incisione creata da MutH sul
filamento di neosintesi in E.coli- e lo
fanno selettivamente sul filamento che
porta l'incisione. Questa osservazione
suggerisce che:
 anche i nick presenti fra un
frammento di Okazaki e l'altro
possono fungere da segnali che
caratterizzano il lagging strand
(filamento discontinuo) di neosintesi.
 l'omologo umano di MutS interagisce
con il PCNA - la pinza scorrevole del
replisoma che recluta le proteine del
sistema di riparazione sul filamento
guida in via di replicazione.
Chimica della Trascrizione e differenze tra procarioti ed
eucarioti.
Peculiarità dei meccanismi di regolazione
dell'espressione genica nei batteri.
 Espressione
genica
Il DNA viene trascritto in RNA il quale funziona
da stampo per la traduzione delle proteine.
 Trascrizione e replicazione del DNA sono chimicamente ed enzimaticamente
molto simili ma ci sono delle differenze importanti:
• L'RNA polimerasi non ha bisogno di un primer (in vivo l'inizio avviene solo in certe sequenze)
• L'RNA prodotto non rimane appaiato al filamento stampo: l'enzima stacca l'RNA nascente a pochi nucleotidi di distanza dal sito di polimerizzazione
• La trascrizione è meno accurata della replicazione: viene commesso 1 errore ogni 104 nucleotidi aggiunti contro 1 errore ogni 107
• La trascrizione copia selettivamente solo alcune porzioni del genoma e produce da una a cento a mille copie di ciascuna regione, mentre la replicazione deve
copiare tutto il genoma 1 sola volta ad ogni divisione cellulare
• Significato della regolazione trascrizionale: diverse parti del genoma vengono trascritte in maniera diversa – in cellule diverse o nella stessa cellula in tempi
diversi possono essere trascritti diversi gruppi di geni - ciò definisce il carattere e la funzione di ogni tipo di cellula.
RNA come prodotto della trascrizione
 TIPOLOGIE DI RNA

mRNA: tRNA: RNA rRNA:

RNA messaggero, transfer (tRNA), RNA ribosomiale, c
trascrive e trasporta l’ lega e trasporta ostituisce
informazione genetica gli aminoacidi i ribosomi
 TIPOLOGIE DI RNA
hnRNA: RNA eterogeneo, negli eucarioti
rappresenta il trascritto primario che non
ha ancora subito maturazione

Small nuclear RNA (snRNA) e Smal nucleolar RNA

(snoRNA) sono piccoli RNA nucleari non
codificanti:
 SnRNA
costituisce lo spliceosoma, complesso per
la promozione dello splicing
 SnoRNA coinvolto nella maturazione del rRNA
e tRNA

miRNA: microRNA non codificanti coinvolti nel

silenziamento dell'espressione genica e nella regolazione
post-trascrizionale negli eucarioti
 Differenze fra procarioti ed eucarioti

 Dimensione e complessità del genoma: le

cellule eucariotiche sono prive di operoni, il
genoma è compartimentato nel nucleo ed ha
un'organizzazione strutturale che ne influenza
l'accessibilità da parte di proteine regolatorie.
 Stabilità dell’mRNA
 Modificazione post-traduzionale delle proteine
 Turnover delle proteine

Nei procarioti l’espressione genica selettiva permette alle cellule di risparmiare energia: la regolazione avviene
prevalentemente a livello trascrizionale
Negli eucarioti: l’espressione genica selettiva permette alle cellule di svolgere ruoli specializzati – La regolazione avviene a
vari livelli
 I geni e la loro espressione
La cellula umana contiene circa 30000 geni ma ogni cellula in un dato momento esprime solo una parte di essi in
funzione dello stadio di differenziamento ed alla sua funzione.
Tutte le cellule di un organismo portano la stessa informazione genetica, ma in ogni tipo di cellula (nelle immagini:
cardiomiocita , neurone, epatociti) viene espresso solo un sottoinsieme dei geni. I geni necessari per altri tipi di
cellule non vengono espressi.
Geni espressi = geni trascritti (codificanti proteine o RNA regolatori)

Geni housekeeping = geni codificanti proteine coinvolte nei processi cellulari

basali: metabolismo, biosintesi, comunicazione e trasporto di membrana,
istoni, ribosomi

Geni tessuto-specifici = geni la cui espressione conduce, regola e caratterizza il

differenziamento cellulare
 L'espressione genica negli eucarioti è
regolata a vari livelli
1) DNA -> Rimodellamento della cromatina – meccanismi
epigenetici
2) DNA-> Controllo trascrizionale - specifiche sequenze di DNA
risultano essere responsive al legame di fattori trascrizionali
(tessuto specifici, ormoni, fattori di crescita) che regolano geni
inducibili
3) RNA trascritto primario (precursore) - controllo post-
trascrizionale della maturazione dell'RNA: splicing alternativo,
polyA alternativo
4) mRNA (messaggero maturo) -> controllo del trasporto (uscita
dal nucleo)
5) mRNA -> controllo della stabilità (degradazione)
6-7-8) controllo traduzionale e post-traduzionale
 1) Meccanismi epigenetici di rimodellamento
della cromatina
 EUCROMATINA (dispersa, si colora debolmente) -> TRASCRIZIONE POTENZIALE a) geni housekeeping b) geni tessuto-specifici
 ETEROCROMATINA (più compatta si colora intensamente)
 FACOLTATIVA -> inattiva quando condensata
 COSTITUTIVA -> sempre inattiva; Localizzata nelle regioni peri - e centromeriche

Fattori che vengono trasmessi alla progenie cioè modificazioni ereditabili che non alterano la sequenza nucleotidica dei geni ma ne alterano l’attività
 2)Attivazione trascrizionale
L'espressione di determinati geni è regolata da:
l'azione di attivatori e/o repressori che mediano la
deacetilazione/acetilazione degli istoni a livello di specifici geni
 2)Attivazione trascrizionale
L'espressione di determinati geni è regolata da:
Fattori trascrizionali (proteine regolatorie, attivatori e repressori) che si
legano al promotore
2)Attivazione
trascrizionale
L'espressione di determinati geni è regolata da:
 Fattori trascrizionali (proteine regolatorie,
attivatori e repressori) che si legano al
promotore
Struttura del gene e del trascritto primario
 Struttura del gene eucariotico
Sequenze regolatorie ESONI ED INTRONI
Sequenze codificanti e non codificanti

La presenza degli introni consente lo splicing alternativo e quindi una grande flessibilità e potenzialità nella regolazione
genica (in alcuni casi gli introni non vengono degradati e danno altri RNA funzionali nella regolazione genica ovvero
alcuni tipi di non coding RNA. Inoltre come ruolo evolutivo la ricombinazione tra introni di geni diversi può avere creato
geni con nuove combinazioni di esoni.
 L'inizio della trascrizione
I due filamenti di DNA si svolgono e il DNA può essere copiato. A differenza della DNA polimerasi, la RNA polimerasi ha
attività elicasica, non ha bisogno di un innesco e non ha attività di proof-reading.

Il Promotore è una sequenza

specifica del DNA che viene
 Procarioti: l' RNA polimerasi riconosciuta dalla RNA
si lega direttamente al polimerasi e determina DOVE la
promotore – la regolazione è a sintesi del trascritto primario inizia
carico di sequenze adiacenti al e
promotore ed ai geni da QUALE filamento del DNA debba
esprimere essere utilizzato come stampo.

