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MICROBIOLOGIA

Esami:
1. Prova in itinere (24 novembre) di 1 h con 2 domande aperte e 10 crocette (10 pt e 1 pt a
domanda giusta, -0.25 per crocette errate).
2. Relazione scritta su esercitazioni in laboratorio, max 3 pagine.
3. Prova scritta su seconda parte o parte totale.
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------La microbiologia la scienza che studia i microorganismi che compongono pi del 50% della
biomassa. I microorganismi sono inseriti a livello di microambienti con la quale interagiscono. Sono
presenti a tutti i livelli della catena alimentare come: produttori, consumatori e decompositori.

Produttore: converte la CO2 in materiale organico.


Consumatore: usa il materiale organico dei produttori.
Decompositore: ricicla le sostanze in natura.

I PGPR sono i promotori della crescita delle piante come ad esempio gli azoto-fissatori.
STORIA DELLA MICROBIOLOGIA

Robert Hooke fu il primo ad aver visto i microorganismi funghi e cellule.


Von Leeuwenhoek vede e descrive i batteri.

Viene rifiutata la teoria della generazione spontanea secondo la quale la vita si forma da materia
non vivente.

Francesco Redi fa un esperimento con dei contenitori con dentro della carne, aperto,
sigillato e chiuso con della stoffa e verifica che solo nel contenitore aperto si formano delle
mosche.
Pasteur con un contenitore con del brodo verifica che se aperto viene utilizzato dai
microorg; se uso una fiamma allingresso il brodo non muta e anche con il contenitore a
collo doca.
Koch da la definizione di coltura pura: popolazione di microorg che sono la progenie che
deriva da un unico microorganismo. 4 passaggi:
1. Isolare lagente sospetto dalla vittima
2. Farlo crescere in coltura pura
3. Iniettarlo in un animale sano
4. Verificare che sia lo stesso agente

RELAZIONI FILOGENETICHE
Le cellule si possono dividere in due tipologie: eucarioti e procarioti. La cellula eucariota possiede
una membrana nucleare, mentre nella cellula procariota la membrana assente e il DNA libero.

Procariota

Eucariota

No membrana nucleare

Nucleo con membrana

No mitocondri e cloroplasti

Mitocondri e cloroplasti

Peptidoglicani nella parete cellulare

Parete non sempre


peptidoglicani.

presente

senza

Pochi micron

> 10 vote

Un cromosoma

> 1 cromosoma

CLASSIFICAZIONE DEGLI ORGANISMI


un sistema che si modificato nel tempo con la divisione in 3 domini che contengono tutti gli
esseri viventi: Bacteria, Archeae e Eukarya.
Da una cellula ancestrale si avuta la divisione in Bacteria e poi agli altri domini.
Bacteria

Archeae

Eukarya

Cellula ancestrale
Nei bacteria e archeae le cellule sono procariote, eukarya sono cellule eucariote. Le differenze tra i
gruppi si evidenziano nei geni che codificano per rRNA (RNA ribosomiale).
Per poter effettuare un analisi comparativa necessario confrontare i geni rRNA che sono
contenuti in tutti gli organismi viventi e ha subito pochi cambiamenti nel tempo.
Il ribosoma procariota 70S costituito da 2 subunit, una pi grande composta da 30S e una pi
piccola composta da 50S. LrRNA presente in entrambe le parti ma ci interessa il 16S RNA
presente nella parte pi piccola per poter confrontare organismi diversi. Negli eucarioti il gene
quello che codifica per 18S RNA.
I mitocondri e i cloroplasti sono presenti solo nelle cellule eucariote. Anche questi contengono i
ribosomi 70S e anche del DNA. Da questo formulata la teoria dellendosimbiosi: ad un certo
punto cera una cellula pi grande che ha ospitato al suo interno altre cellule procariote che sono
diventate mitocondri e cloroplasti formando cos la cellula eucariota.

MORFOLOGIA

Procariota: hanno dimensioni varie, da 0,2 a 50 micron. Le cellule procariote sono molto pi
piccole delle eucariote.
o Sferici: cocchi a formare catenelle
o Bastoncini: bacillus
o Ricurvi: vibrioni
o A spirale: spirilli
o Guainati: guaina che avvolge i bastoncini liberi tra di loro
o Peduncolati: pedicello che si attacca al substrato
o Filamentosi: si muovono per scivolamento
o Spirachete: contengono allinterno un flagello
o Micoplasmi: senza parete e privi di forma
o Mixobatteri: aggregati di cellule tenute insieme da polisaccaridi. Formano corpo
fruttifero
o Rickettsie: parassiti endocellulari animali
o Miceliari: bastoncini irregolari, micelio vegetativo/aereo

Pleomorfismo: batteri con pi di una forma.

RIPRODUZIONE
1. Scissione binaria: replicazione del DNA allinterno (replicazione semiconservativa) inizio
della formazione del setto, formazione del setto e separazione delle due cellule uguali.
2. Gemmazione: sulla superficie cellulare si forma una piccola cellula su quella di >
dimensioni e successivamente si accresce e si stacca.
3. Conidiospore: tipica dei batteri con forma miceliare che alla fine del micelio formano
spore.
4. Frammentazione: pseudo-micelio che si frammenta nelle parti terminali.

CITOLOGIA
Lo strato esterno, non sempre presente, la capsula; al di sotto c la parete cellulare, poi la
membrana citoplasmatica e allinterno il citoplasma dove contenuto il DNA.

