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MAGGIO 2003

Rivista di attualit diagnostiche

in questo numero
Anemie:
aspetti clinici e
Roche Diagnostics
Viale G.B. Stucchi, 110
diagnostici
20052 Monza (MI)
www.roche-diagnostics.it
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SOMMARIO
MONOGRAFIA - ANEMIE: ASPETTI CLINICI E DIAGNOSTICI
Approccio razionale alla diagnosi di anemia Pag. 4
Anemie emolitiche Pag. 10
Problematiche nella diagnosi dei difetti molecolari del gene -globinico Pag. 21
Anemia da carenza di folati e vitamina B12 Pag. 28
Lanemia sideropenica Pag. 36

ROCHE DIAGNOSTICS INFORMA


Light Cycler per la prevenzione del rischio trombotico Pag. 42
Cobas TaqMan 48: alta tecnologia e semplicit duso Pag. 46
I test disponibili sui sistemi Roche Diagnostics per la diagnostica dellanemia Pag. 48
Roche Diagnostics per la coagulazione: Affidabilit, Innovazione e Libert Pag. 51
La piena realizzazione del progetto Modular Pag. 52
Cobas Integra 400 plus e Abuscreen OnLine di IIa generazione:
il non plus ultra per lo screening delle droghe dabuso Pag. 54
NT-proBNP: il contributo del laboratorio nello Scompenso Cardiaco Pag. 58

Anno 6 - n. 14 Maggio 2003


EsaDia un trimestrale di medicina di laboratorio edito da CE.D.RI.M.
Autorizzazione del Tribunale di Milano n. 277 del 18/4/1992
Direttore responsabile: Giuseppe Minola
Redattore capo: Paolo Scala
Progetto grafico: Aretr srl
Art Direction: Ruggero Manganini
Impaginazione e illustrazioni: Simona Burla
Redazione: A. Gallazzi - P. Alessio - E. Beretta - M. Martino - C. Mosso - M. Paci - P. Pedrotti
Hanno collaborato: M. Cazzola - A. Giambona - R. Laricchia - F. Leto - A. Maggio - A. Molteni - D. Scribano

Stampatore: Arti Grafiche Amilcare Pizzi - Cinisello Balsamo

Copyright: Roche S.p.A.


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EDITORIALE

INTRODUZIONE
Inquadramento diagnostico delle anemie

Una delle principali funzioni del sangue il trasporto dellossigeno dai polmoni, dove viene captato dallaria inspirata, ai tessuti, dove viene con-
sumato dalle cellule durante i processi vitali che in esse si svolgono. Il trasporto dellossigeno viene effettuato dai globuli rossi, e pi precisamen-
te dallemoglobina in essi contenuta e che lega la molecola dellossigeno. Si definisce anemia una condizione morbosa caratterizzata dalla ridu-
zione del patrimonio emoglobinico dellorganismo o, pi semplicemente, della concentrazione dellemoglobina nel sangue circolante. Lanemia
certamente una delle condizioni morbose pi diffuse nel mondo, sia nei paesi sviluppati sia in quelli in via di sviluppo. La diagnosi differenziale
non sempre facile e richiede talvolta specifico know-how e sofisticati metodi diagnostici.
Essendo il ferro un componente fondamentale della molecola dellemoglobina, la mancanza di ferro una delle cause pi frequenti di anemia.
La carenza di ferro ha una prevalenza elevata anche nei paesi occidentali. Studi dellOrganizzazione Mondiale della Sanit stimano in 500-600
milioni le persone affette da carenza di ferro nel mondo. I gruppi della popolazione pi a rischio sono i bambini e gli adolescenti, le donne in
et fertile e le persone anziane. Durante la crescita, i giovani hanno bisogno di molto ferro per espandere le masse corporee, e questo contrasta
spesso con un apporto dietetico inadeguato. Le donne in et fertile sono a rischio elevato di carenza non solo per le perdite mestruali, ma anche
per le gravidanze, ciascuna delle quali richiede mediamente circa 700 mg di ferro. Le emorragie, spesso occulte, a carico del tubo digerente sono
la causa pi frequente di carenza nelle persone anziane. Lo spettro delle patologie responsabili di tali emorragie molto ampio: si va condizioni
banali, quali le emorroidi, alle neoplasie del tubo digerente.
Lanemia da carenza di ferro tipicamente microcitica (MCV < 80 fL) e per tale carattere entra in diagnosi differenziale con le talassemie, condizio-
ni morbose molto diffuse nel bacino del Mediterraneo. Le sindromi talassemiche sono disordini ereditari della sintesi della globina: una lesione
genica, trasmessa come carattere ereditario, comporta riduzione o abolizione completa della sintesi di una o pi catene globiniche. I difetti gene-
tici che sono alla base delle sindromi talassemiche sono molto eterogenei e vanno dalla mancanza completa del gene responsabile della sintesi
di una determinata catena globinica, alle cosiddette mutazioni puntiformi che interferiscono con la funzione del gene interessato. La sintesi di
emoglobina deficitaria e si hanno alterazioni degli eritroblasti e degli eritrociti provocate dalle catene globiniche in eccesso. Microcitosi e ipocro-
mia da ridotta sintesi emoglobinica sono caratteristiche costanti delle sindromi talassemiche. Eritropoiesi inefficace, da morte intramidollare degli
eritroblasti, ed iperemolisi periferica sono i meccanismi patogenetici dellanemia, ma svolgono ruoli diversi nei diversi tipi di sindrome talassemica.
Non va confusa con lanemia da carenza di ferro la cosiddetta anemia delle malattie croniche, vale a dire quel tipo di anemia che si associa fre-
quentemente a malattie infettive, flogistiche o neoplastiche aventi un decorso subacuto o cronico, che caratterizzata dalla combinazione di side-
remia bassa con ferritina normale o elevata ed aumento del ferro di deposito nelle cellule reticoloendoteliali del midollo osseo, del fegato e della
milza. Le malattie cui si associa pi frequentemente sono lartrite reumatoide, la polimialgia reumatica e le neoplasie con manifestazioni sistemi-
che. Si tratta probabilmente del tipo di anemia di pi frequente riscontro nei paesi sviluppati; importante distinguerla dallanemia da carenza
di ferro in quanto lanemia delle malattie croniche non risponde generalmente alla terapia marziale.
Lacido folico e la vitamina B12 sono di fondamentale importanza per la proliferazione degli eritroblasti nel midollo osseo, e la loro mancanza
produce anemia megaloblastica. Le anemie megaloblastiche sono caratterizzate da una particolare morfologia degli eritroblasti nel midollo osseo
(eritroblasti che vengono appunto definiti megaloblasti) e da aumentato volume dei globuli rossi, quindi da macrocitosi (MCV > 100 fL). La pi
classica delle anemie megaloblastiche lanemia perniciosa.
Le anemie emolitiche sono dovute ad eccessiva distruzione dei globuli rossi, che pu essere dovuta o ad un difetto intrinseco ai globuli rossi stes-
si o a cause estrinseche. Il meccanismo patogenetico comune consente di individuarle facilmente: infatti, leccessiva distruzione di globuli rossi
comporta un netto aumento dei reticolociti (globuli rossi giovani) ed iperbilirubinemia indiretta. Nella maggior parte dei casi laumentata distru-
zione di eritrociti extravascolare, vale a dire ha luogo nei macrofagi del sistema reticoloendoteliale come nei soggetti normali. In alcuni casi, so-
prattutto di anemie emolitiche acute, leccessiva distruzione degli eritrociti avviene invece allinterno dei vasi sanguigni, con importanti manife-
stazioni cliniche.
Per quanto la causa di unanemia possa talvolta emergere dallanamnesi e dallesame obiettivo del paziente, laiuto del laboratorio indispensa-
bile in ogni caso. Lapproccio iniziale prevede un esame emocromocitometrico completo, il conteggio dei reticolociti e lesame dello striscio di san-
gue periferico. Sono poi necessarie indagini pi approfondite, quali lo studio della eritropoiesi midollare, dello stato del ferro corporeo, della
composizione emoglobinica e dellemolisi periferica per diagnosticare accuratamente unanemia.

Prof. Mario Cazzola


Universit degli Studi di Pavia - Divisione di Ematologia
IRCCS Policlinico S. Matteo - Pavia
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Approccio razionale
alla diagnosi di anemia
M. Cazzola
Professore di Ematologia
dellUniversit di Pavia
Divisione di Ematologia
IRCCS Policlinico S. Matteo
Pavia

La diagnosi di anemia viene posta attraverso una serie di Diagnosi di anemia


esami di laboratorio che consentono di stabilirne la gra- Nelladulto la diagnosi di anemia si pone quando lemo-
vit e la natura. globina inferiore a 13,0 g/dL nel maschio, e a 12 g/dL
Di fondamentale importanza , ovviamente, lesame nella donna. Nellanziano, il livello di emoglobina tende
emocromocitometrico completo, comprendente i parame- a ridursi progressivamente con lavanzare dellet, e 12
tri elencati nella Tabella 1. g/dL costituisce un livello discriminante valido per
In questa breve nota viene presentato un approccio razio- entrambi i sessi. Nella donna gravida, lemodiluizione
nale alla diagnosi di questa condizione morbosa estre- abbassa la concentrazione di emoglobina: il limite infe-
mamente frequente. riore della norma 11 g/dL nei primi due trimestri e 10

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Anemie: aspetti clinici e diagnostici


monografia

g/dL nel terzo trimestre di gravidanza. In generale, quan- Tabella 1


do la concentrazione di emoglobina vicina al valore Maschi Femmine
soglia (cosiddetto valore borderline), conviene ripetere
nel tempo lesame emocromocitometrico per stabilire se Emoglobina (Hb), g/dL 13,0-17,0 12,0-16,0
__________________________________________________________________
vi sia o meno anemia. Ematocrito (Hct o PCV), rapporto 0,39-0,50 0,36-0,45
__________________________________________________________________
I tipi principali di anemia sono riportati nella Tabella 2.
Eritrociti (RBC), 1012/L 4,5-5,9 4,0-5,5
La classificazione adottata strettamente collegata al __________________________________________________________________
procedimento diagnostico, in base al quale i parametri Volume globulare medio (MCV), fL 83-97*
__________________________________________________________________
che hanno allinizio maggior potere diagnostico sono Contenuto emoglobinico
lMCV, che consente la distinzione fra anemie microcitiche globulare medio (MCH), pg 27-32
__________________________________________________________________
e anemie normo-macrocitiche, ed il conteggio dei retico- Concentrazione emoglobinica
lociti, che consente la distinzione fra anemie emolitiche o globulare media (MCHC), g/dL 32-36
__________________________________________________________________
emorragiche, da un lato, e anemie ipoproliferative o da RDW (Red cell distribution width, 11,5-14,5
eritropoiesi inefficace, dallaltro. ovvero ampiezza della distribuzione
Le anemie microcitiche hanno unelevata prevalenza in eritrocitaria), CV %
__________________________________________________________________
Italia per lelevato numero di soggetti con -talassemia Reticolociti (Retic),
% 0,4-2%
eterozigote. Inoltre lanemia da carenza di ferro ha una
109/L 20-100
prevalenza del 10-20% in certe fasce di et, quali i bam- __________________________________________________________________
bini, le donne in et feconda e gli anziani. Lanemia delle Leucociti (WBC), 109/L 4-11
__________________________________________________________________
malattie croniche in assoluto lanemia pi frequente, Piastrine (PLT), 109/L 150-450
__________________________________________________________________
ma microcitica in una minoranza dei casi. La maggior * Nella diagnosi di anemia microcitica, normocitica e macrocitica si usano cut-off di MCV pi netti per avere maggior
parte delle anemie normocitiche costituita dallanemia potere diagnostico: < 80 fL (anemia microcitica), 80-100 fL (anemia normocitica), > 100 fL (anemia macrocitica).
Chiaramente esistono margini di incertezza nellambito 80-83 fL ed in quello 97-100 fL: il follow-up indispensabile
delle malattie croniche e dallanemia da insufficienza in questi casi, soprattutto se non vengono in aiuto altri dati clinici e/o di laboratorio.
renale cronica. Fra le anemie macrocitiche, le pi fre-
quenti sono lanemia associata ad epatopatia cronica e le to di MCV da 80 a 83 fL, per cui i pazienti con questi valo- Tab 1
anemie da carenza di folati e vitamina B12. ri devono essere rivalutati nel tempo e riconsiderati per Valori normali di
le diverse possibili opzioni diagnostiche. riferimento dei vari
Procedimento diagnostico Se lMCV normale (80-100 fL) o aumentato (> 100 fL), si parametri dellesame
Il procedimento diagnostico proposto articolato su un di fronte ad una anemia normocitica o macrocitica, rispet- emocromocitometrico
modello di diagnosi fisiopatologica descrittiva, il cui tivamente. Sulla base del conteggio dei reticolociti si in una popolazione
obiettivo quello di definire il principale meccanismo distingue fra anemie emolitiche, che hanno un numero di adulta (tra parentesi
patogenetico dellanemia, ed integrato dalle informa- reticolociti adeguato per il livello di anemia in quanto il vengono riportate gli
zioni cliniche; spesso, queste ultime consentono di arriva- midollo eritroide in grado di rispondere allo stimolo eri- acronimi inglesi dei
re alla diagnosi rapidamente, anche senza aver percorso tropoietinico, e le anemie ipoproliferative e da eritropoie- singoli parametri).
tutto liter diagnostico fisiopatologico. si inefficace, che hanno un numero di reticolociti non
Stabilita la presenza dellanemia, il primo parametro che appropriato per il grado di anemia in quanto il midollo
si prende in considerazione il volume globulare medio eritroide non in grado di produrli adeguatamente. Non
(MCV) che routinariamente misurato dai contatori auto- vi sono criteri universalmente accettati per definire lade-
matici e ha un forte potere diagnostico. Consente, infat- guatezza della risposta reticolocitaria. Valori > 3% sono
ti, di distinguere fra le anemie microcitiche, nelle quali la adeguati per il grado di anemia, mentre valori <3% e,
sintesi emoglobinica ridotta per inadeguato apporto di soprattutto, al 2% sono inadeguati. In alternativa si pu
ferro al midollo eritroide o per deficitaria sintesi della calcolare il numero assoluto di reticolociti: si considerano
globina o delleme, e tutte le altre anemie. Non va adeguati valori 150 x 109/L, inadeguati valori inferiori.
dimenticato che lMCV fornito dai contaglobuli un valo-
re medio, che come tale pu essere inadeguato in parti- Anemie microcitiche
colari situazioni: conviene quindi esaminare, nei casi Le anemie microcitiche sono per definizione caratterizzate
dubbi, la curva di distribuzione dei volumi eritrocitari. da un volume globulare medio (o MCV) inferiore a 80 fL.
Se lMCV ridotto (< 80 fL), si di fronte ad una anemia Queste anemie sono per solito anche ipocromiche, ovvero
microcitica. Vi un certo margine di incertezza nellambi- hanno un contenuto emoglobinico globulare medio

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Approccio razionale alla diagnosi di anemia

Tabella 2 microcitica. Dopo aver valutato le informazioni anamne-


Anemie microcitiche (MCV < 80 fL) stiche, si passa alle indagini di laboratorio. Il primo passo
di fronte ad unanemia microcitica quello di procedere
Anemia da carenza di ferro
Anemia delle malattie croniche ad una valutazione dello stato del ferro corporeo attra-
Sindromi talassemiche verso la determinazione di sideremia, TIBC, ferritina sieri-
Anemia saturnina ca e, eventualmente, recettore solubile della transferrina.
Anemia sideroblastica congenita
Emoglobina C Se la sideremia bassa, lanemia verosimilmente da
Emoglobina E carenza di ferro o da malattia cronica. Mediante limpie-
go combinato dei vari parametri dello stato del ferro cor-
Anemie normocitiche (MCV 80-100 fL) e macrocitiche (MCV >100 fL)
poreo possibile diagnosticare la carenza di ferro. Lane-
Anemie ipoproliferative (reticolociti < 2%) mia da carenza di ferro va distinta dallanemia dellin-
Anemia delle malattie croniche (incluse le neoplasie)

Anemia da insufficienza renale cronica


fiammazione o delle malattie croniche, vale a dire lane-
Anemia associata ad epatopatia mia associata a processi flogistici subacuti e cronici (infe-
Anemia associata ad endocrinopatia
zioni, collagenopatie, neoplasie, etc.): siccome entrambe
Anemia secondaria a malnutrizione

Anemie refrattarie (sindromi mielodisplastiche)


le condizioni sono molto frequenti, la diagnosi differen-
Anemia associata a malattia mieloproliferativa ziale si pone spesso. Lanemia da malattia cronica nor-
Anemia associata a malattia linfoproliferativa mocromica normocitica in circa i 2/3 dei casi, e quasi
Anemia aplastica (compresa leritroblastopenia selettiva)
sempre nelle fasi iniziali della malattia; tende a diventa-
Anemie da eritropoiesi inefficace (reticolociti < 3%, bilirubina non coniugata ed LDH aumentate) re modicamente microcitica (MCV tra 70 e 80 fL) ed ipo-
Anemie megaloblastiche (carenza di vitamina B12 o folati) cromica con il perdurare della condizione morbosa e
Anemie sideroblastiche acquisite
soprattutto nelle collagenopatie. Nellanemia da malattia
Anemie diseritropoietiche congenite
cronica i depositi corporei di ferro non sono depleti: il
Anemie emolitiche (reticolociti > 3%, bilirubina non coniugata ed LDH aumentate) ferro sequestrato prevalentemente nelle cellule retico-
Anemie immunoemolitiche
loendoteliali (sideropessi). Sideremia e saturazione della
Anemie emolitiche da disordini della membrana eritrocitaria

Anemie emolitiche da emoglobinopatia


transferrina sono in genere basse, come accade anche
Anemie emolitiche da difetti metabolici eritrocitari nella carenza di ferro: sono la TIBC, la ferritina sierica ed
Emolisi intravascolare il recettore solubile della transferrina i parametri che con-
sentono la diagnosi differenziale, come indicato nella
Anemia emorragica (reticolociti variabilmente aumentati)
Tabella 3. Lanemia delle malattie croniche caratterizza-
ta da alcune modificazioni delle proteine plasmatiche, in
Tab 2 (MCH) inferiore a 27 pg. Le anemie microcitiche sono di particolare da una riduzione dellalbumina e da una ele-
Principali possibilit frequente osservazione, costituendo pi della met di vazione delle cosiddette proteine della fase acuta, alfa-2
diagnostiche di fronte tutte le anemie. Il principale meccanismo patogenetico di globuline e proteina C reattiva: il riscontro di indici della
ad un paziente queste anemie una deficitaria sintesi di emoglobina, fase acuta mossi di fondamentale importanza per la
anemico che pu essere dovuta a diverse cause. I tre tipi principa- diagnosi di anemia delle malattie croniche.
li di anemia microcitica sono i seguenti: possibile che una carenza di ferro si sovrapponga ad
- anemia da carenza di ferro; unanemia da malattia cronica, soprattutto nel paziente
- anemia dellinfiammazione o delle malattie croniche; con artrite reumatoide che assume FANS e pu pertanto
- sindromi talassemiche dovute a deficitaria sintesi di una avere uno stillicidio cronico di sangue dal tubo digeren-
o pi catene globiniche. te. Lassociazione di anemia da malattia cronica e caren-
Ai tre tipi principali di anemia microcitica vanno aggiun- za di ferro d luogo ad una condizione clinica di non sem-
te forme pi rare, quali lanemia saturnina (provocata plice diagnosi: gli indici della fase acuta mossi sono sug-
dallinibizione della sintesi delleme indotta dal piombo), gestivi di una patologia flogistica, mentre una ferritina
le anemie sideroblastiche congenite (dovute a sintesi defi- sierica < 50 g/L in presenza di flogosi e, soprattutto, un
citaria delleme) ed alcune emoglobinopatie, quali lemo- recettore solubile della transferrina aumentato sono
globina C (dovuta a cristallizzazione dellemoglobina) e parametri suggestivi di carenza di ferro (Tabella 3). Per-
lemoglobina E (sindrome talassemica a tutti gli effetti): tanto, in un paziente anemico con indici della fase acuta
Talvolta le informazioni anamnestiche consentono di mossi, ferritina sierica inferiore a 50 g/L e/o aumento
orientare subito la diagnosi differenziale di anemia del recettore solubile della transferrina, vale la pena di

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Anemie: aspetti clinici e diagnostici


monografia

Tabella 3 rore pi frequente di fronte ad un soggetto con queste


TIBC Ferritina Recettore solubile caratteristiche di ignorare sia lemoglobina che lMCV, e
(g/dL) sierica della transferrina di guardare solo al numero dei globuli rossi, e quindi di
(g/L) considerare lemocromo normale. E proprio lindividua-
__________________________________________________________________
zione della microcitosi marcata, associata a modica ridu-
Carenza di ferro > 360 < 15 (M) Aumentato
< 10 (F) zione dellemoglobina, che deve suggerire invece il
__________________________________________________________________
sospetto diagnostico di trait talassemico. In questi casi, le
Infiammazione Normale > 50 Normale
o ridotta indagini familiari dimostreranno lereditariet del carat-
__________________________________________________________________
tere. La resistenza osmotica eritrocitaria aumentata, ma
Infiammazione con
carenza di ferro
lesame fondamentale lo studio della composizione
(artrite reumatoide) Variabile Variabile Aumentato emoglobinica, che consente di dimostrare un aumento
dellemoglobina A2 (> 3%, soglia variabile da metodo a
iniziare un trattamento con ferro: la somministrazione Tab 3 metodo). Non tutti i casi di -talassemia eterozigote
endovenosa molto pi efficace di quella orale in questi casi. Diagnosi differenziale hanno alterazioni dellesame emocromocitometrico: esi-
fra carenza di ferro stono infatti i cosiddetti portatori o carrier silenti che
Sindromi talassemiche ed altre anemie microcitiche ed infiammazione hanno un emocromo normale. Anche lemoglobina A2
di pi rara osservazione normale in questi soggetti e solo lo studio della sintesi
Se la sideremia e gli altri parametri dello stato del ferro delle catene globiniche (rapporto /) o lapproccio di
sono normali, e se non vi sono indici della fase acuta biologia molecolare consente la diagnosi.
mossi, ci si orienta verso una sindrome talassemica. Va Siccome la sintesi delle catene globiniche governata
segnalata uneventualit non infrequente in Italia, ovve- da 4 geni (due per cromosoma 16), la genetica delle -
ro che ci si trovi di fronte ad un caso di anemia microci- talassemie complessa e la diagnosi richiede elevato
tica con sovraccarico di ferro (sideremia elevata, TIBC know-how. In generale la diagnosi di -talassemia si
ridotta, ferritina sierica elevata): questi possono essere articola su 3 livelli. Il primo consiste nel riconoscere una
casi di thalassemia intermedia o minor o, pi raramente, condizione di anemia microcitica ipocromica, o pi sem-
casi di anemia sideroblastica congenita. La diagnosi richie- plicemente di microcitosi, attraverso un esame emocro-
de sempre indagini familiari ed attento esame della mocitometrico eseguito con contaglobuli elettronico. Il
morfologia eritrocitaria sullo striscio di sangue periferico. secondo consiste nellescludere una carenza di ferro
Sono inoltre necessari studi sulla composizione emoglobi- (attraverso la valutazione dello stato del ferro corporeo)
nica e approcci di biologia molecolare nel caso di sindro- ed una -talassemia (attraverso lo studio della composi-
me talassemica, ed un aspirato midollare per la dimo- zione emoglobinica). Il terzo livello quello costituito
strazione di sideroblasti ad anello nel caso di anemia dallo studio della biosintesi delle catene globiniche in
sideroblastica congenita. vitro e dalle indagini molecolari.
Se ci si orienta verso una sindrome talassemica, le inda-
gini familiari, lesame della morfologia eritrocitaria sullo Anemie normo-macrocitiche
striscio di sangue periferico ed uno studio della composi- Le anemie normo-macrocitiche di pi frequente osserva-
zione emoglobinica del sangue periferico diventano le zione non sono dovute ad un disordine primitivo del
indagini diagnostiche pi importanti. midollo eritroide, ma sono secondarie a malattie sistemi-
Le sindromi talassemiche sono disordini ereditari della che non ematologiche. Queste anemie secondarie hanno
sintesi emoglobinica, e sono caratterizzate da riduzione o una patogenesi multifattoriale e sono spesso complicate
abolizione completa dalla sintesi di una o pi catene glo- da perdite ematiche, carenza di ferro e carenza di folati.
biniche. La diagnosi di sindrome talassemica che il medi- La pi comune di queste anemie secondarie lanemia
co italiano ha pi occasioni di porre quella di -talas- delle malattie croniche, dovuta ad eccessiva produzione di
semia eterozigote (trait -talassemico) (circa 1.500.000 citochine quali interleuchina 1, interleuchina 6 e tumor
soggetti in Italia). Il paziente tipico ha unemoglobina ai necrosis factor, ed associata a malattie infettive croniche,
limiti inferiori della norma o lievemente ridotta (11-13 malattie infiammatorie e neoplasie. Lanemia per solito
g/dL nel maschio adulto, 10-12 g/dL nella donna adulta), modesta (Hb > 9 g/dL), normocitica e normocromica in
netta microcitosi (MCV intorno ai 60-70 fL) ed un nume- 2/3 dei casi, con sideremia bassa, TIBC normale o bassa e
ro di globuli rossi mediamente superiore al normale. Ler- ferritina sierica normale o aumentata. Come si gi

