Lezione 3 (13 ottobre)

IL RUOLO DEL PTP NELLA MORTE CELLULARE

Un importante ruolo nella NECROSI è giocato dal PTP=Permeability Transition Pore; in italiano: il
poro di transizione della permeabilità mitocondriale.
La COMPOSIZIONE MOLECOLARE del PTP è ancora in fase di definizione; è molto complessa (è
formato da proteine).
Il PTP è un CANALE che mette in comunicazione la MATRICE MITOCONDRIALE con il CITOSOL.
Quando il CANALE è CHIUSO, la MATRICE MITOCONDRIALE è ISOLATA rispetto allo SPAZIO
INTERMEMBRANA e il MITOCONDRIO FUNZIONA NORMALMENTE.
Quando il PTP si APRE, la MEMBRANA DEL MITOCONDRIO è PERMEABILE al PASSAGGIO di
ACQUA--> l’ACQUA ENTRA nel MITOCONDRIO (perché la matrice mitocondriale è più
concentrata rispetto al citoplasma), che può GONFIARSI fino a SCOPPIARE; inoltre, attraverso il
canale possono USCIRE dei componenti importanti per attivare vari fenomeni coinvolti nella
morte cellulare.

CONTRIBUTO DEL DANNO DA RIPERFUSIONE ALLE DIMENSIONI DELL’AREA INFARTUATA

Per parlare del PTP, il modello di malattia più rilevante nella
patologia umana è l’infarto del miocardio.
Supponiamo di avere dei modelli sperimentali animali in cui è
stata ricreata una situazione di ischemia, in diverse situazioni, e
studiamo il contributo del danno da riperfusione alle dimensioni
dell’area infartuata (quanta necrosi è dovuta al danno in sé e
quanta al danno da riperfusione):
v Quando NON non c’è stata possibilità di fare
RIPERFUSIONE (in alto a dx)--> TUTTA l’AREA che era
irrorata dall’arteria (che è stata occlusa) è andata in
NECROSI; quasi sicuramente l’infarto ha causato la morte dell’animale (o se fossimo
Figura 1 A sinistra: barra delle dimensioni dell’infarto.
nell’uomo, avrebbe causato la morte del paziente) A destra: immagini di modelli sperimentali (sezioni trasversali
v Nella situazione migliore (in centro a dx): il paziente giunge di un cuore di topo); la zona biancastra è la zona dell’infarto;
le cellule in questa porzione sono morte.
all’ospedale e viene RIPERFUSO; in questo caso la zona
d’infarto è presente, ma l’AREA INFARTUATA è MOLTO RIDOTTA rispetto al caso
precedente, il danno è meno esteso--> il resto del cuore può continuare a funzionare e il
paziente sopravvive all’infarto; questo danno però è comunque abbastanza esteso e si può
avere adverse remodelling in seguito a riperfusione--> il cuore va incontro ad alterazioni
progressive che portano allo scompenso cardiaco--> in molti casi i pazienti che sopravvivono
all’infarto del miocardio non sono completamente guariti, presentano elevata probabilità di
avere un altro infarto (spesso anche letale) e devono essere trattati farmacologicamente.
Una parte delle cellule dell’area infartuata sono morte a causa dell’ischemia e per quanto
rapido sia l’intervento per fare riperfusione, questo danno non può essere evitato
completamente; una parte delle cellule invece muore conseguentemente a danno da
riperfusione--> quanto grande è la zona dell’area danneggiata che potrebbe essere protetta se
fosse possibile prevenire il danno da riperfusione?
v Nell’immagine in basso a sx è stato applicato un trattamento che riduce il danno da
riperfusione--> l’AREA NECROTICA si RIDUCE DI MOLTO; il cuore non torna come nuovo (si
ha comunque un’area necrotica) ma la probabilità che il cuore vada incontro a scompenso è
minore perché il danno è meno esteso. Quali possono essere questi approcci di
cardioprotezione? Ce ne sono diversi (vediamo il PTP).
 Noi abbiamo preso come modello, come esempio, il danno da
infarto del miocardio e il danno cellulare da riperfusione, per
spiegare dei fenomeni che sono in realtà condivisi da molte altre
patologie (è rappresentativo anche di altre patologie), anche
molto diverse rispetto all’infarto, in cui si pensa possano essere
coinvolti gli stessi meccanismi:
- lo stress ossidativo (produzione eccessiva di ROS)
- alterazioni nell’omeostasi del calcio
- la disfunzione energetica del mitocondrio ma anche alterazione nella glicolisi nel citosol
sono eventi comuni a diverse malattie--> possono portare a morte cellulare--> quando questa
morte cellulare è estesa, può portare ad un danno tissutale e quando il danno tissutale è esteso
può portare alla disfuzione dell’organo.
Questo danno può non essere acuto (ovvero può non avvenire come danno improvviso di grande
entità): può avvenire all’accumulo negli anni di piccoli danni.