Strato esterno: non indispensabile. composto da polimeri polisaccaridi esopolisaccaridi (perch sono allesterno). Se lo strato aderente si chiama capsula, mentre
se non lo si chiama strato mucoso. La capsula facilita ladesione della cellula alla
superficie (patogeni), lega una grande quantit di acqua in caso di scarsit, utilizzata
come fonte di nutrienti e sostanze di riserva ed un recettore per i virus e li rende resistenti
alla fagocitosi (ne aumenta la virulenza).
I polisaccaridi sono di varia composizione. Alcuni batteri possono produrre allesterno della
cellula dei polimeri: Leucanastas mesenteroides trasforma il saccarosio in un polimero che
il destrano che poi diventa fruttosio. I destrani e levani sono sostanze mucose che
vengono rilasciate quando nel terreno di coltura presente saccarosio.
Nei batteri guainati la guaina una specie di cannuccia attaccata al substrato in cui i
microorganismi si moltiplicano.
La biosintesi della capsula indipendente dal tipo di sostanze presenti nel mezzo; i
destrani e levani vengono prodotti solo se nel mezzo presente il saccarosio.
Parete cellulare: conferisce rigidit alla cellula e la protegge dalla lisi enzimatica; formata
da un polimero, il peptidoglicano, formato da un unit di N-acetilglucosammina e da
N-acetilmuramico e alcuni aminoacidi che legano le strutture tra di loro formando un
legame 1-4. Per evidenziare la presenza di microorganismi ci sono delle colorazioni:
alcuni batteri (Gram +) rimangono colorati, altri (Gram -) no. 1) fissare i microorganismi al
substrato, 2) aggiungere cristal violetto e ioduro e successivamente aggiungere alcool. I
Gram+ trattengono il colore mentre i gram no; successivamente si colorano i batteri
Gram con del rosa.
Un enzima che ha effetto sulla parete il Lisozima: attacca la parete a livello del legame
1-4 nei peptidoglicani, rompendolo e sfaldando la parete cellulare. Se il microorganismo
in un liquido e la sua concentrazione interna >> di quella esterna, le cellule scoppiano per
effetto dellosmosi; se invece la concentrazione isotonica si formano i protoplasti.
La parete si sintetizza perch la cellula produce Autolisine, simili al lisozima, che rompono il
legame 1-4 e permettono linserimento di nuove unit che andranno a costituire il
peptidoglicano e nel processo interviene la Transpeptidasi per la formazione di nuovi
legami peptidici.
La Penicillina attacca il legame peptidico attaccandosi alla Transpeptidasi impedendo la
formazione di nuovi legami peptidici e, quindi, ne previene la biosintesi.
Nei Gram il legame diretto tra lAlanina e lacido Diamminopimelico.
La parete dei Gram+ costituita al 90% da peptidoglicani; gli acidi Teicoici sono formati da
glicerolo, o rubitolo, che si lega a zuccheri e aminoacidi.

I Mycobatteri hanno degli acidi micolici legati al peptidoglicano che rendono i batteri acidoalcool resistenti.
La parete dei Gram- costituita da uno strato di peptidoglicani molto sottile e allesterno c
uno strato chiamato Membrana esterna; collegata con delle lipoproteine al
peptidoglicano tramite lacido Diamminopimelico. Sono presenti delle proteine (porine) che
presentano un canale al centro che consente il passaggio delle sostanze. Alcuni fosfolipidi
sono sostituiti da dei lipopolisaccaridi nella membrana esterna. La regione tra la membrana
citoplasmatica e la membrana esterna chiamata Periplasma; ricca di enzimi e proteine
che servono per il trasporto e come chemiorecettori.
Micoplasmi: microorganismi senza parete associati ai batteri Gram+ di dimensioni pi
piccole con un genoma pi piccolo.
La parete degli Archeae ha la stessa funzione ma composizione differente: non ha
peptidoglicani ma pseudo-peptidoglicani fatti da N-acetilglucosammina e Nacetiltalosaminuronico con legame 1-3 e il lisozima non in grado di attaccarlo.
Membrana citoplasmatica: composta da un doppio strato fosfolipidico costituito da un
glicerolo con legati due acidi grassi e un gruppo fosfato. Ci sono delle regioni idrofile e
idrofobiche (centrali, costituite dagli acidi grassi). Associati alla membrana ci sono delle
proteine che possono essere integrali, se attraversano lintero strato, oppure periferiche. Le
permeasi permettono il trasporto di sostanze da una parte allaltra della membrana. Gli
enzimi servono per la sintesi dei componenti della membrana e della parete mentre altre
proteine servono per produrre ATP. Ci sono anche delle sostanze che rendono rigida la
membrana chiamati Opanoidi. In alcuni punti la membrana pu invaginarsi formando i
mesosomi che servono per aumentare la superficie della membrana.
La membrana una barriera che deve essere attraversata da delle sostanze; un luogo
dove ci sono molte proteine ed presente una differente concentrazione di protoni:
allesterno gli ioni h+ sono pi presenti e se portati allinterno generano ATP (catena di
trasporto degli elettroni). Le sostanze piccole idrofobiche possono attraversare la
membrana facilmente, al contrario delle molecole idrofiliche.
Il trasporto pu avvenire:
o Trasporti che non richiedono energia: diffusione passiva e facilitata secondo
gradiente;
Passiva se secondo gradiente senza permeasi.
Facilitata se secondo gradiente con permeasi. Le permeasi hanno una
cavit al loro interno: il trasporto pu essere:
Uniporto: se la sostanza va da un lato allaltro della membrana;
Simporto: se due sostanze entrano insieme;
Antiporto: se la molecola per entrare ha bisogno che ne esca una.
o Trasporti che richiedono energia: ATP-dipendenti;
Traspoto attivo: la molecola trasportata allinterno senza modificazioni
chimiche;
Trasporto di gruppo: le molecole subiscono delle modificazioni chimiche.
Il sistema di trasporto ABC consiste in una proteina che sulla parte esterna della cellula
che passa la sostanza ad un'altra che attraversa la membrana con utilizzo di ATP.
Nella traslocazione di gruppo alla molecola trasportata allinterno viene aggiunto un gruppo
fosfato.

