FATTORI CHE CONTRIBUISCONO ALLA PERDITA DI ESPRESSIONE DI GENI VIRALI NEL

LINFOMA DI BURKITT

La perdita dell’espressione dei geni virali nelle cellule tumorali di BL non è casuale; L'espressione del gene
virale del BL è simile nelle biopsie tumorali. Sebbene non comprendiamo appieno i meccanismi alla base di
questo modello di espressione, ci sono prove che forniscono scorci sulle forze che modellano la perdita di
una certa espressione genica virale. Ad esempio, in uno studio in cui le cellule B sono state trasformate da
un derivato di EBV in cui EBNA2 funziona in modo condizionale e c-Myc veniva espresso a livelli elevati in
modo costitutivo, è stato riscontrato che le cellule non esprimono più LMP1 quando EBNA2 è inibito (Polack
et al., 1996), ma hanno continuato a proliferare. Questo studio mostra che c-Myc, se espresso a livelli
sufficientemente alti, può compensare la perdita sia di EBNA2 che di LMP1. Un altro insieme di geni cellulari
che possono compensare la perdita di espressione dei geni virali in BL appartiene alla via di segnalazione di
Notch, che è nota per essere sovraregolata in BL (He et al., 2009). E’ stato dimostrato che il signaling di
Notch-2 tramite Delta-like ligand 1 inibisce l'inizio della trascrizione di LMP1 mediato da EBNA2 (Rowe et
al., 2014 Inoltre, un alto livello di espressione di Notch intracellulare introdotta nelle cellule in cui EBNA2
funziona ha inibito condizionatamente l'espressione di LMP1 (Gordadze et al., 2001). Queste osservazioni
indicano che livelli aumentati di segnalazione Notch possono compensare la perdita di espressione di LMP1.
Alcune linee cellulari del BL dipendono meno dal virus per la proliferazione e la sopravvivenza rispetto ad
altre (Vereide e Sugden, 2011). Quando EBV è stato espulso dalle linee cellulari BL, quei BL che in
precedenza esprimevano più geni virali subiscono l'apoptosi più rapidamente di quelli che esprimevano
meno geni virali. Un latency I BL che esprimeva il minor numero di geni virali ha continuato a proliferare
lentamente anche in assenza di EBV. Molti di questi geni di latenza virale persi sono essenziali per
trasformare le cellule B, il che indica che deve esserci una sorta di compensazione funzionale quando questi
geni virali vengono persi. È probabile che questa compensazione avvenga attraverso le mutazioni cellulari
che potenzialmente possono essere identificate attraverso il sequenziamento dei BL primari. Nella sezione
successiva, discuteremo le mutazioni cellulari comuni trovate in BL, mutazioni specifiche dei BL positivi per
EBV e come queste mutazioni potrebbero compensare la perdita di espressione dei geni virali.

MECCANISMI PER CELLULARE RISARCIMENTO PER LA PERDITA DI ESPRESSIONE DI

EPSTEIN - GENI DEL VIRUS BARR NEL LINFOMA DI BURKITT

Regolazione dell'apoptosi

Con il recente aumento della disponibilità e dell'accessibilità economica del sequenziamento dell'intero
genoma, ora c'è una pletora di informazioni sul carico mutazionale cellulare dei tumori, compresi i BL. Gli
studi che confrontano i BL positivi per EBV con i tumori privi del virus hanno confermato risultati paralleli
nelle cellule in coltura. I tumori positivi all'EBV hanno un significativo minor numero di mutazioni nei geni
che influenzano l'apoptosi rispetto ai tumori EBV-negativi (Grande et al., 2019), supportando i risultati che
EBV inibisce l'apoptosi nelle linee cellulari BL. In effetti, molti dei geni di latenza di EBV prendono di mira le
vie apoptotiche, e questo è stato ipotizzato precocemente quando l'espulsione del virus dalle linee cellulari
BL ha causato la morte per apoptosi (Kennedy et al., 2003). Esperimenti successivi con linee cellulari di BL
Wp-restricted hanno scoperto che queste linee cellulari tumorali erano molto più resistenti ai trigger di
morte cellulare rispetto alle linee EBV negative o latenza I BL (Kelly et al., 2005; Kelly et al., 2006). EBNA3A e
EBNA3C - che sono espressi in BL con Wp limitato - hanno mostrato di downregolare Bim (Anderton et al.,
2008), fornendo un meccanismo per la maggiore resistenza all'apoptosi osservata in questo sottogruppo di
tumori BL EBV-positivi. I BL con limitazioni possono anche esprimere BHRF1, un gene virale che interferisce
con Bim e altre proteine pro-apoptotiche (PUMA, BID, BAK) per prevenire l'apoptosi nelle cellule BL
(Desbien et al., 2009; Fitzsimmons et al., 2018; Fitzsimmons et al., 2020). La scoperta che i BL che mancano
di EBV contengono più mutazioni cellulari nei geni apoptotici, incluse significativamente più mutazioni in
TP53 (Grande et al., 2019), supporta ulteriormente l'ipotesi che le mutazioni nei geni cellulari legati
all'apoptosi possano compensare la perdita di espressione dei geni di EBV nei BL.