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Approccio razionale alla diagnosi di anemia

detto, lanemia tende ad essere microcitica nei casi di attraverso laspirato midollare e la biopsia ossea. La sin-
maggior gravit (con marcata iperproduzione di citochi- drome mielodisplastica si pu sospettare dalla presenza di
ne) e di pi lunga durata, e tipicamente nellartrite reu- alcune anomalie del sangue periferico (bi- o pancitope-
matoide. nia, degranulazione dei neutrofili, anomalia tipo Pelger-
Linsufficienza renale cronica comporta anemia da produ- Huet, piastrine giganti).
zione inadeguata di eritropoietina. Lanemia pi impor-
tante nei soggetti in trattamento dialitico che nei pazien- Anemie emolitiche ed emorragiche
ti in fase predialitica, non solo per maggior gravit della Il riscontro di reticolociti elevati (conteggio reticolocitario
malattia di fondo, ma anche in quanto la dialisi pu corretto > 3%, o reticolociti in valore assoluto > 150 x
comportare cause aggiuntive di anemia. La diagnosi 109/L) in un paziente anemico indica che il midollo eri-
importante anche perch questa anemia pu essere com- troide in grado di rispondere adeguatamente allo sti-
pletamente corretta con la somministrazione di eritro- molo eritropoietinico producendo un maggior numero di
poietina umana ricombinante. eritrociti. Lesistenza di un compenso eritropoietico effica-
Le neoplasie possono produrre anemia non soltanto attra- ce indica a sua volta che il meccanismo di anemia peri-
verso il meccanismo delliperproduzione di citochine (ane- ferico.
mia delle malattie croniche), possono infiltrare diretta- Lapproccio diagnostico allanemia emolitica cronica richie-
mente il midollo osseo e possono comportare perdite di de tre livelli sequenziali di intervento: a) la dimostrazio-
sangue. Linfiltrazione midollare costante nel mieloma ne della natura emolitica dellanemia, b) lidentificazione
multiplo e molto frequente nei linfomi a basso grado di della causa dellemolisi ed eventualmente c) la caratteriz-
malignit, mentre pi rara nei tumori solidi. In alcuni zazione del difetto molecolare.
casi, tipicamente nelladenocarcinoma metastatizzato, Esame emocromocitometrico completo, conteggio accura-
pu essere presente unanemia emolitica microangiopatica. to dei reticolociti, esame accurato della morfologia eri-
Un MCV molto elevato (> 110 fL) di per s un parametro trocitaria, determinazione della bilirubina e della LDH
sufficientemente espressivo per generare ipotesi diagno- costituiscono le indagini di laboratorio di primo livello.
stiche. Pi dell80% di tali pazienti hanno una anemia da Lesame della morfologia eritrocitaria di fondamentale
carenza di acido folico o di vitamina B12 (anemia megalo- importanza, in quanto ha in talune condizioni un eleva-
blastica); altre possibili ipotesi diagnostiche sono lanemia to potere diagnostico: basti pensare alle implicazioni del
associata ad epatopatia alcoolica, leffetto di farmaci riscontro di schistociti, sferociti, ellissociti, stomatociti,
antifolici o antimetaboliti (tipicamente lidrossiurea) sul drepanociti, acantociti o granulazioni basofile intraeritro-
midollo eritroide, o una pesudomacrocitosi (da crioagglu- citarie (costanti nel deficit di pirimidin-5-nucleotidasi).
tinine, iperglicemia, leucocitosi). La pseudomacrocitosi da Bilirubina non coniugata e LDH sono due indicatori
crioagglutinine viene diagnosticata eseguendo lesame importanti di emolisi, anche se sono parametri scarsa-
emocromocitometrico a caldo, quella da iperglicemia mente specifici.
sostituendo il plasma con fisiologica e quella da leucoci- La presenza o lassenza di emorragie il criterio secondo
tosi analizzando la distribuzione dei volumi eritrocitari. il quale si realizza la suddetta distinzione. Lemorragia
Lipersegmentazione dei neutrofili tipica delle anemie esterna facile da diagnosticare: si tratta in genere di
megaloblastiche: questo parametro ha un forte potere emorragia a carico del tubo digerente, comportante ema-
diagnostico, tanto che il riscontro su uno striscio di san- temesi, melena o rettorragia, manifestazioni che com-
gue periferico di un singolo neutrofilo con 6 o pi seg- paiono nel giro di poche ore dopo levento emorragico
mentazioni nucleari deve far immediatamente pensare responsabile. Vi possono essere maggiori difficolt nel
allanemia megaloblastica, e quindi indurre a dosare la caso di emorragia interna, ma questa per solito causa-
vitamina B12 o il livello di folati nel siero. Ovviamente, il ta da trauma e quindi il contesto clinico. Nei casi dubbi
riscontro simultaneo di macrocitosi marcata e di iperseg- possono essere daiuto la bilirubina e lLDH, che sono ele-
mentazione dei neutrofili molto suggestivo di anemia vate nellanemia emolitica e normali nellanemia emorra-
megaloblastica. gica: nel caso di emorragia interna, tuttavia, gli eritrociti
Una volta escluse le anemie normo-macrocitiche pi fre- stravasati vengono catabolizzati, seppur lentamente, e
quenti (anemia delle malattie croniche, anemie seconda- questo pu produrre una certa elevazione dei suddetti
rie, anemie megaloblastiche), la diagnosi passa quasi ine- parametri.
vitabilmente attraverso lesame del midollo osseo, quindi Lanemia emorragica richiede alcuni giorni (da 3 a 7) per

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Anemie: aspetti clinici e diagnostici


monografia

Tabella 4

Esami di laboratorio di routine nella diagnosi dellanemia


Esame emocromocitometrico completo (mediante contatore automatico)
Parametri importanti: emoglobina, MCV, leucociti e formula leucocitaria, piastrine
_____________________________________________________
Esame microscopico della morfologia eritrocitaria e pi in generale dello striscio di
sangue periferico: va sempre fatto al momento della prima diagnosi.
_____________________________________________________
Conteggio accurato (automatizzato) dei reticolociti: questo esame troppo spesso
dimenticato, mentre di fondamentale importanza.
_____________________________________________________
Sideremia, TIBC, ferritina sierica
_____________________________________________________
Bilirubina e LDH
_____________________________________________________
Indici di fase acute (proteina C reattiva)

sviluppare una reticolocitosi adeguata, e quindi pu rien- Conclusioni


trare anche nelle anemie normo-macrocitiche con retico- La Tabella 4 riporta una batteria di esami che possono
lociti bassi. ritenersi routinari nellapproccio alla diagnosi di anemia:
In questa anemia sono prominenti i segni dellipovolemia tali esami, non invasivi, hanno complessivamente un
e lintervento terapeutico deve essere primariamente forte potere diagnostico e consentono di diagnosticare la
diretto al ripristino della volemia, attraverso la sommini- maggior parte delle anemie.
strazione di soluzione fisiologica o di plasma expander.

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Anemie emolitiche
R. Laricchia
Direttore U.O.C. Servizio di
Immunoematologia e
Medicina Trasfusionale
Osp. Generale Regionale
F. Miulli
Acquaviva delle Fonti (Bari)

Anemie emolitiche superare le capacit di compenso del midollo, eventual-


Le anemie emolitiche (A.E.) sono condizioni, eterogenee mente ridotte per la concomitante presenza di fattori che
sotto il profilo eziopatogenetico, caratterizzate da una ne limitano la risposta, si determina uno stato anemico
riduzione della vita media dei globuli rossi (G.R.) circo- (anemia emolitica)1.
lanti rispetto ai normali 100-120 giorni.
La diminuita sopravvivenza delle emazie (iperemolisi), Classificazione
comunque determinata, comporta lattivazione di mecca- In base ai meccanismi eziopatogenetici, le A.E. vengono
nismi di compenso a livello midollare, con incremento classificate in forme ereditarie, causate da difetti intrinse-
dellattivit eritropoietica fino a 7-8 volte i valori basali. ci dei G.R. (che possono interessare la membrana, il cor-
Quando laumentata produzione di G.R. ne bilancia lac- redo enzimatico, le catene globiniche) determinati gene-
celerata distruzione, i livelli di emoglobina restano entro ticamente, e forme acquisite. Queste ultime, ad eccezione
i limiti della norma (stato emolitico compensato). dellemoglobinuria parossistica notturna dovuta ad una
Se, invece, lintensit del processo emolitico tale da mutazione somatica della cellula staminale con produzio-

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Anemie: aspetti clinici e diagnostici


monografia

ne di un clone eritrocitario anomalo, sono causate da Tabella 1


noxae esterne che esercitano la loro azione lesiva su ema-
zie metabolicamente e strutturalmente normali (Tabella I) 2. 1. ANEMIE EMOLITICHE EREDITARIE
In numerose altre condizioni anemiche (associate a neo- 1. 1. ANEMIE EMOLITICHE DA DIFETTO DELLA MEMBRANA
plasie diffuse, a leucemie, a linfomi, a epatopatie, a insuf- 1.1.1. sferocitosi ereditaria
1.1.2. ellissocitosi e piropoichilocitosi ereditarie
ficienza renale, ad artrite reumatoide ecc.), generalmente
1.1.3. altre forme ereditarie (stomatocitosi, acantocitosi)
a patogenesi multifattoriale, pu essere presente uno 1. 2. ANEMIE EMOLITICHE DA DIFETTO ENZIMATICO
stato iperemolitico, di solito evidenziabile esclusivamente 1.2.1. della via glicolitica di Embden-Meyerhof
mediante studi di sopravvivenza eritrocitaria e poco rile- 1.2.2. dello shunt degli esoso-monofosfati
vante ai fini del determinismo dellanemia il cui meccani- 1. 3. ANEMIE EMOLITICHE DA DIFETTO DELLE CATENE GLOBINICHE
1.3.1. varianti emoglobiniche stabili
smo patogenetico principale risiede nella ridotta produ-
1.3.2. varianti emoglobiniche instabili
zione midollare di G.R. Tali situazioni vengono definite di
anemia con componente emolitica1. 2. ANEMIE EMOLITICHE ACQUISITE
2. 1. ANEMIE EMOLITICHE AUTOIMMUNI
Fisiopatologia dellemolisi 2.1.1. da anticorpi caldi
Nelle A.E. la precoce distruzione dei G.R. avviene o per 2.1.2. da anticorpi freddi
fagocitosi da parte dei macrofagi tessutali (emolisi extra- 2.1.2.1. da agglutinine fredde
vascolare) oppure per lisi nel circolo sanguigno (emolisi 2.1.2.2. da emolisine bifasiche
2.1.3. mixed
intravascolare). In alcuni casi tali due differenti meccanismi
2.1.4. con test dellantiglobulina diretto negativo
possono coesistere. 2. 2. ANEMIE EMOLITICHE IMMUNOMEDIATE DA FARMACI
Lemolisi extravascolare si realizza con modalit simili a 2.2.1. con meccanismo dellimmunocomplesso
quelle con cui fisiologicamente vengono rimosse a livello 2.2.2. con meccanismo delladsorbimento del farmaco
macrofagico le emazie senescenti, con liberazione in circo- 2.2.3. con meccanismo di induzione dellautoimmunit
lo di bilirubina indiretta (B.I.) e di ossido di carbonio (CO). 2. 3. ANEMIE EMOLITICHE DA ALLOANTICORPI
2.3.1. malattia emolitica del neonato
Anche in tal caso, comunque, una certa quota di costi-
2.3.2. reazioni trasfusionali emolitiche
tuenti eritrocitari, tra cui emoglobina (Hb) e latticodei- 2. 4. EMOGLOBINURIA PAROSSISTICA NOTTURNA
drogenasi (LDH), viene riversata nel plasma. 2. 5. ANEMIE EMOLITICHE MECCANICHE
Lemolisi intravascolare dovuta a lisi dei G.R. in circolo, 2.5.1. microangiopatiche
con liberazione nel plasma del contenuto eritrocitario, 2.5.2. da traumatismo cardiaco
2.5.3. emoglobinuria da marcia
quindi principalmente di Hb, oltre che di enzimi, tra i Tab 1 2. 6. ANEMIE EMOLITICHE DA AGENTI CHIMICI
quali la LDH. LHb nel plasma si scinde in dimeri che si Classificazione delle 2. 7. ANEMIE EMOLITICHE DA AGENTI INFETTIVI
legano allaptoglobina (Hp), un2-globulina in grado di anemie emolitiche
captare fino a 1 g di Hb/litro. Il complesso Hb-Hp viene
veicolato a livello macrofagico, dove metabolizzato con dove documentabile sotto forma di emosiderina. La
conseguente consumo di Hp. LHb che eccede la capacit quota di Hb che eccede le capacit di riassorbimento
di legame dellHp subisce vari destini: tubulare viene eliminata con le urine (emoglobinuria),
- in parte viene captata come tale dai macrofagi epatici; nelle quali si trova in forma di ossiemoglobina, preva-
- in parte si ossida a metemoglobina, con distacco suc- lente a pH alcalino, e/o metemoglobina, maggiormen-
cessivo delleme che si lega allemopessina (Hx) o allal- te presente a pH acido1, 2, 3.
bumina (Al), mentre la globina viene agganciata dal-
lHp. Tali complessi vengono trasportati a livello dei Sintomatologia
macrofagi, specie epatici, dove sono degradati, con con- Sintomi e segni comuni alle diverse forme di A.E., varia-
seguente caduta dei valori dellHx e dellHp sieriche; mente associati e con differente espressivit in relazione
- in parte viene filtrata a livello renale, riassorbita dalle al tipo e grado di anemia e alla rapidit con la quale
cellule tubulari, fino ad una soglia massima di 0,25 g/l, questa si instaurata, sono:
e qui catabolizzata. Il ferro (Fe) eminico, legato dalla- - astenia, facile affaticabilit, polipnea e tachicardia da
poferritina a formare ferritina ed emosiderina, in parte sforzo, cefalea, vertigini, ronzii, disturbi visivi ecc.;
riutilizzato dallorganismo e per il resto viene perso - pallore di cute e mucose, subittero o ittero, urine iper-
con la desquamazione delle cellule tubulari nelle urine, cromiche, feci ipercoliche, soffi cardiaci anorganici, ecc.

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Anemie emolitiche

Nelle forme croniche possono riscontrarsi litiasi biliare, Peraltro nelle A.E., specie intravascolari, liperbilirubine-
per formazione di calcoli bilirubinici, con colicistite croni- mia non un reperto costante e, quando presente, va
ca ed episodi di colica biliare, splenomegalia di entit posta la diagnosi differenziale con le altre condizioni
variabile, talvolta epatomegalia, ulcere malleolari, car- nelle quali riscontrabile;
diomegalia. Inoltre possono verificarsi episodi di aplasia - laumento dei valori della latticodeidrogenasi (LDH)
midollare transitoria, eventualmente causati da infezioni sierica, in particolare degli isoenzimi 1 e 2, generalmen-
da parvovirus2. te pi evidente negli stati emolitici di tipo intravascola-
Nelle A.E. intravascolari la sintomatologia differisce in re. Poich lincremento della LDH riconosce anche altre
relazione allentit dellemolisi, al tipo dellA.E. e, conse- cause, talvolta pu essere necessario valutarne gli isoen-
guentemente, alla possibilit che vengano variamente zimi per stabilirne lorigine;
attivati diversi sistemi (emocoagulativo, complementare, - la riduzione dei tassi di aptoglobina (Hp) sierica, pi
delle chinine, simpatico) che interagiscono tra loro in marcata nelle forme intravascolari. Nella valutazione di
maniera complessa, anche per lintervento di svariate tale indice va considerato, comunque, che i livelli basa-
citochine e di altre sostanze biologicamente attive. Posso- li di Hp, in quanto proteina della fase acuta prodotta
no essere presenti febbre preceduta da brividi, stato di dal fegato, sono pi elevati in varie condizioni patolo-
malessere e di ansiet, cefalea pulsante, dolore addomi- giche (flogosi acute e croniche, neoplasie ecc.) e sono pi
nale e/o lombare, urine ipercromiche (rossastre o nera- bassi nella insufficienza epatica grave.
stre), dolore toracico con senso di costrizione retrosterna- Altri indici di iperemolisi sono costituiti dallaumentata
le, nausea, vomito e, nei casi pi gravi, ipotensione, produzione ed escrezione di ossido di carbonio (CO), dal-
shock, insufficienza renale acuta, coagulazione intravasco- lincremento dei livelli di sideremia e di ferritinemia
lare disseminata (CID)3. (tranne che nelle A.E. con emoglobinuria) e, limitatamen-
te alle forme con emolisi intravascolare, dallincremento
Diagnosi dei valori di emoglobinemia (con plasma di tonalit rosa
La diagnosi di A.E. si basa sulla valutazione globale del o rossa), dalla riduzione dellemopessina sierica, dalla
paziente. E necessaria, pertanto, unapprofondita indagi- comparsa di metemalbumina nel plasma (che assume
ne anamnestica, sia familiare (per definirne la possibile colore brunastro), dalla presenza di emoglobinuria (con
natura ereditaria), sia fisiologica (con particolare riguar- urine di colore variante dal rosso vivo al marrone scuro a
do alle caratteristiche dellalvo e della diuresi, allalimen- seconda della prevalenza di ossiemoglobina o di mete-
tazione ecc.), sia patologica (che tenda a stabilirne let di moglobina) e di emosiderinuria 1, 2, 3.
insorgenza, talvolta rivelata da un ittero neonatale, che Lindice di compenso midollare pi semplice da determina-
ricerchi i sintomi legati allanemia e ad eventuali crisi re costituito dalla conta dei reticolociti, il cui valore
emolitiche, valutandone i possibili fattori scatenanti, che correla in maniera diretta con leritropoiesi efficace
indaghi sullassociazione di malattie infettive o autoim- midollare. I reticolociti possono essere espressi come per-
munitarie ecc.). Altrettanto accurato deve essere lesame centuale dei G.R. circolanti (da rapportare al grado di
fisico, mirato ad evidenziare i segni legati allo stato ane- anemia, mediante il calcolo dellindice reticolocitario:
mico e alle possibili complicanze. Peraltro la diagnosi I.R. = % reticolociti x Hct paziente / Hct normale) o come
definitiva pu essere posta solo mediante appropriate numero assoluto. In entrambi i casi nelle condizioni di
indagini di laboratorio, che devono essere finalizzate a stress eritropoietico, in considerazione del rilascio prema-
definire la natura emolitica dellanemia e a consentirne turo in circolo e dellallungamento dellemivita reticoloci-
linquadramento generale e, quindi, la precisa caratteriz- tari, per ottenere una stima pi accurata del tasso di pro-
zazione. duzione dei G.R. tali valori vanno corretti dividendoli per
24. Lassenza di reticolocitosi non esclude la diagnosi di
La natura emolitica dellanemia pu essere stabilita A.E. in quanto pu essere determinata dalla concomitan-
mediante semplici esami di laboratorio che documentino te presenza di fattori che impediscono laumento com-
lo stato iperemolitico, fornendo indicazioni circa la tipo- pensatorio dellattivit eritropoietica, oltre a riscontrarsi
logia intra- o extravascolare, e la risposta compensatoria nelle fasi iniziali delle A.E. ad insorgenza acuta, finch
midollare. non si completa la risposta midollare1. Daltro canto, in
I principali indici di emolisi correntemente valutati sono: presenza di un incremento del numero dei reticolociti,
- lincremento dei valori della bilirubina indiretta (B.I.). vanno escluse le altre possibili cause di reticolocitosi.