Membrana negli Archea: composta da legami etere perch non ci sono acidi grassi ma
molecole chiamate isoprenoidi. Hanno catene analoghe che possono dare uno o due
strati, dipende dal legame.

MATERIALI INTRACELLULARI DI RISERVA


Composti organici:

Glicogeno e amido: vengono accumulati perch c un eccesso di S.O. e sono fonte di


energia e di carbonio in caso di necessit.
Acido poli--idrossibutirrico: viene accumulato quando c un rapporto tra sostanze che
contengono carbonio e altre che contengono azoto a sfavore dellazoto; appaiono come dei
granuli e occupano grande volume cellulare. Vengono utilizzati come alternativi alle
plastiche perch biodegradabili, sono fonti rinnovabili e sono molecole non tossiche. Hanno
come svantaggio che hanno dei precursori molto costosi e hanno una crescita ridotta.
Cianoficina: si trova solo nei cianobatteri che usano come fonte di energia la luce e
producono ossigeno e sono in grado di accumularlo. un polimero di riserva dellazoto e
servono per la produzione di plastiche.

Composti inorganici:

Volutina: sono molecole di polisolfati che vengono accumulate quando c un eccesso di


ATP che ne permette la formazione. La cellula la accumula in occasione di momenti
sfavorevoli.
Granuli di zolfo: possono essere sia allinterno che allesterno della cellula. Servono come
fonte di energia o pu intervenire nel processo di fissazione della CO2 perch servono
elettroni che dona lo zolfo.

Altri composti:

Tilacoidi: posseduti solo dai cianobatteri (fotosintesi ossigenica). Sono lamelle appiattite
allinterno della membrana citoplasmatica e servono per laccumulo di ficobilisomi che sono
degli aggregati di pigmenti.
Clorosomi: presenti solo nei batteri verdi, sono attaccati alla membrana citoplasmatica e
hanno la funzione di accumulare pigmenti che consentono di fare fotosintesi a livelli
profondi.
Vacuoli gassosi: presenti in microorganismi acquatici e contengono delle vescicole che
allinterno contengono gas che conferiscono alla cellula la capacit di spostarsi verso lalto
o verso il basso.
Carbossisomi: sono accumuli della rubisco, nel ciclo di Kelvin per la fissazione della CO2.
Magnetosomi: accumuli di sostanze contenenti ferro e servono alla cellula per capire il
campo magnetico terrestre. Vivono con poco ossigeno e con il campo magnetico si
spostano dove c meno ossigeno.

FLAGELLI
La cellula batterica possiede delle appendici chiamate flagelli che le consentono lo spostamento.
Si distinguono per numero e posizione: i batteri monotrico possiedono un solo flagello, iofotrico
se possiedono un ciuffo di flagelli da una sola parte, amfitrico se possiedono due ciuffi opposti e
peritrico se possiedono flagelli su tutta la superficie.
I flagelli possono variare anche in lunghezza e spessore. Il flagello suddiviso in tre parti: il
motore che permette il movimento, una struttura ad uncino e il filamento terminale. Due coppie di
anelli M-S sono presenti in tutti i microorganismi, P-L solo nei Gram- perch L si lega alla

membrana esterna. Il filamento costituito dalla flagellina disposta a spirale. Il Cap aggiunge le
proteine.

Lo spirochete presente allinterno della cellula (endoflagello) per movimento su superfici


solide. Sono situati nella membrana periplasmatica (Gram-).
Fimbrie o pili: hanno appendici molto pi corte dei flagelli e hanno la funzione di facilitare
ladesione alle superfici e i pili F servono per formare un canale tra cellule diverse che
permette il passaggio di DNA da una cellula allaltra.

Movimento: per i flagelli, per scivolamento e/o vescicole gassose. Lo scivolamento caratteristico
di alcuni procarioti su superfici solide. Alcuni producono del muco che aiuta a scivolare, altri si
muovono per lo spostamento delle proteine.
Il movimento non casuale ma dettato da uno stimolo detto tassi. Pu essere un composto
chimico: chemiotassi, aereotassi per spostamento in regioni a differente concentrazione di
ossigeno, fototassi verso stimoli luminosi e magnetotassi verso livelli differenti di campo
magnetico.

GENOMA BATTERICO
DNA e RNA sono formati da nucleotidi (base azotata, zucchero 5C e un gruppo fosfato). 1 kilobase
equivale a 1000 paia di basi.
La polymerase chain reaction (PCR) una tecnica biologica molecolare che serve per fare tante
copie di un segmento di DNA. A temperature elevate serve la DNA polimerasi di microorganismi
che vivono a temperature elevate. La PCR consiste in 3 fasi:
1. Denaturazione: separazione del doppio filamento di DNA.
2. Raffreddamento e appaiamento dei primers.
3. Allungamento del filamento complementare.
Si deve avere: il filamento da copiare, 2 primer complementari che si appaiano in regioni note,
DNA polimerasi termostabile (TAC) e nucleotidi per allungare la catena.
Un plasmide non contiene informazioni per la crescita cellulare, ma ne permette la sopravvivenza
anche in condizioni particolare; si replica autonomamente e quando integrato nel cromosoma
viene detto episoma. Molti plasmidi possono trasferirsi da una cellula ad unaltra tramite il
processo di coniugazione.
Il DNA ricombinante consiste nellunire sequenze di DNA da due organismi diversi:

Usare gli ER per tagliarli a livello delle sequenze


Interviene la ligasi che lega filamenti di DNA da due organismi (ligazione); si ottiene DNA
ricombinante.