I MITOCONDRI E IL PTP
Il mitocondrio è considerato un organello fondamentale per la vita della cellula perché è la fonte
principale di produzione di energia. Quando parliamo di morte cellulare, il mitocondrio funziona
anche come INTEGRATORE di segnali cellulari e stress, ovvero un organello che interpreta la
situazione a livello cellulare e, in condizioni di danno esteso, da il via a fenomeni che possono
portare alla morte cellulare: esprime dei fattori che, in presenza di danno esteso (che causerà
morte cellulare), iniziano a funzionare in maniera opposta rispetto a quanto fanno normalmente--
> non contribuiscono alla sopravvivenza della cellula (ruolo fisiologico) bensì a ucciderla (questo
vale sia nella necrosi, sia nell’apoptosi).

Nel caso specifico della necrosi (prevalentemente), un ruolo importante è

svolto dal PTP.
Il PTP mette in contatto la matrice e il citosolo e può essere aperto o
chiuso: quando è chiuso non c’è comunicazione; quando è aperta c’è
comunicazione e possono passare, in entrambe le direzioni, liquido, ioni, Figura 2 IMM=membrana mitocondriale
piccole molecole. interna; OMM=membrana mitocondriale
esterna; c=citocromo; mPTP=PTP,
Quando invece parliamo di apoptosi: sono importanti le proteine della indifferente
famiglia Bcl2, che regolano la formazione di canali nella membrana mitocondriale esterna e sono
coinvolte nella regolazione dell’apoptosi.

Quindi il mitocondrio gioca un ruolo chiave nella morte cellulare, regolando la sua permeabilità
tramite il PTP, prevalentemente nella necrosi (ma si pensa possa essere coinvolto anche nella
morte cellulare per apoptosi) e tramite le proteine Bcl2 per l’apoptosi.
La distinzione tra necrosi e apoptosi però è stata superata; quindi, diciamo che quando c’è una
regolazione della morte cellulare, sia il PTP sia il Bcl2 possono giocare un ruolo importante.
COMPONENTI IMPORTANTI PER L’ATTIVITA’ DEL PTP
La composizione molecolare del PTP NON è ancora nota. Si
pensa però che la CICLOFILINA D sia una COMPONENTE
REGOLATORIA del canale (ne facilita l’apertura). Alcune di
queste MOLECOLE REGOLATORIE, tra cui la CICLOFILINA D,
possono essere bersaglio di TERAPIA FARMACOLOGICA.
Sulla MEMBRANA MITOCONDRIALE INTERNA, inoltre, ci sono
una serie di molecole che sono state estesamente studiate nella
fosforilazione ossidativa e nella bioenergetica mitocondriale.
Alcune di queste molecole sono importanti per la struttura del PTP.
In particolare, c’è un complesso detto ATP SINTETASI, l’ultima componente della catena
respiratoria, che genera le molecole di ATP; questo complesso proteico sembra essere coinvolto
nella formazione del PTP.

