Traduzione: dal RNA messaggero alle

proteine
Sintesi proteica

D. L. Nelson, M. M. Cox, I PRINCIPI DI BIOCHIMICA DI LEHNINGER 4/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright © 2006
 La traduzione
Necessita di:
(Codice)
mRNA
tRNAs
Ribosomi
Amminoacidi
Aminoacil-tRNA sintetasi
Fattori di inizio, allungamento, termine
ATP
GTP
5’-ATGCCTAGGTACCTATGA-3’ DNA
3’-TACGGATCCATGGATACT-5’
Transcription
5’-AUGCCUAGGUACCUAUGA-3’ mRNA

decoded as

5’-AUG CCU AGG UAC CUA UGA-3’

Translation
N-MET-PRO-ARG-TYR-LEU-C Protein
 CODICE GENETICO
passaggio da un codice a 4 lettere (nucleotidi) ad un
codice a 20 lettere (amminoacidi)

DNA 4 lettere

RNA 4 lettere

Proteine 20 lettere

Come si passa dai nucleotidi agli amminoacidi?

D. L. Nelson, M. M. Cox, I PRINCIPI DI BIOCHIMICA DI LEHNINGER 4/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright © 2006
No. nucleotidi/a.a. Possibilità

1 41=4

2 42=16

3 43=64

Minimo codice
proponibile
D. L. Nelson, M. M. Cox, I PRINCIPI DI BIOCHIMICA DI LEHNINGER 4/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright © 2006
 U C A G
UUU Phe UCU Ser UAU Tyr UGU Cys
UUC Phe UCC Ser UAC Tyr UGC Cys
U
UUA Leu UCA Ser UAA End UGA End
UUG Leu UCG Ser UAG End UGG Trp
CUU Leu CCU Pro CAU His CGU Arg
C CUC Leu CCC Pro CAC His CGC Arg
CUA Leu CCA Pro CAA Gln CGA Arg
CUG Leu CCG Pro CAG Gln CGG Arg
AUU Ile ACU Thr AAU Asn AGU Ser
A AUC Ile ACC Thr AAC Asn AGC Ser
AUA Ile ACA Thr AAA Lys AGA Arg
AUG Met ACG Thr AAG Lys AGG Arg
GUU Val GCU Ala GAU Asp GGU Gly
G GUC Val GCC Ala GAC Asp GGC Gly
GUA Val GCA Ala GAA Glu GGA Gly
GUG Val GCG Ala GAG Glu
• Il codice è di 3 lettere= 64 combinazioni.
• È degenerato.
• Il numero dei codici per un particolare amminoacido
e’ correlato alla sua frequenza nelle proteine
 Quadri di lettura -Reading frames
• I codoni sono
letti senza
interruzioni.
• Esistono tre
potenziali
“reading
frames” per un
mRNA

Quadro di lettura aperto “open reading frame”: un quadro di

lettura che non presenta un codone di terminazione per piu’ di
50 nucleotidi consecutivi.
t-RNA
Stelo
accettore
aminoacido

D. L. Nelson, M. M. Cox, I PRINCIPI DI BIOCHIMICA DI LEHNINGER 4/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright © 2006
 Modified Bases
Found in tRNAs

= UH2

D. L. Nelson, M. M. Cox, I PRINCIPI DI BIOCHIMICA DI LEHNINGER 4/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright © 2006
 t-RNA

D. L. Nelson, M. M. Cox, I PRINCIPI DI BIOCHIMICA DI LEHNINGER 4/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright © 2006
 APPAIAMENTO
CODON-ANTICODON

Il numero massimo di codoni

che puo’ essere riconosciuto
da un tRNA= 3

D. L. Nelson, M. M. Cox, I PRINCIPI DI BIOCHIMICA DI LEHNINGER 6/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright © 2014
Appaiamento codon-anticodon – ipotesi della
oscillazione