 Eucarioti: i fattori di
trascrizione proteici legano il
promotore prima dell’ RNA
polimerasi II – la regolazione è
anche a carico di sequenze
poste a distanza dai geni da
esprimere
Negli eucarioti oltre alla sequenza del
promotore sono presenti altri Elementi
regolatori: sono sequenze di DNA che
possono trovarsi in posizioni e distanze
variabili rispetto al promotore
(spesso sono nella regione da –50 a –
100) ed influenzano il legame della RNA
pol al promotore:
 Gli Enhancers stimolano la
trascrizione
 Silencers inibiscono la trascrizione
 La RNA polimerasi si lega al promotore con un orientamento prefissato, dallo stesso promotore
viene sempre trascritto lo stesso filamento. La scelta del promotore è influenzata dall'azione dei
fattori di trascrizione. Ciò determina quale filamento viene trascritto.

Direzionalità del
trascritto ad RNA:
la trascrizione
procede sempre in
direzione da 5'->3'
 Terminologia della trascrizione
Il filamento di RNA ossia il prodotto della trascrizione è complementare allo stampo di DNA ed uguale all'altro filamento di
DNA definito filamento codificante (con la differenza che nell'RNA è presente uracile al posto della timina e ribosio al post
o di desossiribosio).

Coding strand (Sense strand) del DNA ha la stessa sequenza del mRNA
Antisense strand (Template strand) è quella che funge da template per la sintesi del mRNA.
RNA polymerases sono enzimi che sintetizzano RNA usando DNA come template.
Promoter è una regione di DNA dove la RNA polimerasi si lega per iniziare la trascrizione.
Startpoint (Startsite) si riferisce alla posizione sul DNA che corrisponde alla prima base incorporata nel RNA
Terminator è una sequenza di DNA che fa terminare la trascrizione alla RNA polymerase.
Transcription unit è la distanza tra i siti di iniziazione e di terminazione della RNA polymerase: può includere più di un gene.
Primary transcript è il prodo o di RNA non modificato che corrisponde ad una unità di trascrizione.
Geni posti sullo stesso cromosoma possono avere
come "coding strand" filamenti diversi del DNA
 Effetto della compartimentazione sul meccanismo
di trascrizione
Nei procarioti il trascritto viene subito tradotto Negli eucarioti il trascritto primario subisce un
in proteina: si osserva la formazione di processo di maturazione prima di essere esportato
poliribosomi in prossimità di mRNA in fuori dal nucleo
allungamento.
Poliribosomi nei
procarioti
 L'inizio della trascrizione nei procarioti
La polimerasi riconosce specificatamente la sequenza promotore grazie al fattore
sigma.
Grazie alla formazione del complesso promotore-polimerasi si verifica un ̀cambiamento
strutturale.
Il DNA a doppio filamento si denatura per 12-14 pb e si forma una "bolla di trascrizione".
La polimerasi utilizza il DNA stampo dal suo 3' al 5' e la trascrizione avviene in direzione
5’->3’ (un solo filamento di DNA funge come stampo/template).
 Il legame della RNA polimerasi
(RNAp) al promotore batterico

Il confronto fra sequenze (nucleotidiche o amminoacidiche) può far evidenziare una omologia di sequenza
(similarità che indica la discendenza da una sequenza ancestrale comune e che implica una similarità strutturale e
funzionale).
Sequenza consenso: sequenza che contiene ad ogni posizione la base più frequente.
L'allineamento delle sequenze dei promotori ha mostrato che diversi promotori hanno sequenze che "somigliano"
a quella consenso.
 RNApol core e "Holoenzyme"

La RNAP core enzima (αββ'Ω) può

Iniziare la trascrizione in qualsiasi
punto della molecola di DNA (in vitro)

La RNAP "holoenzyme" (αββ'Ω + sigma)

inizia la trascrizione solo a partire dai promotori
specifici che includono una sequenza consenso
di 12 pb.
Una volta legato nell’ oloenzima σ ha contatti
col DNA a livello del promotore ma poi si
stacca nella fase di allungamento dove le
sequenze non mostrano alcun consensus a
livello di sequenza.
Gli enzimi RNApol nei diversi
organismi condividono molte
caratteristiche comuni
soprattutto nei domini
direttamente coinvolti nella
catalisi della sintesi dell'RNA

I batteri hanno una sola RNA

polimerasi che richiede la subunità
σ per iniziare la trascrizione, in
quanto ha il compito di riconoscere
il promotore. Alcuni gruppi di geni
hanno promotori particolari che
sono riconosciuti da fattori σ
alternativi. Si tratta di geni la cui
attivazione è richiesta in condizioni
ambientali particolari, come la
carenza di azoto o l'esposizione alle
alte temperature.
 Ogni specifico fattore sigma permette alla RNA
polimerasi di riconoscere specifiche sequenze del
promotore in posizione –35 e –10 rispetto allo
startpoint.
RNA polimerasi negli eucarioti:
• RNA pol I: Trascrive tutti i geni
rRNA (meno 5S rRNA)
• RNA pol II: Trascrive tutti i geni
strutturali (tutti i mRNA),
alcuni geni snRNA e miRNA
• RNA pol III: Trascrive tutti i
geni tRNA ed il gene 5S rRNA
Formazione della bolla di trascrizione
 Chimica della Reazione di trascrizione

Mg2+: A: riduce affinità del'O per

il suo H

Mg2+: B: neutralizza 3 cariche

negative del trifosfato
 Evasione dal promotore
Passaggio dal complesso chiuso (la Polimerasi
interagisce con il DNA a doppia elica) al Complesso
aperto (facilitata da una serie di interazioni chimiche
fra proteina e DNA che mediano un cambiamento
conformazionale).

Due nucleotidi vengono portati sul sito attivo, allineati

allo stampo ed uniti.

All'inizio la trascrizione è inefficiente: vengono

prodotti brevi (5-10nt) trascritti ad RNA (abortivi).
Via via che aumentano le interazioni che stabilizzano
il complesso ternario (DNA/enzima proteico ed RNA),
la polimereasi riesce ad evadere dal promotore e
continuare in modo efficiente la trascrizione.
 Fase di allungamento del trascritto
La polimerasi rilascia il fattore sigma e torna ad avere affinità generale per tutto il DNA, indipendente dalla
sequenza, per la continuazione della trascrizione.
La polimerasi funge da elicasi aprendo il DNA e catalizza la formazione del legame fosfodiesterico tra il 3-OH
dell'ultimo ribonuclotide ed il fosfato alfa del ribonucleotide trifosfato entrante.
Il trascritto nascente viene separato dal DNA stampo ed i due filamenti del DNA si riappaiano.

Funzione di correzione:
- Editing pirofosfolitico (immediato), rimuove il nucleotide incorporato erroneamente tramite
reincorporazione di PPi.
– Editing idrolitico (torna indietro di uno o piu nt).
Stimolato dai fattori Gre che stimolano anche l’allungamento
 Terminazione della trascrizione

R HO DIPENDENTE
• E' un meccanismo ATP-dipendente che
richiede l'intervento della proteina Rho
(ATPasi) che spinge la RNAP
• Le sequenze di terminazione Rut non
sono presenti sugli RNA neotrascritti
che sono associati ai ribosomi
 Terminazione rho indipendente
• Il terminatore è intrinseco nella sequenza di DNA che viene trascritta e
forma una struttura secondaria (regioni ricche in GC separate da uno
spaziatore). A valle sono presenti regioni ricche in T.
• La polimerasi trascrive la regione ricca in GC – nel trascritto si forma
una struttura a stem-loop
• In prossimità della regione terminale le interazioni A-U sono deboli ed il
complesso ternario si dissolve
 Regolazione trascrizionale nei batteri
La cellula batterica trascrive un gruppo diverso di geni a seconda del terreno di coltura in cui sta
crescendo-così è in grado di rispondere ai cambiamenti ambientali.