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Anemie: aspetti clinici e diagnostici


monografia

Nei casi di particolare stress eritropoietico nel sangue diagnostiche. La presenza di unelevata percentuale di
periferico possono comparire anche degli eritroblasti. ellissociti suggestiva di una ellissocitosi, mentre il
Quale ulteriore indice di compenso midollare stato pro- riscontro di sferociti indicativo di una sferocitosi o di
posto il dosaggio della creatina eritrocitaria, presente unA.E. immunomediata o di una setticemia da clostridi o
in maggiore concentrazione nei G.R. pi giovani, che cor- di una ipofosfatemia. Il rilievo di schistociti o di emazie
rela sia con let media eritrocitaria sia, in ragione inver- ad elmetto o triangolari ecc. pu indirizzare verso
samente proporzionale, con la durata di vita media delle unA.E. di tipo microangiopatico o meccanico o causata da
emazie misurata col51Cr2. sostanze chimiche, mentre levidenziazione di acantociti
Con lesecuzione del mielogramma si pu evidenziare li- suggerisce una condizione di a--lipoproteinemia o di
perplasia compensatoria della serie eritroide. malassorbimento o di epatopatia cronica. Eritrociti a
La dimostrazione conclusiva della ridotta sopravvivenza bersaglio, drepanociti, corpi di Jolly-Howell, punteg-
eritrocitaria si pu ottenere mediante studi di ferrocineti- giatura basofila ecc. vengono variamente evidenziati
ca, tramite marcatura in vivo delle emazie con 59Fe e misu- nelle diverse forme di emoglobinopatia e talassemia1, 2.
razione della loro durata di vita (normalmente 100-120 Un numero limitato di esami di laboratorio, da selezio-
giorni), o con marcatura random in vitro dei G.R. con 51Cr e nare tra quelli riportati nella tabella II sulla base delle
determinazione della loro emivita apparente dopo rein- valutazioni clinico-laboratoristiche precedenti, in gene-
fusione (di norma 27-33 giorni)5. Le indagini basate sul- re sufficiente per consentire linquadramento diagnostico
limpiego di traccianti radioattivi possono essere sostitui- generale dellA.E., mentre la caratterizzazione precisa
te dalla determinazione del pattern eritropoietico fondato della forma e la definizione approfondita dei meccanismi
sulla valutazione integrata di alcuni parametri di labora- patogenetici che ne sono alla base richiede generalmente
torio, agevolmente determinabili pure in situazioni che ulteriori specifiche indagini.
non consentono la somministrazione di sostanze radioat-
tive al paziente e anche pi volte a breve intervallo di Anemie emolitiche da difetto della membrana
tempo. Tali parametri sono leritropoietina sierica, Epo, eritrocitaria
(indice dello stimolo proliferativo cui sottoposto il Le A.E. ereditarie da difetto della struttura e della funzio-
midollo eritroide), il recettore solubile della transferri- ne della membrana eritrocitaria comprendono varie
na sierico, TfR-s, (misura della massa eritroide totale forme tradizionalmente raggruppate in base ai peculiari
midollare, in quanto presente per l80% sugli eritrobla- Tab 2 aspetti morfologici dei G.R. patologici, anche se defini-
sti), il numero dei reticolociti (espressione del grado di Esami di laboratorio tivamente accertato che ciascun gruppo cos individuato
efficacia delleritropoiesi stimolata dallEpo) e lematocri- per linquadramento include condizioni eterogenee sia sotto il profilo clinico e
to (misura della massa eritrocitaria circolante che regola diagnostico delle laboratoristico che per quanto attiene lalterazione bio-
la produzione di Epo). Contemporaneamente deve essere anemie emolitiche chimica in causa.
valutato il bilancio marziale, sia perch lattivit eritro-
Tabella 2
poietica condizionata anche da un adeguato apporto di
Fe sia perch le situazioni di sideropenia comportano un esame morfologico eritrocitario
resistenze osmotiche eritrocitarie
incremento dei livelli di TfR-s. Bench la corretta inter-
- a fresco
pretazione di tali parametri ne preveda unopportuna - dopo incubazione
elaborazione matematica, il semplice riscontro di un test di lisi al glicerolo acidificato
incremento dei valori di Epo, di TfR-s e di reticolociti, va pink test
considerato espressione di A.E., quando si sia esclusa elettroforesi e/o HPLC dellemoglobina
unanemia postemorragica6. ricerca di emoglobine instabili
- test di stabilit allisopropanolo
- test di stabilit al calore
Posta la diagnosi generica di A.E., ulteriori indagini di - shaking test
laboratorio, supportate dagli elementi acquisiti con la- ricerca di corpi inclusi eritrocitari
namnesi e con lesame fisico, ne consentono linquadra- - con metilvioletto, con blu brillante di cresile
mento diagnostico e la caratterizzazione precisa. - con acetilfenilidrazina
test dellantiglobulina diretto
Unaccurata valutazione della morfologia eritrocitaria in stri-
test di Ham-Dacie
sci di sangue periferico spesso pu gi suggerire una dia- test di lisi al saccarosio
gnosi specifica o, comunque, circoscrivere le possibilit

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Anemie emolitiche

La membrana eritrocitaria costituita da un doppio strato splenico, a causa dellostacolo meccanico rappresentato
di fosfolipidi, con intercalate molecole di colesterolo per gli sferociti poco deformabili dal tipo di microcircolo
non esterificato, e da varie proteine identificate median- di tale organo, dellambiente metabolicamente sfavore-
te elettroforesi su gel di poliacrilamide, dopo solubilizza- vole (per una minore concentrazione di glucosio e di ATP,
zione con dodecilsolfato sodico (SDS-PAGE). Alcune di tali per un pH pi basso, per una maggiore presenza di radi-
proteine (- e -spettrina, actina, ankirina, proteine 4.1, cali liberi), e del contatto pi intimo tra emazie e macro-
4.2, 4.9, p55, adducina ecc.), definite periferiche o fagi che qui si verifica.
estrinseche, costituiscono il citoscheletro, applicato in Il quadro clinico varia in relazione al tipo e alla gravit
forma di reticolo esagonale contro la superficie interna del difetto biochimico e al conseguente grado di altera-
della membrana, mentre altre (banda 3, glicoforine A, B zione della membrana, potendosi osservare oltre alle
e C, stomatina ecc.), denominate integrali o intrin- forme tipiche, con modesti anemia, ittero e splenomegalia,
seche, sono situate nel suo contesto. Una serie comples- forme asintomatiche o lievi, con stato emolitico compensa-
sa di interazioni tra le varie proteine periferiche (legami to, forme gravi, con anemia intensa, e forme complicate da
orizzontali) nonch tra i fosfolipidi o le proteine intrinse- crisi aplastiche, da crisi emolitiche, da litiasi biliare, da
che e le proteine del citoscheletro (legami verticali) sono ulcere malleolari ecc..
essenziali per mantenere lintegrit strutturale e funzio- La diagnosi si basa, oltre che sui dati clinico-anamnesti-
nale della membrana, garantendo al G.R. la necessaria ci e sul rilievo degli indici di emolisi extravascolare e di
deformabilit. Mentre le proteine periferiche svolgono un compenso midollare, sulla evidenziazione di sferociti e di
ruolo eminentemente meccanico, quelle integrali hanno stomatociti nello striscio periferico e sullaumento delle
anche funzione di trasporto ionico (banda 3), formano fragilit osmotiche eritrocitarie a fresco e dopo incuba-
canali transmembrana (acquaporine) e, nella porzione zione. Il test di lisi al glicerolo acidificato ed il pink test
che sporge sulla superficie eritrocitaria, sono recettori (del sono stati proposti in alternativa a quello per le resisten-
complemento, dellacetilcolina, di citochine, -adrenergi- ze globulari, mentre il test dellautoemolisi viene rara-
ci ecc.), enzimi (acetilcolinesterasi, proteasi ecc.), proteine mente effettuato per la scarsa specificit. Una precisa
regolatorie dellattivazione complementare (decay accele- caratterizzazione della forma e dellanomalia biochimica
rating factor ecc.), molecole di adesione. Inoltre sia le pro- che la sostiene, con eventuale documentazione del difet-
teine integrali sia i fosfolipidi sporgenti sulla superficie to genetico specifico, si pu ottenere con valutazioni
esterna della membrana, come tali o variamente glicosi- strutturali e funzionali delle proteine di membrana
lati, sono portatori dei determinanti antigenici dei vari (mediante tecniche elettroforetiche e di immunoblotting,
sistemi gruppoematici eritrocitari (ABO, Rh, MNSs, Duffy, eventualmente dopo digestione triptica limitata della
P, Kidd, Kell ecc.)2. spettrina, tramite studi di trasporto ionico ovvero di rigi-
dit e di fragilit della membrana ecc.) e con appropria-
Sferocitosi ereditaria te indagini genetiche e di biologia molecolare (studio del
Con il termine di Sferocitosi Ereditaria (HS) si indica un DNA genomico, del DNA complementare ecc.)2, 7.
gruppo eterogeneo di A.E. ereditarie, dovute a varie
mutazioni genetiche trasmesse come carattere autoso- Ellissocitosi e piropoichilocitosi ereditarie
mico dominante o recessivo, che causano alterazioni qua- Lellissocitosi (EE) e la piropoichilocitosi (PPE) ereditarie
litative o quantitative, di differente tipo ed entit, delle comprendono diverse forme di A.E. causate da mutazio-
diverse proteine di membrana del G.R., periferiche o inte- ni geniche, trasmesse come carattere dominante o reces-
grali (anchirina e/o -spettrina, banda 3, -spettrina, sivo, responsabili di varie anomalie delle proteine perife-
banda 4.2). Tali anomalie determinano un difetto dei riche (in particolare della spettrina, ma in alcuni casi della
legami verticali del membranoscheletro, con destabiliz- banda 4.1), con conseguenti alterazioni dei legami oriz-
zazione del doppio strato lipidico e perdita di parti di zontali del membranoscheletro.
membrana in forma di microvescicole. La riduzione della Nella EE a causa delle alterazioni strutturali della mem-
superficie della membrana, laumento della sua permea- brana i G.R. circolanti, sollecitati dai normali stress mec-
bilit al Na (con formazione di stomatociti e di sferociti) canici, si deformano assumendo la caratteristica forma
e la diminuita deformabilit delle emazie che ne conse- ovale e vengono rimossi a livello splenico.
guono provocano unemolisi extravascolare per rimozione La PPE rappresenta una variante della EE, come docu-
macrofagica che si realizza quasi esclusivamente a livello mentato dallosservazione che entrambe possono compa-

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Anemie: aspetti clinici e diagnostici


monografia

rire nei membri di una stessa famiglia e possono ricono- globinico, la globina e le proteine di membrana.
scere un difetto a carico della stessa proteina di mem- Tali esigenze vengono soddisfatte metabolizzando il glu-
brana, la spettrina, che nel caso della PPE presenta delle cosio attraverso due vie principali:
anomalie quantitative oltre che qualitative. Linstabilit - la glicolisi aerobia di Embden-Meyerhof, con la quale
della membrana, accentuata dal calore (piro), ne deter- da ogni molecola di glucosio vengono ricavate due
mina la frammentazione con perdita di lipidi (micropoi- molecole di ATP, utilizzate per soddisfare il fabbisogno
chilociti) e formazione di schistociti, oltre che di emazie di energetico cellulare, e due molecole di NADH, coenzima
forma varia (poichilociti). della metaemoglobina reduttasi principale che mantie-
La sintomatologia della EE e della PPE, anche se gene- ne il Fe emoglobinico allo stato bivalente;
ralmente pi severa in questultima, variabile in rela- - lo shunt degli esoso-monofosfati, attraverso il quale
zione al tipo di difetto in causa ed sovrapponibile a viene prodotto NADPH, coenzima sia della metaemoglo-
quella che si osserva nella HS. bina reduttasi accessoria sia, principalmente, della glu-
La diagnosi si fonda sugli stessi principi descritti per la tatione reduttasi nel processo di rigenerazione del glu-
HS. E patognomonico il rilievo nello striscio periferico di tatione ridotto (GSH), il quale a sua volta funge da sub-
percentuali elevate di ellissociti nella EE ovvero di schi- strato per la glutatione perossidasi che neutralizza le
stociti e di poichilociti nella PPE. Per la caratterizzazione noxae ossidative, proteggendo dallossidazione la globi-
molecolare della forma pu essere utile il test di autoas- na e le proteine strutturali del G.R.
sociazione dei dimeri di spettrina2, 7. Sono state descritte diverse forme di A.E. ereditaria, la
maggior parte delle quali trasmesse come carattere auto-
Altre A.E. ereditarie da difetto di membrana somico recessivo, determinate sia da difetti degli enzimi
Oltre alla HS, alla EE e alla PPE sono state descritte diver- dello shunt degli esoso-monofosfati (riguardanti pi di
se altre forme di A.E. ereditarie da difetto di membrana, frequente la glucosio-6-P-deidrogenasi, raramente la glu-
generalmente rare e con espressivit clinica variabile in tatione sintetasi, la glutatione perossidasi, la glutatione
relazione al tipo e alla gravit dellalterazione biochimica. reduttasi, la 6-P-gluconato deidrogenasi ecc.) sia da defi-
La stomatocitosi ereditaria comprende diverse forme di cit enzimatici della glicolisi aerobia (in particolare della
A.E., caratterizzate tutte dalla presenza di stomatociti piruvato-chinasi, meno frequentemente della triosofosta-
negli strisci di sangue periferico, causate da alterazioni to isomerasi, della 2,3-difosfogliceromutasi, della gluco-
dello scambio cationico attraverso la membrana, con ipe- sio-6-P-isomerasi ecc.).
ridratazione o disidratazione cellulare. Alcune di tali con-
dizioni sono sostenute da anomalie delle proteine di Deficit di glucosio-6-fosfato-deidrogenasi
membrana portatrici delle specificit Rh, per cui pre- Le A.E. da deficit di glucosio-6-fosfato-deidrogenasi (G-6-
sente unalterata espressione dei corrispondenti antigeni PD) costituiscono un gruppo eterogeneo di forme dovute
(sindromi Rh null e Rh mod). a svariate mutazioni del gene codificante per lenzima
Lacantocitosi ereditaria raggruppa varie ed eterogenee posto sul cromosoma X, per cui vengono trasmesse secon-
sindromi (a--lipoproteinemia congenita, sindrome do la modalit ginecoforo-diaginica, con femmine solita-
corea-acantocitosi ecc.) accomunate dalla presenza di mente portatrici e maschi emizigoti affetti. Lenzima nor-
emazie a forma di riccio o di foglia di acanto. In alcuni male, in base alla mobilit elettroforetica pi o meno
casi il difetto di membrana interessa strutture portatrici rapida, viene definito di tipo A o di tipo B. Le mutazioni
di determinanti antigenici eritrocitari, con conseguente note sono oltre 350 e determinano difetti quantitativi
loro anomala espressione (antigeni del sistema Kell, anti- (forme A- e B-) e/o qualitativi (forme A+ e B+) della G-
geni del sistema Lutheran ecc.) 2, 7. 6-PD, che pu presentare ridotta stabilit in vivo, ridotta
affinit per i substrati, abnorme sensibilit per leffetto
Anemie emolitiche da difetto enzimatico inibitore dei prodotti ecc.)
Al fine di conservare integre le proprie caratteristiche Lemolisi determinata da noxae ossidanti (farmaci o
morfologiche e funzionali i G.R. devono produrre una sostanze chimiche, alimenti tipo fave, H2O2 rilasciata dai
quantit adeguata di energia da utilizzare in vari pro- fagociti in corso di infezioni ecc.). Il difetto enzimatico
cessi metabolici ATP-dipendenti (tra i quali la pompa determina diminuita produzione di NADPH e, conseguen-
Na/K che, estrudendo Na, impedisce liperidratazione cel- temente, scarsa disponibilit di glutatione ridotto, per cui
lulare) e devono mantenere allo stato ridotto il Fe emo- le noxae ossidative, non venendo neutralizzate, causano

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Anemie emolitiche

ossidazione dei gruppi tiolici dellHb, delle proteine strut- Anemie emolitiche da emoglobinopatie
turali del G.R. e del glutatione che si complessano a costi- Le A.E. da emoglobinopatie sono causate da varie muta-
tuire i disolfuri misti. Si formano in tal modo i corpi di zioni che possono interessare i geni che codificano per le
Heinz, inclusioni cellulari dislocate in posizione epilem- catene globiniche, con conseguente sintesi di globine,
matica, che comportano intrappolamento delle emazie quindi di Hb, strutturalmente anomale.
nel filtro splenico e successiva rimozione dal circolo. Le emoglobinopatie vengono raggruppate in varianti
La sintomatologia, come anche let a cui si manifesta emoglobiniche instabili (Hb Zurich, Hb Koeln, Hb Ferrara
lemolisi, varia notevolmente in relazione alla gravit del ecc.) e varianti emoglobiniche stabili (HbS, HbC, HbD, HbE
difetto enzimatico, potendosi osservare quadri che vanno ecc.)9.
da una condizione di emolisi cronica con crisi parossisti-
che scatenate a distanza di ore o giorni dallesposizione Anemia da emoglobine instabili
ad agenti ossidanti, a situazioni ematologiche apparen- Nelle Hb instabili una sostituzione aminoacidica a vari
temente normali con episodi emolitici intercorrenti. livelli della catena globinica, determinata da una delle
La diagnosi si basa sui dati clinico-anamnestici, sul rilie- oltre 80 mutazioni note, comporta instabilit del
vo dei consueti indici di emolisi e di compenso midollare, tetramero che tende a denaturarsi e a precipitare allin-
sulla dimostrazione dei corpi di Heinz (evidenziabili in terno del G.R., spontaneamente o in seguito allazione di
vivo dopo lo stress ossidativo e prima della crisi emoliti- sostanze ossidanti, con conseguente ridotta deformabilit
ca o indotti in vitro mediante incubazione delle emazie delle emazie che vengono fagocitate dai macrofagi sple-
con acetilfenilidrazina), sulla documentazione della sensi- nici. La diagnosi, oltre che sui consueti reperti clinico-
bilit dei G.R. alle noxae ossidative (con il test di riduzio- laboratoristici, si basa sulla ricerca dei corpi di Heinz, sui
ne della metaHb mediante blu di metilene, con il test di test di instabilit al calore e allisopropanolo e, per la
stabilit del glutatione ecc.), ma soprattutto con lo stu- caratterizzazione della forma, su indagini elettroforetiche,
dio della G-6-PD eritrocitaria, da eseguire a distanza dalla di cromatografia liquida ad alta pressione (HPLC), sulla-
crisi emolitica. A tal fine, oltre ai test di screening, posso- nalisi delle catene globiniche e su quella del DNA9.
no essere utili le indagini citochimiche che evidenziano la
doppia popolazione di emazie, normale e carente, pre- Anemia drepanocitica
sente nelle donne eterozigoti in seguito allinattivazione La forma pi frequente di A.E. causata da una variante
random del cromosoma X. Diagnostico il dosaggio del- emoglobinica stabile lanemia drepanocitica o falcemia,
lenzima, mentre indagini pi approfondite possono esse- trasmessa come carattere autosomico recessivo. La
re necessaire per lidentificazione delle sue varianti (elet- mutazione interessa il gene che codifica per la catena -
troforesi, Km per G-6-PD e NADP, stabilit termica, pH globinica, nella quale in posizione 6 lacido glutammico
ottimale, risposta agli inibitori ecc.). La caratterizzazione sostituito dalla valina, con formazione dellHbS. In con-
biochimica pu essere affiancata o sostituita dallanalisi dizioni di deossigenazione le molecole di HbS si aggre-
del DNA mediante tecniche di biologia molecolare 2, 8. gano in microtubuli a formare una struttura filamentosa
elicoidale, il tactoide. I tactoidi costituiscono un gel che
Deficit di piruvato-chinasi deforma progressivamente il G.R. facendogli assumere il
Il deficit di piruvato-chinasi (PK) costituisce il difetto enzi- caratteristico aspetto a falce, ad un certo punto irrever-
matico meno raro della via glicolitica di Embden- sibile. La falcizzazione delle emazie determina delle alte-
Meyerhof e viene trasmesso come carattere autosomico razioni progressive del metabolismo cellulare e della
recessivo. Il malfunzionamento di tale via metabolica struttura e funzione della membrana (perdita del K e
comporta una ridotta produzione di ATP e, conseguen- anomala distribuzione del Ca intracellulari, deplezione in
temente, uno squilibrio elettrolitico con perdita del ATP, alterazione dei legami tra doppio strato fosfolipidi-
potassio cellulare. co e citoscheletro, perdita dellasimmetria dei fosfolipidi
Alle oltre 100 mutazioni descritte fa riscontro una sinto- di membrana ecc.) che ne favoriscono la precoce rimozione.
matologia molto varia che si manifesta solo negli omozi- Gli eritrociti irreversibilmente deformati, inoltre, danno
goti. Sono presenti i caratteristici indici laboratoristici di luogo in vari distretti a eventi vaso-occlusivi acuti, alla
emolisi extravascolare e di compenso midollare, mentre base dei quali vi sono complesse interazioni tra G.R., cel-
per la diagnosi vengono utilizzati vari test di screening, lule endoteliali, piastrine e neutrofili, con il coinvolgi-
restando per conclusivo il dosaggio dellattivit dellenzima2. mento di alcune molecole di adesione, di citochine e di