Mutazioni nei geni tipicamente bersagliate da Epstein - Barr Virus ' miRNA

Oltre a codificare diverse proteine virali, EBV codifica almeno 40 miRNA che possono colpire i geni cellulari.
In effetti, è stato scoperto che pochi geni virali sono bersagli dei miRNA dell'EBV (Pfeffer et al., 2004; Riley
et al., 2012; Skalsky et al., 2012; Jung et al., 2014), portando all'ipotesi che abbiano maggiori probabilità di
colpire i geni cellulari mediante inibizione della traduzione o degradazione dell'mRNA. I geni cellulari presi
di mira dai miRNA dell'EBV possono essere un'altra via con cui la perdita di espressione dei geni EBV può
essere compensata da mutazioni nei geni cellulari. Questi geni cellulari, se opportunamente mutati,
potrebbero fornire funzioni simili ai geni trasformanti di EBV e quindi potrebbero trovarsi mutati anche nei
BL negativi per EBV. Si sa molto su come I miRNA di EBV gestiscano la risposta immunitaria dell'ospite
all'infezione da EBV (rivisto in Albanese et al., 2017); qui ci concentreremo sui bersagli cellulari confermati
dei miRNA di EBV (recensiti in Kuzembayeva et al., 2014) che quando mutato può compensare i geni
trasformanti virali che sono sottoregolati nei tumori BL. Collettivamente, quando I miRNA BART di EBV sono
stati espressi nelle cellule indotte a perdere il virus, la loro presenza proteggeva le cellule dall'apoptosi nelle
linee cellulari BL. Ulteriori indagini hanno mostrato che il cluster di miRNA BART targettano la Caspasi 3 per
inibire l'apoptosi in queste cellule BL ( Vereide et al., 2014 ). Le linee cellulari BL utilizzate per questi
esperimenti esprimevano solo una proteina virale, EBNA1, indicando che l'inibizione della Caspasi 3 da
parte dei miRNA di EBV compensa la perdita di altri geni EBV che bloccano l'apoptosi. Un altro esempio di
compensazione funzionale cellulare è probabilmente attraverso miRNA BART6-3p che inibisce PTEN ( Cai et
al., 2015 ). È interessante notare che Ambrosio et al. hanno scoperto che i livelli proteici di PTEN sono
significativamente inferiori nei BL positivi per EBV rispetto ai BL negativi per EBV (Ambrosio et al., 2014).
Questa scoperta supporta un meccanismo in cui un miRNA virale inibisce la traduzione di PTEN. Questa idea
è supportata anche dalla scoperta che ci sono più mutazioni di PTEN identificate in BL negativi per EBV
rispetto a BL positivi per EBV, sebbene la frequenza complessiva con cui le mutazioni di PTEN si verificano in
BL è solo del 4% (Grande et al., 2019). Eppure, EBV beneficia enormemente dalla codifica dei miRNA dato
che occupano relativamente poco spazio genomico, si pensa che non siano immunogenici e regolino
chiaramente i geni cellulari per supportare la trasformazione. Se, come suggerisce l'evidenza emergente, le
vescicole extracellulari e / o gli esosomi contenenti miRNA virali, EBER e altri piccoli RNA virali sono
funzionali, possono supportare la linfomagenesi (rivista in Zhao et al., 2019). Attraverso la secrezione di
queste vescicole ad altre cellule o attraverso l'espressione di miRNA virali in cellule infettate da EBV,
mutazioni nei bersagli cellulari dei miRNA di EBV possono superare il requisito di questi miRNA e ridurre la
dipendenza dei BL da EBV.