CONSEGUENZE DELL’APERTURA DEL PTP

Cosa accade quando si verifica l’apertura di questo poro mitocondriale? A seguito dell’apertura
del poro mitocondriale, si verifica la perdita di alcune caratteristiche fondamentali del
mitocondrio:
- il mitocondrio ha un GRADIENTE ELETTROCHIMICO fondamentale per produrre ATP; esso
può essere mantenuto perché la matrice è sigillata rispetto all’esterno; quando la matrice
mitocondriale viene messa in comunicazione con l’esterno (all’apertura del PTP), non si può
più mantenere il gradiente protonico--> quando si apre il PTP, la respirazione mitocondriale
cessa (non viene più prodotta ATP per fosforilazione ossidativa).
- nella matrice mitocondriale sono presenti concentrazioni più elevate di calcio rispetto al
citosol (centinaia di volte di più rispetto al citosol, ma comunque meno rispetto all’esterno
della cellula) --> quando si apre il PTP, il calcio passa secondo gradiente di concentrazione
dall’interno del mitocondrio al citoplasma; ci sono proteine che facilitano questo passaggio.
- la matrice del mitocondrio è molto più concentrata e densa rispetto al citoplasma (contiene
molte più proteine) --> quando si apre il canale, l’acqua tende ad entrare per osmosi nel
mitocondrio--> i mitocondri si gonfiano fino a scoppiare--> morte cellulare.

Come viene scatenata l’apertura del poro? L’eccessiva produzione di ROS e l’aumento del calcio
(a livello extracellulare credo) sono due fenomeni che portano all’apertura del poro.

Vediamo due fotografie al microscopio elettronico: sono

due sezioni di mitocondri.
Nell’immagine A, l’esterno del mitocondrio è circoscritto
dalla membrana mitocondriale esterna; la membrana
mitocondriale interna è circonvoluta. La struttura molto
densa che si vede all’interno è dovuta alle circonvoluzioni
della membrana interna; all’interno di essa: matrice
mitocondriale. Hanno grandezza omogenea, sono regolari.
Se diamo substrati specifici (es piruvato), questi mitocondri
possono fare normale fosforilazione ossidativa.
Nell’immagine B: possiamo mimare l’apertura del PTP in
vitro (ciò che succede durante l’infarto di un paziente); se aggiungiamo agenti ossidanti o
aumentiamo la quantità di calcio in vitro--> il PTP si apre--> c’è un rilascio di molecole verso
l’esterno dal mitocondrio e un ingresso di liquido all’interno del mitocondrio--> la dimensione dei
mitocondri è maggiore; all’interno si vede uno spazio bianco: l’acqua entra nella matrice, la
matrice si è espansa e la membrana interna diviene più adesa alla membrana esterna quindi non si
vedono le circonvoluzioni; in alcuni casi i mitocondri scoppiano e riversano il contenuto
all’esterno.
Questo saggio può essere usato per fare analisi quantitative: possiamo misurare con uno
spettrofotometro l’assorbanza dei mitocondri--> quando sono normali assorbono luce; quando il
PTP è aperto, fanno passare più luce perché la soluzione diviene più limpida (cala l’assorbimento
spettrofotometrico).

PTP E MALATTIE
L’apertura del PTP è coinvolta nell’eziologia e nella progressione di
diverse patologie, tra cui: malattie neurodegenerative (es
Parkinson, Huntington, Alzheimer, SLA), l’ischemia/danno da
riperfusione, distrofie (es Duchenne), complicanze del diabete
(retinopatia, nefropatia).
Il danno da stress ossidativo, il signaling di calcio irregolare e la
disfunzione mitocondriale è comune a tutte queste malattie.
In europa e negli USA è stato approvato un farmaco che regola l’apertura del PTP, utilizzato per
trattare la sclerosi laterale amiotrofica (SLA, malattia neurodegenerativa, dove l’apertura del PTP
porta ad un aumento della morte cellulare).