La regolazione genica avviene a livello trascrizionale e permette alle cellule di risparmiare

energia: la quantità del prodotto codificato da un gene è controllata in relazione al fabbisogno
cellulare (es. sintesi adattativa di enzimi)
 L'operone è l'unità trascrizionale descritta nel
1961 da François Jacob e Jacques Monod
Rappresenta una unità funzionale di geni adiacenti la cui espressione è controllata in modo coordinato (viene attivata od inattivata
in funzione della presenza di un repressore o di un attivatore).
Comprende i seguenti elementi:
• promotore (P) - sito di legame della RNA polimerasi;
• operatore (O), una sequenza di nucleotidi posta dopo il promotore, al quale si lega un repressore o un attivatore;
• Dopo l'operatore ci sono due o più geni strutturali organizzati in "cluster" ovvero gruppi di geni codificanti per proteine con
funzioni correlate, (es. enzimi di una stessa via metabolica, proteine deputate al trasporto intracellulare ecc);
• il gene regolatore (I), non appartiene propriamente all'operone, può trovarsi in qualsiasi punto del cromosoma batterico, e
codifica per una proteina, il repressore, che si lega all'operatore
Effetti del cambiamento conformazionale e
ruolo dell'ingombro sterico su specifiche
sequenze regolative
 Tipi di regolazione

Il repressore (codificato dal gene regolatore) è Uno specifico fattore può agire anche da
una proteina che legandosi all'operatore attivatore cioè legandosi all'operatore recluta
ostacola il passaggio della RNA polimerasi la RNA polimerasi facilitandone il legame al DNA
(effettua una regolazione negativa). (effettua una regolazione positiva).
 Tipi di regolazione

La presenza di una molecola "effettore" presente nel terreno di crescita può indurre un cambiamento
conformazionale nella proteina regolatrice (repressore o attivatore) ed influenzare la regolazione. Ad es. Se una
molecola effettore funge da induttore, si lega al repressore e ne impedisce il legame all'operatore. In questo
modo la polimerasi si lega al promotore e (senza trascrivere il gene operatore che non codifica per nessuna
proteina) trascrive i geni.
 L'operone lac di Escherichia coli
Per trasformare il LATTOSIO in glucosio da utilizzare come fonte di energia sono necessari tre enzimi codificati dall'operone lac. Questa via
catabolica normalmente è inattiva (regolazione negativa mediata dal repressore costitutivamente presente), si attiva (l'operone è detto
inducibile) solamente in presenza del substrato da catabolizzare, cioè quando servono gli enzimi specifici per espletare questa funzione.

Una proteina repressore è

normalmente legata
all'operatore e blocca la
trascrizione dei geni
strutturali poiché,
ostacolando il promotore,
impedisce all'RNA
polimerasi di legarsi al DNA
o, se si lega, non può
spostarsi lungo i geni. Se è
presente una molecola,
chiamata induttore (in
questo caso il lattosio che è
la molecola che si accumula
e deve essere degradata
mediante l'attivazione di
questa via catabolica),
questa si attacca al
repressore e, modificandone
la forma, lo inattiva e lo
stacca dall'operatore e così si
può avviare la trascrizione.
L'operone lac, di Escherichia coli
La presenza esclusiva di lattosio nella cellula batterica comporta
l'attivazione di tre enzimi diversi per la sua metabolizzazione. I geni
che codificano per questi tre enzimi (Z, Y, A) sono allineati e
producono proteine correlate dal punto di vista funzionale.

Il lattosio (disaccaride costituito da

Il gene regolatore (I) produce in continuazione la proteina
glucosio e galattosio) è assente: non
repressore, che ha due siti di legame: uno per legarsi all'operatore e
servono gli enzimi per metabolizzarlo
l'altro al lattosio.
(sarebbe uno spreco energetico per la
Il repressore è normalmente legato all'operatore e ciò impedisce
cellula batterica)
stericamente all'RNA polimerasi di formare un legame con il
promotore, poiché esiste una leggera sovrapposizione tra il
promotore e l'operatore e di conseguenza non può iniziare la
trascrizione.

Se è presente il lattosio, questo si comporta da induttore: si lega al

repressore il quale, cambiando forma, si stacca dall'operatore; l'RNA
polimerasi, non trovando ostacoli, può dare avvio alla trascrizione
dei geni che codificano gli enzimi.

Quando tutto il lattosio presente nella cellula è stato demolito, il

Il lattosio è presente: servono gli repressore, non avendo più legato il lattosio, riprende la sua forma e
enzimi per metabolizzarlo si colloca nuovamente sull'operatore bloccando la trascrizione.
 Operone trp di Escherichia coli
Per sintetizzare il TRIPTOFANO servono cinque enzimi codificati dall'operone Trp

Regolazione negativa negli operoni reprimibili. In questo caso i geni strutturali sono normalmente attivi e avviene la
trascrizione, mentre il repressore, pur essendo prodotto, è inattivo. Questo si attiva in presenza di una molecola,
detta corepressore, la quale, modificando la conformazione del repressore, lo rende capace di legarsi all'operatore e di
bloccare quindi la trascrizione. Gli operoni reprimibili controllano in genere le vie anaboliche, attivate dal prodotto.
OPERONE TRP DI ESCHERICHIA COLI
Contrariamente all'operone lac, il repressore
dell'operone trp è inattivo quando è libero e si attiva in
presenza di triptofano, che funziona da corepressore.
L'operone comprende:
• il promotore (P),
• l'operatore (O),
• la regione leader (L), contenente un sito attenuatore (A),
• cinque geni strutturali E, D, C, B, A.
Il gene regolatore (I) produce continuamente il repressore,
che ha un sito di legame per l'operatore e uno per il
triptofano, ma non è attivo. La cellula perciò trascrive i cinque
geni per la produzione degli enzimi necessari alla sintesi del
triptofano.
Se però il triptofano è presente nell'ambiente, la cellula
smette di produrlo per assorbire quello disponibile. Infatti, il
triptofano, agendo da corepressore, modifica la
conformazione del repressore, il quale può ora legarsi
all'operatore, impedendo l'accesso dell'RNA polimerasi.
Un secondo meccanismo di regolazione del triptofano
coinvolge l'attenuatore che si trova nella regione leader.
L'operone, in presenza di un prodotto finale (in questo caso il
triptofano), provoca alterazioni della struttura secondaria
dell'mRNA, portando alla terminazione prematura della
trascrizione.
Trascrizione e meccanismi di
regolazione dell' espressione
genica negli eucarioti
 NEGLI EUCARIOTI LA REGOLAZIONE
D E L L ' E S P R E S S I O N E G E N I C A AV V I E N E A VA R I L I V E L L I
E P E R M E T T E A L L E C E L L U L E D I S V O L G E R E RU O L I
S P E C I A L I Z Z AT I
PROCARIOTI EUCARIOTI
FATTORI DI PEPTIDE SIGMA GTF , TF ubiquitari, TF
TRASCRIZIONE tessuto specifici
DNA DNA SUPERAVVOLTO CROMATINA
COMPLESSATA CON
ISTONI
INTERAZIONE TF- SUFFICIENTE IL TF MEDIATOR COMPLEX
DNA

La trascrizione negli eucarioti è più complessa perché è caratterizzata dall'interazione del macchinario di
trascrizione basale con una serie di altri fattori regolativi che modificano gli istoni ed il rimodellamento della
cromatina, fanno interagire la pol II con elementi presenti a distanza dal gene da regolare e mediano la
modificazione del mRNA.
C O M P L E S S O M E D I AT O R E
Grande complesso di proteine caratteristico degli eucarioti che
media l’interazione tra la RNA pol II e i vari fattori di
trascrizione regolatori.
Agisce da "ponte molecolare" per connettere la pol II con gli
attivatori trascrizionali legati agli enhancer o agli elementi
regolatori presenti a grande distanza dal gene da regolare:
-Si associa alla coda CTD della RNA pol II e presenta superfici di
legame debole per l’interazione con attivatori legati al DNA.
–Presenta una composizione complessa, organizzata in moduli e
variabile (nell’uomo ha almeno 20 subunità).