Da un plasmide si estrae il gene che ci interessa che si lega allinterno del plasmide dellaltro
organismo per mezzo della ligasi. Il vettore lelemento che ospita il DNA dellaltro organismo.
LAgrobacterium tumefaciens causa galle al colletto delle piante ed un batterio che possiede il
plasmide Ti (tumor inducing); c una regione che viene trasferita alla pianta quando questa viene
infettata dal batterio: un frammento del plasmide Ti T-DNA, che contiene dei geni che causano il
tumore (geni oncogeni ONC) e dei geni OPS che sintetizzano opine. La pianta subisce delle lesioni
e produce dei composti fenolici che richiamato A. tumefaciens. I composti fenolici causano delle
risposte nel batterio e lespressione dei geni vir sul plasmide Ti. Si formano le proteine vir-D che

tagliano un frammento di T-DNA alle estremit, la proteina vir-E stacca il gene e, per mezzo di
canali, lo trasporta nella cellula della pianta dove verr poi replicato e causando tumori.
A. radiobacter produce dei composti che hanno azione tossica in modo selettivo su A.
tumefaciens. Si pu usare questo batterio per inserire dei geni utili allinterno delle piante.
La pianta possiede un enzima EPS sintetasi che permette di ottenere AA aromatici e per
funzionare utilizza fosfoenolpiruvato (PEP). EPS non riesce a riconoscere la differenza tra PEP e
glifosate e cos non riesce a produrre AA aromatici; si pu utilizzare EPSP di agrobacterium che
invece selettivo per la PEP e riesce a produrre AA aromatici.

ENDOSPORE
Alcuni batteri riescono a produrre delle endospore che sono molto resistenti in particolare al calore.
Si formano perch interne alla cellula dove c poca acqua, sopravvivono al calore, alle UV e
possono sopravvivere per molto tempo. Quando le condizioni sono avverse si formano le
endospore. Le endospore possono essere

Terminali
Subterminali
Centrali

I passaggi per la formazione delle endospore sono:

Replicazione del DNA allinterno della cellula. Si forma una membrana che delimita il DNA.
Una membrana tende ad avvolgere la membrana gi formata con allinterno un
cromosoma. Viene depositato del peptidoglicano (cortex) e si forma lendosporio con la
formazione finale dellendospora.

Il core permette allendospora di resistere alle alte temperature perch forma un acido dipicolinico
che assieme al calcio aiuta la cellula a disidratarsi e a resistere al calore.
Il processo di germinazione avviene quando le condizioni sono favorevoli.
Bacillus turingiensis quando forma le endospore, produce la pre-tossina CRY che reagisce con
lambiente intestinale della larva che, se ne nutre, forma cos la tossina attiva che si lega a dei
recettori e forma dei pori nelle membrane cellulari causando degli squilibri di ioni e linsetto muore.

FUNGHI
Sono organismi pluricellulari ad eccezione dei lieviti e sono fatti da dei filamenti chiamati ife e
linsieme delle ife costituisce il micelio. La parete contiene chitina e conferisce forma e protegge
dalla pressione osmotica. Spesso sono presenti dei setti e formano una ifa settata o ifa
cenocitica. Sotto la parete presente la membrana composta da fosfolipidi ed presente
lergosterolo al posto del colesterolo. I funghi si nutrono per assorbimento e utilizzano sostanze
organiche che sono fonte di energia. Producono degli enzimi che sono idrolitici e rompono il
materiale organico con la formazione di composti a basso peso molecolare che vengo portati
allinterno della cellula.
Ci sono 3 tipi di funghi:
1. Saprofiti: si nutrono di sostanze morte.
2. Parassiti: vivono a spese di altri organismi.
3. Simbionti: compartecipazioni tra ospite e parassita.

Gruppi:

Zygomiceti: deteriorano gli alimenti


Glomeromiceti: associazioni positive con le piante
Ascomiceti: fermentazioni e licheni
Basidiomiceti: funghi pi evoluti con ife settate

I funghi possono riprodursi per spore da ciclo sessuato o asessuato. Un micelio forma le strutture
che formano spore, le spore germinano e formeranno altri miceli (riproduzione asessuata).
Le ife di organismi diversi si avvicinano e si fondono i citoplasmi (plasmogamia); poi si ha la
fusione dei nuclei, lorganismo diventa diploide e si forma lo zigote che si divide per meiosi. Si
formano delle spore aploidi e si ha la germinazione (riproduzione sessuata). Se le spore sono
allinterno della struttura si hanno sporangiospore che sono contenute nello sporangio. Se le spore
sono allesterno si hanno conidiospore che sono contenute nei conidi. Nei lieviti avviene la
gemmazione.

ECOLOGIA
I funghi sono:

importanti decompositori della S.O.


servono nellindustria alimentare per le fermentazioni e come lieviti
danneggiamento delle derrate alimentari (penicillium)
produzione di antibiotici ed enzimi idrolitici
malattie delle piante, animali e produzione di tossine

Lappressorio lifa deputata alladesione del fungo alla superficie mentre laustorio serve per il
parassitismo. I funghi possono svolgere anche azioni benefiche. I licheni sono un associazione tra
un fungo ed un alga eucariota o un cianobatterio. Le micorrize sono un associazione mutualistica
tra migliaia di funghi miceliari presenti nel suolo e radici delle piante dove il fungo amplia lapparato
radicale delle piante a vantaggio del fungo (la pianta produce S.O. e carbonio organico), oppure a
vantaggio della pianta (migliora lassorbimento di fosforo e azoto e difesa dai fitopatogeni).
Possono essere ectomicorrize (penetrazione tra le cellule ma non nelle cellule) o endomicorrize
(penetrazione delle ife allinterno delle cellule e aumenta la superficie di scambio tra le cellule
fingine e quelle della pianta).
ESIGENZE NUTRIZIONALI
I funghi necessitano di una fonte di carbonio organico che serve per la sintesi del materiale
cellulare; necessitano anche di una fonte di energia che gli serve per effettuare i movimenti, il
trasporto di nutrienti e tutte le reazioni di sintesi. Il metabolismo sono tutte le serie di reazioni che
portano la cellula a costruire molecole complesse. Se la sintesi richiede energia si parla di
anabolismo, mentre se si ottiene energia dalla demolizione dei composti complessi si parla di
catabolismo.