I base III base

anticodone del codone

C G
A U
U A o G
G U o C
I U, C o A
 Riconoscimento codon-anticodon

• Le prime due basi di un codone formano sempre solidi

appaiamenti di Watson-Crick con le basi corrispondenti
dell’anticodone del tRNA e conferiscono la maggior parte
della specificità di codificazione
• La terza base della maggior parte dei codoni si appaia in
«modo libero» con la prima base dell’anticodone (ipotesi
dell’oscillazione).
• La prima base di alcuni anticodoni determina il numero di
codoni letti da uno specifico tRNA.
• Il numero massimo di codoni che possono essere letti da
un tRNA sono 3 (quando è presente Inosina nella prima
posizione dell’anticodone).
• Per la traduzione di tutti i 61 codoni sono necessari 32
tRNA.
 ATTIVAZIONE DEGLI AMMINOACIDI-
FORMAZIONE DELL’AMMINOACIL-tRNA
a
Aminoacil-adenilato + tRNA

Aminoacil-tRNA + AMP
AMINOACIL-tRNA

D. L. Nelson, M. M. Cox, I PRINCIPI DI BIOCHIMICA DI LEHNINGER 6/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright © 2014
 AMINO-ACYL tRNA SYNTHETASES
• One synthetase for each amino acid.
A single synthetase may recognize multiple tRNAs
for the same amino acid
• Two classes of synthetase.
Different 3-dimensional structures
Differ in which side of the tRNA they
recognize and how they bind ATP
Class I - monomeric, acylates the 2’OH on the
terminal ribose
Class II - dimeric, acylate the 3’OH on the terminal
ribose
D. L. Nelson, M. M. Cox, I PRINCIPI DI BIOCHIMICA DI LEHNINGER 6/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright © 2014
D. L. Nelson, M. M. Cox, I PRINCIPI DI BIOCHIMICA DI LEHNINGER 4/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright © 2006
Structure of an amino acyl-tRNA synthetase bound to a tRNA
L’INTERAZIONE TRA UN AMINOACIL-tRNA SINTETASI
E UN tRNA:“SECONDO CODICE GENETICO”

Uguali in tutti i
tRNA

D. L. Nelson, M. M. Cox, I PRINCIPI DI BIOCHIMICA DI LEHNINGER 4/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright © 2006
Elementi strutturali per il riconoscimento del t-RNAAla

D. L. Nelson, M. M. Cox, I PRINCIPI DI BIOCHIMICA DI LEHNINGER 4/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright © 2006
Accuratezza dell’amminoacil-tRNA-
sintetasi

• Alcuni aa sono
molto simili (es
Ile e Val)

• Errori 1/104
ALCUNE AMMINOACIL-tRNA SINTETASI HANNO
UN’ATTIVITA’ DI CORREZIONE
 Editing dell’aminoacil-tRNA

Il braccio flessibile contenente CCA di un tRNA puo’

spostare l’aminoacido dal sito di attivazione al sito di
editing
D. L. Nelson, M. M. Cox, I PRINCIPI DI BIOCHIMICA DI LEHNINGER 4/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright © 2006
Two levels of control to ensure that the
proper amino acid is incorporated into
protein
1) Charging of the proper tRNA
2) Matching the cognate tRNA to the messenger RNA
 RIBOSOMES

and mitochondria
 Ribosomes
The ribosomal proteins are important for maintaining the
stability and integrity of the ribosome, but NOT for
catalysis
ie. the ribosomal RNA acts as a ribozyme

Mitochondrial
or Prokaryotic
Eukaryotic 60S subunit 80S ribosome 40S subunit

rosso e blu: proteine

giallo: rRNA 23S 65% RNA
arancio: rRNA 5S 45% Proteine
verde: rRNA 16S
D. L. Nelson, M. M. Cox, I PRINCIPI DI BIOCHIMICA DI LEHNINGER 4/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright © 2006
 Ribosomal proteins often have extensions that snake into
the core of the rRNA structure