PTP NELL’ISCHEMIA/DANNO DA RIPERFUSIONE

Cosa succede quando si passa dallo stato di ischemia a quello di riperfusione? Quali sono gli
eventi?
In condizioni normali, in un cuore sano, i mitocondri sono
funzionali, respirano normalmente.
A concentrazioni fisiologiche del calcio, la
concentrazione di calcio nel mitocondrio è più alta
rispetto al citoplasma, ma non può stimolare l’apertura
del PTP; la concentrazione di calcio nel mitocondrio è
regolata grazie alla presenza di canali che portano il
calcio all’interno e canali che portano il calcio all’esterno--> l’omeostasi del calcio tra citoplasma e
mitocondrio è regolata dalla presenza di questi canali.
Tuttavia, mentre il canale che porta calcio all’interno è molto capace (quindi più calcio c’è
all’esterno, più calcio viene portato nei mitocondri), il canale che porta il calcio fuori dai
mitocondri è un canale che può essere saturato (quindi se c’è molto calcio all’interno dei
mitocondri questo canale non può pompare sufficientemente calcio all’esterno del mitocondrio)--
> aumenta la concentrazione di calcio nel mitocondrio.
In condizioni normali la concentrazione di calcio nel mitocondrio non porta il canale a saturazione.

In condizioni di ischemia: la cellula non riceve più

ossigeno né nutrienti--> in assenza di O2, il
mitocondrio non può più fare fosforilazione ossidativa.
All’interno della cellula, se non avviene più
respirazione, aumenta la glicolisi e viene prodotto il
piruvato. Inoltre, poiché il piruvato non viene più
convertito e non entra più nel ciclo di Krebs, c’è un
enzima che converte il piruvato in acido lattico (questo
accade normalmente anche durante uno sforzo muscolare intenso nelle cellule muscolari
scheletriche). L’acido lattico acidifica il citoplasma, dunque, il pH cellulare si abbassa (aumentano
gli ioni H).
Quando il pH si abbassa, si hanno effetti negative ma le cellule sono ancora vive, relativamente
funzionanti, non respirano e cercano di adattarsi a questa condizione di stress. Per ridurre il pH è
possibile sfruttare dei canali presenti sulla membrana citoplasmatica che scambiano ioni (in
particolare un sistema di anti-trasporto Na+/H+: Na+ entra in cellula e gli ioni H+ vengono estrusi
per aumentare il pH). Per aumentare il pH però aumenta la quantità di ioni sodio in cellula; la
concentrazione di ioni sodio deve essere regolata; normalmente quando entrano ioni sodio
all’interno, esistono altre pompe che estrudono sodio per ristabilire la normale concentrazione. La
cellula però è in deficit energetico (no fosforilazione e la glicolisi non riesce a far fronte a tutte le
necessità energetiche della cellula) --> il sodio non può essere trasportato all’esterno e si
accumula in cellula.
Quando il sodio si accumula in cellula però, può essere sfruttata un’altra molecola, che non
necessita di ATP per funzionare: il canale sodio/calcio antiporto--> porta fuori ioni sodio ma porta
dentro ioni calcio.
Quindi il risultato di tutti questi eventi molecolari che avvengono durante l’ischemia, è un
aumento di ione Ca++. Se questa condizione si protrae nel tempo (senza avere riperfusione), il
calcio inizia ad attivare proteasi, lipasi ecc--> la cellula muore. Quindi se non si ha riossigenazione
la cellula muore.

Cosa succede se però riusciamo a fare riperfusione?

Quando si esegue riperfusione, la cellula continua a
funzionare, ricomincia la respirazione ma il mitocondrio
in una fase iniziale produce grandi quantità di ROS;
questo è uno stimolo per l’apertura del PTP.
Il calcio, aumentato nel citoplasma, entra all’interno del
mitocondrio (è il canale che non ha saturazione--> più ca
ho nel citoplasma, più ca entra nel mitocondrio); il mitocondrio cerca di tenere la concentrazione
di calcio bassa nella matrice mitocondriale attraverso un altro canale che però può essere
saturato--> la concentrazione di calcio nel mitocondrio rimane elevata.

La concentrazione di calcio elevata e la produzione di ROS

portano all’apertura del PTP e allo scoppio del mitocondrio-->
sono rilasciate delle molecole che causano la morte della
cellula.
Quindi nel caso di riperfusione è l’apertura del PTP che causa
morte della cellula.

Come aumentano i ROS?

Si pensa che quando il mitocondrio, che aveva smesso di fare
fosforilazione ossidativa per un certo periodo, ricomincia a
fare respirazione, la catena di trasporto degli elettroni
funziona al contrario--> si ha reverse electron transport: il
flusso di elettroni avviene in direzione opposta. Il
funzionamento al contrario del mitocondrio sarebbe
responsabile dell’aumento della produzione di ROS.