Il complesso mediatore non è necessario per

la trascrizione basale e quindi non
è un fattore generale di trascrizione.
E’ un componente del complesso di pre-
inizio e stimola anche l’attività di TFIIH.
COMPLESSO MEDIATORE PUÒ REGOLARE
LA REPRESSIONE O L'ATTIVAZIONE
I fattori di trascrizione sono proteine che legano specifiche
sequenze di DNA ai promotori dei geni e agli elementi di
regolazione e mediano l’attivazione o la repressione specifica
della trascrizione in quanto reclutano sul gene da regolare i co-
attivatori o i co-repressori.
I co-attivatori e i co-repressori sono proteine che fanno
aumentare o diminuire l’attività di trascrizione tramite
interazioni proteina-proteina senza legarsi direttamente al
DNA. Sono necessari ma non indispensabili (senza di essi si ha
la trascrizione basale):

1) I fattori di trascrizione marcano il gene da regolare (da attivare

o silenziare);
2) I co-attivatori e co-repressori servono per il riconoscimento di
altre proteine che andranno ad alterare la struttura della cromatina
modificandola: gli ottameri istonici devono essere transitoriamente
modificati (rimozione del dimero H2A/H2B per lasciare un
esamero che è più facile da spostare).
L’ottamero istonico è ricostitutito dietro alla RNA pol.
 G T F E D I L C O M P L E S S O D I P RE I N I Z I O

I General transcription factor presenti negli eucarioti hanno la funzione di sigma presente nei procarioti: i GTFs aiutano la
RNA pol a legarsi al promotore, a separare la doppia elica, a lasciare il promotore per passare alla fase di allungamento. In vitro
sono capaci di dare origine ad una trascrizione basale
• TF ubiquitari: incrementano l'efficienza di inizio della trascrizione e permettono al promotore di funzionare ad un livello
adeguato (misurazione in vitro o in cellule trasfettate)
• TF inducibili/tessuto specifici: hanno un ruolo regolativo – vengono espressi solo in determinate condizioni/momenti.
 T F
I ND UC I B I L I / T E S S UTO
S P E C I F I C I

Il fegato è l'organo deputato alla

regolazione del metabolismo
nell'organismo umano: nelle cellule
epatiche sono presenti fattori di
trascrizione regolativi che permettono
una elevata trascrizione del gene
codificante l' albumina (proteina che
interviene in specifici meccanismi
legati al trasporto di ormoni e farmaci).
Nelle cellule del cervello il gene
dell'albumina viene espresso ad un
livello basale.
 L A RN A P O L I I T RA S C RI V E G E N I C O D I F I C A N T I
P RO T E I N E E S I L E G A A L P RO M O T O RE G RA Z I E
AL L ' AUS IL IO DE I G TF
TFIID: contiene TBP e fornisce la Il legame di TFIID con la Pol II è
piattaforma per il reclutamento degli necessario per reclutare TFIIE che
altri fattori recluta la TFIIH (elicasi)

TFIIB: proteina a
singola catena che
entra nel complesso
dopo TBP: riconosce
BRE, la TATA box,
l’iniziatore (Inr) e
l’elemento del
promotore a valle
(DPE, DCE e MTE)

TBP (TATA binding protein) si
associa a circa 10 TAF (TATA
binding protein associated
factors) diversi per legare il
promotore.
In genere un promotore contiene solo alcuni di questi elementi (es. TATA o
DPE)
• Inr è comunemente trovato con TATA e con DPE.
• Altre sequenze sono quelle regolatrici: UAS(upstream activator sequences),
enhancer, silencers, elementi di confine (boundary elements) e isolatori
(insulators) che legano proteine attivatrici o repressori della trascrizione
 PER INIZIARE LA
TRASCRIZIONE LE POL
EUCARIOTICHE
NECESSITANO DELL’AIUTO
DI UN GRAN NUMERO DI
PROTEINE
TFIID È
UN COMPLESSO MULTIPROTEICO CHE SI
LEGA ALLA TATA BOX:
LA TBP TATA BINDING PROTEIN
LEGA DIRETTAMENTE LA SEQUENZA TATA,
I TAF (TATA
BINDING PROTEIN ASSOCIATED FACTORS)
AUMENTANO LA SUPERFICIE DI LEGAME.
Vengono reclutate altre proteine che costituiscono un
complesso mediatore:
 TFIIA e TFIIB
 TFIIF e la RNA Polimerasi II
 TFIIE e TFIIH (contiene subunità ATP-asica
che favorisce la denaturazione (melting) del promotore
e fosforila il dominio C terminale (CTD) della RNAP->
evasione della trascrizione
INIZIO, ALLUNGAMENTO E TERMINAZIONE
DELLA TRASCRIZIONE NEGLI EUCARIOTI

All'inizio della trascrizione il dominio C terminale della Pol II non è

fosforilato (il complesso di pre-inizio è ipofosforilato).
• Il reclutamento del fattore TFIIH favorisce l'evasione dal promotore
ed un efficiente inizio di trascrizione perché con il suo sito catalitico
chinasico fosforila la CTD ed in questo modo la Pol II riesce a
liberarsi di molti TFs e recluta altri fattori di allungamento (come
TFIIS e hSPT5) alcuni dei quali sono necessari per la maturazione
dell’RNA.
 TFIIS stimola l’allungamento e facilita la correzione (stimola
l’attività RNasi latente della RNA pol per rimuovere i
nucleotidi incorporati erroneamente all’estremità del RNA
nascente). Inoltre limita le pause della RNA pol a siti definiti
(questa attività è svolta anche da TFIIF).
 La CTD fosforilata recluta gli enzimi per il capping e per lo
splicing.
 T A T A B I N D I N G P RO T E I N ( T P B )

• TFIID, è fatto da TBP e 11

TAFs, con una massa totale di ~800 kD.

TBP è una subunità di TFIID. E’ composta

da due domini simili. Lega TATA box in
modo inusuale: si lega alla TATA box nel
minor groove del DNA con un dominio beta
(usa il beta–foglietto per contattarlo);
forma una sella intorno al DNA (lo allarga)
e lo piega di ~80°.
Piegando il DNA dà così un segnale agli altri
general TF

TATA BOX DNA

1) TBP è parte di TFIID che rappresenta la piattaforma molecolare sulla quale
vengono reclutati gli altri fattori:
2) TFIIB ha un dominio di legame alla TBP ed una porzione che riconosce una
sequenza consenso sul DNA promotore ricca in GC – in questo modo fa localizzare il
complesso di trascrizione sul promotore.