Crystal structure of L19

D. L. Nelson, M. M. Cox, I PRINCIPI DI BIOCHIMICA DI LEHNINGER 4/E, Zanichelli

Editore S.p.A. Copyright © 2006

L15 (yellow) positioned in a fragment
of the rRNA (red)
 Procaryotic Ribosomes

Three tRNA binding

sites:
A site = amino-acyl
tRNA binding site

P site = peptidyl-
tRNA
binding site

E site = exit site

D. L. Nelson, M. M. Cox, I PRINCIPI DI BIOCHIMICA DI LEHNINGER 4/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright © 2006
Sequenze segnali di inizio per la sintesi proteica nei batteri

Berg J, Tymoczko JL, Stryer L. Biochimica- Zanichelli 6 ed

Sequenze segnali di inizio per la sintesi proteica nei batteri

Il sito di inizio della sintesi delle proteine e’ determinato da due tipi di

interazione:

•l’appaiamento di basi tra l’mRNA e l’estremita’ 3’ del rRNA 16S, in modo che
l’AUG di inizio sia posizionato correttamente sulla subunita’ 30S.

•L’appaiamento del codone d’inizio del mRNA con l’anticodone di una molecola di
tRNA iniziatore,
D. L. Nelson, M. M. Cox, I PRINCIPI DI BIOCHIMICA DI LEHNINGER 6/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright © 2014
 LA SINTESI PROTEICA INIZIA CON
UNO SPECIFICO AMMINOACIDO
AUG: codone unico per la metionina

Tutti gli organismi hanno due tRNA per la metionina:

-uno inserisce la metionina come primo amminoacido
appaiandosi con l’AUG di inizio e si posiziona nel sito
P del ribosoma;
-l’altro inserisce la metionina in posizioni interne
della proteina appaiandosi ad AUG interni e si
posiziona nel sito A del ribosoma;
-la metionina viene legata a questi due tRNA dalla
stessa amminoacil-tRNA sintetasi.
 FORMILAZIONE DELLA METIONINA (Procarioti)

Metionina + tRNAfMet +ATP→ Met-tRNA fMet + AMP + PPi

Met-tRNA fMet + N10-Formiltetraidrofolato → fMet-tRNAfMet

+ tetraidrofolato

enzima transformilasi
 Formazione del complesso di inizio della traduzione
nei batteri

Nelson & Cox I principi di Biochimica di Lehninger- Zanichelli 6 ed.

 Fase di allungamento

Nelson & Cox I principi di Biochimica di Lehninger- Zanichelli 6 ed.

 Fase di allungamento

Nelson & Cox I principi di Biochimica di Lehninger- Zanichelli 6 ed.

 Peptidil transferasi
• Il sito catalitico della peptidil transferasi non e’ in
una proteina ma nell’ RNA 23S
• Un’ Adenina sembra avere un ruolo nell’attivare la
nucleofilicità dell’N del aa
 Fase di traslocazione

EF-Tu-tRNA EFG-GDP

D. L. Nelson, M. M. Cox, I PRINCIPI DI BIOCHIMICA DI LEHNINGER 4/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright © 2006
 FORMAZIONE DEL LEGAME
PEPTIDICO

I legami peptidici si formano trasferendo la catena

polipeptidica da un tRNA all’altro: reazione peptidil-
transferasica
Fase di terminazione

D. L. Nelson, M. M. Cox, I PRINCIPI DI BIOCHIMICA DI LEHNINGER 4/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright © 2006
 SINTESI PROTEICA
CONFRONTO PROCARIOTI-EUCARIOTI

• Ribosomi

• tRNA di inizio

• Inizio
-selezione AUG
-fattori di inizio

• Struttura del mRNA

• Fattori di rilascio
 Fase di inizio negli eucarioti
• La subunità minore associata al tRNA
iniziatore con legata la Met lega il CAP
• La subunità minore scorre sul mRNA fino a
trovare AUG nel contesto giusto (sequenza
Kosak, 5’-G/ANNAUGG-3’)
• Intervengono 30 proteine, tra cui i fattori
di inizio eucariotici (eIF2, eIF4E, eIF4G)
• Un’ elicasi elimina le strutture secondarie
dell’mRNA tra il CAP e l’AUG d’inizio
SINTESI PROTEICA EUCARIOTI - Fase inizio