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Anemie: aspetti clinici e diagnostici


monografia

proteine plasmatiche. za primaria o secondaria, da virus, dallinvecchiamento,


La sintomatologia, presente negli omozigoti e nei doppi da fattori genetici predisponenti ecc.), o la presenza di
eterozigoti per lHbS e per unaltra emoglobinopatia o la antigeni (Ag) a reazione crociata o modificati, o un effet-
-talassemia, caratterizzata da emolisi cronica, compli- to allogenico dopo trapianto di midollo osseo oppure tra-
cata spesso da litiasi biliare, da ulcere malleolari, da epi- sfusione di emocomponenti, o la proliferazione neopla-
sodi acuti vaso-occlusivi scatenati da situazioni che ridu- stica di cloni B linfocitari autoreattivi.
cono lossigenazione del sangue. Il meccanismo con cui si determina lemolisi immuno-
La diagnosi si basa, oltre che sul quadro clinico e sul mediata differente nelle diverse forme di A.E.A.. Di per
rilievo degli indici di emolisi e di compenso midollare, s il legame degli anticorpi (Ac) agli Ag di membrana
sulla dimostrazione di drepanociti nello striscio di sangue delle emazie non in grado di ridurne la vita media. La
periferico, sul test di falcizzazione delle emazie in presen- distruzione immunologica eritrocitaria secondaria allin-
za di agenti riducenti, sullelettroforesi e/o sullHPLC del- terazione Ag-Ac dovuta alla conseguente attivazione
lHb. La diagnosi prenatale possibile con tecniche di bio- della cascata complementare e/o alladesione dei G.R.
logia molecolare su DNA fetale ottenuto mediante biopsia rivestiti da immunoglobuline (Ig) e/o da frazioni del
dei villi coriali9. complemento (C) ai corrispondenti recettori di membrana
(FcR e CR) dei macrofagi e delle cellule natural killer (NK).
Anemie emolitiche autoimmuni Daltro canto il riscontro di auto-Ac antieritrocitari non
Le A.E. autoimmuni (A.E.A.) comprendono le situazioni indica necessariamente una condizione di iperemolisi.
nelle quali la ridotta sopravvivenza dei G.R. determina- Infatti la capacit dellauto-Ac di determinare emolisi e la
ta da una condizione di autoimmunit anti-eritrocitaria. sede della stessa dipendono da vari fattori correlati tra di
La classificazione delle A.E.A. si basa sulle caratteristiche loro, quali lisotipo e la sottoclasse anticorpale, la capa-
sierologiche delle diverse forme e sulla eventuale presen- cit dellAc di attivare il C, le caratteristiche termiche del-
za di malattie associate, in qualche modo collegate ad lAc, laffinit per lAg, il numero di siti antigenici pre-
esse sotto laspetto patogenetico (tabella III). senti sulla membrana eritrocitaria, lo stato funzionale dei
I meccanismi eziopatogenetici proposti per i diversi tipi fagociti mononucleati ecc.. Lemolisi immunomediata si
di A.E.A. sono vari, essendo in causa o un disordine della pu determinare con 3 differenti meccanismi:
immunoregolazione (indotto da stati di immunodeficien- - emolisi intravascolare: causata da emolisine bifasiche,
da agglutinine fredde e, meno di frequente, da Ac caldi
Tabella 3
(IgG1 e IgG3), dovuta ad attivazione della cascata
1. ANEMIE EMOLITICHE AUTOIMMUNI DA ANTICORPI CALDI complementare fino al C9, con formazione del mem-
1.1. IDIOPATICHE brane attack complex (MAC) che produce nella membra-
1.2. SECONDARIE
(malattie linfoproliferative, immunodeficienze, malattie
na eritrocitaria dei pori, attraverso cui passano libera-
autoimmuni, infezioni virali e batteriche, neoplasie, farmaci ecc.) mente acqua e ioni, con conseguente lisi osmotica;
- emolisi extravascolare: determinata dalla fagocitosi
2. ANEMIE EMOLITICHE AUTOIMMUNI DA ANTICORPI FREDDI
2.1. DA AGGLUTININE FREDDE e/o frammentazione dei G.R. sensibilizzati da IgG1 e/o
2.1.1. Croniche IgG3 e/o IgA, eventualmente associate a C, da parte dei
2.1.1.1. idiopatiche macrofagi dotati dei corrispondenti recettori (FcRI,
2.1.1.2. secondarie (malattie linfoproliferative ecc.)
2.1.2. Acute (secondarie ad infezioni) FcRII, FcRIII, FcRI, CR1, CR2, CR4). La sede della rimo-
2.2. DA EMOLISINE BIFASICHE zione varia in relazione al tipo e allentit della sensibi-
2.2.1. Croniche
lizzazione cellulare, venendo eliminate quasi esclusiva-
2.2.1.1. idiopatiche
2.2.1.2. secondarie (lue, malattie linfoproliferative) mente a livello splenico le emazie con una quantit
2.2.2. Acute (A.E. di Donath-Landsteiner) limitata di IgG adese alla membrana e a livello epatico
2.2.2.1. idiopatiche
2.2.2.2. secondarie (infezioni virali)
quelle ricoperte massivamente da IgG o rivestite da IgG
e C. Lesclusiva sensibilizzazione con C3b determina un
3. ANEMIE EMOLITICHE AUTOIMMUNI MIXED temporaneo sequestro macrofagico, tramite i CR, degli
3.1. DA ANTICORPI CALDI E AGGLUTININE FREDDE
3.2. DA ANTICORPI CALDI E EMOLISINE BIFASICHE eritrociti che successivamente, in seguito a degradazio-
Tab 3
ne del C3b a C3d, vengono rilasciati in circolo dove
4. ANEMIE EMOLITICHE CON TEST DELLANTIGLOBULINA Classificazione delle
sopravvivono normalmente. Peraltro in presenza di uno
DIRETTO NEGATIVO anemie emolitiche
autoimmuni stato di iperattivit funzionale dei macrofagi, il C3b pu

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Anemie emolitiche

diventare segnale sufficiente per la fagocitosi; capacit di attivare il C in vitro. La precisa caratterizzazio-
- citotossicit cellulo-mediata anticorpo-dipendente ne del tipo di sensibilizzazione eritrocitaria e degli Ac libe-
(ADCC): i G.R. sensibilizzati da IgG1 e/o IgG3 vengono ri nel siero ha rilevanza clinica e prognostica, potendo
agganciati dai macrofagi o dalle cellule NK, dotati del fornire indicazioni circa la gravit del processo emolitico,
corrispondente recettore (Fc_RIII), che ne determinano essere predittiva della responsivit della forma al tratta-
la lisi, i primi mediante esocitosi di lisozima e le secon- mento terapeutico, fornire elementi valutativi relativa-
de generando nella membrana, tramite le perforine, dei mente allutilit della splenectomia ecc..
canali attraverso i quali passano in maniera incontrol- Nelle A.E.A. da agglutinine fredde il TAD documenta la pre-
lata acqua e ioni 10. senza di frazioni complementari adese alle emazie. Nel
Il quadro clinico delle A.E.A. varia in relazione al tipo siero si rilevano Ac di isotipo IgM, raramente IgG o IgA,
dellautoanticorpo in causa e alla presenza eventuale di con specifit anti-I, meno frequentemente anti-i e, anco-
una malattia associata. Le A.E.A da auto-Ac caldi esordisco- ra pi raramente, anti-Pr. Tali Ac presentano la massima
no di solito con unanemizzazione lenta e progressiva, attivit a +4C (temperatura alla quale il titolo general-
accompagnata da ittero e splenomegalia, mentre le mente superiore a 1/512) ed hanno un ampio range
forme acute sono rare, ed hanno unevoluzione variabile, termico, essendo ancora attivi oltre i 30C. Nelle forme
potendo presentare un decorso transitorio o cronico, con acute transitorie secondarie a fatti infettivi le IgM sono
remissioni e recidive. Le A.E.A. da agglutinine fredde hanno solitamente policlonali, in quanto espressione di una
un andamento acuto e transitorio, se insorgono in corso risposta immunitaria normale verso Ag a reazione crocia-
di infezioni da Mycoplasma pneumoniae oppure di mono- ta o modificati ovvero di unattivazione policlonale di
nucleosi infettiva ecc., o cronico se sono idiopatiche oppu- linfociti B. Nelle forme croniche, invece, sono monoclona-
re si associano a malattie linfoproliferative. In ogni caso li, generalmente IgMk, in quanto prodotti da cloni B
il paziente, dopo esposizione al freddo, presenta formico- autoreattivi normalmente silenti. In tal caso lagglutini-
lii, parestesie alle estremit, acrocianosi, ittero, talora na fredda, se presente ad elevata concentrazione, pu evi-
emoglobinuria. Lemoglobinuria parossistica a frigore (EPF) denziarsi allelettroforesi come componente monoclonale.
pu avere un decorso acuto o cronico. Le forme acute Nella E.P.F. sui G.R. sono documentabili frazioni comple-
transitorie, raramente idiopatiche, si osservano non infre- mentari. Nel siero, con il test di Donath-Landsteiner, si
quentemente in et pediatrica in associazione ad infezio- dimostra la presenza dellemolisina bifasica (E.B.), una
ni virali. In tali casi, definiti pi propriamente A.E. di IgG diretta generalmente contro lAg eritrocitario P, la
Donath-Landsteiner, si rileva uno stato emolitico conti- quale a bassa temperatura si lega ai G.R. iniziando latti-
nuo, anzich linsorgenza di crisi emoglobinuriche scate- vazione complementare, che a freddo si ferma al C3. A
nate dal freddo. Le forme croniche, idiopatiche o eccezio- temperature pi elevate, mentre lAc si distacca dalla
nalmente secondarie a sifilide o a malattie linfoprolifera- membrana eritrocitaria, la cascata del C prosegue fino al
tive, sono caratterizzate da periodiche crisi emolitiche C9 con lisi dellemazia (bitermicit del complemento).
emoglobinuriche causate dalle basse temperature. Nelle A.E.A. Mixed le indagini immunoematologiche
La diagnosi di A.E.A., oltre che sul rilievo dei dati clinico- dimostrano la presenza contemporanea di Ac caldi e
anamnestici e degli indici di emolisi e di compenso midol- freddi (generalmente agglutinine fredde, eccezional-
lare, si basa su specifiche indagini immunoematologiche mente E.B.).
che consentono la precisa caratterizzazione della forma. In alcune A.E.A. il TAD risulta negativo a causa del basso
Nelle A.E.A. da Ac caldi sulle emazie si rileva la presenza di numero di Ig adese ai G.R.. Tale scarsa sensibilizzazione
IgG (IgG1 e IgG3) e/o di IgA e/o di IgM e/o di C, in varia eritrocitaria da parte dellauto-Ac, talvolta, pu essere
combinazione, documentabili con il test dellantiglobuli- favorita da una depressione dellAg bersaglio, per cui in
na diretto (TAD) o con altre tecniche (ELISA, RIA, immu- tali casi lAc documentabile nel siero. In altre A.E.A. con
nofluorescenza, test di interazione emazie-macrofagi, test TAD negativo gli auto-Ac, adesi alle emazie ma non dimo-
di consumo dellantiglobulina ecc.). Leluizione degli Ac strabili con il TAD, possono essere eluiti ed evidenziati nel-
adesi agli eritrociti consente di stabilirne leventuale spe- leluato con il TAI1, 11, 12.
cificit. Nel siero frequente il riscontro di auto-Ac liberi,
dimostrabili con il test dellantiglobulina indiretto (TAI), Anemie emolitiche immunomediate da farmaci
con il test in enzimi ecc.. Degli anticorpi sierici vanno defi- Numerosi farmaci possono essere responsabili di A.E. con
niti lisotipo, la specificit, il range termico, il titolo, la meccanismo immunologico. Secondo una recente teoria

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Anemie: aspetti clinici e diagnostici


monografia

patogenetica unitaria, alla base delle citopenie immuno- componenti contenenti plasma ABO incompatibile con
mediate da farmaci vi sarebbe uninterazione tra il far- G.R. del ricevente, in tale gruppo va inquadrata la
maco (o un suo metabolita) e le strutture della membra- Malattia Emolitica del Neonato (MEN).
na cellulare. Tale legame, stabile o labile, potrebbe crea- Nella MEN le emazie del bambino vanno incontro ad
re un neoantigene il quale, a sua volta, potrebbe indur- emolisi, generalmente di tipo extravascolare, per lazione
re la produzione di Ac farmaco-dipendenti (di isotipo IgM degli Ac anti-eritrocitari materni di isotipo IgG, trasferiti
o IgG) e/o di auto-Ac farmaco-indipendenti (di isotipo nel circolo fetale per passaggio transplacentare attivo. La
IgG). La capacit o meno di tali Ac di attivare il comple- forma pi diffusa di MEN dovuta ad incompatibilit
mento condizionerebbe, poi, linsorgenza di episodi di Rh(D), con madre Rh(D)+ e figlio Rh(D)-, e pu determi-
citolisi acuta o la rimozione delle cellule per fagocitosi o narsi, ma non necessariamente, se la donna si immu-
ADCC. Una stessa sostanza pu determinare formazione di nizzata verso tale Ag in corso di precedenti gravidanze,
Ac, dipendenti o meno dal farmaco, diretti contro vari aborti o trasfusioni. Meno frequenti sono la MEN da
target cellulari (G.R., globuli bianchi, piastrine)13. Tuttavia incompatibilit ABO (che pu verificarsi in bambini di
ancora consuetudine suddividere le A.E.A. da farmaci, gruppo A o B figli di madri O, anche in assenza di prece-
sulla base di criteri patogenetici, in tre differenti gruppi: denti stimolazioni immunologiche) e quella da incompa-
- A.E. causate con il meccanismo dellimmunocomplesso o tibilit per altri Ag del sistema Rh o di altri sistemi eri-
dellastante innocente da farmaci che hanno il loro pro- tocitari (Kell, Kidd ecc.) verso i quali vi sia stata una pre-
totipo nella chinidina. La somministrazione di piccole gressa immunizzazione. Il quadro clinico della MEN varia
dosi di sostanza a soggetti gi sensibilizzati causa vio- notevolmente in relazione a diversi fattori (Ag in causa,
lente crisi emolitiche intravascolari che regrediscono titolo dellAc, sottoclasse dellAc ecc.). Alla nascita nel
rapidamente con la sospensione del farmaco. Sulle ema- bambino si rilevano, oltre ai classici segni di emolisi e di
zie si riscontra solo C, mentre nel siero lAc farmaco- compenso midollare, una positivit del TAD (determinata
dipendente, di classe IgM o IgG, pu essere evidenziato dalle IgG adese ai G.R., la cui specificit pu definita dopo
esclusivamente aggiungendo alla miscela siero-eritrociti averle eluite) ed una non costante presenza di Ac anti-
una soluzione contenente il farmaco; emazie nel siero. Il TAI nella madre, invece, sempre posi-
- A.E. determinate con il meccanismo delladsorbimento del tivo in tutte le forme di MEN, tranne che in quelle da
farmaco da farmaci il cui prototipo la penicillina. incompatibilit ABO, nelle quali nel siero materno pu
LA.E. di tipo extravascolare, ad andamento ingravescen- documentarsi un elevato titolo di IgG anti-A o anti-B14.
te, compare dopo almeno 7 giorni di terapia con dosi
massive di farmaco e regredisce dopo pochi giorni dalla Emoglobinuria parossistica notturna
sua sospensione. I G.R. sono intensamente sensibilizzati Lemoglobinuria parossistica notturna (EPN) unA.E. cro-
da IgG. Gli Ac eluiti e quelli presenti nel siero, farmaco- nica, con esacerbazioni notturne, causata da un difetto
dipendenti, possono essere dimostrati col TAI solo utiliz- intraglobulare acquisito, associata a neutropenia e/o a
zando emazie pretrattate col farmaco. piastrinopenia. E determinata da una mutazione soma-
- A.E. causate mediante induzione di autoimmunit da tica verificatasi a carico della cellula staminale emopoie-
farmaci tra i quali l-metildopa quello pi di fre- tica che d origine a dei cloni anomali (EPN+) eritrocita-
quente implicato. LA.E., di tipo extravascolare, si instau- rio e/o leucocitario e/o piastrinico. Tale mutazione, che
ra gradatamente dopo almeno 3-6 mesi di trattamento interessa un gene posto sul cromosoma X, determina
col farmaco e regredisce altrettanto gradualmente con unalterazione del sistema di ancoraggio mediato dal
la sua sospensione. Sierologicamente la forma non fosfatidil-inositolo (PI) comune a varie proteine di
distinguibile da una A.E.A. da Ac caldi, con eritrociti membrana di differenti linee cellulari. Diverse, pertanto,
intensamente sensibilizzati da IgG e presenza nel siero sono le strutture proteiche di membrana carenti nelle cel-
di Ac simili, farmaco-indipendenti1, 14. lule EPN+: lacetilcolinesterasi, la fosfatasi alcalina leucoci-
taria, la 5-ectonucleotidasi, lFcRIII, il decay accelerating
Anemie emolitiche alloimmuni factor (DAF), lhomologous restriction factor (HRF), il mem-
Le A.E. alloimmuni sono causate da allo-Ac anti-eritroci- brane inhibitor of reactive lysis (MIRL) ecc.. In particolare il
tari trasferiti passivamente da un soggetto ad un altro. deficit di proteine (DAF, HRF e, soprattutto, MIRL) che
Oltre alle infrequenti reazioni trasfusionali emolitiche modulano in senso inibitorio gli effetti del complemento,
acute causate dagli Ac anti-emazie presenti negli emo- espone maggiormente i G.R. EPN+ alla sua azione litica in

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Anemie emolitiche

condizioni di attivazione sia basale (emolisi cronica) sia aggrediscono direttamente, con meccanismo dose-dipen-
conseguente ad eventi che ne innescano la via classica o dente, la membrana o i sistemi enzimatici di G.R. nor-
quella alternativa (episodi litici parossistici). mali. In tali forme generalmente evidenziabile la pre-
Il quadro clinico, molto vario, caratterizzato dai segni senza di corpi di Heinz, determinati dallazione ossidante
dellA.E., dalla possibile comparsa di complicanze trom- della sostanza chimica.
botiche ed infettive e dalla eventuale evoluzione verso la-
plasia midollare o la leucemia acuta. Anemie emolitiche da agenti infettivi
La diagnosi, oltre che sui dati clinico-anamnestici e sul Le A.E. da agenti infettivi possono determinarsi, con vario
rilievo degli indici di emolisi e di compenso midollare, si meccanismo, in corso di alcune infezioni batteriche o pro-
fonda su test che evidenziano una abnorme sensibilit dei tozoarie. Ad esempio nella malaria da Plasmodium falci-
G.R. allazione litica del complemento. Tali esami si basa- parum la lisi eritrocitaria causata dallinvasione proto-
no sullattivazione complementare indotta in vitro da un zoaria, mentre la grave emolisi che si manifesta nel corso
abbassamento del pH (test di Ham-Dacie), da una ridu- di sepsi puerperali sostenute da Clostridium welchii
zione della forza ionica (sucrose test), dallazione di Ac determinata dalla tossina batterica, un-lecitinasi, che
freddi ecc.. Lanalisi in citofluorimetria del CD59 (MIRL) danneggia direttamente la membrana eritrocitaria.
eritrocitario e granulocitario o del CD55 (DAF) granuloci-
tario, oltre a confermare la diagnosi, consente di quanti-
ficare le cellule EPN+ 14.

Anemie emolitiche meccaniche


Le A.E. meccaniche sono forme eterogenee in cui un
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Le A.E. da traumatismo cardiaco sono dovute general- 8. Mason P.J.: New insights into G6PD deficiency. Br. J. Hae-
mente a protesi valvolari malfunzionanti o di vecchia con- matol., 1996; 94: 585.
9. Dacie J.: The Haemolytic Anaemias. vol. 2 The hereditary
cezione. In tal caso il danno eritrocitario determinato
haemolytic anaemias, Part 2, 3th ed, London, Churchill
dalla turbolenza del flusso sanguigno e comporta una Livingstone, 1988.
frammentazione eitrocitaria simile a quella riscontrabile 10. Engelfriet C.P.: The immune destruction of red cells.
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nelle A.E. microangiopatiche. 11. Dacie J.: The Haemolytic Anaemias, vol. 3, The auto-
Lemoglobinuria da marcia causata da distruzione immune haemolytic anaemias, 3th ed, London, Churchill
Livingstone, 1992.
traumatica delle emazie per schiacciamento dei vasi della 12. Chaplin H. (ed) Methods in Hematology: Immune
pianta del piede tra losso e il piano dappoggio. Nello Hemolytic Anemias, vol. 12, New York, Churchill Livingstone,
1985.
striscio non si rilevano alterazioni morfologiche eritroci- 13. Mueller-Eckhardt C., Salama A.: Drug-induced cytope-
tarie. nias: A unifying pathogenetic concept with special emphasis
on the role of drug metabolites. Transfus. Med. Rev., 1990; 4:
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Le A.E. da agenti chimici sono causate da sostanze di varia mical-induced haemolytic anaemias; Paroxysmal Nocturnal
haemoglobinuria; Haemolytic disease of the newborne, 3th
natura (tossine animali o vegetali, veleni di serpenti, ed, London, Churchill Livingstone, 1999.
idrogeno arsenicale, piombo, rame, sulfoni, PAS ecc.) che

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Problematiche nella diagnosi dei


difetti molecolari del gene -globinico
A. Giambona - F. Leto - A. Maggio
Azienda Ospedaliera
Vzo Cervello
Divisione Ematologia II
con Talassemia
Centro Regionale di Riferimento
per la Diagnosi e la Terapia Fetale
delle Emoglobinopatie
Palermo

Le -Talassemie ma anche a causa di un certo numero di altri fattori


Le -talassemie sono rappresentate da un gruppo di genetici. Nellindividuo normale sono presenti tre tipi di
disordini autosomici recessivi molto eterogenei con la emoglobine: HbA (adulta) per il 98%, HbA2 presente per
conseguente riduzione (+) o totale assenza () della il 2.5%, e HbF (fetale), presente in bassa percentuale < 1%.
produzione delle catene -globiniche. Ci determina uno
sbilancio della sintesi /non- delle catene globiniche Struttura dei geni globinici
del tetrametro emoglobinico causando la maggiore o I due cluster globinici sono presenti nel cromosoma 11
minore severit delle manifestazioni cliniche ed ematolo- (cluster ) e nel cromosoma 16 (cluster ). Il cluster
giche. Sia nello stato di eterozigosi che di omozigosi di - contenuto in un tratto di DNA di 60 Kb comprendente il
talassemia, il rapporto di sintesi /non- varia non solo gene embrionario attivo fino all8 settimana di gesta-
in relazione al tipo di mutazione che colpisce il gene zione, due geni fetali G e A attivi dallottava settimana

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Problematiche nella diagnosi dei difetti molecolari


del gene -globinico

di gestazione fino a 3-6 mesi dopo la nascita e i due geni Sono presenti altri punti caldi hot spot per una corret-
adulti e che si attivano man mano che si riduce lat- ta produzione di mRNA e tra questi le consensus sequen-
tivit dei geni . ces che fiancheggiano i dinucleotidi GT e AG nel sito di
Il cluster contenuto in un tratto di DNA di 30 Kb taglio (splicing) donatore o accettore.
comprendente un gene embrionario 2 e i geni feto- Lespressione dei geni globinici viene anche controllato da
adulti 2 ed 1, oltre alcuni pseudo geni 1, 2, 1. altri geni o da fattori esterni. Nel cluster presente una
Tutti i geni globinici presentano tre regioni codificanti regione a circa 15 Kb dal gene che si estende per 90 Kb
(esoni) e due regioni intercalanti (introni o IVS). Il gene conosciuta come Locus Control Region (LCR). La LCR
-globinico contiene 146 codoni mentre i geni globi- comprende 5 siti principali eritroidi specifici (HS-1, HS-2,
nici contengono 141 aminoacidi. Altra caratteristica comu- HS-3, HS-4, HS-5) che conferiscono al gene globinico, in
ne la presenza di estremit 5 e 3 fiancheggianti, note- cis, una efficiente trascrizione ed una specificit eritroide
volmente importanti per la traduzione. ed ontogenetica. La LCR svolge la sua funzione regolatri-
Lestremit 5 di tutti i geni globinici essenziale per una ce dellespressione dei geni attraverso legami con fattori
efficiente trascrizione di mRNA; tale regione composta proteici di trascrizione che attivano i suoi siti specifici che
da specifiche sequenze nucleotidiche (box). mediano le sue interazioni con i promoter globinici. La
Nel gene globinico sono presenti le seguenti box: la teoria che oggi spiega linterazione fra LCR e geni globi-
sequenza ATAA (ATA box) situata a circa -30 bp dal Cap; la nici nota come looping secondo la quale si ha la for-
sequenza CCAAT (CAAT box) situata tra i nucleotidi -70 e - mazione di unansa cromatinica che permette allLCR di
80 ed una terza sequenza CACC duplicata (CACC prossima- porsi fisicamente a contatto con il promotore del gene
le e distale) situate in posizione -90 e -86 (prossimale) e globinico che nella fase attuale ontogenetica (ad es.
in posizione -105 e -101 (distale). Limportanza di tali gene durante il periodo fetale; gene durante il perio-
sequenze, per il gene globinico, stata valutata in vivo do adulto). Fattori proteici si legano in sequenze partico-
dalla presenza di mutazioni puntiformi che hanno deter- lari dellHS che interagiscono con il complesso di inizio
minato una riduzione del 20-40% di sintesi di mRNA e trascrizionale del promoter.
quindi di forme di talassemie con fenotipo lieve.
Unaltra sequenza che presenta una particolare impor- Quadro ematologico ed emoglobinico del -trait
tanza per la funzione del gene il CAP. Tale sequenza di Un complesso di caratteri permettono il riconoscimento
50 paia di basi contiene un gruppo di 6-8 nucleotidi, del portatore sano di thalassemia:
subito a monte del codone di inizio, che permette la tra- 1) aumento del numero dei globuli rossi per mm3;
duzione di mRNA mediante il loro legame con le sub- 2) riduzione del livello di Hb di circa il 10-30%;
unit ribosomiali pi piccole (16S rRNA). Mutazioni in tale 3) riduzione del volume corpuscolato medio (MCV) intor-
sequenza riducono lefficienza di traduzione degli mRNA. no a 60-70 fl;
La stabilizzazione e la traduzione di mRNA permessa da 4) riduzione del contenuto globulare medio di Hb (MCH)
una sequenza tra il codone di termine TAA e la sequenza intorno a 20-22 pg;
AATAAA al 3 del gene globinico. Inoltre, la sequenza 5) aumento della resistenza osmotica;
AATAAA ha il compito di termine trascrizionale di mRNA e 6) alterata morfologia eritrocitaria con microcitosi, poi-
permette laggiunta della coda di Poly-A. chilocitosi, emazie a bersaglio, ipocromia;
Al 5del gene globinico presente una sequenza fian- 7) aumento della quota di HbA2 >3.5%;
cheggiante il CAP, la ATA box, la cui funzione permette- 1) rapporto / >1.3.
re linizio della trascrizione. A - 80 basi presente la CAAT
box che determina il livello di trascrizione ed ulterior- Difetti molecolari del gene globinico
mente al 5 presente una sequenza che lega il fattore di Le talassemie sono molto eterogenee a livello moleco-
trascrizione SP1. I due geni differiscono tra loro al livel- lare. Oggi sono note 645 differenti alterazioni molecola-
lo del II introne e al 3 dei geni; in particolare l2 pre- ri che colpiscono il gene -globinico, di cui la maggiore
senta una sostituzione di due basi e la delezione di 7 basi parte data da mutazioni puntiformi che alterano le aree
nella IVS2, inoltre la sostituzione di 18 basi e la delezione critiche per la funzione del gene globinico, come
di 1 base al 3 di 2. Anche se gli RNA dei due geni glo- descritto sopra.
binici sono identici, la quantit di mRNA del gene 2 Rispetto alle mutazioni puntiformi, il gene globinico
risulta circa i 2/3 maggiore rispetto al gene 1. interessato da poche mutazioni da delezione che colpisco-