3) TFIIE, TFIIF,
TFIIH permettono
il corretto
caricamento della
Pol II e del
complesso
mediatore sul
promotore (il
complesso di pre-
inizio è formato).
 5) TFIIH svolge diverse attività: fosforila la coda CTD
della Pol II (attività chinasica-passaggio alla fase di
allungamento dell'RNA), attiva la riparazione del DNA in
presenza di un danno che altrimenti bloccherebbe
l'espressione di quel gene ed ha attività elicasica
(favorisce il meltind del DNA che deve essere trascritto).
(Sia nei procarioti che eucarioti c’è attivazione della ripara
zione durante la trascrizione).
Apparato di trascrizione basale è costituito da RNA pol II
+ GTFs
 L A C T D F O S F O RI L A T A RE C L U T A G L I
E N Z I M I P E R L A M A T U RA Z I O N E D E L L ' RN A
 M A T U RA Z I O N E
D E L L ' RN A N E G L I
E U C A RI O T I
La RN A p o l II as s e mb la u n t ras c rit t o p rimario c h e è
c o mp le me n t are al D N A d e ll'in t e ra u n it à d i t rasc rizio n e :
g l i RN A t r a s cr i t t i s i a s s oci a n o con p r ot ei n e e
p a r t i cel l e p i ù g r a n d i q u a n d o è a n cor a i n a t t o i l p r oces s o
d i t r a s cr i z i on e – i t r a s c r i t t i d i p r e - m R N A v e n g o n o
mat u rat i me n t re so n o sin t e t izzat i ( c io è c o -
t ras c rizio n alme n t e ) . Le p art ic e lle RN P n o n s o n o
d ist rib u it e a c aso lu n go il t rasc rit t o n asc e n t e , ma so n o
in ve c e le gat e a sit i sp e c if ic i d o ve avvie n e la
mat u razio n e d e ll'RN A c h e p re ve d e :

 La re azio n e d i c ap p in g al 5'

 La p o liad e n ilazio n e d e ll'e st re mit à 3'

 Lo Sp lic in g – rimo zio n e d e gli in t ro n i

https://www.sciencedirect.com/topics/agricultural-and-biological-sciences/transcription-factories
 La fosforilazione del CTD è un segnale per il
reclutamento degli enzimi per il capping e per lo
splicing
 Il Capping del trascritto all'estremità 5'
avviene nella fase di transizione tra l'inizio e
l'allungamento nel canale di uscita dell'RNA

La 7-metil guanosina attaccata

covalentemente al terminale 5’
impedisce la degradazione dell'RNA da
parte delle esonucleasi e permette:
– la traslocazione di alcuni RNA dal
nucleo al citoplasma
– l'inizio della traduzione
– lo splicing degli introni
- Il reclutamento del ribosoma
L'estremità 5' di un pre-mRNA nascente si
lega ad un enzima per il capping

L'enzima deputato alla formazione del cappuccio nei

mammiferi ha due siti attivi che catalizzano due reazioni
differenti:
 una trifosfatasi che rimuove il gruppo fosfato terminale
 Una guanililtransferasi che aggiunge un residuo di
guanina con orientamento inverso mediante formazione di
un legame 5'-5'

 Successivamente diverse metiltrasferasi aggiungono un

gruppo metile al cappuccio terminale di guanosina ed al
ribosio del nucleotide che prima costituiva l'estremità
dell'RNA nascente
Capping del trascritto all'estremità 5'

Le estremità 5' di tutti gli mRNA hanno un gruppo trifosfato

che non ha reagito.
 L'ultimo dei tre fosfati viene rimosso convertendo il
terminale 5' in un difosfato (RNA trifosfatasi)
 Viene aggiunto un GMP con orientamento invertito:
l'estremità 5' di una guanosina viene a trovarsi di fronte
all'estremità 5' della catena di RNA: i primi due
nucleosidi sono uniti da un peculiare ponte trifosfato 5'-
5' (guanililtrasferasi)
Metilazione del cappuccio

 La guanosina invertita è metilata nella posizione 7

della sua base guanina
 Il nucleotide sul lato interno del ponte trifosfato
è metilato nella posizione 2 del ribosio
 La maturazione del trascritto primario
negli eucarioti
Nei geni degli eucarioti
le sequenze codificanti
per proteine (esoni)
sono interrotte da
sequenze non codificanti
(introni).

Il trascritto primario, prima

di abbandonare il nucleo,
viene sottoposto ad un processo di
taglio e
ricucitura (splicing): gli introni
vengono eliminati e gli esoni
riuniti uno all’altro. La molecola
di mRNA maturo che esce dal
nucleo sarà costituita da una
sequenza codificante continua.
Splicing alternativo e rimozione degli introni

Lo splicing alternativo
aumenta il potenziale
espressivo negli eucarioti:
da uno stesso gene possono
derivare trascritti diversi
che, una volta
tradotti, danno luogo a
proteine simili ma diverse
 Splicing alternativo dell’ mRNA per la
tropomiosina

Tropomiosina ha 5 isoforme: proteina che lega l’actina (coinvolta nella contrazione muscolare)
e fa parte delle proteine del citoscheletro nelle cellule non muscolari
La trascrizione termina
500-
2000 nt a valle della sequ
enza segnale per poliA

Quando viene trascritto il segnale di

poliadenilazione (normalmente AAUAAA a 5-30nt
a monte del segnale di taglio e
poliadenilazione) ha inizio il processo di
terminazione della trascrizione:
 I pre-mRNAs con cap al 5'
sono modificati mediante il taglio all’estrem
ità3’
 Dopo il taglio la trascrizione può
continuare ma il trascritto senza capping al
5' viene degratato ed il complesso ternario
diventa instabile e si stacca
 Viene addizionata la coda di poliA al
trascritto primario con cap al 5'
La coda di poli A presente al terminale 3' degli RNA
maturi non è codificata dalla sequenza del gene ma è
aggiunta dopo che il gene è stato trascritto
Il complesso di maturazione del poli-A è fisicamente associato
con la RNA polimerasi mentre essa sintetizza il trascritto
primario.

Quando la RNApol trascrive la sequenza del segnale del poliA nel

DNA i fattori di taglio e poliadenilazione vengono trasferiti
dal CTD alle sequenze consensus presenti nel trascritto:

 CPSF (cleavage and ployadenylation specificity

factor) si lega alla sequenza AAUAAA
 CSTF (cleavage stimulation factor) si lega
alla regione ricca in –GU o –UUU e recluta CFI
e CFII (endonucleasi) che tagliano a valle
della sequenza segnale
Taglio e poliadenilazione al 3'

• Dopo il taglio al 3' l'endonucleasi CstF viene

rilasciata

• La PAP (poli-A polimerasi) aggiunge circa 250 adenosine

senza la necessità di uno stampo: in tal modo protegge
il trascritto dalle esonucleasi che digeriscono il
trascritto a valle della sequenza di poliadenilazione
Complesso di maturazione
dell'estremità 3'
• CPSF e CstF riconoscono sequenze specifiche

• CFI e CFII hanno attività endonucleasica

 Complesso di maturazione
dell'estremità 3'

La coda di poli-AAA viene

legata e stabilizzata dalle
PBP (Poli-A binding protein)
proteggendo il trascritto da
una prematura degradazione
ad opera delle esonucleasi.
L'mRNA negli eucarioti viene
modificato e trasportato
fuori dal nucleo

La coda di poliA è presente nella maggior parte degli

mRNA fatta eccezione per quelli degli istoni ed ha la
funzione di:
 stabilizzare e proteggere il mRNA dalla
degradazione,
 favorire i processi di splicing e la traslocazione
dal nucleo al citoplasma
 aumentare l’efficienza della traduzione
 mRNA Factory

Some evidence suggests that factories are

stationary and that the transcribed DNA template is
reeled through the factory (small gray arrows) while
the resulting RNA transcript is extruded. (B) Some
experimental evidence supports the model of
“specialized” or “preferred” transcription factories,
where a given transcription factor (pink dot) is
enriched and multiple genes regulated by this factor
are transcribed. (C) Genes that are located on the
same chromosome and transcribed by the same
factory could cause formation of chromatin loops at
the transcription site.
There is considerable evidence that transcription does not occur homogeneously or
diffusely throughout the nucleus, but rather at a number of specialized, discrete sites
termed transcription factories.