Regolazione trascrizionale
Diversi studi dimostrano che l'EBV influenza l'espressione dei geni cellulari in modo trascrizionale, anche
attraverso meccanismi epigenetici. Ad esempio, Hernandez-Vargas et al. hanno scoperto che la presenza
del virus era la variabile più significativa nella variazione della metilazione del DNA in linee di cellule BL EBV-
positive rispetto a quelle EBV-negative (Hernandez-Vargas et al., 2017). Lo stesso studio ha anche scoperto
che due geni cellulari comunemente mutati in BL, TCF3 e il suo regolatore negativo ID3, aveva diversi
modelli di metilazione a seconda della presenza o assenza dell'EBV. In più analisi genome-wide di tumori
primari BL, le mutazioni nei geni cellulari coinvolti nella regolazione epigenetica erano significativamente
più frequenti nelle biopsie EBV-positive (Kaymaz et al., 2017; Grande et al., 2019; Panea et al., 2019). Questi
includono KMT2D, HIST1H1E, CHD8, e BCL7A, con alcuni geni aggiuntivi identificati che coinvolgono
percorsi regolatori epigenetici inclusi DNMT1. È stato riscontrato che sia LMP1 che LMP2A aumentano
l'espressione delle DNA metiltransferasi, incluso DMNT1 nei carcinomi, determinando l'inibizione dell'E-
caderina (CDH1) e l’espressione di PTEN ( Tsai et al., 2006 ; Hino et al., 2009 ). EBNA2 e EBNA3A, 3B e 3C
regolano la trascrizione interagendo con il macchinario trascrizionale cellulare. È stato riscontrato che
EBNA2 lega i membri del complesso SWI / SNF coinvolti nella funzione dell’enhancer ( Wu et al., 1996 ;
Alver et al., 2017 ) mentre tutte e quattro le proteine EBV possono associarsi al fattore di trascrizione
cellulare, RBPJ, in misura diversa per favorire la trascrizione da sottoinsiemi di geni parzialmente
sovrapposti ma distinti ( Wang et al., 2016 ). Questa regolazione trascrizionale mediata dal virus deve
essere superata da alterazioni nel macchinario cellulare per consentire con l'evoluzione dei BL la perdita di
espressione di EBNA2 e dei geni trasformatori di EBNA3.
È stato scoperto un meccanismo diverso per EBNA1 per contribuire alla trascrizione dei geni cellulari.
Coppotelli et al. hanno sottolineato la somiglianza del Dominio AT-hook di EBNA1 alle proteine HMGA (High
Mobility Group A) (Coppotelli et al., 2013). Essi hanno scoperto che EBNA1, analogamente alle proteine
HMGA, può aiutare la decondensazione della cromatina e aumentare la mobilità dell'istone H1. Questo
ruolo per EBNA1 è presumibilmente mediato dal suo legame specifico ai siti nel DNA cellulare (Dresang et
al., 2009). Sebbene sia possibile immaginare meccanismi in cui il mimetismo di EBNA1 verso proteine
HMGA è abrogato, il suo ruolo nel mantenere i genomi dell'EBV come plasmidi appare essenziale.
Un approccio recente ha identificato i geni cellulari che regolano l'espressione dei geni di EBV e hanno
rivelato che sia DNMT1 che UHRF1 sono fondamentali per disattivare l'espressione di più geni trasformanti
virali espressi dai promotori C, W e LMP nelle linee cellulari BL (Guo et al., 2020). Finché esistono funzioni
cellulari, wild-type o mutanti, che possono compensare la perdita dei geni trasformanti di EBV, DNMT1 e
UHRF1 favorirebbero la fuga dei BL dal riconoscimento immunitario degli antigeni virali.