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Anemie: aspetti clinici e diagnostici


monografia

no parte o tutto il gene globinico e parte del cluster. Le mutazioni non-senso sono rappresentate da variazioni
Prima di iniziare la descrizione delle mutazioni che colpi- puntiformi che creano una tripletta di STOP determinan-
scono il gene -globinico, facciamo alcuni accenni alle do un blocco della traduzione.
fasi che portano alla produzione delle proteine. Tali mutazioni sono presenti allinterno delle sequenze
Il DNA viene trascritto in mRNA contenente tutte le codificanti (esoni) producendo un fenotipo talassemico
sequenze del DNA del gene -globinico, anche quelle che . La mutazione pi nota interessa il codone 39, pre-
non verranno tradotte. Tale mRNA, definito pre-mRNA, sente in Sicilia ad es. con una frequenza del 36%.
subisce una serie di processi che lo porteranno alla matu- Gli introni sono interessati da molte mutazioni puntifor-
razione, pronto per essere letto e tradotto in proteina. mi che annullano o riducono un sito di splicing. Tali
La trascrizione inizia dal CAP al 5 di fino al 3 di . mutazioni possono alterare un sito normale di splicing
La maturazione comporta: distruggendo i dinucleotidi GT o AG oppure possono pro-
1) laggiunta di un residuo di 7 metilguanosina al 5 del durre un nuovo sito di splicing con la creazione di un
trascritto primario (capping), permettendo lattacco dei nuovo sito criptico GT o AG.
ribosomi a mRNA; Tra il primo gruppo sono da annoverare le mutazioni
2) il taglio della parte terminale di pre-mRNA in corri- della IVS1.nt1 G>A, IVS2.nt 1 G>A, molto frequenti nella
spondenza della sequenza AATAA e laggiunta di una nostra regione (Vedi Tab. 1), la IVS1. nt 130.
coda di acido adenilico con la funzione di stabilizzare Tra il secondo gruppo (mutazioni interne agli introni) la
mRNA; pi comune la IVS1. nt 110, la IVS1. nt6, la IVS1. nt 5,
3) la rimozione degli introni e la perfetta saldatura degli IVS2. nt 745 etc.
esoni (splicing); tale processo necessita di 2 coppie di Tali mutazioni producono una talassemia se colpisco-
dinucleotidi, GT al 5 degli introni, AG al 3 conosciute no i siti criptici, ed una + talassemia pi o meno grave
come siti criptici; tali nucleotidi sono estremamente se sono interessate le sequenze interne agli introni. La
importanti in quanto sono riconosciuti da enzimi di IVS1. nt 110 la mutazione intronica pi frequente nel-
taglio e cuci che permettono di assemblare tra loro i larea mediterranea, una mutazione grave che crea un
tre esoni. nuovo sito consenso AG, 19 basi a monte della fine del-
Alla fine mRNA maturo passa nel citoplasma, dove viene lintrone. La produzione di catene di pre-mRNA anomale
tradotto in proteina. rappresenta circa l80-90%, per cui il risultato quello di
una + talassemia grave. Al contrario la IVS1.nt6 produce
Mutazioni Puntiformi
Le mutazioni che colpiscono il gene -globinico sono dif- Tabella 1
ferenti: delezioni o inserzioni di singoli nucleotidi o sosti- TIPO E FREQUENZA DELLE -MUTAZIONI IN SICILIA
tuzioni di basi che alterano il processo di trascrizione, di (8000 chromosomes)
maturazione di mRNA, di traduzione o di stabilit della
% %
molecola messaggero.
Cd 39 36.0 -92 < 0.1
Le delezioni o le inserzioni puntiformi degli esoni deter- IVS1.nt 110 26.5 IVS1.nt 5 (C) < 0.1
minano uno scivolamento del messaggio con lalterazio- 85%
IVS1.nt 6 16.0 IVS1.nt 130(G) < 0.1
ne di tutti i codoni a valle della mutazione producendo IVS1.nt 1 9.6 96.5% IVS1.nt 116(G) < 0.1
una proteina non funzionante con un arresto pi o meno IVS2.nt 745 5.3 IVS1. nt 2 (G) < 0.1
precoce della proteina (Frameshift). Alcune di queste - 87 (G) 1.9 - 28 (C) < 0.1
mutazioni presenti ad es. in Sicilia sono: FrCd 6(-A), FrCd IVS2.nt 1 1.7 - 86 (A) < 0.1
5 (-CT), FrCd 8 (-AA), FrCd 44 (-C), FrCd 76 (-C). Fr Cd6 1.0 Cd 126 (G) < 0.1
I difetti di trascrizione da sostituzione di base interessano -101 0.6 Thal Sicil 1.2
soprattutto il promotore determinando una riduzione IVS1.nt 2(A) 0.5 Hb Lepore Bost. 0.5
IVS1.nt 5(A) 0.5
della quantit di mRNA e producendo forme di + talas-
Cd 30 0.3
semia pi o meno lievi in relazione alla box del promo-
Fr Cd 5 0.2
tore colpita.
Fr Cd 76 0.2
Sono conosciute mutazioni nella ATA box (-28, Fr Cd 44 0.2
-29, -30, -31), nella CACCC prossimale (-86, -87, -88, -90, - 87 (T) 0.1
-92) o nella CACCC distale (-101). Tab 1

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Problematiche nella diagnosi dei difetti molecolari


del gene -globinico

una minore percentuale di molecole di pre-mRNA ano-


male tanto che un soggetto omozigote IVS1.nt6/IVS1.nt6
pu presentare una forma di talassemia intermedia.
Un altro gruppo di difetti del gene -globinico che gene-
rano + talassemia, spesso lieve, rappresentato da alte-
razioni della sequenza AATAAA.
La trascrizione del pre-mRNA prosegue oltre tale sequen-
za, ma durante la maturazione dellmRNA avviene un
taglio a 22 nt a valle della sequenza AATAAA riconosciuta
da un enzima specifico e lattacco della coda di adenina
per la stabilizzazione dellmRNA. Se la sequenza muta-
ta, il termine della trascrizione e la poliadenilazione si
verifica pi a valle producendo mRNA instabili e quindi
una + talassemia molto lieve con HbA2 poco pi alta
della norma.
Mutazioni nel codone dinizio, mutazioni nel CAP, nel
codone di termine o nella nella regione 3UTR, possono
provocare difetti di traduzione di mRNA.
Le mutazioni del codone dinizio ATG danno origine a
talassemia, mentre una mutazione del codone di termine
del gene -globinico CAC, codone 146, d origine ad una
catena pi lunga determinando forme di + o talassemia.
Interessante la mutazione a 6 basi a valle del codone di
termine C>G descritta nella popolazione greca. Tale muta-
zione d origine nel soggetto ad una forma di talasse-
mia silente, mentre lomozigote per tale mutazione pre-
senta un fenotipo da eterozigote. Se tale mutazione
composta con unaltra mutazione marcata, genera un
fenotipo da talassemia intermedia.

Mutazioni delezionali
Le delezioni, in relazione alla loro estensione producono
differenti fenotipi ematologico che sono conosciuti come
HPFH (hereditary persistence of fetal hemoglobin), -
talassemia, o -talassemia.
La HPFH in eterozigosi caratterizzata da un livello di HbF
tra il 15 e il 25%, HbA2 normale o ridotta, indici eritro-
citari normali e rapporto globinosintetico / bilanciato.
La -thalassemia allo stato eterozigote ha un range di
HbF del 5-15%, normale o ridotta HbA2, ipocromia,
microcitosi e sbilancio del rapporto / (>1).
Delezioni di tutto il cluster portano ad un fenotipo
ematologico di -thalassemia caratterizzato da micro-
citosi, ipocromia, normale livello di HbF, normale o ridot-
to valore di HbA2 e sbilancio del rapporto / (>1).
Sembra che tale fenotipo possa essere prodotto anche
dalla delezione dei siti ipersensibili HS2, HS-3 ed HS-4 del
LCR (Locus Control region).

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Anemie: aspetti clinici e diagnostici


monografia

Analisi dello stato di portatore sano di sono risultare dalla presenza delle doppie eterozigosit
-talassemia per e talassemia lieve.
La -talassemia causata da uno squilibrio globinosinte-
tico /, in cui la quantit di -globina ridotta in per- -Thalassemia con alti livelli di HbA2
centuale dovuta al tipo di mutazione presente. Il valore di HbA2 nello stato eterozigote varia tra il 3.5
Ci che rilevato nel portatore sano di talassemia ed il 5.5%, raramente superando il 6%. Sono stati riscon-
principalmente leffetto microcitemico con laumento del trati dei casi il cui valore di HbA2 era particolarmente
valore dellHbA2. alto, oltre 6.5%, spesso associato con un aumento di HbF.
Lo studio del portatore sano si svolge attraverso una serie Le basi molecolari, in questi casi, sono spesso legati a
di tappe che devono partire da un ottimo esame emo- delezioni che rimuovono il promotore del gene globi-
cromocitometrico completo, eseguito su un contaglobuli nico incluse la box TATA e la box CACCC. Tale fenomeno si
automatizzato seguito dalla determinazione del valore spiega con lannullamento della competizione del gene
dellHbA2 con apparecchiatura HPLC di provata affidabi- globinico per lLCR ed un miglioramento dellinterazione
lit, e dallesame elettroforetico dellHb. Lanalisi della dellLCR con i geni e in cis, aumentandone lespres-
sideremia e della ferritina sono spesso necessari e per sione.
escludere anemie sideropeniche. Quando con questi esami
non si raggiunge una diagnosi certa, si passa ad una Thalassemia dominante
seconda fase con la sintesi delle catene globiniche in vitro Il portatore sano eterozigote si presenta clinicamente
e successivamente allanalisi molecolare dei geni , , asintomatico. Sono state osservate delle forme presenti in
globinici. eterozigosi con un fenotipo -thalassemico piuttosto
marcato legate alla presenza di emoglobine iper-instabi-
-Thalassemia eterozigote con indici eritrocitari li, definite anche come talassemia dominante. A livello
normali molecolare sono presenti quattro categorie di alterazioni:
Sono causate, spesso, dalla co-eredit tra una mutazione sostituzione di una singola base, delezione di un codone
-talassemica in eterozigosi ed una -talassemia in cui intero, catene troncate o allungate. La maggiore parte
sono coinvolti due geni (delezione o mutazioni puntifor- delle Hb iper-instabili, risultano da un termine prematu-
mi ). In tale forma, il volume corpuscolare ed il conte- ro della traduzione causato da mutazioni nel terzo esone
nuto emoglobinico per cellula possono rientrare in un determina una catena -globinica troncata. Se la muta-
range di normalit. Di contro, la co-eredit del gene zione che porta ad una prematura interruzione della tra-
triplicato con un gene eterozigote -thal, pu determi- duzione di mRNA cade nel 1 o nel 2 esone, non deter-
nare una manifestazione clinica pi marcata con un feno- mina produzione di frammenti di catene -globiniche
tipo tra la talassemia intermedia e il semplice stato di tali da determinare forme cliniche importanti. Essendo
portatore di -talassemia. queste emoglobine particolarmente instabili molto dif-
Limplicazione pratica per lo screening lanalisi moleco- ficile identificarle con metodi cromatografici o elettrofo-
lare dei geni e dei geni , soprattutto in una popola- retici ed per questo che molte volte si costretti a ricor-
zione come quella siciliana dotata di grande eterogeneit rere allanalisi della sequenza nucleotidica. La continua
e presenza di mutazioni nei due clusters. degradazione di tali Hb iper-instabili porta ad un aumen-
to dellattivit proteolitica nei globuli rossi.
-Thalassemia eterozigote con normale livello di Questo determina un accumulo ed una precipitazione
HbA2 (-Thalassemia silente) delle catene -globiniche, in grado maggiore a quanto si
Un altro gruppo di talassemia eterozigote caratteriz- osserva nel semplice stato di portatore di - thalassemia.
zato da lieve o assenza di microcitemia con valori di HbA2
normali. Le cause molecolari che possono spiegare tali Analisi Molecolari per lo studio del gene
forme di talassemia sono piuttosto eterogenee. Studi -globinico
recenti hanno mostrato che incrementi lievi dei livelli di La patologia molecolare dei geni -globinici oramai
HbA2 possono essere in relazione al tipo di -mutazione perfettamente chiarita.
presente. Alcune di tali mutazioni possono essere: -101 La maggior parte dei difetti responsabili della -talasse-
C>T, - 92 C>T, CAP + 45 G>T, CAP +1 A>C, IVS2.nt844 C>G. mia sono dovuti a mutazioni puntiformi come la sostitu-
Comunque, molti casi di -thal con HbA2 normale pos- zione, linserzione o la delezione di basi. Di rado il gene

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Problematiche nella diagnosi dei difetti molecolari


del gene -globinico

-globinico interessato da delezioni pi o meno ampie. Digestione Enzimatica


Oggi sono state descritte oltre 650 mutazioni nel mondo, E la tecnica pi conosciuta ed utilizzata per lanalisi del
per cui la talassemia una patologia molto eterogenea a DNA. Un enzima di restrizione riconosce una specifica
livello molecolare. sequenza, per cui una sostituzione nucleotidica determina
Per fortuna tale eterogeneit limitata allinterno di una una variazione del pattern normale dei frammenti nor-
singola popolazione ove un numero ristretto di mutazio- mali. La variazione di una base pu annullare un sito di
ni possono essere riscontrate. restrizione normalmente presente o pu creare un sito di
In Sicilia, per esempio sono presenti 27 mutazioni che restrizione nuovo.
rappresentano il 99.5% delle mutazioni puntiformi Trattando uno specifico frammento di DNA amplificato
riscontrabili. Di queste, l85% sono rappresentate da con un enzima di restrizione e dopo valutazione dei fram-
quattro mutazioni: Cd 39, IVS1.nt110, IVS1.nt1, IVS1.nt6. menti con metodi elettroforetici (gel dagar o poliacrila-
Per lo screening molecolare dei soggetti portatori sani di mide) sar possibile riconoscere se presente o meno una
-talassemia e per i malati sono state messe a punto mutazione.
delle tecniche basate principalmente sullamplificazione
del DNA (come punto di partenza) e lanalisi dei fram- ASO Probes
menti amplificati. Gli ASO Probes sono delle piccole sonde (15-25 basi) che
I metodi di analisi possono essere distinti in due gruppi: vengono utilizzate per analizzare specifiche mutazioni del
analisi indiretta o analisi diretta. Con il primo metodo si gene -globinico mediante una reazione di ibridazione
pu identificare uno o pi tratti di DNA ove presente specifica tra la sonda e il DNA.
una mutazione; lanalisi dovr essere completata con i Sono conosciuti due sistemi che utilizzano gli ASO Probes,
metodi diretti per la identificazione della specifica mutazione. il Dot Blot ed il Reverse Dot Blot. Il principio di base
Il metodo indiretto pi utilizzato il DGGE (Elettroforesi sempre lo stesso, cio libridazione specifica tra il fram-
su gradiente di gel denaturante). mento di DNA contenente la mutazione e la sonda.
Questa tecnica si basa su una migrazione elettroforetica Nel Dot Blot il campione amplificato viene denaturato e
su gel di poliacrilamide con gradiente di sostanze dena- deposto su un filtro di nylon, quindi ibridato con una
turanti (formamide ed urea), nella quale i frammenti sonda specifica contenente la sequenza mutata ed una
amplificati riducono la velocit di corsa quando raggiun- sonda normale per distinguere leventuale eterozigote
gono una concentrazione di gel denaturante corrispon- per la mutazione dallomozigote.
dente alla loro temperatura pi bassa di denaturazione Questo metodo, insieme al metodo della digestione enzi-
(Tm: temperatura di melting). Questa temperatura spe- matica, stato quello pi largamente utilizzato per la-
cifica per ogni segmento di DNA e dipende dalla sua com- nalisi dei geni globinici.
posizione nucleotidica. Poich ad ogni mutazione corri- Il Reverse Dot Blot, al contrario, consiste nel legare al fil-
sponde un pattern elettroforetico caratteristico, possibi- tro di nylon diverse sonde nucleotidiche (normali e muta-
le individuare un frammento contenente una mutazione te) ed ibridare uno di questi filtri con un campione di
attraverso il confronto del pattern del soggetto esamina- DNA amplificato. In tal modo possibile fare uno scree-
to con quello di altri campioni noti. Il DGGE utile per ning di mutazioni con il campione in esame. I vantaggi
lidentificazione di frammenti contenenti mutazioni sco- del reverse dot blot (RDB) rispetto al dot blot (DB) sono:
nosciute. Il frammento identificato dovr successivamen- lRDB non radioattivo, permette lo screening di molte
te essere sequenziato. mutazioni (da 1 a 50 e pi mutazioni) in poche ore di
Diversi sono i metodi per la identificazione diretta delle lavoro, poco costoso. Al contrario il DB un metodo che
mutazioni. fa uso di radioattivo, costoso e permette lanalisi di una
Ogni laboratorio, in relazione alla propria esperienza, sola mutazione al giorno.
opera con uno o pi metodi.
Tra i metodi diretti possiamo elencare: GAP-PCR
1) Digestione Enzimatica. E il sistema che viene utilizzato per lanalisi di geni dele-
2) Uso di ASO Probes: Reverse Dot Blot e Dot blot. ti o ricombinati come per la -siciliana o lHb lepore.
3) Gap-PCR Tale sistema viene molto utilizzato per lanalisi delle dele-
4) ARMS zioni dei geni globinici.
5) Sequencing. In questa tecnica si utilizzano per la PCR una coppia di

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Anemie: aspetti clinici e diagnostici


monografia

primers complementari alle sequenze a monte e a valle ca mediante reazione di PCR, reazione di sequenza e
della delezione. In presenza della delezione si otterr un separazione con gel di poliacrilamide o con apparecchia-
prodotto di ampiezza pari a quella ottenuta dal segmen- ture a capillare.
to compreso fra il 5 e il 3 meno la lunghezza del fram-
mento deleto. Se non c stata alcuna delezione non si
ottiene alcun prodotto di amplificazione.