Luce fototrofi
Fonte di energia
Composto organico chemio-organotrofi
Composto chimico

Composto inorganico chemio-litotrofi


Eterotrofo composto organico come fonte di carbonio organico
Fonte di carbonio
Autotrofo CO2 come fonte di carbonio inorganico
Fotoautotrofo: luce CO2 come carbonio inorganico
Fotoeterotrofo: luce S.O.
Chemioautotrofo: composti chimici CO2
Chemioeterotrofo: composti chimici S.O.
COMPOSIZIONE MACROMOLECOLARE DELLA CELLULA
Circa il 70-80% della cellula composta da H2O, il resto costituito da macromolecole (proteine,
lipidi, acidi nucleici e polisaccaridi).
Gli elementi principali sono: carbonio (50%), ossigeno (20%), azoto, idrogeno La cellula per
effettuare la biosintesi e per produrre energia ha bisogno di nutrienti che devono essere presenti
nellambiente in cui si trova. Esistono due tipi di nutrienti:

Macronutrienti: richiesti in grande quantit.


Micronutrienti: richiesti in quantit minori.

I terreni colturali sono delle soluzioni che contengono nutrienti per la cellula con lo scopo di far
crescere i microorganismi. Il terreno deve soddisfare le esigenze nutrizionali della cellula per
permettere che essa cresca e quindi la composizione del terreno varia a seconda della cellula
presente. Si aggiungono dei fattori di crescita a basso peso molecolare come vitamine, AA e acidi
nucleici. I terreni colturali possono essere liquidi e solidi; per poter ottenere un terreno solido da
uno liquido, si utilizza lagar-agar che estratto da alghe rosse e non tossico per i
microorganismi. I terreni colturali possono essere di diversi tipi:

Terreni naturali: sono costituiti da un elemento naturale che contiene le sostanze adatte
per la crescita.
Terreni sintetici: sono composti totalmente da nutrienti chimicamente definiti.
Terreni complessi: sono simili ai sintetici ma contengono alcuni composti la cui
composizione chimica con ben definita (lievito).
Terreni selettivi e differenziali: consentono la crescita di alcuni microorganismi a scapito
di altri; i terreni differenziali permettono la crescita di tipi diversi di microorganismi che per
formano colonie facilmente distinguibili.

Quando i microorganismi crescono su un terreno di laboratorio vengono chiamati coltura. Essa


pu essere pura se costituita da un solo tipo di microorganismi. La coltura pu essere mista se
composta da microorganismi differenti. Una coltura pura si ottiene per mezzo dellisolamento fatto
con terreni di arricchimento (intervengo sulle caratteristiche diverse dei microorganismi e le
seleziono) o per striscio su piastra. Le condizioni ambientali influiscono sulla crescita dei
microorganismi (temperatura, ossigeno, luce, pH).

pH: i funghi tendono a preferire pH acidi (acidofili) mentre i batteri preferiscono quelli
neutri o alcalini (alcalofili).
Temperatura: influenza la velocit delle reazioni enzimatiche; se ho una temperatura
elevata, fino ad un certo limite, la velocit delle reazioni aumenta, se la temperatura
invece troppo elevata le proteine tendono a denaturarsi e le reazioni si interrompono. I

microorganismi possono essere: psicrofili (<20 C), mesofili (20-45 C), termofili (40-70
C) o ipertermofili (> 65 C).
Pressione osmotica dellacqua: rapporto tra la tensione di vapore del substrato e lacqua
pura (0-1). I microorganismi vivono bene a valori abbastanza alti.
Luce: i fototrofi necessitano di energia luminosa.
Ossigeno: i cianobatteri effettuano la fotosintesi ossigenica e producono ossigeno.
o Aerobi obbligati: utilizzano lossigeno dellatmosfera.
o Microaerofili: hanno bisogno di ossigeno in quantit ridotte.
o Anaerobi facoltativi: possono vivere in presenza/assenza di ossigeno.
o Anaerobi: vivono in assenza di ossigeno ma possono tollerarlo (aerotolleranti)
oppure vengono uccisi dalla presenza di ossigeno (anaerobi stretti).
Le forme tossiche dellossigeno sono il singoletto, lanione superossido e lacqua
ossigenata.

Per mantenere le colture si possono usare diversi metodi.

Trasferimento periodico in terreno fresco


Liofilizzazione: eliminazione dellacqua portando il campione sotto zero e poi trasformare
lacqua contenuta subito in vapore.
Ultracongelamento: temperatura -80 C.

CRESCITA MICROBICA
La crescita microbica lincremento numerico delle cellule. Il tempo di generazione il tempo
necessario a duplicare la popolazione. Nella scissione binaria si ha una crescita esponenziale: N=

2n N: numero di cellule, n: numero generazioni.

Nella fase di latenza (o fase lag) avviene ladattamento alle nuove condizioni; non si hanno
divisioni ma sintesi di composti cellulari.
Nella fase esponenziale si ha la crescita esponenziale della popolazione.
Nella fase stazionaria la divisione cellulare e la morte cellulare sono bilanciate.
Nella fase di morte il numero di cellule decresce per mancanza di nutrienti.