Si sta cercando di intervenire per chiudere il PTP e per evitare un aumento nella produzione di
ROS.
Questi eventi sono eventi transitori cui la cellula va incontro nella fase di ossigenazione; se non c’è
l’apertura del poro, la cellula riesce a salvarsi quando c’è la riossigenazione. Questo è il motivo per
cui riperfondiamo.
In altre cellule però si ha l’apertura del poro e muoiono. Se riusciamo a evitare l’apertura del poro
però, salviamo le cellule.

IDENTIFICAZIONE DELLE COMPONENTI DEL PTP

Sono state investigate le componenti del poro per cercare di

capire se è possibile impedirne l’apertura e capire se questo
può esercitare un effetto protettivo.
Com’è fatto il PTP e quali sono i geni coinvolti nella sua
formazione?
Definire dal punto di vista molecolare il PTP è un task molto
complesso; ancora ad oggi ci sono dei dubbi. È una struttura
particolarmente complessa e ha molti regolatori.
Si pensa che sia costituito da una particolare subunità dell’ATP-SINTETASI; si pensa che
l’oligomerizzazione della subunità C dell’ATP sintetasi possa costituire il poro (il PTP).

Attraverso vari tipi di studi si era arrivati all’ipotesi che quando il

mitocondrio non respira e quando poi si ha riperfusione, la subunità C
forma dei canali all’interno del mitocondrio e regola l’apertura del PTP.
Questo è supportato dal fatto che se la subunità C viene fatta esprimere
nei batteri, viene purificata e mescolata con lipidi per mimare la
membrana, si forma un canale che mima il PTP (può formare dei pori).
Questa non è una prova definitiva perché molte proteine poste in
condizioni artificiali formano strutture che normalmente non
formerebbero.

In altri studi sono stati eseguiti dei knock-down che consentono di ridurre l’espressione della
subunità C dell’ATP-sintasi (non la azzeriamo altrimenti le cellule morirebbero) e si è cercato di
capire se l’apertura del PTP in queste condizioni è ostacolata.
Quando le cellule sono esposte a una molecola che aumenta molto la concentrazione di calcio in
cellula, il calcio satura i canali e il PTP si apre--> si ha una diminuzione della fluorescenza che
deriva dalla calceina, che viene aggiunta durante l’esperimento per monitorare i livelli di calcio: la
calceina riconosce il calcio; tanto più calcio c’è in cellula, quanto più aumenta la fluorescenza. In
questo caso il calcio entra nel mitocondrio e si ha una diminuzione della fluorescenza.
Il mitocondrio non è ancora scoppiato.
Se riduciamo i livelli di espressione della sub C, il drop di fluorescenza non è più visibile:
impediamo l’apertura del poro quindi non si ha la diminuzione della fluorescenza perché il calcio
non entra nel mitocondrio. Questa è un’altra evidenza indiretta che la subunità C potrebbe essere
coinvolta nella formazione del PTP.

Quando però sembrava abbastanza accertato che la subunità C contribuisse alla formazione del
PTP, sono stati pubblicati studi più recenti che mettono nuovamente in dubbio che l’ATP-sintasi
sia la componente del PTP: in particolare, sono stati eseguiti dei KO su cellule, in modo che la
subunità C non fosse prodotta--> queste cellule sono comunque in grado di supportare un cambio
di permeabilità del mitocondrio--> la subunità C potrebbe non essere necessaria per aprire il PTP.
C’è inoltre un’altra molecola detta ANT, che è probabilmente un’altra componente chiave del
PTP. Esistono 3 geni che codificano per questi trasportatori di nucleotidi mitocondriali; in passato
sono stati fatti degli studi di KO di questi geni; in passato però era difficile fare KO di tutti e 3 i
geni; sono stati generati dei doppi KO di ANT1/ANT2--> questi studi sembravano dimostrare che
ANT non era importante. Più recentemente però, si è scoperto che ANT3 potrebbe essere
coinvolto nella formazione del PTP.
ANALISI DI TOPI KO PER LA CICLOFILINA D
Un altro gruppo di studiosi si è addentrato sul dimostrare l’importanza del PTP e cercare di
migliorare la terapia di pazienti che hanno malattie in cui il PTP è importante.
C’era già da molti anni l’evidenza che la ciclofilina D fosse una molecola che aiuta a regolare
l’apertura del poro (non è parte della struttura). È possibile fare KO del gene che codifica per la
ciclofilina D e si ottengono dei topi normali.