Bibliografia
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base al 3 del primer. 7. Giambona A, Lo Gioco P, Marino M et al. The great hete-
rogeneity of thalassemia molecular defects in Sicily. Human
Se lamplificazione avviene sia con il primer normale che Genetics 1995; 95:526.
con quello mutato il soggetto un portatore sano della 8. Newton CR, Heptinstall LE. Amplification refractory
mutation system for prenatal diagnosis and carrier asses-
mutazione, mentre se lamplificazione avviene solo con sment in cystic fibrosis. Lancet 1989; ii: 1481.
uno dei due primer, il soggetto omozigote per la 9. Fischer SG, Lerman LS. DNA fragments differing by simple
base pair substitution are separate in denaturant gradient
sequenza normale o mutata in quel determinato tratto di gels: Correspondence with melting theory. PNAS USA 1983;
DNA. Questo metodo rapido, non richiede radioattivo 80: 1579.
ed applicabile a qualsiasi mutazione. 10. Sanger F, Nicklen S, Couson AR. DNA sequencing with
chain terminatine inhibitors. PNAS USA 1977; 74: 5463.
11. Maggio A, Giambona A, Cai SP, Wall J, Kan YW, Chehab
SEQUENCING FF. Rapid and simultaneous typing of hemoglobin S, hemo-
globin C, and seven Mediterranean -thalassemia mutations
E la tecnica che viene utilizzata per le identificazioni di by covalent reverse dot-blot analysis: application to prenatal
mutazioni nuove o non presenti in pannelli di mutazio- diagnosis in Sicily. Blood 1993; 81:239.

ni studiate con altri metodi. In genere possono essere


seguite due strategie:
a) utilizzare il DGGE, identificare il frammento coinvolto
per la possibile presenza di una mutazione e successiva-
mente sottoporre tale frammento ad unanalisi di
sequenza;
b) analizzare il DNA direttamente mediante sequenzia-
mento senza usare il DGGE.
La tecnica di Sanger quella oggi adottata nella mag-
giore parte delle metodiche di sequenza. Questa tecnica
consiste in reazioni di estensione nelle quali si utilizzano
4 terminatori (dideossinucleotidi) dellallungamento della
catena nucleotidica.
I prodotti che si ottengono differiscono tra di loro per
una sola base. Tali frammenti vengono separati in fun-
zione della loro lunghezza tramite elettroforesi e loro let-
tura dopo rivelazione con apparecchiature specifiche.
La reazione di sequenza pu essere manuale utilizzando
radioattivo e lastra autoradiografiche, oppure automati-

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Anemia da carenza di folati


e vitamina B12
D. Scribano
Dirigente di I Livello
Laboratorio di Chimica Clinica
Policlinico Gemelli - Roma

La carenza di acido folico e di vitamina B12 determina e diventano pertanto pi grandi del normale. Di conse-
una forma di anemia megaloblastica caratterizzata da guenza si verifica uneritropoiesi inefficace con rilascio in
macrocitosi. La vitamina B12 e i folati sono composti che circolo di macro-megalociti, che clinicamente si manifesta
svolgono un ruolo fondamentale e interdipendente nella con un quadro di anemia ingravescente. La severit del-
sintesi degli acidi nucleici, pertanto la loro carenza pro- lanemia ed il grado della macrocitosi dipendono dallen-
voca alterazioni in tutti i tessuti ad alto turn-over cellu- tit e dalla durata della carenza vitaminica.
lare. Nel midollo osseo gli eritroblasti, precursori degli
eritrociti maturi, subiscono una trasformazione megalo- Cause di anemia megaloblastica
blastica (fig.1) non potendo completare in maniera sin- 1. Cause nutrizionali
crona la maturazione del nucleo e quella del citoplasma, Deficit di Vitamina B12 Veganismo, alimentazione insuffi-

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Anemie: aspetti clinici e diagnostici


monografia

ciente
Deficit di Folati - Apporto alimentare inadeguato, et
avanzata, condizioni economiche disagiate, latte di capra
2. Malassorbimento
Cause gastriche di deficit di Vitamina B12: anemia pernicio-
sa, deficit congenito di fattore intrinseco, gastrectomia
Cause intestinali di deficit di Vitamina B12: sindrome del-
lansa cieca, malassorbimento selettivo, resezione ileale
Cause intestinali di deficit di folati: morbo celiaco, sprue
tropicale
3. Aumentato turnover cellulare
Deficit di folati: gravidanza, prematurit, anemia emoliti-
ca cronica (ad es. lanemia a cellule falciformi), malattie
infiammatorie, tumori
4. Perdite renali
Deficit di folati: scompenso cardiaco congestizio, dialisi gruppi metilici (metil-cobalamina), 5-deossiadenosina Fig. 1:
5. Farmaci (deossiadenosil-cobalamina o coenzima B12), gruppi midollo con cellule
Deficit di folati: antiepilettici, sulphasalazine idrossilici (idrossicobalamina o vitamina B12), o cianuro megaloblastiche
6. Anomalie metaboliche (cianocobalamina o vitamina B12). La cianocobalamina
deficienza congenita di transcobalamina II (TCII) un composto stabile ed il composto di riferimento per
7. Altre cause di macrocitosi la misura della concentrazione di cobalamina nel siero. Le
Alcool cobalamine sieriche sono poco stabili e devono essere con-
Malattie epatiche vertite in cianocobalamine per essere misurate. Fig. 2:
Ipotiroidismo In ogni caso il termine di vitamina B12 viene usata per struttura chimica
Reticolocitosi descrivere tutti i corrinoidi che esibiscono lattivit biolo- della vitamina B12
Anemia aplastica
Mielodisplasia
Farmaci citotossici
Paraproteinemie (come il mieloma) CH2 CONN2
Gravidanza CH2
CH3 CH3
Periodo neonatale
NH2 CO CH2 CH2 OCNH2
A B CH2 CH2
Queste condizioni sono in genere caratterizzate da midol- CH3 N
CN
N CO
lo normoblastico con presenza di reticolocitosi. CH3
CO+ NH2
N N
Vitamina B12 CH3
NH2 CO CH2 D C
Struttura CH3
Il termine generico di vitamina B12 si riferisce ad un CO CH2 CH2 CH3 CH3
CH2 CH2
gruppo di sostanze fisiologicamente attive classificate da NH
CO
un punto di vista chimico come cobalamine o corrinoidi. CH2
NH2
N
Sono composte da un anello tetrapirrolico che circonda CH CH3 CH3
un atomo centrale di cobalto, da una catena laterale O
O CH3
costituita dal nucleoside del 5,6 dimetilbenzimidazolo N
P
legato al cobalto e da un ligando organico. Lanello tetra- O O OH
pirrolico, escluso il cobalto e le catene laterali, chiama-
C C
to corrina e tutti i composti contenenti questo nucleo H H
HC C
sono indicati come corrinoidi. Il complesso cobalto-corri- H
HO CH2 O
na prende il nome di cobamide. In natura le cobalamine
differiscono per i gruppi addizionali legati al cobalto:

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Anemia da carenza di folati e vitamina B12

line, dette anche aptocorrine o proteine leganti R;


distacco di B12 dalle cobalofiline per opera del succo
pancreatico;
legame di B12 al fattore intrinseco (FI), prodotto dalle
cellule parietali del fondo e del corpo dello stomaco, la
cui secrezione sotto il controllo vagale; il FI prodotto
giornalmente pu legare 40-80 g di B12;
la vitamina B12 assorbita a livello dellileo; il com-
plesso FI-B12 si lega agli enterociti a pH 6.4-8.4 in pre-
senza di ioni Ca2+ e viene internalizzato; la B12 rilascia-
ta dal complesso si lega alla transcobalamina II (TC-II,
la pi importante proteina di trasporto), oppure ad
aptocorrine sieriche, TCI e TCIII;
la vitamina B12 viene poi captata da cobalofiline bilia-
ri, riversata nel duodeno e riassorbita nel circolo ente-
ro-epatico.

Le proteine di trasporto, oltre al FI, sono le tre transco-


balamine (TCI, TCII, TCIII).
La TCI o Rapid Protein (R) presente in diversi liquidi bio-
logici e pu determinare falsi aumenti della concentra-
zione sierica di vitamina B12, in quanto lega sia la forma
biologicamente attiva sia analoghi non attivi.
gica della cianocobalamina. La TCII trasporta la forma biologicamente attiva della B12
Tre sono le forme naturali di cobalamina: metil, idrossi ai recettori cellulari.
e adenosilcobalamina. La TCIII prodotta dai granulociti; nei pazienti affetti da
leucemia mieloide cronica si osservano valori falsamente
Sorgenti alimentari e fabbisogno giornaliero aumentati di Vitamina B12.
Tutti i prodotti animali sono ricchissimi di vitamina B12,
soprattutto il fegato e la carne rossa, ma anche il pesce Acido folico
e il latte: le verdure non contengono invece quantit Struttura
importanti, a meno che non siano contaminate da alghe Lacido folico una vitamina del gruppo B, costituita da
o batteri. tre componenti: pteridina, acido p-aminobenzoico ed
Lapporto di vitamina B12 nella dieta occidentale (5-15 acido glutammico (Fig 3). Lapporto alimentare di acido
ug/giorno) pi che sufficiente a coprire il fabbisogno folico essenziale perch lorganismo umano non in
giornaliero di 2 ug/die. Per cui, ad eccezione dei vegeta- grado di sintetizzare p-aminobenzoico o di attaccare il
riani stretti (vegaliani), la carenza di B12 la spia di un glutammato alla pteridina. Lacido folico funge da accet-
problema di assorbimento. La riserva corporea di B12 tore-donatore di unit monocarboniose, fondamentali
notevole, e il tempo richiesto per evidenziare un deficit nella reazione di sintesi della glicina, della metionina e di
di circa 2-5 anni anche in presenza di un grave malas- purine e pirimidine.
sorbimento. I livelli sierici di vitamina B12 sono 200-835
pg/ml. Sorgenti alimentari e fabbisogno giornaliero
Alimenti ricchi di folato sono soprattutto i vegetali a
Assorbimento e trasporto foglie verdi, ma anche il lievito, il fegato, i reni, i cereali
Lassorbimento della vitamina B12 avviene tramite diver- e il latte. Tuttavia con la cottura si distrugge circa il 50-
se fasi: 95% dei folati contenuti negli alimenti.
rilascio di B12 dagli alimenti nello stomaco, ad opera Lapporto giornaliero (circa 227 pgr/die, in genere sotto
della pepsina e dellacidit gastrica; forma di poliglutammato) copre ampiamente il fabbiso-
legame della B12 alle glicoproteine salivari, le cobalofi- gno (circa 50 pgr/die). A differenza della vitamina B12, le

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Anemie: aspetti clinici e diagnostici


monografia

scorte di folati (5-10 mg) sono scarse rispetto alla richie- ne deriva che un deficit di cobalamina determina un
sta quotidiana, per cui stati carenziali possono insorgere aumento del metilmalonilCoA e del suo prodotto di idro-
pi rapidamente. lisi lacido metilmalonico (MMA) nelle urine;
2) come metil-cobalamina, interviene nella reazione di
Assorbimento e trasporto metilazione dellomocisteina a metionina, con formazione
Lassorbimento dei folati avviene nel digiuno sotto forma finale di S-adenosil-metionina (SAM).
di poliglutammati. Questi vengono idrolizzati dagli enzi- Questultima reazione rappresenta il punto di contatto
mi intestinali, e assorbiti nel digiuno come monoglutam- tra la via metabolica del folato e quella della vitamina
mati. Nella cellula intestinale la diidrofolato redattasi B12 (Fig. 4); la cobalamina accetta infatti il gruppo meti-
riduce lacido folico a diidrofolico e a tetraidrofolico. lico dal N-5-metil-tetraidrofolato, che si trasforma in
Dopo lassorbimento i folati sono trasportati al fegato tetraidrofolato: inoltre il prodotto finale della reazione,
che li accumula e li distribuisce ai tessuti. La captazione ladenosil-metionina (SAM), controlla con un meccanismo
da parte delle cellule del folato circolante facilitata da di feed-back negativo la disponibilit di metil-tetrai-
meccanismi di trasporto e da un recettore dei folati. Nella drofolato, bloccando la sua formazione dal metilen-
cellula il folato viene di nuovo trasformato a poliglutam- tetraidrofolato.
mato e viene utilizzato nel metabolismo delle purine e Il SAM produce inoltre vari composti metilati che inter-
pirimidine e nella sintesi del DNA. vengono come donatori di formiato, necessario per le tra-
In situazioni di carenza di acido folico, i depositi epatici sformazioni:
sono mobilitati. Gli eritrociti maturi contengono folati
in quantit strettamente correlata al pool depositato nel tetraidrofolato --> metilen-tetraidrofolato
fegato. tetraidrofolato --> formil-tetraidrofolato --> folato-poliglutamato
I livelli di folato sierico variano da 6 a 20 ng/ml, quelli
dei globuli rossi da 160-640 ng/ml. In caso di carenza di vitamina B12, viene bloccata la for-
Livelli sierici inferiori a 4 ng/ml ed eritrocitari inferiori a mazione di tetraidrofolato: il folato rimane intrappola-
140 ng/ml, sono indicativi di carenza di folati. to sotto forma di metil-tetraidrofolato ed metabolica-
mente inattivo. A livello cellulare si realizza una deplezio-
Lesione biochimica nelle anemie megaloblastiche Fig. 3: ne di metilen-tetraidrofolato, che blocca la sintesi di acido
La Vitamina B12 nelle sue forme attive interviene in due struttura chimica timidilico secondo la reazione:
importanti reazioni biochimiche: dellacido folico e
1) come deossiadenosil-cobalamina, interviene nella tra- dellacido timidilico-sintetasi
sformazione del metilmalonilCoA in succinilCoA; 5-metil-tetraidrofolico deossi-uridil-monofosfato <-----------> timidil-monofosfa
metilen-tetraidrofolato

H N N NH2 Viene anche bloccata la sintesi ex novo di nucleotidi puri-


HO2C O H nici, normalmente catalizzata dal formil-tetraidrofolato.
N NH
HO
N N La conseguenza diretta di questo blocco metabolico il
H H ritardo maturativo del nucleo cellulare ed insorgenza di
O O Acido Folico
anemia megaloblastica. In caso di carenza di vitamina
H
H N N NH2
B12, la concentrazione di folato nel siero pu essere
H abnormemente elevata per laccumulo di metil-tetrai-
H NH
N drofolato, a fronte di una concentrazione intraeritrocita-
CH3 O ria diminuita per linsufficiente sintesi di poliglutamati
N metabolicamente attivi.
H
O
HO2C La ridotta sintesi di SAM provoca una compromissione
NH della disponibilit di gruppi metilici per la metilazione
H dei lipidi della sostanza bianca e quindi unalterata sin-
Acido 5-Metil-tetraidrofolico
R
O
tesi della mielina. Anche il metabolismo dellacido pro-
pionico compromesso per la mancata formazione di suc-

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Anemia da carenza di folati e vitamina B12

cinil-CoA, dovuta alla carenza di deossi-adenosil-cobala- A carico dello stomaco presente una gastrite atrofica
mina (reazione 1). spesso di natura autoimmune, con infiltrazione linfocita-
Linsieme di queste alterazioni metaboliche determina ria e plasmacellulare della mucosa.
linsorgenza di lesioni neurologiche. Lanemia perniciosa pu infatti manifestarsi anche nel
quadro di altre patologie autoimmuni, non infrequen-
Sintomatologia clinica te ad esempio lassociazione con la vitiligo, con lipotiroi-
Anemia perniciosa dismo da tiroidite autoimmune e con la rettocolite ulce-
Lanemia perniciosa la sindrome pi tipica dovuta a rosa. Nel 85% circa dei pazienti sono presenti nel siero
carenza di vitamina B12. Lesordio insidioso ed il qua- anticorpi anti-cellule parietali ed in circa la met sono
dro clinico diventa generalmente manifesto quando le presenti anticorpi-anti fattore intrinseco, altamente spe-
concentrazioni di vitamina B12 sono inferiori a 160 cifici perch raramente presenti nei soggetti sani o con
pg/ml. Progressivamente si manifestano i segni di una- altre endocrinopatie autoimmuni.
nemia severa, con astenia marcata, pallore e subittero, I sintomi neurologici possono essere precoci e comparire
dovuto alleccessiva distruzione dei globuli rossi per eri- prima dei segni ematologici di carenza di vit. B12 e, se
tropoiesi inefficace. non corretti tempestivamente, possono diventare irrever-
Frequentemente si osserva un interessamento cardiaco sibili. I pazienti sviluppano una polineuropatia demieli-
proporzionale allentit dellanemia: le alterazioni del nizzante a carico dei cordoni posteriori e laterali del
miocardio sono riconducibili direttamente alla carenza di midollo spinale e dei nervi periferici. Ci si manifesta dap-
vitamina B12 e possono esitare in uninsufficienza car- prima con astenia e parestesie pi marcate agli arti infe-
diaca congestizia con cardiomegalia. riori poi, nelle fasi pi avanzate, con atassia, andatura
Le alterazioni del trofismo cellulare sono molto evidenti paretico-spastica e iperriflessia.
nel cavo orale: i pazienti presentano cheilite angolare ed Sono spesso presenti disturbi cerebrali pi difficili da
una glossite caratteristica (glossite di Hunter); dapprima inquadrare, ad esempio perdita di memoria e stati
la lingua appare ricoperta da vescicole e ragadi molto depressivi.
dolorose, successivamente assume un aspetto traslucido e
liscio dovuto allatrofia della mucosa. I pazienti sono Altre anemie megaloblastiche da carenza di Vitamina B12
spesso inappetenti e lapporto alimentare ulteriormen- La sintomatologia simile a quella dellanemia pernicio-
te limitato dalla possibile coesistenza di diarrea e vomi- sa e la gravit in relazione al grado di deficit vitamini-
to, espressione dellinteressamento intestinale e gastrico. co. Possono inoltre essere presenti sintomi legati alla

Sintesi Reazioni
Acido Nucleico di Metilazione

TH4- Folato

Metionina

5,10-Metilen TH4- Folato


Metionin
sintasi Vitamina B12

Metilen TH4
NADPH+H+ reduttasi
Omocisteina
Riboflavina
(FAD) 5-Metil TH4- Folato
Fig. 4:
vie metaboliche della
vitamina B12 e NADP+
dei folati

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Anemie: aspetti clinici e diagnostici


monografia

patologia responsabile della carenza; ad esempio, nella di Arneth.


sindrome da ansa cieca con abnorme proliferazione di Le piastrine sono modestamente diminuite con anomalie
microrganismi intestinali, si osserva diarrea con steator- morfologiche e strutturali.
rea e calo ponderale. In tutte le condizioni caratterizzate da una carenza con-
temporanea di ferro, il quadro periferico non cos spic-
Anemia megaloblastica da carenza di folati catamente macrocitico-megaloblastico e pu essere pre-
Sono costantemente assenti i sintomi neurologici e quel- sente una doppia popolazione eritrocitaria, una microci-
li riconducibili allachilia gastrica istamino-resistente; la tica e unaltra macrocitica.
sintomatologia legata allanemia e allinteressamento del Anche nella carenza di folato insorta in corso di anemie
sistema digerente invece sovrapponibile a quella della- emolitiche manca in genere il quadro megaloblastico.
nemia perniciosa. Nella carenza di vit. B12 prodotta da infestazione da
Nelle sindromi da malassorbimento difficilmente la caren- diphillobotrium latum, leosinofilia periferica unitamente
za di folato isolata, molto pi spesso accompagnata al dato anamnestico di ingestione di pesce crudo, dirige
da una carenza contemporanea di vitamina B12 e di verso la ricerca delle uova del parassita nelle feci.
ferro. Le anemie megaloblastiche devono essere differenziate
dalle altre anemie macrocitiche non megaloblastiche,
Esami di laboratorio caratterizzate da macrociti rotondeggianti e non ovalari e
Sangue periferico da spiccata reticolocitosi.
A carico dei globuli rossi si manifestano nel sangue peri-
ferico sia alterazioni quantitative, fino a valori di Aspirato midollare
1.000.000/mm3, sia gravi alterazioni morfologiche. Nelle anemie megaloblastiche da carenza di vit. B12 e
La macrocitosi, ossia laumento del volume corpuscolare folati si osserva uniperplasia della serie rossa con pre-
medio eritrocitario, quasi sempre presente e pu prece- senza predominante di megaloblasti basofili, con volume
dere la caduta della concentrazione emoglobinica. Tutta- aumentato e ridotto rapporto nucleo-citoplasmatico: gli
via non sempre indirizza verso una diagnosi di anemia eritroblasti normali sono notevolmente ridotti e vi sono
megaloblastica, sia perch pu essere mascherata se la segni evidenti di eritropoiesi inefficace.
carenza di Vitamina B12 e folati insorge in soggetti Mielociti e metamielociti raggiungono un diametro di
microcitemici o sideropenici, sia perch una macrocitosi si 20-30 con gravi alterazioni della maturazione nucleare:
osserva anche in condizioni patologiche non-megalobla- anche i megacariociti sono diminuiti di numero e presen-
stiche, ad esempio nelle anemie emolitiche, nelle anemie tano nucleo ipersegmentato e granulazioni citoplasmatiche.
che accompagnano patologie epatiche e nellalcolismo.
Solo un aumento del Volume Corpuscolare Medio al di Altri parametri sierici
sopra dei valori di 130 fl pu essere considerato realmen- Si pu osservare un modesto aumento della bilirubina
te predittivo di anemia perniciosa. indiretta per lemolisi intramidollare; per lo stesso moti-
E presente una poichiloanisocitosi con tipici ovalociti di vo si ha aumento della sideremia con modesta diminu-
diametro generalmente superiore a 10, frequentemente zione della capacit legante il ferro.
sono presenti anche eritroblasti ortocromatici ed emazie La latticodeidrogenasi nettamente aumentata, in parti-
con granulazioni basofile, corpi di Jolly e anelli di Cabot. colare si osserva un prevalente aumento della frazione
Il numero di reticolociti diminuito come conseguenza isoenzimatica LDH1, diversamente da quanto avviene nei
delleritropoiesi inefficace. pazienti affetti da anemia emolitica in cui aumenta la
La quantit di emoglobina sempre diminuita, fino a 4- LDH2.
5 g/dl, ma il contenuto emoglobinico medio aumenta
proporzionalmente allaumento del volume globulare Diagnosi di anemia megaloblastica
medio. Per la diagnosi di anemia megaloblastica fondamenta-
Anche la serie bianca mostra alterazioni evidenti. Eco- le eseguire unanamnesi accurata, atta a mettere in evi-
stantemente presente una neutropenia assoluta e linfoci- denza i possibili fattori eziologici responsabili della caren-
tosi relativa. I granulociti hanno in genere dimensioni za vitaminica.
maggiori rispetto alla norma ed hanno sempre il nucleo Lesame emocromocitometrico di solito permette gi di
plurisegmentato, con spostamento a destra dello schema fare diagnosi con il reperto di macrociti ovalari, neutro-

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Anemia da carenza di folati e vitamina B12

penia con ipersegmentazione nucleare e assenza di reti- ni e poi somministrare vitamina B12 marcata; se
colocitosi. questa viene trovata nelle urine il difetto dovu-
Tuttavia occorre ricordare che sebbene le anormalit ema- to ad alterato assorbimento ileale per abnorme
tologiche si sviluppino generalmente prima di quelle crescita batterica, condizione corretta dagli anti-
neurologiche, circa un quarto dei pazienti con manifesta- biotici; nel caso in cui la vit. B12 non elimina-
zioni neurologiche da carenza di vitamina B12 ha emato- ta con le urine perch gli antibiotici non hanno
crito normale o un volume corpuscolare medio nella sortito nessun effetto, il difetto secondario ad
norma. alterazione anatomica.
A volte entrambi i valori sono normali. Quando si valuta un paziente con anemia megaloblastica
Per effettuare una diagnosi sicura pertanto indispensa- occorre eseguire, contemporaneamente, la determinazio-
bile effettuare. ne della concentrazione di folato e vitamina
- il dosaggio sierico della vitamina B12 B12 nel siero e la concentrazione dei folati intraeritrocita-
- il dosaggio sierico ed eritrocitario del folato ria (espressione del pool di folato disponibile).
- il test di Schilling Si deve tenere presente che:
La diagnosi di anemia perniciosa richiede la dimostrazio- nel deficit di folato la concentrazione dei folati nel siero
ne di anticorpi anti-fattore intrinseco nel siero e la dimo- diminuita mentre negli eritrociti pu essere normale
strazione dellincapacit di assorbire la vitamina B12 (test o diminuita;
di Schilling), per differenziare le forme di carenza della il 10 % dei pazienti con deficit di folato presenta valori
vitamina per carenza di fattore intrinseco da quelle dovu- di vitamina B12 intorno a 100 pg/ml, che si normaliz-
te a malassorbimento. zano dopo somministrazione di acido folico;
Nell85% dei pazienti sono presenti anticorpi anticellule nel deficit di vitamina B12 il folato sierico e quello
parietali, che per non sono specifici, in quanto sono pre- intraeritrocitario possono essere diminuiti;
senti anche in pazienti affetti da patologie autoimmuni e spesso i deficit di B12 e folati sono strettamente asso-
nel 3-7% di persone sane. ciati.
Gli anticorpi anti-Fattore Intrinseco sono presenti soltan-
to nel 50% dei pazienti affetti da anemia perniciosa, ma Diagnosi differenziale tra carenza di folati e di
raramente nelle persone sane o nei pazienti affetti da vitamina B12
patologia autoimmune, pertanto sono pi specifici. Il dosaggio della omocisteina e dellacido metilmalonico
pu risultare utile per differenziare le forme da carenza di
Test di Schilling vitamina B12 da quelle di folato.
Il test di Schilling un test a 3 steps: Questo perch cobalamina e folato intervengono ambe-
1. step somministrare al paziente 1 nanogrammo di vita- due nel metabolismo dellomocisteina, mentre la sola
mina B12 marcata per via orale; controllare leli- cobalamina interviene nel metabolismo dellacido metil-
minazione urinaria della vitamina marcata assun- malonico.
ta oralmente; se la vitamina marcata nelle urine Pertanto, in caso di deficit di cobalamina, si osserva un
circa 5-40%, il paziente ha assorbito la vit. B12 aumento sia di metilmalonico che di omocisteina, mentre
e la diagnosi deficit alimentare di B12; in caso di carenza di folato si osserva solo un aumento di
se la vitamina marcata non eliminata con le omocisteina. Laccumulo di questi metaboliti nel plasma
urine, evidente che la vitamina B12 sommini- precede la caduta delle concentrazioni sieriche delle vita-
strata non stata assorbita; mine nel siero e riflette in maniera accurata lo stato
2. step somministrare contemporaneamente per via nutrizionale.
orale fattore intrinseco e vitamina B12 marcata e Inoltre, il dosaggio dellomocisteina permette di identifi-
controllare leliminazione urinaria di B12; se que- care le forme di deficit di folato atipiche o associate a
sta viene trovata nelle urina, il difetto dovuto manifestazioni cliniche inusuali. Questo pu avere impli-
a carenza di fattore intrinseco; se la vitamina cazioni importanti rispetto al rischio di malattia, dal
marcata non eliminata con le urine, il difetto momento che un apporto sub-ottimale di folato pu
non dovuto a carenza di fattore intrinseco, ma essere associato a rischio aumentato di malattia cardio-
a livello intestinale; vascolare, di neoplasie e, nelle donne in gravidanza, a
3. step trattare il paziente con antibiotici per 7-10 gior- difetti del tubo neurale a carico del feto.