Nella coltura in batch (sistema chiuso) i nutrienti diminuiscono e si formano prodotti di scarto.
Nella coltura in continuo si ha laggiunta di terreno fresco e asporto di terreno esausto, quindi il
numero di cellule rimane costante. Nel chemostato la velocit di crescita dipende dalla
concentrazione di un fattore limitante.
METODI DI MISURAZIONE DELLA CRESCITA

Conta cellulare: pu avvenire al microscopio, in piastra o liquido o su membrana filtrante;

Conta diretta al microscopio: avviene in soluzione liquida e si contano sia cellule


vive sia quelle morte. La conta avviene su un vetrino con disegnato sopra un
reticolo dove andr a contare il numero di cellule presenti e poi far un calcolo
approssimativo del numero di cellule per ml di campione.
o Conta in piastra: eseguo pi diluizioni seriali del mio campione e conto solo le
cellule vive. Per la conta in liquido eseguo la conta MPN (most probable number)
usando tabelle statistiche.
o Conta su membrana filtrante: si ottengono campioni con poche cellule perch
filtro la soluzione e le cellule rimangono nel filtro, metto il filtro in un piastra con del
terreno e poi conto il numero di cellule.
Misurazione della massa cellulare: calcolo il peso secco (in stufa per 8-12 h a 105 C) o
mediante il contenuto di azoto.
o Spettrofotometro: misura lassorbanza della luce in un liquido: le cellule riflettono
la luce e non la trasmettono.
Misura dellattivit cellulare: misuro lATP presente; per mezzo del luminometro che
misura la luce. In una reazione lATP reagente con la luciferina, si forma lossiluciferina +
ANP + luce. Il luminometro misura la luce.
o

La resa di crescita il peso secco in un certo momento rispetto al peso secco allinizio del
processo, diviso le moli di substrato utilizzato.
STERILIZZAZIONE
La sterilizzazione un trattamento che libera il materiale da tutti gli organismi (spore comprese).
Si ottiene attraverso:

Calore: utilizzato ad alte temperature per denaturare le proteine e gli enzimi. Il tempo di
5

riduzione D, il tempo affinch ci sia la diminuzione di un ordine di grandezza ( 10

104 ) delle cellule. Per gli oggetti voluminosi la diffusione del calore pi lenta. Luso del

calore per la sterilizzazione avviene per:


o Sterilizzazione diretta alla fiamma
o Con calore secco: oggetto messo in stufa a 180 C per 2 ore.
o Con calore umido: oggetto posto in autoclave dove, grazie allaumento di
pressione si ottengono temperature pi elevate: 120 C. Il calore umido ha pi
potere di penetrazione del calore secco.
La pastorizzazione riduce la popolazione microbica negli alimenti senza cambiare le
propriet organolettiche degli alimenti.
A basse temperature posso avere effetto biocida cio quando un microorganismo sensibile
alle basse temperature viene ucciso, o biostatico quando le basse temperature inibiscono
la crescita microbica.
Radiazioni: i raggi UV hanno effetto germicida a 260nm. A livello del DNA si formano dei
dimeri di timina: due timine vicine vengono legate tra di loro. Le radiazioni hanno un basso
potere di penetrazione e quindi vanno usate su superfici piane.
I raggi X e rompono i filamenti di DNA e hanno elevata penetrazione.
Filtrazione: rimozione dei microorganismi attraverso un filtro che non permette il loro
passaggio. La sterilizzazione con ultrasuoni avviene per rottura delle cellule per la forte
pressione esercitata.
Composti chimici: sono agenti antimicrobici, e alcuni hanno tossicit selettiva solo per
alcuni microorganismi.
o Agenti chemioterapici: composti di sintesi in grado di inibire o uccidere i
microorganismi che causano infezioni.
o Antibiotici: composti biologici in grado di uccidere i microorganismi che causano
infezioni.

BIOFILM
I biofilm sono microorganismi adesi ad una superficie ed inglobati in una matrice polimerica
extracellulare autoprodotta. I microorganismi sono spesso adesi alle superfici. Possono essere di
due tipi:

Microorganismi planctonici: sono spesso separati, hanno rapida velocit di crescita e


hanno bassa densit.
Microorganismi sessili (o biofilm): sono attaccati, bassa velocit di crescita, alta densit ed
esprimono informazione genetica distinta in base allambiente.

Le superfici dove si possono trovare i microorganismi sessili sono solido-liquido, liquido-aria e


solido-aria. La matrice dei microorganismi pi volumetrica delle cellule; composta da ESP
(extracellular polimerics substrates) polisaccaridi, proteine, DNA e lipidi. Serve per mantenere
ladesione tra il substrato e i microorganismi e tra microorganismi e microorganismi. Non una
matrice omogenea, ma discontinua ed eterogenea. Il biofilm consente la resistenza agli
antimicrobici. La formazione del biofilm si svolge in 3 fasi:
1. Adesione: si attaccano al substrato x mezzo dei flagelli: ladesione diventa irreversibile
dopo un lasso di tempo.
2. Maturazione e formazione della matrice con divisione cellulare.
3. Dispersione nellambiente quando questo diventa sfavorevole. Le cellule diventano
planctoniche o si staccano a frazioni pi ampie.
Fino al 40% del C fissato dalla pianta viene rilasciato in forma di essudato dalle radici.
Evitare la presenza di biofilm nellindustria alimentare significa produrre alimenti esenti da
microorganismi, patogeni, prolungare la conservazione, risparmio economico ed energetico (<
trattamenti) e < corrosione dei metalli.
I microorganismi sono in grado di comunicare tra di loro producendo delle molecole. Questo
meccanismo prende il nome di quorum sensing. Nelle cellule planctoniche le molecole segnale
sono ridotte, mentre nei microorganismi sessili sono presenti in quantit elevate. I batteri sono
capaci di comunicare normalmente intraspecie, ma alcuni sono in grado di comunicare anche
interspecie.
La prevenzione molto importante perch non permette la diffusione dei microorganismi. Esistono
dei prodotti anti-biofilm che non utilizzano sostanze biocide, ma sono in grado di evitare che i
microorganismi si formino su una superficie limitandone ladesione. Esistono delle molecole
naturali che hanno capacit anti-biofilm: la capsaicina estratta dal peperoncino.
MUTAZIONI
Una mutazione un cambiamento a livello di una sequenza di nucleotidi che ereditaria. un
fenomeno naturale molto raro ma che pu essere indotto. Le mutazioni contribuiscono al processo
evolutivo. Un mutante un organismo che ha subito delle mutazioni. Il genotipo cambia mentre il
fenotipo pu rimanere uguale.
Le mutazioni puntiformi possono essere:

Mutazioni silenti: quando il cambiamento di una base azotata non crea sostanziali
differenze nella produzione di un amminoacido.
Mutazioni nonsenso: danno luogo ad un codone di stop e la proteina si interrompe
incompleta.
Mutazioni missenso: un amminoacido diverso sostituito alloriginale.
Microinserzioni e microdelezioni: provocano uno slittamento nella sequenza di basi
azotate.
Spontanee

Mutagenesi

Mutageni chimici
Indotte
Mutageni fisici

Mutageni chimici
o Omologhi delle basi: hanno somiglianza strutturale con le basi azotate; 5bromouracil al posto della timina e inserimento di una base complementare errata.
o Agenti alchilanti: su una base viene inserito un gruppo metile/etile.
o Agenti intercalanti: composti che si inseriscono a livello del doppio filamento di
DNA e favoriscono microinserzioni e microdelezioni che favoriscono le mutazioni.
Mutageni chimici
o Raggi UV: provocano la formazione di dimeri della timina.
o Radiazioni ionizzanti: causano la ionizzazione di sostanze con la formazione di
radicali liberi.

I meccanismi di riparazione agli appaiamenti sbagliati delle basi azotate sono:

Escissione di una base: rimozione della base azotata danneggiata.


Escissione di un frammento: il frammento danneggiato viene rimosso enzimaticamente.

La selezione di mutanti pu avvenire per:

Selezione positiva: selezione di mutanti perch appaiono o crescono in modo diverso.


Selezione negativa: selezione per mutanti che necessitano un fattore di crescita.

Il test delle fluttuazioni si effettua per capire il motivo delle mutazioni:

Ipotesi 1: la mutazione un adattamento del microorganismo ad uno specifico agente.


Ipotesi 2: le mutazioni si verificano continuamente e spontaneamente.

Attraverso un test tramite coltura su Escherichia coli si dimostrato che le mutazioni sono eventi
spontanei indipendenti da fattori ambientali.
Ladattamento fisiologico coinvolge quasi tutta la popolazione, ladattamento genetico, a
seguito di una mutazione, coinvolge un numero ridotto di cellule.

VIRUS
I virus sono elementi genetici che si possono replicare solo allinterno di cellule ospiti. Se sono
localizzati allesterno vengono chiamati virioni. I virus sono costituiti da un acido nucleico e sono
rivestiti da proteine che nel complesso vengono chiamate capside. I capsomeri sono le sub-unit
proteiche ripetute. A volte allesterno c un doppio strato lipidico che contengono delle proteine
chiamate spicole che servono per ladesione alle cellule ospiti. I virus arrivano allinterno della
cellula mediante il processo di infezione: lacido nucleico entra allinterno e effettua la replicazione.
I virus sono molto pi piccoli delle cellule eucariote e procariote. I virus complessi possiedono un
capside con allinterno acidi nucleici e allesterno una coda con delle fibre terminali. I virus che
hanno come ospite una cellula procariota vengono chiamate fagi. Possono essere:
Litici: si moltiplicano allinterno della cellula ospite che alla fine muore e libera i fagi.
Lisogeni: possono svolgere il ciclo litico oppure entrare in uno stato quiescente (pro-fago)
dove il DNA batterico si replica, replicando anche il DNA del virus.
Il ciclo litico consiste in:

Attacco: ancoramento allo strato esterno della cellula in siti specifici chiamati recettori virali
e se non sono presenti la cellula non suscettibile.
Penetrazione: lacido nucleico penetra nel citoplasma.
Sintesi di acido nucleico e proteine.
Riassemblaggio.
Liberazione.

Il ciclo lisogeno consiste in: contatto e inserimento dellacido nucleico nella cellula ospite; lacido
nucleico si inserisce allinterno del cromosoma batterico, la cellula procariota si divide e divide cos
anche il profago, successivamente si distacca ed entra nel ciclo litico.
La lisogenia in avviene quando il DNA del virus allinterno della cellula ospite circolarizza; c poi
una ricombinazione specifica tra un sito del DNA del fago e quello dellospite. Una proteina
repressore si attacca successivamente al DNA fagico e blocca lespressione di tutti i geni tranne
quello del repressore. In caso di condizioni sfavorevoli una proteasi attacca il repressore e ne
provoca lescissione formando del DNA batterico circolare.
Quando il numero di cellule alto preferito il ciclo litico, mentre quando basso preferito il ciclo
lisogeno.
RESTRIZIONE
I batteri possono difendersi dai virus:

Modificando la superficie esterna.


Producendo enzimi di restrizione.

Anche i virus si possono difendere dagli enzimi di restrizione con delle modificazioni.
Per poterli coltivare, i virus devono essere cresciuti in cellule vive e vengono contati tramite
placche che si formano quando in atto il processo di infezione e avviene la lisi della cellula
ospite.

TRASFERIMENTO ORIZZONTALE
Il trasferimento orizzontale il passaggio di geni da una cellula ad unaltra della stessa
generazione. Il ciclo unidirezionale e c una cellula donatrice e una ricevente.
Il filamento uscito dalla cellula ha due possibilit:

Viene degradato.
Per ricombinazione omologa viene inserito allinterno del cromosoma batterico (scambio
di sequenze simili, ma non identiche).