Sono stati presi i mitocondri isolati dal fegato di:

- topo WT
- topo eterozigote KO Ppif-/+
- topi omozigoti KO Ppif-/-
(Ppif=gene che codifica per la ciclofilina D).
L’esperimento dura 10 minuti.
I mitocondri sono posti in un tubo; dopo un minuto viene
pipettata nel tubo una soluzione ricca di calcio
--> nei topi WT il PTP si apre, i mitocondri scoppiano e c’è un
calo di assorbanza; questo avviene nell’arco di pochi minuti.
--> anche nei topi eterozigoti si ha lo stesso risultato.
--> nei mitocondri dei topi KO, aggiungendo calcio non si ha diminuzione dell’assorbanza--> il
poro è ancora chiuso (ma è presente, infatti, se aumentiamo calcio alla fine si apre e diminuisce
l’assorbanza).
Questi sono esperimenti su mitocondri isolati.

Adesso vediamo esperimenti su cellule prelevate da topi WT o KO

della ciclofilina D.
Le cellule sono trattate con acqua ossigenata, che causa apertura
del PTP e morte cellulare per necrosi.
All’aumentare della concentrazione di acqua ossigenata: aumenta
la morte cellulare nelle WT; le KO sono protette (il poro non si
apre).
Questo accade anche utilizzando altre molecole che portano
all’apertura del poro PTP.
Se invece consideriamo delle molecole che portano alla morte
cellulare per apoptosi, le cellule WT e KO hanno una risposta molto
simile.
 I topi, normali e KO per la ciclofilina D sono stati sottoposti a
esperimenti per riuscire a simulare eventi di ischemia seguiti da
riperfusioni, ripetuti nel tempo (con il laccetto che chiude una
coronaria, come visti in precedenza). L’esperimento è fatto in
modo da avere un danno da riperfusione significativo.
Al termine dell’esperimento, dopo 24 ore dalla riperfusione, gli
animali vengono sacrificati. Per misurare la necrosi dei
cardiomiociti, i cuori sono trattati da una sostanza che può essere
assorbita dalle cellule morte ma non dalle cellule vive (è una
molecola bluetta); queste sono sezioni di un unico cuore
(l’esperimento è stato effettuato su 4 topi KO e 4 topi WT); misurando l’area necrotica in tutti gli
animali WT: 20-40% della superficie totale.
Nel KO: in tutti i topi la quantità di danno che si vede è minimale, al massimo è il 5% di area
necrotica. Quindi anche in questo modello si nota che se si riesce ad impedire l’apertura del PTP
(è assente la molecola regolatoria) --> quando passa lo stress, la cellula può recuperare--> il danno
cellulare è minore.

NUOVE STRATEGIE CARDIOPROTETTIVE: INIBITORI mPTP

Questi topi KO per la ciclofilina D sono stati utilizzati
anche per studi riguardanti patologie differenti: in tutti
i casi i topi KO erano più resistenti al danno cellulare.
Potenzialmente il PTP ha ruoli importanti nelle
patologie del topo e forse anche dell’uomo.
Questo è potenzialmente estremamente interessante
perché se si hanno dei farmaci che riescono a regolare
l’apertura del poro (es farmaci che agiscono come
antagonisti della ciclofilina D), questi farmaci
potrebbero essere usati per trattare malattie
dell’uomo.