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28-35scribano.qxd 7-05-2003 13:55 Pagina 35

Anemie: aspetti clinici e diagnostici


monografia

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Criteri di interpretazione dei dati di Laboratorio Breedveld FC, Bieger R., Van Wermeskerken RK.
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Cause che influiscono sulla concentrazione sierica
Carmel R. Pernicious anemia: the expected findings of very
di cobalamina low serum cobalamin levels, anemia, and macrocytosis are
La concentrazione sierica di cobalamina pu risultare nor- often lacking. Arch Intern Med 1988; 148: 1712-1714
Hillman RS, McGuffin R., Campbell C. Alcohol interference
male, pur in presenza di deficit, nel caso di: with the folate enterohepatic cycle. Trans Assoc Am Physi-
disordini mieloproliferativi (CML, Policitemia vera) cians. 1977; 90: 145-156
Christopher F.Snow. Laboratory diagnosis of vitamin B12
deficit congenito di transcobalamina II and folate deficiency. Arch intern Med, 1999;159:1289-1298.
sovracrescita batterica intestinale Doscherholmen A., Silvis S., McMahon. Dual isotope
Schilling Test for measuring absorpion of food-bound and
precedente somministrazione di composti a base di vit. free vitamin B12 simultaneously. Am J Clin Pathol, 1983;
B12 80:490-495
George G. Klee. Cobalamin and folate evaluation: measure-
La concentrazione sierica di cobalamina pu risultare
ment of methylmalonic acid and homocysteine vs vitamin B12
diminuita pur in assenza di un quadro carenziale nel caso di: and folate.Clinical chemistry,2000;46:1277-1283
deficit di folato Bruno Zappacosta, Silvia Persichilli, Donata Scribano,
Angelo Minucci, Daniele Lazzaro, Pasquale De Sole and
gravidanza Bruno Giardina. Comparing different methods for homocy-
uso prolungato di contraccettivi orali steine determination. Clin Chem Lab 2002;40(11):1139-1142.

deficit congenito di aptocorrine sieriche


mieloma multiplo

Occorre ricordare infine che lomocisteina pu essere ele-


vata, oltre che nel deficit di folato e cobalamina, per defi-
cit di piridossina, nellinsufficienza renale, nelle ipovole-
mie, nella psoriasi, e per difetti metabolici ereditari.
Anche lacido metilmalonico pu variare per cause non
legate al deficit di vitamina B12. In particolare pu risul-
tare elevato nellinsufficienza renale, e per difetti meta-
bolici ereditari, pu invece risultare ridotto in seguito a
terapie antibiotiche per riduzione della flora batterica
intestinale.

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L anemia sideropenica
A. Molteni
Azienda Ospedaliera
Ca Granda Niguarda
Milano

Lanemia da carenza di ferro (sideropenica) si manifesta Lemoglobina, contenuta nei globuli rossi, la proteina
quando la quantit di ferro disponibile nellorganismo deputata al trasporto dellossigeno. E formata da un
risulta insufficiente per una adeguata sintesi di emoglobina. tetramero di catene proteiche, dette globina, in ciascuna
La carenza di ferro una condizione che si verifica quan- delle quali inserito un gruppo prostetico, detto eme,
do la velocit di perdita o di utilizzazione del ferro supe- formato da un anello tetrapirrolico contenente allinter-
ra la velocit di assimilazione dello stesso. no un atomo di ferro in forma ridotta. Questa struttura
permette di legare e rilasciare lossigeno in relazione alla
1. Il ferro nellorganismo umano pressione parziale dello stesso secondo una curva sigmoidea.
Il contenuto medio di ferro in un individuo adulto varia La mioglobina, contenuta nel muscolo scheletrico e car-
tra i 2 e i 5 grammi ed in rapporto con il peso corpo- diaco, ha la struttura di un singolo monomero ed carat-
reo e con la concentrazione emoglobinica. Nel maschio terizzata da un legame con lossigeno ad alta affinit, con
risulta circa 50 mg/kg, mentre nelle femmine circa 35 lo scopo di costituire un serbatoio di ossigeno che la cel-
mg/kg. lula utilizza quando sottoposta ad ipossia.
La quota maggiore di ferro contenuta nellemoglobina In presenza di normali livelli di emoglobina, 1 mL di san-
(70%) e nella mioglobina (10-13%). gue contiene 0,5 mg di ferro.

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Anemie: aspetti clinici e diagnostici


monografia

Per il resto il ferro risulta presente in un compartimento


di deposito e un compartimento plasmatico. Lume intestinale
I depositi di ferro si individuano nelle molecole di ferriti-
na ed emosiderina.
La ferritina una proteina costituita da un guscio protei- Epitelio intestinale Eliminazione
co detto apoferritina che in grado di racchiudere al suo
interno fino a 4500 atomi di ferro. E una molecola ubi-
quitaria, anche se concentrazioni particolarmente elevate Trasferrina
si riscontrano a livello di fegato, milza e midollo osseo.
Lemosiderina trae origine dallaggregazione di diverse
Macrofagi Depositi Eritrone
molecole di ferritina in seguito alla degradazione dellin- (sistema reticolo endoteliale) (fegato) (midollo osseo)
volucro proteico formando cos polimeri di diverse dimen-
sioni. Come la ferritina, essa presente soprattutto a Eritrociti
livello di fegato, milza e midollo osseo. (sangue)
La fissazione del ferro alla molecola di ferritina e la sua
liberazione sono mediate da un meccanismo metabolica-
mente controllato, che ne consente la pronta disponibi-
lit per le necessit fisiologiche della cellula. Al contrario Fig. 1: in pazienti sideropenici durante il trattamento con ferro,
il ferro compreso nel condensato emosiderinico pu esse- il ciclo del ferro soprattutto se trattati con ferro per via parenterale.
re mobilizzato soltanto in modo lento ed incontrollato. La ferritina presente in piccola quota anche nel sangue
Il ferro plasmatico costituisce meno dello 0,1% del ferro circolante e varia, nei soggetti normali, da 20 a 200
nellorganismo e viene trasportato quasi esclusivamente g/L. Esistono significative differenze tra i livelli medi di
dalla transferrina. Questa molecola una glicoproteina ferritina negli uomini (94 g/mL) e nelle donne (34
con conformazione bilobata, in cui ciascun lobo contiene g/mL). Nelladulto sano la concentrazione di ferritina
un sito di legame con una molecola di ferro trivalente. sierica risulta essere direttamente proporzionale allentit
Normalmente la transferrina non si lega al ferro al mas- dei depositi di ferro nellorganismo: 1 g di ferritina
simo delle sue potenzialit, ma viene occupata per circa equivale approssimativamente a 10 mg di ferro accumu-
un terzo. Per questa ragione, spesso e pi correttamente lato nei siti di deposito. La presenza di uno stato infiam-
viene espressa attraverso la sua capacit di legare il ferro, matorio, anche di modesta entit, ne pu aumentare la
detta TIBC dallacronimo inglese total iron-binding capa- concentrazione. La sua concentrazione risulta inoltre
city. La sua concentrazione sierica compresa tra 4.4 e incrementata dallassunzione di terapia marziale sia orale
8.0 mol/100ml (250 e 450 g/100ml, con valore medio che parenterale.
di circa 300 g/100ml). La saturazione della transferrina Allinterno dellorganismo il ferro viene scambiato in
definita come il rapporto tra i siti occupati da atomi di modo unidirezionale dalla transferrina plasmatica alleri-
ferro e i siti disponibili a tale legame, ed espressa in trone (definito come la totalit degli elementi eritroidi in
percentuale. I valori di normalit sono compresi tra il ogni stadio di maturazione), da questo ai macrofagi e di
20% e il 50%. nuovo alla transferrina plasmatica (figura 1). Circa 4/5
La concentrazione sierica di ferro, detta sideremia, nor- del ferro trasportato dalla transferrina, ogni giorno vei-
malmente circa un terzo della TIBC, ossia mediamente 1.8 colato verso leritrone. La cellula emopoietica acquisisce il
mol/100ml (circa 100g/dL). La concentrazione del ferro ferro dalla transferrina attraverso uno specifico recettore
influenzata da molte variabili sia fisiologiche che pato- di membrana e i complessi transferrina-recettore vengo-
logiche. Ha un ritmo diurno, per cui si riduce di pome- no internalizzati allinterno di endosomi. La maggior
riggio raggiungendo il valore pi basso attorno alle 9 di parte del ferro viene utilizzato per la sintesi dellemoglo-
sera, mentre raggiunge il massimo tra le 7 e le 10 del bina, mentre una piccola parte viene immagazzinato
mattino. Pu apparire ridotta durante il ciclo mestruale, nella ferritina citoplasmatica. La sintesi del recettore della
in presenza di stato infiammatorio, di neoplasia o succes- trasferrina e della ferritina citoplasmatica vengono rego-
sivamente a infarto del miocardio. Neoplasia e chemiote- late da due proteine dette IRP-1 e IRP-2. Gli eritrociti
rapia possono per causare anche un incremento dei senescenti vengono fagocitati dai macrofagi a livello di
valori di sideremia. Valori incrementati si osservano anche fegato, milza e midollo osseo e, allinterno dei macrofa-

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Lanemia sideropenica

gi, lenzima eme-ossigenasi catabolizza il gruppo eme giornalmente circa 10-20 mg di ferro, ma in condizioni
liberando ione ferroso. Questultimo, attraverso un mec- normali solo una parte di questo, corrispondente al 5-
canismo non ancora completamente chiarito, che coinvol- 10%, viene assorbito ed quanto corrisponde per bilan-
ge una proteina detta ferroportina 1 e la ceruloplasmina, ciare le perdite fisiologiche. In condizione di carenza las-
viene per la maggior parte ceduto nuovamente alla tran- sorbimento aumenta fino a cinque volte quello basale.
sferrina e il ciclo ricomincia. Il ferro contenuto negli alimenti di origine animale
La forma tronca del recettore della transferrina solubile assorbito molto meglio rispetto al ferro vegetale perch i
nel plasma. Tale proteina pu essere dosata e riflette la primi contengono quote elevate di ferro emico, ossia
quantit totale del recettore cellulare della transferrina e legato al gruppo eme dellemoglobina e della mioglobi-
quindi lattivit delleritrone. In caso di iperplasia eritroi- na, che non viene digerito, ma penetra intatto nella cel-
de (che si ha per esempio in caso di talassemia, anemia lula intestinale. Lambiente acido dello stomaco ha un
falciforme, anemia emolitica) si osserva un incremento di ruolo fondamentale in quanto rende possibile la dige-
tale proteina. Anche la carenza marziale causa di incre- stione peptica degli alimenti liberando il ferro e fa si che
mento del recettore solubile della transferrina in quanto esso rimanga in forma chimicamente attiva e possa legar-
la carenza di ferro comporta una up-regulation del si a sostanze con cui forma complessi che rimangono suc-
recettore. Questo parametro dunque pu essere utilizzato cessivamente stabili nel pH neutro intestinale, disponibi-
anche come indice di sideropenia, ovviamente solo in li per lassorbimento.
assenza di copatologie che determinino iperplasia eritroi- La maggior parte del ferro viene assorbita nella prima
de. La sua importanza deriva soprattutto dal fatto che la parte dellintestino tenue (duodeno e met prossimale
sua concentrazione non influenzata dallo stato infiam- del digiuno).
matorio.
3. Cause di carenza di ferro
2. Ricambio giornaliero del ferro Levento di gran lunga pi frequente che causa una ane-
Non esiste una vera e propria via di eliminazione del ferro mia da carenza di ferro lincremento delle perdite. Nella
dallorganismo. Ogni giorno attraverso lesfoliazione delle donne in et fertile ipermenorrea, gravidanze e metror-
cellule dellepitelio gastrointestinale vengono eliminati ragie sono i fattori pi spesso implicati. I donatori di san-
circa 0.5 mg di ferro. Altrettanto ferro viene eliminato gue dimostrano spesso una carenza marziale. Nelluomo e
attraverso urine, sudore, desquamazione epiteliale e bile, nella donna in menopausa, o senza problematiche di tipo
per cui la perdita giornaliera media di un uomo adulto ginecologico, il tratto gastrointestinale molto spesso
di circa 1 mg al giorno. La donna mestruata ha una ulte- responsabile di perdite ematiche patologiche. Le cause
riore perdita media di ferro. Calcolando che il flusso Fig. 2: pi frequenti di sanguinamento sono: ulcera peptica,
mestruale oscilla tra 25 e 80 ml di sangue, si ottiene che cause principali gastrite, emorroidi, varici esofagee, ernie jatali, poliposi,
la perdita mensile si stima in 17-40 mg e cio circa 1 mg di carenza di ferro langiodisplasia colica, carcinoma gastrico, diverticolosi,
al giorno medio, che aggiunto alle altre perdite fisiologi- (in ordine di frequenza) diverticolo di Meckel, colite ulcerosa, morbo di Crohn,
che comporta una perdita totale di circa 2 mg al giorno.
La gravidanza una ulteriore causa fisiologica di perdita
marziale. La madre perde circa 680 mg di ferro durante
la gravidanza, calcolando la quota ceduta al feto, la
quota ritenuta dalla placenta e dal cordone ombelicale e
la perdita durante il parto. La perdita in gravidanza
aumenta con laumentare della gestazione, per cui si
calcolato che il fabbisogno della gestante risulta di circa
0.8mg al giorno nei primi mesi, 4,4 mg al giorno a met
della gravidanza, fino ad arrivare a 8-9mg al termine
della gestazione.
Non essendo possibile una eliminazione attiva, lassor-
bimento che regola il bilancio del ferro. Lassorbimento
del ferro risulta infatti correlato alla attivit eritropoieti-
ca e ai depositi di ferro. Una dieta bilanciata contiene

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Anemie: aspetti clinici e diagnostici


monografia

adenocarcinoma del colon. E sufficiente una perdita


anche di soli 10-15 mL/die per provocare nelladulto ane-
mia sideropenica. Talora la sideropenia pu essere lunico
segno insidioso di una neoplasia del tratto gastroenteri-
co. La figura 2 riassume le cause pi frequenti di sidero-
penia.Rare cause di perdita marziale sono epistassi fre-
quenti, diatesi emorragiche da difetto congenito emo-
coagulativo (emofilie, piastrinopenie-patie, malattia di
Von Willebrand), teleangectasia ereditaria, emoglobinu-
ria, emorragie polmonari secondarie a bronchiectasia o a
siderosi polmonare idiopatica, ematuria, stillicidio intesti-
nale da infezione da parassiti quali lAnchilostoma ed il
Necator Americanum (sopratutto frequenti nelle regioni
tropicali). Alcune rare carenze marziali possono essere
causate da diminuito apporto.
Questo si verifica nei vegetariani stretti, in quanto seb-
bene frutta e verdura contengano discrete quantita di Fig. 3: trattamento con eritropoietina (per esempio pazienti
ferro, non ne contengono in forme emica, ed possibile anemia chirurgici che debbano effettuare autodepositi di glo-
che il ferro ionico venga chelato da nitrati, fosfati e quin- sideropenica lieve buli rossi concentrati) questa situazione incarna lo
di non assorbito. stato di carenza funzionale in cui sebbene le riserve
Alcuni soggetti sono sideropenici per un meccanismo di di ferro risultino di fatto normali, vi una quota ina-
inadeguato assorbimento del ferro che pu essere dovu- deguata di ferro per far fronte alle aumentate richieste
to ad acloridia, gastrectomia totale o parziale con gastri- da parte delleritrone stimolato. Solo in questi casi si
te atrofica del moncone, morbo celiaco. ritiene corretto avviare terapia di supporto marziale
Nel bambino tra i sei mesi e i tre anni abbastanza fre- nella sideropenia latente.
quente linstaurarsi di una sideropenia come bilancio 2. Sideropenia conclamata senza compromissione delleritro-
negativo tra i depositi di ferro presenti alla nascita e la poiesi: situazione che corrisponde a svuotamento dei
quantit assorbita con la dieta verso le forti richieste per depositi marziali senza ancora compromissione emato-
lincremento della massa corporea e le perdite fisiologiche. logica. Da un punto di vista biochimico caratterizza-
ta da sideremia ridotta, TIBC aumentata, saturazione
4. Fisiopatologia della carenza di ferro e diagnosi della transferrina inferiore al 10% e ridotta ferritina. In
di laboratorio questo caso sempre indicato supporto marziale per
La sideropenia pu essere pi o meno importante e com- ricostituire i depositi.
portare conseguenze pi o meno rilevanti. Infatti lorga- 3. Eritropoiesi sideropenica: lo stato in cui compare la
nismo dapprima contrasta la carenza di apporto richia- riduzione del livello di emoglobina e quindi lanemia.
mando il ferro ferritinico e il ferro dei depositi. Svuotati i Dal punto di vista biochimico si noteranno le stesse
depositi viene sfruttato il ferro circolante che viene sot- alterazioni dello stato precedente: sideremia ridotta,
tratto alla transferrina, poi viene ridotta la sintesi degli TIBC aumentata, saturazione della transferrina inferio-
enzimi contenenti ferro e solo alla fine viene sacrificata la re al 10% e ridotta ferritina. Ovviamente lentit del-
sintesi dellemoglobina. Si distinguono cos diverse fasi: lanemia corrispondente allentit della carenza di
1. Sideropenia latente: costituisce una condizione di dimi- ferro. Leritropoiesi avviene senza la possibilit di sin-
nuzione del ferro plasmatico, senza evidenza di altera- tetizzare una quantit adeguata di emoglobina, per
zioni ematologiche. Da un punto di vista biochimico cui tipicamente verranno prodotti eritrociti ipocromici
caratterizzata da sideremia ridotta, TIBC normale o lie- e microcitici. Nelle forme di anemia pi lievi allosser-
vemente aumentata, saturazione della transferrina vazione con il microscopio ottico si noter solo anisoci-
inferiore al 20% e ridotta ferritina. Non vi anemia, tosi e lieve ovalocitosi (figura 3). Con la progressione
n riduzione del volume delle emazie. Questa situazio- dellanemia si noter una riduzione consensuale del
ne normalmente non richiede supporto marziale. Ma in volume corpuscolare medio (MCV) e del contenuto di
soggetti che, per qualunque motivo siano sottoposti a emoglobina (MCH), mentre le concentrazione eritroci-

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Lanemia sideropenica

lappunto, un rapporto normale. E quindi sempre


opportuno, per evitare falsi negativi, correggere la
carenza marziale prima di eseguire lelettroforesi del-
lemoglobina.
2. Anemia delle malattie croniche: lanemia che si svilup-
pa nelle malattie croniche infiammatorie e nelle neo-
plasie in genere normocitica, ma appare microcitica
nel 20-30% dei casi. La morfologia del sangue perife-
rico spesso non differente dallanemia da carenza di
ferro. Di solito la distinzione si basa sulla riduzione
della TIBC e sul riscontro di valori di saturazione di
transferrina superiori al 15% e di ferritina elevata. Ci
possono essere casi dubbi, perch , come visto, anche
in caso di sideropenia i valori di ferritina possono esse-
re alterati ed in particolare aumentati dallo stato
infiammatorio. In questi casi pu essere utile il dosag-
gio del recettore solubile della transferrina che risulta
taria di emoglobina (MCHC) rimane solitamente stabi- Fig. 4: ridotto nellanemia delle malattie croniche. In partico-
le. Al microscopio compariranno emazie francamente anemia sideropenica lare utile il transferrin receptor-ferritin index defi-
ipocromiche e microcitiche, talora anche con forme biz- conclamata nito come il rapporto tra il recettore solubile della
zarre come ellissociti, forme allungate a sigaro e ber- transferrina e il logaritmo della ferritina, che risulta
sagliociti (figura 4). Sono descritte anche alterazione basso (<1) nellanemia delle malattie croniche ed eleva-
delle piastrine, in particolare trombocitosi, soprattutto to (>4) nella anemia sideropenica.
in caso di perdita cronica, ma anche trombocitopenia e 3. Anemia nellinsufficienza epatica: talora in pazienti
leucopenia. Ovviamente in questo caso indicato il affetti da insufficienza epatica vi pu essere anemia
supporto marziale. ipocromica, ma si riscontra comunemente incremento
della concentrazione di sideremia con TIBC normale o
5. Diagnosi differenziale ridotta e aumento della saturazione della trasferrina
Esistono altre anemie microcitiche ipocromiche oltre a 4. Anemia nellinsufficienza renale: spesso di difficile
quelle dovute a carenza di ferro. In particolare, lanemia distinzione in quanto sideremia e TIBC possono mima-
sideropenica si dovr distinguere da: re il comportamento che hanno nellanemia siderope-
1. Talassemia minor: tutte le talassemie minor sono nica. Nellinsufficienza renale la ferritina spesso ele-
modeste anemie microcitiche, spesso morfologicamente vata, anche nel caso in cui sia concomitante una caren-
indistinguibili dalla anemia sideropenica. Spesso que- za di ferro. In casi estremi, per valutare lo stato mar-
ste forme di talassemia presentano, molto pi fre- ziale di questi pazienti, pu essere utile eseguire un
quentemente di quanto accada della carenza marziale, aspirato midollare per valutare con colorazione specifi-
conte eritrocotarie particolarmente elevate (oltre 5 x ca (blu di Prussia) i depositi di emosiderina.
1012/L). LMCV di regola molto piccolo, tra 60 e 70 fL, Gli elementi differenziativi di queste anemie sono rias-
e costante nel tempo, mentre nellanemia sideropenica sunti nella figura 5.
raggiunge tali valori solo in caso di grave anemia. Nor-
malmente nelle talassemie la misurazione di sideremia, 6. Clinica
TIBC e ferritina non risultano alterati e naturalmente il Lo stato di sideropenia spesso clinicamente silente; i
riscontro allelettroforesi dellemoglobina di incremen- segni ed i sintomi compaiono con la comparsa dellane-
to delle catene globiniche HbA2 o HBF ne permette la mia. Nella grande maggioranza dei pazienti si verifica
diagnosi. E opportuno per ricordare che in caso di una progressione estremamente lenta e graduale della
concomitante sideropenia lelettroforesi dellemoglobi- sintomatologia.
na pu essere falsamente normale in quanto la ridu- Molte caratteristiche cliniche dellanemia sideropenica,
zione di HbA2 da sideropenia pu essere pi marcata quali pallore, astenia, apatia, tachicardia, dispnea da
della riduzione della HbA e quindi pu risultare, per sforzo, facile irritabilit, insonnia e labilit emotiva sono

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Anemie: aspetti clinici e diagnostici


monografia

Fig. 5:
Diagnosi differenziale
delle anemie
microcitiche

comuni a tutte le altre forme di anemia. Occasionalmente si pu verificare gastrite atrofica con
Dal momento che la carenza di ferro coinvolge anche acloridia. Descritta anche atrofia della mucosa vaginale.
molti coenzimi, come i citocromi, le catalasi, le perossida- Entrambi questi ultimi due sintomi possono assumere
si e le metallo-flavoproteine, possono comparire sintomi significato sia di conseguenza che di causa della sidero-
non correlati allanemia. penia stessa.
In particolare sono descritte lesioni a carico della cute,
degli annessi cutanei e delle mucose. La cute diventa 7. Cenni di terapia
secca, anelastica, i capelli sottili, fragili, radi, le unghie Il primo intervento terapeutico deve mirare a correggere
fragili, opache, con striature longitudinali, appiattite e/o le cause delle sideropenia quando questo possibile. Il
concave (coilonichia, cio unghie a forma di cucchiaio). supporto marziale dipende dalla entit della carenza
Lesioni a carico delle mucose interessano particolarmente (figura 6).
il cavo orale e, pi raramente, la faringe. In caso di anemia grave (Hb < 9 g/dL) la quantit media
A livello labiale frequente una stomatite angolare che di ferro da fornire per correggere la carenza risulta di 2,5
pu presentarsi con piccole erosioni e fissurazioni dolenti g corrispondente a 30 giorni di terapia con ferro per via
Fig. 6:
ai lati della bocca; la mucosa orale arrossata, la lingua endovenosa (e.v.), al dosaggio di 100 mg al giorno o a 6
Terapia sostitutiva
tumefatta, liscia, disepitelizzata, lucente e dolente. Spora- mesi di terapia con ferro per via orale (per os), al dosag-
dicamente pu verificarsi anche glossite. gio di 150 mg al giorno.
Se lanemia lieve (Hb compresa tra 9 e 12 g/dL) baste-
ranno 1,8 g di ferro (20 giorni di terapia e.v. oppure 4
mesi di terapia per os). Infine per correggere solo la side-
ropenia senza anemia bisogna fornire circa 1,0 g di ferro
(10 giorni di terapia e.v oppure 2,5 mesi di terapia per os).