I frammenti di DNA sono trasferiti per mezzo di:

Trasformazione: un segmento di DNA libero nellambiente viene portato allinterno di una


cellula batterica. Lesposizione dei batteri in una soluzione contenente DNA porta

allacquisizione di caratteristiche ereditabili. Succede che anche del DNA batterico venga
inserito nel capside virale e che quando il virus attacca una cellula, inserisce il DNA
derivante da un altro batterio.
Coniugazione: trasferimento mediato da plasmidi. La cellula donatrice possiede il
plasmide F (fertilit) che pu formare un pilo che collega la cellula a quella ricevente dove
nel mezzo passa il DNA che viene trasferito. Nella cellula ricevente alcune volte il plasmide
viene integrato nel cromosoma tramite ricombinazione e si formano delle cellule HFR (alta
frequenza di ricombinazione). Quando si ha il distaccamento imperfetto del plasmide F dal
cromosoma si formano plasmidi chiamati F.
Trasduzione: trasferimento operato dalla presenza di fagi. La trasduzione pu essere:
o Generalizzata: ogni gene del donatore pu essere trasferito al recettore. Alcune
volte dei pezzi di DNA batterico vengono impacchettati nel capside.
o Specializzata: solo alcuni geni vengono trasmessi con alta frequenza (hanno pi
probabilit di essere trasmessi). Al momento di iniziare il ciclo litico, lescissione
pu essere imprecisa e comportare incorporazione di una parte del DNA batterico
che viene replicato e incapsidato in tutte le particelle fagiche.
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------SIMBIOSI
La simbiosi un interazione-associazione tra due organismi differenti. Il simbionte lorganismo
pi piccolo mentre lospite quello pi grande. Si ha un ectosimbionte se questo esterno e un
endosimbionte se interno allospite. Le associazioni possono essere:

Neutre: non si hanno sostanziali differenze .


Positive: gli organismi traggono beneficio dalla simbiosi.
o Mutualismo: traggono vantaggio entrambi dallassociazione. unassociazione
obbligatoria, se vengono separati tendono a non sopravvivere. (rumine, rizobi e
leguminose). (A+B+)
o Protocooperazione: simile al mutualismo ma non unassociazione obbligatoria.
o Commensalismo: un organismo trae vantaggio, laltro no. AB+
Negative: portano allesclusione di un organismo.
o Predazione: il predatore attacca unaltra specie e lo uccide; penetra nella preda e si
duplica a spese della cellula ospite.
o Parassitismo: un parassita ricava il nutrimento dallospite. Nel parassitismo il
tempo pi lungo che nella predazione.
o Antagonismo: un microorganismo rallenta/inibisce la crescita di altri. attivit
antibiotiche.
o Competizione: alcuni organismi tendono ad escludere altri da un ambiente.

ASSOCIAZIONI POSITIVE TRA MICROORGANISMI E LE PIANTE


Nella rizosfera:

Micorrize: sono associazioni tra un fungo e lapparato radicale di una pianta. Il fungo ottiene
carboidrati mentre la pianta azoto e fosforo, minerali, acqua e protezione dai patogeni
radicali.
Processo di azoto-fissazione: N2 in atmosfera, NO3- nitrati per fenomeni naturali come
fulmini, NH4+ ammoniaca con processo ad alta temperatura e pressione ma molto costoso,
NH4+ da batteri azoto-fissatori. N richiesto in grande quantit ed spesso un fattore
limitante. presente un triplo legame tra gli N2 N N. esistono dei microorganismi che

sono in grado di convertire N2 in ammonio tramite la fissazione dellazoto. La proteina


nitrogenasi ha due sub-unit: ferro-proteina e ferro-molibdeno proteina; gli

vengono

portati alla nitrogenasi dalla ferredossina e utilizza ATP e passa gli elettroni alla ferromolibdeno proteina. Nel primo passaggio si ha la trasformazione di diimmide, nel secondo
di idrazina e nel terzo di NH3.
N N 4H HN NH 2H H2N NH2 2H H3N NH3

La nitrogenasi sensibile alla presenza di O2 ma molti azoto-fissatori sono anaerobi. Per


gli aerobi, invece, alcune volte si produce della leghemoglobina che sequestra O2 e non lo
rende disponibile per la nitrogenasi. Nei cianobatteri ci sono delle cellule chiamate
eterocisti dove O2 non diffonde.
Rizobi-leguminose:
o La pianta produce dei flavonoidi che richiamano i rizobi liberi nel suolo;
lassociazione specifica.
o I flavonoidi attirano dei geni NOD che sono dei fattori della nodulazione e
determinano la produzione di una proteina che serve per far aderire il
microorganismo sul pelo radicale della pianta con la successiva formazione del
nodulo.
o Il pelo radicale si arriccia e i microorganismi riescono ad entrare nel pelo formando
un canale di infezione. Nelle cellule della corticale i rhizobium perdono la loro forma
e diventano batteroidi e vengono rivestiti da una membrana peribatteroidale e
iniziano lazoto-fissazione.
Attinorrize: frankia nelle radici delle piante non leguminose. Si sviluppano noduli di grandi
dimensioni.
PGPR: Plant Growth-Promoting Rhizobacteria. La presenza di questi batteri data dalla
liberazione di essudati dalle radici della pianta. Questi microorganismi favoriscono la
crescita delle radici della pianta.
o PGPR extracellulari: sono presenti in rizosfera e vivono nel suolo
o PGPR intracellulari: vivono allinterno della cellula
o PGPR endofiti: sono tra una cellula e unaltra e possono spostarsi nel sistema
vascolare.
Questi batteri sono competenti perch sono richiamati e colonizzano la rizosfera
competendo con altri microorganismi. possibile marcare i PGPR per vedere lo
spostamento dei batteri durante la colonizzazione.

MECCANISMI DIRETTI DI PROMOZIONE DELLA CRESCITA

Fissazione dellazoto: N2NH3


Produzione di siderofori: vengono rilasciati dai batteri e hanno selettivit per il ferro che
un fattore di crescita.
Solubilizzazione del fosforo: spesso insolubile
Sintesi di fitormoni: produzione di auxine.