Each factory contains 4–30 stationary

RNA polymerase II molecules which
are located on the surface of a protein-
rich core (87 nm in diameter, as
determined by EFTEM in HeLa cells).
These proteins include many factors
involved in transcription such as co-
activators, chromatin remodelers,
transcription factors, histone
modification enzymes, RNPs, RNA
helicases, and splicing and processing
factors. Multiple genes can be
processed by the same factory (three
are shown).
A working model for coupling transcription and
pre-mRNA processing based on the gene expression
factory model is shown in Fig. 2. In this model
capping (CAP), splicing (SF) and polyadenylation
(pA) factors are recruited to the transcription
preinitiation complex (PIC) (see Fig. 2a).

At this stage transcription factors (TF)

are bound to the unphosphorylated CTD.

Upon transcription initiation the

CTD is phosphorylated, the
PIC is released and capping, splicing
and polyadenylation components associa
te with the CTD (Fig. 2b).
Shortly after pre-mRNA synthesis begins, the 5' end is capped, and the capping machinery then
dissociates from the CTD (Fig. 2b). As the DNA is reeled into the gene expression factory, and the
nascent pre-mRNA is extruded through the exit channel of the RNA polymerase, splicing factors are
systematically transferred from the CTD to the exons (Fig. 2c), where they recruit the rest of the
splicing machinery. Splicing factors are also transferred via the elongation complex (not shown)
The interaction between splicing factors
bound to the CTD with those bound to the
exon functions to tether the exon to the
CTD until the next exon emerges from the
exit pore of the polymerase (Fig. 2d). This
tethering plays a role in recognizing
exons, and in ensuring the correct 5' and
3' association of sequentially synthesized
exons. The splicing factors transferred
from the CTD to the nascent pre-mRNA are
rapidly replaced by new splicing factors
which are optimally positioned for the
appearance of the next exon.
This reloading mechanism is consistent with
electron tomography studies of Balbiani
ring chromosomes showing that splicing
factors are continuously added to and
released from nascent transcripts
during transcription elongation. The
splicing machinery associates with the
exons in a 5' to 3' order as they are
synthesized. However as indicated in the
figure the covalent joining of exons does
not necessarily proceed in a 5' to
3' direction owing to inherent differences
in rates of splicing catalysis between each
exon pair.
Splicing leads to the formation of a specific complex of proteins on the spliced
exons (messenger RNA±ribonucleoprotein (mRNP) complex, described below). When the
polymerase approaches the end of the transcript, the polyadenylation factors
function (Fig. 2e). Finally the CTD is dephosphorylated, the processing factors are
released and the mature mRNP is released from the site of transcription (Fig. 2f).
Come possiamo isolare mRNA?
Strategie per l'isolamento di mRNA
Le sequenze oligodT vengono immobilizzate su un
supporto solido generalmente di cellulosa.
Quando una miscela di RNA cellulari è fatta passare
attraverso una colonna cromatografica contenente poli-
T sintetico gli mRNA si legano alla colonna mentre
tRNA, rRNA e snRNA più abbondanti ma privi di code do
poli-A vengono eluiti via dalla colonna insieme con il
solvente di eluizione:

 L'RNA totale estratto dalle cellule viene applicato

alla colonna in una soluzione salina concentrata
(NaCl 0,5M)
 Si effettuano molti lavaggi con una soluzione
salina meno concentrata (NaCl 100mM) in modo da
rendere più selettivo il legame tra RNA ed oligodT
 L'aggiunta di una soluzione TRIS/EDTA ci consente
di far eluire dalla colonna l'mRNA poliadenilato.
 Il flusso dell'informazione genetica dal DNA all'RNA:
lo splicing come meccanismo inatteso negli eucarioti
 Splicing dell'RNA negli eucarioti
Tra gli anni '60-'70 del '900 emerse da studi
sui procarioti e sui loro virus una visione del gene
semplice -> sequenza lineare di coppie di basi
codificante una sequenza lineare di aminoacidi nel suo
prodotto polipeptidico.
1. Dimostrazione che il DNA (e non la
componente proteica) trasporta l'informazione
genetica nel batteriofago T2 (Esperimento
di Hershey e Chase)

 Se la maggior parte dei geni eucariotici è localizzata nel nucleo e le proteine sono
sintetizzate nel citoplasma, come fanno questi geni a controllare la sequenza
amminoacidica dei loro prodotti proteici?---->l'informazione genetica dal DNA deve
essere trasferita da qualche altro intermedio dal nucleo al citoplasma -> sebbene la
necessità di un messaggero sia più ovvia negli eucarioti la prima prova della loro
esistenza derivò da studi su procarioti
2. Prova dell'esistenza di un RNA messaggero instabile (Esperimento di Elliot Volkin e
Lawrence Astrachan)
3. Prova che sequenze non codificanti nel genoma vengono eliminate dalla sequenza del
messaggero (Esperimento di Susan Berget e Claire Moore)
 I batteriofagi come modello di studio per dimostrare che il
DNA (e non le proteine) trasportano l'informazione
genetica
I virus sono parassiti acellulari la cui propagazione è
controllata dall'informazione genetica immagazzinata negli
acidi nucleici (esistono sia virus a DNA che ad RNA). I virus
sfruttano il macchinario metabolico dell'ospite per replicare
il proprio genoma, trascrivere geni e codificare proteine
(che caratterizzano l'involucro esterno della particella
virale).

La semplicità della loro struttura e composizione chimica e la loro rapida riproduzione (20 minuti per
alcuni virus batterici in condizioni ottimali) li rende strumenti molto utili in molti studi di
biologia molecolare.
 Batteriofagi T2
Alfred D. Hershey e Martha Chase (1953) lavoravano con i batteriofagi (o fagi), virus che infettano
le cellule batteriche. In particolare, il fago T2 che infetta le cellule batteriche del colon Escherichia
coli è composto per il 50% da proteine (che costituiscono l'involucro proteico – contenente Zolfo) e per
il 50% da DNA (contenente fosforo)
• Questo tipo di struttura rendeva i fagi uno strumento ideale per definire una volta per tutte quale
fosse la natura del materiale genetico -> utilizzarono la procedura basata sulla marcatura dei fagi con
isotopi radioattivi (32P marca i nucleotidi mentre 35S marca le proteine)​
 Marcatura dei batteriofagi nelle colture batteriche:
i batteri metabolizzano gli isotopi 32P e 35S introducendo questi atomi radioattivi nelle biomolecole
presenti all'interno delle cellule -> i nucleotidi e gli amminoacidi utilizzati dal virus per la sintesi del
DNA e delle proteine virali sono quelli presenti all'interno della cellula batterica infettata (cresciuta
nutrendosi degli isotopi radioattivi)