D. L. Nelson, M. M. Cox, I PRINCIPI DI BIOCHIMICA DI LEHNINGER 4/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright © 2006
 FASE D’INIZIO NEGLI EUCARIOTI

A)

C)

B)

D)

Berg J, Tymoczko JL, Stryer L. Biochimica- Zanichelli 6 ed

 STRUTTURA CIRCOLARE DEL mRNA DEGLI EUCARIOTI

Nelson & Cox I principi di Biochimica di Lehninger- Zanichelli 6 ed.

Alterazioni funzionali di eIF-4G nella sindrome del cromosoma X fragile e in

diversi tumori (es. tumore della prostata)
Messenger RNAs are translated on polyribosomes

Da 10 a 100 ribosomi

D. L. Nelson, M. M. Cox, I PRINCIPI DI BIOCHIMICA DI LEHNINGER 4/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright © 2006
Translation Inhibitors are important antibiotics
 Interruzione della sintesi proteica:
antibiotico puromicina

Nelson & Cox I principi di Biochimica di Lehninger- Zanichelli 6 ed.

Inibizione sintesi proteica

TOSSINA DIFTERICA

Corynebacterium
diphtheriae

ADP-ribosilazione di E-EF2 (traslocasi)

ADP-RIBOSILAZIONE
TOSSINA DIFTERICA- ADP-RIBOSILAZIONE
DEL FATTORE EF-2 (traslocasi)
 Ricino tossina
Proteina eterodimerica
Subunita’ B: legame ad un
recettore di membrana
Subunita’ A: rimuove una
adenina dal 28S RNA
Inibisce l’allungamento
della sintesi proteica
• Usata per
assassinare il
dissidente bulgaro
in esilio Georgi
Markov, a Londra,
nel 1978.
• Un ombrello con un
meccanismo a molla
per iniettare nel
sottocute delle
sferette
metalliche caricate
con la tossina
 CONTROL OF TRANSLATION
Protein synthesis is often regulated at the
level of translation initiation
 AN EXAMPLE OF CONTROL OF SPECIFIC mRNAS
regulation by iron (Fe)

Ferritin is a cytosolic iron binding protein expressed

when iron is abundant in the cell.

Transferrin receptor is a plasma membrane receptor

important for the import of iron into the cytosol.

They are coordinately regulated, in opposite

directions, by control of protein synthesis.
Regulation by iron (Fe):
There is also general control of translational initiation

ie. all transcripts of the cell are affected (though the

relative effect differs between specific mRNAs)

Global downregulation or upregulation can occur in response

to various stimuli, the most common are

1) Nutrient availability
low nutrient (amino acids/carbohydrate)
downregulates translation

2) Growth factor signals

stimulation of cell division upregulates translation
GENERAL CONTROL OF TRANSLATIONAL INITIATION
IS EXERTED THROUGH TWO PRIMARY MECHANISMS

● Control of the phosphorylation of eIF2

● Control of the phosphorylation of eIF4

binding proteins
FATTORE DI INIZIO EIF2
 FOSFORILAZIONE DI EIF2
1) chinasi regolata dall’eme

The regulation of translation by heme controlled inhibitor (HCI).

FOSFORILAZIONE DI EIF2

indotta indirettamente dall’interferone

 Control of translation by eIF4E availability
The 7MEG cap binding subunit of eIF4, eIF4E, is sequestered
by eIF4E binding protiens (4E-BPs). The binding of these
proteins is regulated by their phosphorylation state

Growth Nutrient
Factors Limitation
 Nutritional
controls 2

Nutritional signals can control both the recognition of the mRNA

and loading of the 40S subunit.