Da molti decenni esiste un farmaco detto ciclosporina A, in grado

di legare e regolare l’attività della ciclofiliina D. Quando gli
studiosi hanno capito che la ciclofilina D era importante, hanno
deciso di testare la ciclosporina A in vitro e in animali WT.
Il trattamento in vitro dei mitocondri isolati, delle cellule normali e
anche nei topi con la ciclosporina A riesce a avere effetti vicini al
KO della ciclofilina D. il vantaggio è che la ciclo A è un farmaco
che viene usato da molti anni--> può essere direttamente testato
su pazienti per osservarne l’effetto.
In Francia sono stati selezionati 50 pazienti cercando di
identificare quelli che fossero il più possibile vicini a una situazione in cui si ha poco danno da
ischemia prolungata e molto danno da riperfusione (il trattamento può essere molto efficace se
l’ischemia è breve perché sono farmaci che “salvano” le cellule, non le “resuscitano”).
Guardiamo l’immagine a sinistra: un modo per seguire lo stato dell’infarto nel paziente è misurare
alcune proteine (es creatinina chinasi, troponina) nel siero che sono espresse selettivamente nelle
cellule del miocardio--> quando si ha un infarto, le cellule muoiono, il contenuto è riversato nel
siero--> dopo qualche ora si vede un aumento di queste proteine nel siero; tanto più è l’aumento,
maggiore è il danno.
A sinistra abbiamo la curva dei pazienti trattati con ciclosporina A dopo infarto (per metà dei
pazienti, dopo essersi recati in ospedale, venivano riperfusi e la ciclosporina A veniva
somministrata in endovena--> raggiunge il cuore--> impedisce l’apertura del PTP nei
cardiomiociti) e la curva dei pazienti non trattati con ciclosporina.
Nello studio si vede che prima aumentano i livelli di creatina chinasi a causa della morte delle
cellule poi diminuiscono perché si ha riperfusione, in entrambi i casi.
Si vede che nei pazienti trattati con cliclosporina, il picco della creatina chinasi è minore--> si ha
un certo livello di protezione importante.

Il problema è che questo studio è stato replicato in un

secondo studio, su un numero molto più elevato di
pazienti e ha dato risultati molto meno promettenti.
Studi clinici più estesi quindi non hanno confermato il
miglioramento clinico dell’infarto del miocardio. Quali
possono essere i motivi?
1. Un primo motivo è che l’ipotesi di partenza,
malgrado le evidenze sperimentali nei modelli
preclinici, non è del tutto corretta
2. Un’altra possibilità ragionevole, che mantiene la
validità dell’ipotesi, è che la selezione dei pazienti
deve essere molto accurata (non tutti i pazienti hanno la stessa probabilità di beneficiare del
trattamento perché alcuni pazienti potrebbero avere già un danno non reversibile). Quindi un
motivo può essere che non si è avuta una selezione sufficientemente accurata per vedere
risultati significativi (tanti più pazienti che non dovevano essere inclusi, vengono presi in
considerazione, tanto più i dati si sporcano)
3. Un’altra possibilità è che noi studiamo l’apertura del PTP in condizioni sperimentali in cui
l’ischemia viene fatta avvenire in tempo breve. Magari nel caso del paziente, il PTP non si è
aperto ma la cellula del paziente è in sofferenza e muore comunque dopo qualche giorno.
Nel frattempo, c’è un altro farmaco che agisce sul PTP che è stato approvato in Giappone per il
miglioramento della sintomatologia clinica della SLA (sclerosi laterale amiotrofica); è stato
riscontrato un miglioramento.

I topi KO per la ciclofilina D sono stati testati anche

per altre malattie (es SLA, Alzheimer, distrofia
muscolare); in qualsiasi caso questi topi si sono
rivelati fortemente protetti dai segni di malattia,
anche se vengono seguiti a lungo.
I mitocondri sono strutture che giocano un ruolo
chiave nelle cellule eucariotiche, dunque, i
meccanismi di base sono altamente conservati nei
vari animali--> è molto probabile che la ciclofilina
D svolga un ruolo importante. È inoltre
improbabile che i risultati che sembrano non
sostenere l’ipotesi, siano riconducibili a delle differenze tra mitocondri di topo e di uomo.
Forse la ciclosporina A non è il farmaco ottimale per bloccare la ciclofilina D. Si stanno cercando
altri farmaci per avere un’inibizione maggiore del PTP rispetto alla ciclosporina.