Nella prima coltura batterica si Nella seconda coltura batterica si

introduce fosforo marcato
radioattivamente ---> si effettua
l'infezione della coltura
batterica con il fago T2:
 il DNA virale è marcato
radioattivamente
introduce zolfo marcato
radioattivamente---> si effettua
l'infezione della coltura
batterica con il fago T2:
 l'involucro proteico virale è
marcato radioattivamente

1-2) I fagi neoformati (marcati) vengono separati dai due terreni di coltura ed
utilizzati per infettare altre due colture di E. coli, in questo caso cresciute su
terreni standard (privi di isotopi radioattivi).
 Analisi della radioattività delle colture batteriche: dove è localizzata?
Dopo un certo tempo dall'inizio dell'infezione virale:
3) il terreno di coltura viene posto in un agitatore che consente il distacco del rivestimento proteico dei virus dalla membrana cellulare
del batterio (il DNA è già stato iniettato nella cellula batterica=ombre fagiche=gli involucri virali sono vuoti);
4) La centrifugazione permette la separazione del sovranatante contenente gli involucri proteici e di un pellet di cellule batteriche sul
fondo della provetta

In seguito all'infezione con fagi

marcati con 35S la radioattività
In seguito all'infezione con
fagi marcati con 32P gran parte veniva misurata solamente nel
della radioattività veniva sovranatante (e non era presente
misurata nel pellet- sul rivestimento proteico dei
> all'interno delle nuovi fagi perché la coltura
batterica cresceva in terreno
cellule batteriche
>e nel DNA di una parte dei privo di isotopi radioattivi per
nuovi fagi sviluppatisi in cui le proteine dei nuovi virus
seguito a questa infezione sviluppatisi in seguito a questa
(basso livello di radiottività infezione vengono costruite con
amminoacidi contenenti l'atomo
nel supernatante).
non radioattivo 32S).
Il DNA dirige la sintesi di nuovo DNA e di
proteine

Hersey e Chase dimostrarono che:

 Nell'infezione virale il DNA virale
entra all'interno della cellula
batterica mentre il capside proteico
rimane adeso all'esterno della
membrana cellulare
 Il DNA virale iniettato nella cellula
dirige la sintesi delle proteine
virali costruite utilizzando il
"macchinario" ed i metaboliti
del batterio
 Il DNA dirige anche la sintesi di un
intermedio ad RNA?
Nel 1956 Volkin ed Astrachan osservarono un aumento improvviso della sintesi di
RNA dopo infezione delle cellule di E.coli con il batteriofago T2. Marcando
l'RNA con l'isotopo radioattivo 32P dimostrarono che:

 Le molecole di RNA neosintetizzate erano instabili (emivita di pochi minuti)

 La composizione nucleotidica degli RNA instabili era simile a quella del DNA
del fago T2 e diversa da quella del DNA di E.coli

Nel 1961 Sol

Spiegelman dimostrò
che:
 Gli RNA instabili
sintetizzati dopo
l'infezione con T4
(in terreno
contenente il
nucleoside
radioattivo 3H-
uridina) formano
ibridi RNA:DNA con
DNA del fago
Ibridi RNA:DNA -> nuova visione del gene "interrotto"

La prima prova della presenza di

porzioni non codificanti nella
sequenza di un gene derivò da studi
sugli adenovirus (virus a DNA che
infettano l'uomo).
Nel 1977 Susan Berget e Claire Moore
purificarono mRNA tardivo di
Adenovirus e lo fecero ibridare con
DNA di adenovirus:
 Gli eteroduplex RNA:DNA sono più
stabili delle doppie eliche DNA:DNA
-> se le doppie eliche di DNA sono
parzialmente denaturate ed incubate
con molecole di RNA i filamenti di
RNA ibrideranno con le sequenze
omologhe di DNA

https://www.pnas.org/doi/epdf/10.1073/pnas.1525084113
Prima prova dell'esistenza degli introni e dello splicing
dell'RNA
L'mRNA tardivo di Adenovirus non
ibridizza con un'unica regione
del DNA ma con 3 differenti
regioni (in rosso nell'immagine
A).
Nell'immagine B (microscopia
elettronica):
 la linea rossa rappresenta la
regione di appaiamento RNA:DNA
 Le anse A,B,C rappresentano il
singolo filamento di DNA
spiazzato e non ibridato che
corrisponde alla sequenza
degli introni non codificanti

In qualche modo, differenti segmenti dell'mRNA trascritto su una sequenza di DNA

vengono tagliati ed eliminati (introni) mentre le restanti sequenze presenti sul
messaggero maturo (esoni) vengono unite dal processo di splicing.
 La visualizzazione degli
introni nel gene
dell'ovoalbumina
Fotografia al microscopio elettronico di un
ibrido formato tra mRNA dell'ovoalbumina e un
“The ovalbumin gene is
frammento di DNA genomico di pollo contenente split in chicken DNA” ,
il gene dell'ovoalbumina: il DNA contiene P. Chambon 1977-1981
l'intera sequenza genica poiché è stato
isolato direttamente dal genoma, al contrario
l'RNA è stato completamente maturato e le
porzioni trascritte dagli introni sono state
rimosse.
Quando il DNA genomico e l'mRNA ibridano le
porzioni del DNA che non sono rappresentate
nell'mRNA si estendono come anse.
Lo splicing durante la maturazione co-
trascrizionale dell'mRNA
 Splicing dell'mRNA: rimozione degli
introni dal pre-mRNA
Le parti di un trascritto primario
corrispondenti alle sequenze
interposte (introni) del DNA devono
essere rimosse durante il processo di
splicing che prevede:
 Rotture nel filamento di RNA a
livello delle estremità 5' e 3' di
ciascun introne (siti di splicing)
 Unione covalente degli esoni ai
lati dei siti di splicing

Il processo di splicing deve essere

In che modo lo stesso macchinario di base di preciso ed accurato perché l'aggiunta
splicing riconosce i confini di introne ed o la perdita anche di un solo
esone tra migliaia di pre-mRNA diversi? nucleotide causerebbe una lettura
errata del codice.
 Siti di splicing
Le proteine SR:
 Cariche positivamente
 Legano elettrostaticamente i gruppi fosfato
carichi negativamente aggiunti al CTD della
polimerasi in trascrizione e stimolano
l'assemblaggio dell'apparato di splicing via
via che vengono trascritti gli introni
Le analisi di centinaia di giunzioni tra esoni
ed introni negli eucarioti, dal lievito agli
insetti, fino ai mammiferi, hanno rivelato la
presenza nei siti di splicing di sequenze
consensus altamente conservate:
 La sequenza G/GU al sito di splicing al 5'
dell'introne
 La sequenza AG/G all'estremità 3'
dell'introne
 Il tratto polipirimidinico vicino al sito di
splicing al 3'
 ESE (enhancer esonici per lo splicing)
localizzate all'interno degli esoni –
servono per il legame delle proteine SR
(proteine ricche in serina e arginina)
Sequenze consenso nei siti di splicing
Definiscono i punti precisi in cui avvengono interazioni e/o
reazioni chimiche ben specifiche​

