Dipartimento Clinico Assistenziale Oncologico Unit Operativa di Ematologia Centro Trapianto di Cellule Staminali

Leucemie acute e PCR: diagnostica e valutazione della malattia residua

D.ssa Sabrina Coluzzi

Lematopoiesi

Leucemie acute
Le leucemie derivano da alterazioni molecolari presenti a livello di un precursore ematopoietico

Leukemic Stem Cell

La popolazione leucemica eterogenea: solo una piccola percentuale di queste cellule ha capacit di autorinnovamento e mostra una multidrug resistance Queste caratteristiche spiegano limportanza di tecniche (come la PCR) volte alla individuazione di eventuali cellule leucemiche residue dopo lottenimento di una risposta apparentemente completa

Percorso diagnostico
Emocromo Morfologia delle cellule Esami citochimici Esami citofluorimetrici Indagini citogenetiche Indagini molecolari

Classificazione leucemie (WHO)

1. LMA CON TRASLOCAZIONI GITOGENETICHE RICORRENTI
LMA con t(8;21)(q22;22), AML1(CBF )/ETO Leucemia Promielocitica Acuta [LMA con t(15;17)(q22;q11-12) e varianti PML/RAR ] LMA con ipereosinofilia midollare [inv(16)(p13;q22) o t(16;16)(p13;q11), CBF /MYH11X] LMA con anomalie 11q23 Secondaria a sindrome mieloproliferative De novo mielodisplastica o sindromi mielodisplastiche/malattie

2. LMA CON DISPLASIA MULTILINEARE

3. LMA E SINDROMI MIELODISPLASTICHE SECONDARIE A CHEMIOTERAPIA Secondaria ad agenti alchilanti Secondaria a epipodofillotossine Alti tipi 4. LMA NON ALTRIMENTI CLASSIFICATA LMA con differenziazione minima LMA senza maturazione LMA con maturazione Leucemia mielomonocitica acuta Leucemia monocitica acuta Leucemia eritroide acuta Leucemia megacariocitica acuta Leucemia basofila acuta Panmielosi acuta con mielofibrosi Sarcoma mieloide (granulocitico)

Traslocazioni citogenetiche ricorrenti

Rappresentano il 15-20% delle LAM Sono alterazioni del core binding factor, complesso proteico essenziale per lematopoiesi, che normalmente attiva una istone acetiltrasfrasi e la trascrizione di fattori di differenziamento Il complesso, se mutato, attiva una istone deacetilasi e quindi si ha blocco trascrizionale e blocco differenzitivo Hanno prognosi favorevole

Rilevamento trascritti di fusione

Estrazione RNA Retrotrascrizio ne Amplificazione Corsa su gel di agarosio 2% Osservazone agli UV

Monitoraggio mediante RQ-PCR

Il livello di espressione del trascritto quantizzato in Real Time Numero Copie trascritto/Numero Copie ABL x 104 Una riduzione al follow-up di tre logaritmi considerata remissione

Follow up AML1 ETO

Classificazione leucemie (WHO)

1. LMA CON TRASLOCAZIONI GITOGENETICHE RICORRENTI
LMA con t(8;21)(q22;22), AML1(CBF )/ETO Leucemia Promielocitica Acuta [LMA con t(15;17)(q22;q11-12) e varianti PML/RAR ] LMA con ipereosinofilia midollare [inv(16)(p13;q22) o t(16;16)(p13;q11), CBF /MYH11X] LMA con anomalie 11q23 Secondaria a sindrome mieloproliferative De novo mielodisplastica o sindromi mielodisplastiche/malattie

2. LMA CON DISPLASIA MULTILINEARE

3. LMA E SINDROMI MIELODISPLASTICHE SECONDARIE A CHEMIOTERAPIA Secondaria ad agenti alchilanti Secondaria a epipodofillotossine Alti tipi 4. LMA NON ALTRIMENTI CLASSIFICATA LMA con differenziazione minima LMA senza maturazione LMA con maturazione Leucemia mielomonocitica acuta Leucemia monocitica acuta Leucemia eritroide acuta Leucemia megacariocitica acuta Leucemia basofila acuta Panmielosi acuta con mielofibrosi Sarcoma mieloide (granulocitico)

Difficolt diagnostiche
Tuttavia, solo nel 50% dei casi si riscontrano alterazioni genetiche, utili per indirizzare il clinico verso un sottotipo neoplastico piuttosto che un altro Nei rimanenti casi la diagnosi si deve attualmente avvalere delle tecniche precedentemente accennate