 G/GU al 5' e AG/G al 3' sono nucleotidi invariabili

 Le altre basi indicate rappresentano "nucleotidi preferiti" presenti in
quella posizione
 Il punto di ramificazione è una Adenina
 Il tratto polipirimidinico vicino al sito di splicing al 3' contiene
tipicamente da 10 a 20 pirimidine
 Enzimi ad RNA o ribozimi: autosplicing
Gli introni di gruppo II
1 (scoperti successivamente ad un rRNA
precursore in grado di realizzare
l'autosplicing nel protozoo
5' 3' 5' 3' Tetrahymena) sono introni capaci di
autosplicing - scoperti nei mitocondri
2 dei funghi, nei cloroplasti delle
5' piante ed in un'ampia varietà di
3' batteri.
Il meccanismo di autosplicing prevede:
1. Il taglio del sito di splicing al
3'
5'dell'introne
2. la formazione di una struttura a
3
cappio mediante un legame covalente
tra l'estremità 5' dell'introne ed
un residuo di adenosina prossimo
all'estremità 3' dell'introne
3. Taglio del sito di splicing al 3',
rilascio del cappio e giuntura
covalente degli esoni
Rimozione degli introni
nei pre-mRNA nelle
cellule animali
Il meccanismo di splicing è simile a
quella degli introni di gruppo II, con
la differenza che il pre-mRNA non è in
grado di realizzare da sé un self-
splicing ma necessita di una serie di
small nuclear RNA (snRNA) e delle loro
proteine associate che si assemblano
sull'RNA via via che viene trascritto a
formare ribonucleoproteine (RNP).
 Reazione di splicing
La prima reazione è mediata dal 2'-OH della A
del branch-point/punto di ramificazione che attua
un attacco nucleofilo sul gruppo fosfato della G
conservata al 5’ splice "acceptor" site o sito
accettore. L'introne si chiude su sé
stesso e rimane
legato all'esone a valle. E'
3' 5'
necessaria dunque una
seconda reazione in cui
l'introne viene liberato
5' 3'
come cappio/laccio "lariat":
 il 3’-OH libero dell'esone
a monte fa un attacco
nucleofilo al 3’
5' 3' 3' splice "acceptor" site sul
gruppo fosfato della G.
Come conseguenza i due
esoni si uniscono.
 Reazione di splicing

1
Formazione del "lariat"
Associazione di piccoli RNA nucleari (snRNA) e
piccole proteine nucleari agli introni
La rimozione di un introne richiede
l'associazione di diverse particelle
ribonucleoproteiche chiamate snRNP
(pronunciato snurp) agli introni
neotrascritti: ogni introne del pre-
mRNA si associa con un complesso
macromolecolare detto spliceosoma.
Sono coinvolte 5 particelle
snRNP (U1,U2,U5, U4/U6) ognuna
caratterizzata da 1 snRNA e
complessi di circa 8-20 piccole
proteine nucleari.
 Lo spliceosoma agisce come un ribozima
Gli small nuclear (snRNA) sono gli elementi cataliticamente attivi delle snRNP, mentre
le proteine giocano ruoli supplementari:​
 Mantengono la corretta struttura tridimensionale
degli snRNA e ne guidano i cambiamenti
conformazionali
 Trasportano gli mRNA maturi all'involucro nucleare
 Selezionano i siti alternativi di splicing da
utilizzare
Reazioni chimiche all'interno dello spliceosoma
 Early complex: U1 snRNP riconosce
lo splice-donor (formazione di ibridi
RNA-RNA). Il fattore accessorio U2AF si
lega al tratto polipirimidinico ed
interagisce con BBP che si lega al branch
point. U2AF interagisce anche con le
proteine SR che si legano agli enancher
esonici per lo splicing. Queste
interazioni giocano un ruolo importante
nel riconoscimento dei confini
introne/esone.
 Ciò favorisce il reclutamento di U2 snRNP
(Complex A) che attraverso interazioni
RNA-RNA riconosce il branch point site e
fa sporgere la A per l'attacco
nucleofilo.
 U4, U5, U6 snRNPs si uniscono al
complesso: U6 sostituisce U1 che esce.
Anche U2AF esce dal complesso
L'assemblaggio di uno spliceosoma coinvolge una serie di inetrazioni dinamiche sia del pre-
mRNA con specifici snRNA sia di specifici snRNA tra loro

Nel momento in cui entrano nel complesso con il pre-mRNA U4 ed U6

sono estesamente appaiati fra loro.
 Complex C: quando U4 si stacca da U6 per azione di RNA elicasi,
una porzione di U6 si appaia con alcune regioni di U2 ed
un'altra porzione di U6 resta localizzata a livello del sito di
splicing al 5' dove aveva spiazzato U1

 Si ritiene che U6 sia un ribozima e che U4 sia un inibitore

della sua attività catalitica.
 Una volta che U1 ed U4 sono stati rilasciati U6 è posizionato
in modo tale da catalizzare le due reazioni di esterificazione:
 La prima reazione genera il taglio del sito di splicing al 5':
l'esone libero al 5' è tenuto in posizione da U5 che
interagisce anche con l'intermedio a cappio che contiene
l'introne e l'esone al 3'.
 E' proprio U5 snRNP che supporta la ligazione
dello splice donor con lo Splice acceptor nella seconda
reazione di esterificazione.
 Gli snRNA riconoscono le
sequenze consenso e partecipano
alla catalisi

L'ibridazione RNA:RNA
è importante per lo splicing
 Lo splicing alternativo aumenta la
complessità e variabilità genetica

Spesso gli esoni codificano domini strutturali

con funzioni distinte.
Nel corso dell'evoluzione nuovi geni sono
emersi per effetto del rimescolamento degli
esoni – si osserva inoltre che esoni simili
sono presenti in proteine molto diverse fra
loro.
Diverse tipologie di splicing
 Regolazione
dello splicing
alternativo in
cellule
diverse
Una forma alternativa di splicing può avere effetti
patologici, alterare pathway di segnale e modificare la
risposta ai farmaci
Il complesso di splicing recluta proteine
che permettono il trasporto dell'mRNA dal
nucleo al citoplasma

Mentre gli introni che hanno subito lo splicing vengono

trattenuti nel nucleo e degradati, gli RNA maturi vengono
legati da proteine segnale che ne mediano il trasporto
regolato attraverso il poro nucleare.
Durante la sua maturazione l'RNA si associa ad un
corredo di proteine segnale per l'esportazione
attraverso il poro nucleare
Corredo di proteine segnale dell'mRNA maturo pronto
per essere esportato nel citosol

EJC (Exon Junction Complex): proteine che si legano ai confini esone-esone indicano che
l'mRNA ha subito uno splicing corretto.
CBC (Cap binding complex): segnala che il capping è avvenuto correttamente
PABP (Poli-A Binding Protein): segnala la corretta poiliadenilazione del trascritto
Nucleus restricted proteins: segnalano i trascritti che devono essere trattenuti nel nucleo
Nuclear export receptor: recettore contenente una sequenza segnale
 Trasporto attraverso
il poro nucleare

Il poro nucleare è una struttura complessa

costituita da circa 100 proteine alcune delle
quali sono deputate ad interagire con la
sequenza di segnalazione di esporto dal
nucleo al citosl presente sugli mRNA maturi.
Il trasporto attraverso il poro
nucleare è un trasporto attivo
che richiede la localizzazione
della GTPasi monomerica Ran:
 Ran-GDP nel citosol (grazie
all'attività di RAN-GAP che è
localizzata nel citosol)
 Ran-GTP nel nucleo (grazie a
Ran-GEF che è legata alla
cromatina e quindi agisce nel
nucleo
 Una volta nel citoplasma alcune proteine vengono rimosse,
mentre altre sopraggiungono, per la traduzione

Quando l’mRNA è esportato nel citosol il recettore di esportazione si dissocia dall’mRNA e

viene reimportato nel nucleo, dove può essere usato di nuovo
 L'apparato richiesto per la maturazione
dell'RNA e l'esportazione nel citoplasma
agisce insieme alla polimerasi come parte
di un enorme "fabbrica dell'mRNA"