Nuovi marker molecolari

Sono in corso studi multicentrici per individuare nuovi markers molecolari Lattenzione si focalizzata principalmente su: - FLT3 (fms-like tyrosine kinase) - WT1 (Wilms tumor 1)

FLT3
Recettore tirosin-chinasi presente sulla superficie dei progenitori ematopoietici Fondamentale per sopravvivenza e differenziazione delle cellule

Pathway di FLT3

Genetica di FLT3
Nel 30% dei casi di LAM si osserva mutazione di FLT3 ITD, associata a leucocitosi ed alto numero di blasti. Tale mutazione consiste in una ripetizione da 3 a 400 nucleotidi nel dominio iuxtamembrana di FLT3
Normal Exon 14 Intron Exon 15

Exon 14 Abnormal

Intron

Exon 15

ITD

Rilevamento FLT3-ITD
Estrazione di DNA Amplificazione con primers specifici sugli esoni 14 e 15 Corsa elettroforetica su gel 2% agarosio Visualizzazione agli UV

FLT3-ITD

34%

32%
31%

Impatto di FLT3-ITD

RISCHIO DI RICADUTA ITD + Citogenetica favorevole Citogenetica intermedia Citogenetica sfavorevole 37% 67% 75% ITD 29% 43% 76%

Rilevamento FLT3 D835 mut

Estrazione di DNA Amplificazione con primers specifici sulla regione TK Digestione con Eco RV Corsa elettroforetica su gel 2% agarosio Visualizzazione agli UV Le bande non digerite (mutate) sono sequenziate

FLT3 D835 mut

Presente nel 5-10% dei casi di LAM CN Ha un minore impatto sulla prognosi rispetto a FLT3ITD

FLT3: considerazioni
Attualmente FLT3 un ottimo marker prognostico in pazienti a citogenetica negativa Nei pazienti a citogenetica nota deve essere correlato con la specifica alterazione

FLT3: livelli di espressione

I livelli di espressione di FLT3 correlano con la conta dei blasti nel midollo Sono pi alti in M5, bassi in M3

FLT3: livelli di espressione

Ancora pochi studi tendono a considerare i livelli di espressione di FLT3 wt un utile marker prognostico

WT1:nuovo marker molecolare

WT1 una proteina con probabile funzione di oncosoppressore che recentemente stato correlato a molte forme leucemiche Presenta tre domini zinc-finger codificati dagli esoni 7 e 9 in grado di legare il DNA Il suo mRNA espresso a bassi livelli nel paziente sano, invece nel paziente leucemico iper-espresso

WT1: PCR Real Time

Estrazione RNA dal campioni Retrotrascrizione a cDNA Amplificazione del cDNA di WT1 e di Abl (gene housekeeping) N copie WT1/N copie Abl x 104

Range di riferimento in campione normale

Range di riferimento in campione patologico

WT1
Diventa fondamentale la quantizzazione dellmRNA di WT1 per: Diagnosi di leucemia acuta Follow up del paziente nel tempo. evidente che mediante WT1 possano essere seguiti anche pazienti privi di alterazioni citogenetiche e molecolari evidenti

WT 1 e inv16 (CBF -MYH11)

WT1 e inv16 post allotrapianto

Casi Clinici

AREB stazionaria: NCN 137

Threshold cycle

Leucemia acuta T(8;21): NCN 369 AREB in evoluzione: NCN 1794

Log starting quantity, copy number

WT1:vantaggi
WT1 appare pi sensibile degli altri markers genetici precedentemente utilizzati WT1 rappresenta un marker prognostico di altissima importanza nel prevedere landamento di una terapia o la ricaduta del paziente

WT1: aggiornamenti
Recentemente, si osservata anche una correlazione tra il grado mutazionale di WT1 e la prognosi Sono state riscontrate mutazioni negli esoni 7 e 9 che determinano una perdita dei domini zinc-finger Ci non comporta una diversa risposta alla terapia, bens una maggiore possibilit di ricaduta

Mutazioni di WT1 e prognosi

Correlazione tra WT1 mutato ed alterazioni molecolari classiche

WT1: considerazioni
Al momento, WT1 rappresenta il marker prognostico pi importante per il follow up delle leucemie Ha infatti valore prognostico in tutti i tipi di leucemia utile per valutare ogni singolo caso indipendentemente

Conclusioni
Con il termine LAM si intende un insieme eterogeneo di patologie ematologiche La individuazione di marker molecolari fondamentale per inquadrare le LAM in sottogruppi distinti per prognosi e scelte terapeutiche Le recenti scoperte, principalmente di WT1 e FLT3, sono di notevole supporto alla diagnosi e al follow up

Grazie per lattenzione!