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Light Cycler per la prevenzione


del rischio trombotico

La biologia molecolare sta aprendo davvero nuovi oriz- diffusa nella popolazione di origine caucasica, cos come
zonti di possibili utilizzi in campo diagnostico; il range lembolia polmonare (EB) che la complicanza pi temi-
delle offerte con metodologie automatizzate e standar- bile della TVP.
dizzate si amplia continuamente e arriva a coprire anche E difficile fornire stime precise sullincidenza della TVP
quelle indagini che erano appannaggio quasi esclusivo nella popolazione, poich spesso misconosciuta.
dei centri di ricerca. Dati pi precisi, invece, sono disponibili sulla prevalenza
Oggi presentiamo alcune applicazioni della biologia di TVP ed EP in condizioni ad alto rischio, con dati che
molecolare nel settore della coagulazione. sono sorprendenti e preoccupanti, se sottovalutati.
Grazie alla versatilit del sistema LIGHT CYCLER dispo- La tabella 1 mostra lincidenza della TVP in alcune situa-
niamo di alcuni importanti parametri per la valutazione zioni cliniche in pazienti non sottoposti a idonea profi-
del rischio trombotico. lassi.

Trombosi venosa profonda Altre situazioni cliniche sono associate ad aumentato


La trombosi venosa profonda (TVP) una patologia molto rischio di TVP (et avanzata, neoplasie, gravidanze, scom-

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Tabella 1 Poco tempo dopo venne identificata la causa che risiede-


%PVP va in una singola mutazione (Adenina al posto di Guani-
____________________________
na) nel nucleotide 1961 del gene che codifica il fattore V.
Chirurgia generale 15-25 Il fattore V sintetizzato in presenza della mutazione risul-
Chirurgia ortopedica (protesi danca) 50-60 ta avere una sostituzione aminoacidica (Glutamina al
politrauma ca. 65 posto di Arginina) in posizione 506, cio proprio in uno
dei siti di legame con la proteina C attivata.
ictus cerebrale ischemico ca.45
La scoperta del difetto molecolare avvenne in un labora-
infarto del miocardio ca. 25 torio della cittadina olandese di Leiden e per questo
motivo la mutazione viene comunemente chiamata
penso cardiaco, collagenopatie, ecc.) e possono coesistere fattore V Leiden.
e sommarsi in un medesimo individuo in modo da ren-
dere meno prevedibile e comunque amplificato il rischio Mutazione della protrombina
stesso di ipercoagulabilit che il meccanismo patogene- E stata scoperta nel 1996 la mutazione puntiforme (Ade-
tico della TVP. nina al posto di Guanina) in posizione 20210 della regio-
E evidente limportanza di individuare soggetti partico- ne 3 del gene che codifica per la protrombina.
larmente predisposti che possono sviluppare trombosi Tale mutazione comporta un aumento del 30% dei livel-
venose in presenza di cause scatenanti (o anche sponta- li di protrombina che quindi spiegano il meccanismo
neamente) e persino in giovane et. trombogenico della mutazione.
Un traguardo ambizioso sarebbe la valutazione del La mutazione stata riscontrata nel 10% dei casi di
rischio trombotico di qualunque soggetto in procinto di pazienti portatori della mutazione di Leiden.
essere sottoposto ad una situazione a rischio (es. inter-
vento chirurgico) per poter attuare le adeguate misure di Epidemiologia e rischio relativo
prevenzione. Le mutazioni Fattore V e fattore II sono le cause di
Tra i fattori di rischio evidenziati da numerosi studi, quel- trombofilia ereditaria pi frequenti, dieci volte in pi
li di tipo genetico giocano un ruolo cruciale nello svilup- rispetto alle altre anomalie relative alle carenze degli
po della malattia. anticoagulanti naturali.
Tra le anomalie congenite possiamo ricordare le carenze Le stime di rischio riguardanti gli omozigoti, pi raro
degli anticoagulanti naturali quali Antitrombina III, Pro- riscontro rispetto agli eterozigoti, sono molto pi eleva-
teina C, Proteina S, che sono generalmente trasmesse
come carattere autosomico dominante; tuttavia queste
anomalie sono rare nei pazienti con trombosi venosa e
rarirssime nella popolazione generale (meno dell1 %)

Nellultimo decennio la conoscenza dei meccanismi pato-


genetici della TVP migliorata notevolmente grazie alla
scoperta di altre due anomalie della coagulazione: una
mutazione a carico del fattore V ed una mutazione a
carico del fattore II, trasmesse ereditariamente con carat-
tere autosomico dominante e che si traducono in un mec-
canismo di ipercoagulabilit.

Fattore V Leiden
Nel 1993 venne fatta la prima osservazione su alcuni indi-
vidui con TVP, appartenenti alla stessa famiglia, ai quali
il test -aPTT- non veniva prolungato dallaggiunta di pro-
teina C attivata.
Lanomalia venne infatti denominata resistenza alla pro-
teina C attivata.

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Tabella 2 re diagnostiche.
Tale variante comporta un accumulo di omocisteina che
Popolazione Pazienti Pazienti
generale non selezionati selezionati* considerato un fattore di rischio di trombosi sia venosa
che arteriosa.
Fattore V Leiden 3 - 7% 15 - 20% 50%
___________________________________________________________________ Ricerca delle mutazioni
Mutazione della protrombina 2 - 5% 6 - 10% 18% Il venire a conoscenza che il paziente portatore di una
___________________________________________________________________
*selezionati per avere storia famigliare positiva e trombosi in et giovanile (< 45-50anni) mutazione, oltre a chiarire la causa dellevento, ha il van-
taggio di poter ottimizzare la profilassi secondaria della
TVP, in termini di terapia anticoagulante e di necessit di
Tab 2 te, sino a 80 volte per il fattore Leiden., e presumibil-
profilassi delle situazioni a rischio.
Prevalenza delle mente sono allo stesso livello per lomozigosi nel caso
Inoltre, una volta identificata lanomalia trombofilica
mutazioni del della protrombina.
possibile allargare lo studio ai consanguinei: chi risulter
fattore V Per la presenza delle due mutazioni spesso non suffi-
portatore della stessa anomalia potr beneficiare di una
e della protrombina ciente a causare trombosi. Infatti gli individui portatori
prevenzione primaria della TVP nelle condizioni a rischio.
nella popolazione sono asintomatici oppure hanno trombosi in et avanza-
La TVP un evento di per s pericoloso per la vita e ancor
generale e nei pazienti ta e frequentemente in occasione di condizioni scatenanti.
pi poich esiste il problema delle TVP asintomatiche:
con trombosi venosa Linterazione tra fattori genetici e fattori scatenanti
questa mancanza di sintomi pu portare alla EP con esiti
ambientali porta ad aumenti che non sono solo la
anche fatali, senza aver dato segni specifici apprezzabili.
somma dei rischi ma sono moltiplicativi, per cui il rischio
Fino a pochi anni fa la diagnosi di TVP era resa difficile
complessivo ben maggiore.
dalla scarsa disponibilit di mezzi adeguati e per questo
motivo stata sottostimata ed anche curata in modo tar-
MTHFR
divo.
La metilentetraidrofolatoreduttasi (MTHFR) un enzima
Oggi possibile porre con sicurezza e rapidit la dia-
coinvolto nel metabolismo dellaminoacido metionina e
gnosi di TVP ed auspicabile che il medico coinvolto
precisamente interviene nel processo di rimetilazione da
adegui le proprie conoscenze in relazione alle nuove
omocisteina a metionina tramite lintervento della vita-
possibilit diagnostiche atte ad identificare i soggetti
mina B12. Rare mutazioni possono causare deficenza
a rischio.
grave di MTHFR e comparsa di omocisteinemia con sinto-
matologia grave sullo sviluppo psico-motorio e impor-
Light Cycler
tanti fenomeni trombotici.
Per rendere facilmente applicabile questo concetto Roche
Un polimorfismo genetico pi comune, dovuto alla sosti-
Diagnostics dispone del sistema Light Cycler.
tuzione di una Citosina in Timina al nucleotide 677 causa
Un sistema di PCR real-time con kit specifici per la deter-
una riduzione dellattivit enzimatica della MTHFR
minazione delle mutazioni sopraindicate:
(variante termolabile). E condizione piuttosto frequente
Fattore V Leiden, Protrombina, MTHFR.
nella popolazione a livello sino al 40% per quanto
Le determinazioni avvengono in maniera estremamente
riguarda gli eterozigoti e al 10 % come omozigoti: tutta-
rapida e certa su normali campioni di sangue, identifi-
via non semplice da identificare con le normali procedu-
cando le mutazioni puntiformi alla posizione 1691 per il
Tabella 3 gene relativo al Fattore V Leiden, alla posizione 20210 per
la protrombina e 677 per MTHFR
Pazienti Pazienti
Tab 3 non selezionati selezionati* Il sistema Light Cycler in grado di fornire la conferma
Rischio relativo di del prodotto amplificato grazie allinnovativa funzione
trombosi venosa chiamata melting curve analysis, assolutamente specifi-
Fattore V Leiden 5-8 10 - 20
in portatori ___________________________________________ ca per ciascun prodotto.
eterozigoti delle Mutazione In tal modo possibile evidenziare a video il genotipo
della protrombina 3-4 5 - 10
mutazioni del fattore ______________________________________ wildtype il mutante, leterozigote.
V o della protrombina
* selezionati per avere storia famigliare positiva e trombosi in et
Il Light Cycler rende facile e sicura anche lidentifica-
rispetto ai non giovanile (< 45-50anni) zione delle mutazioni
portatori

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Il Light Cycler oggi un sistema moderno, di grande fles-


CARATTERISTICHE PRINCIPALI sibilit analitica, perch consente unampia gamma di
esami possibili, altamente specialistici, anche in diversi
settori, oltre a quelli sopraindicati.
E rapido : - 30-40 cicli di PCR in 20-30 minuti
E sicuro: - reagenti pronti alluso E il sistema adatto ad approcciare indagini molecolari
- Presenza di un controllo in ogni kit particolari quali i test per le mutazioni ed altri ancora.
- Tubi di reazione chiusi Il crescente interesse verso nuovi test una esigenza che
- Nessun rischio di contaminazione soddisfa i bisogni dei laboratori che vogliono differen-
ziarsi, aumentando la qualit e la quantit dei servizi
E specifico: - rileva anche mutazioni puntiformi
offerti ai pazienti.

E innovativo: - PCR real time con monitoraggio on line


- Hybidization Probes e SYBR green format
- miniaturizzazione dei volumi
- Melting curve analysis
E semplice - pochissima manualit
- software user friendly
- minime necessit di disposables
- ingombro ridottissimo
E robusto: - nessuna manutenzione

E affidabile - elevata precisione : 0,3% CV al crossing point


- range dinamico da 10 a 1010 copie-reazione

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Cobas TaqMan 48: alta tecnologia


e semplicit duso

I traguardi raggiunti dalla tecnologia, nelle scienze medi- le: il Cobas TaqMan 48, come vedremo pi avanti, rispon-
che e diagnostiche, sono evidenti: non sempre per evo- de perfettamente a questi requisiti.
luzione tecnologica e semplicit duso vanno di pari passo.
Il Cobas TaqMan 48, strumento concepito per la PCR Real La PCR Real Time con sonde TaqMan
Time in diagnostica, stato sviluppato con un occhio di I test virologici presto disponibili su Cobas TaqMan (HCV,
riguardo allutilizzatore: chi non possiede una diretta HBV, HIV) si basano sul principio delle sonde TaqMan o
esperienza in PCR cinetica pu ottenere fin da subito sonde didrolisi: brevi sequenze nucleotidiche che si vanno
risultati accurati e precisi, mentre lutente esperto pu a ibridare alla sequenza target, a valle del sito di attacco
esplorare tutte le possibilit offerte dallo strumento e dei primer.
sfruttarne al meglio le notevoli caratteristiche. Sulla sonda TaqMan si trovano, a stretto contatto, fluo-
Per i test diagnostici di routine, dove il numero delle rocromo e quencher, legati chimicamente a nucleotidi
richieste notevole, importante poter disporre di un vicini. In tali condizioni la sonda non emette fluorescenza.
sistema che processi i campioni in completa automazione, Ad ogni ciclo di PCR la polimerasi costruisce il nuovo
dalla PCR al risultato finale, nel pi breve tempo possibi- amplificato,incontrando lungo il suo percorso la sonda

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TaqMan, che viene idrolizzata. Solo se i passaggi precedenti hanno avuto esito positivo,
I frammenti si allontanano in soluzione, la miscela di rea- il calcolo del risultato pu procedere:
zione viene illuminata per eccitare il fluorocromo la cui la curva cinetica viene derivata, per evidenziare meglio

fluorescenza, non pi mascherata dal quencher, viene il punto di inizio della fase esponenziale della PCR,
letta e misurata. espresso in n di cicli;
Il risultato una curva cinetica (in figura) che riproduce nuovi controlli sulla forma della derivata, simili ai pre-

landamento della fluorescenza totale, proporzionale alla cedenti;


quantit di DNA amplificato, in rapporto al numero dei cicli rapporto tra curva del target e curva del controllo interno;

della PCR. calcolo del risultato, sia qualitativo che quantitativo.

Per quanto riguarda lultimo punto, va sottolineato che


Analisi e calcolo del risultato in totale automazione tutti i test Cobas TaqMan sono caratterizzati da uneccel-
A questo punto, senza alcun intervento delloperatore, il lente sensibilit e da un range dinamico estremamente
software del Cobas TaqMan elabora i dati raccolti: ampio, vantaggi ottenuti grazie allefficienza della PCR
Real Time, alla precisione della lettura in fluorescenza e
le letture sono processate da un algoritmo brevettato allaffidabilit del software di calcolo.
(risoluzione multicomponente) che elimina le recipro-
che interferenze tra fluorocromi diversi, es. target e con- Con il Cobas TaqMan 48 Roche Diagnostics intende egua-
trollo interno oppure amplificazioni simultanee di pi gliare e superare il successo del Cobas Amplicor, ponendo
target (multiplex); una nuova pietra miliare nellautomazione in PCR grazie
a un sistema che rappresenta lo stato dellarte in termi-
vengono rilevate e automaticamente corrette tutte le ni di versatilit, semplicit duso, affidabilit e sicurezza.
piccole anomalie di forma della curva (spike, rumore di
fondo) che potrebbero alterare i calcoli successivi;

la curva viene ulteriormente analizzata attraverso con-


trolli detti di plausibilit, che prendono in considera-
zione landamento della cinetica (pendenza della linea
basale, monotonia).

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I test disponibili sui sistemi RD


per la diagnostica dellanemia

Lanemia, considerazioni generali Approssimativamente il 50% di tutte le anemie sono


Lanemia, nella sua accezione pi ampia, corrisponde imputabili a carenza di Ferro, infatti il pi alto grado di
allincapacit da parte del sangue di fornire ossigeno ai incidenza della malattia stato riscontrato proprio nelle
tessuti in quantit sufficiente per svolgere le proprie fun- regioni meno sviluppate del mondo a causa di un insuf-
zioni metaboliche. ficiente o inadeguato apporto alimentare.
Lanemia normalmente associata a bassi livelli ematici
di emoglobina oppure ad una diminuzione dellEmatocri- Diagnostica dellanemia
to (rapporto percentuale fra volume dei globuli rossi e Da un punto di vista clinico la diagnosi primaria di ane-
volume del sangue intero). mia viene fatta riferendosi alla storia del paziente, alla
Allanemia da molto tempo viene attribuita una notevo- sintomatologia e ai risultati ematologici dei referti di
le importanza per il fatto che interessa una porzione laboratorio.
molto consistente della popolazione mondiale di tutte le Lanemia pu essere considerata leffetto secondario di
et. E stato calcolato che circa il 30% della popolazione una patologia primaria, il cui riconoscimento richiede li-
mondiale abbia sofferto o stia soffrendo di anemia. dentificazione del meccanismo e delle cause del deficit eri-

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trocitario. Da un punto di vista diagnostico la quota satura viene


La determinazione della causa specifica di una certa ane- misurata direttamente con la determinazione della con-
mia fondamentale perch il medico possa mettere a centrazione plasmatica del Ferro. La restante quota insa-
punto la terapia pi appropriata a quel caso. tura, che deputata alla regolazione dellassorbimento
Nella diagnosi e nel monitoraggio di unanemia giocano intestinale del Ferro, viene misurata specificamente con
un ruolo molto importante i seguenti parametri: test appositi per la UIBC.
Quando tutta la Transferrina risulta satura di Ferro las-
Ferro sorbimento cessa del tutto. La quota insatura della Tran-
Una parte dellossigeno presente nel sangue viene tra- sferrina diminuisce quindi con laumento della sideremia,
sportato dalla emoglobina. e risulta in aumento invece in condizioni di sideropenia.
Questa quota risulta direttamente influenzata da fattori
come la concentrazione di ossigeno e di CO2, il pH ema- Ferritina
tico e la temperatura corporea. Lemoglobina una pro- Il Ferro viene immagazzinato nelle cellule del fegato, della
teina ematica costituita da quattro catene proteiche con milza, del midollo spinale e della mucosa intestinale,
quattro gruppi eme, ciascuno di questi, contenendo Fe 2+ sotto forma di Ferritina. Questa una macromolecola
in grado di legare una molecola di Ossigeno. proteica la cui struttura quaternaria permette di imma-
La concentrazione plasmatica del Ferro (Ferro non-attivo) gazzinare nel suo interno un numero molto elevato di
e la sua distribuzione nellorganismo risultano di fonda- atomi di Ferro.
mentale importanza nel profilo desami utile alla dia- La sintesi della Ferritina viene stimolata dalla quantit di
gnosi o al monitoraggio dellanemia. Ferro intracellulare e il dosaggio della sua concentrazione
I disturbi metabolici del Ferro, dovuti a carenza o a catti- ematica risulta indicativo principalmente per una valuta-
va distribuzione, sono tra le malattie pi comunemente zione clinica delle riserve corporee di Ferro.
esaminate e mal interpretate dai clinici.
In un organismo sano adulto ci sono, in totale, circa 3 - Recettori solubili della Transferrina
5 gr. di Ferro, questa quantit dipende direttamente dal- Il recettore della Transferrina una glicoproteina dimeri-
lequilibrio fra assorbimento intestinale e perdite corpo- ca bivalente. La sua funzione legata allassorbimento
ree. Il metabolismo del Ferro viene generalmente consi- del Ferro da parte delle cellule eritropoietiche.
derato un sistema chiuso, dato che gli scambi con lester- Questo avviene tramite un legame specifico che i recetto-
no rappresentano meno dello 0.05%. ri formano sulla superficie cellulare con la Transferrina
Nellorganismo umano il Ferro totale pu essere diviso in satura di Ferro e con linglobamento degli atomi del
tre frazioni, fra loro funzionalmente e strutturalmente metallo per endocitosi mediata dai recettori stessi.
diverse: Quando le riserve endocellulari di Ferro si abbassano la
1) Ferro attivo del gruppo eme
2) Ferro plasmatico di trasporto
3) Ferro di deposito

Transferrina e Capacit Ferro-Legante Totale


e Insatura
Il Ferro nel plasma presente sostanzialmente solo in
forma legata. La proteina di trasporto che veicola il Ferro
nellorganismo la Transferrina. Ogni molecola di questa
proteina presenta due siti di legame per il Ferro, quindi
nel plasma si pu trovare in forma BI-ferrica, MONO-fer-
rica o APO-ferrica (priva di atomi di Ferro).
La TIBC (Total Iron Binding Capacity) rappresenta la
Capacit Ferro-Legante Totale mentre la UIBC invece la
quota insatura della stessa capacit.
Normalmente la quota satura solo di 1/3, mentre 2/3
restano invece insaturi (quota insatura).

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quantit dei recettori della Transferrina aumenta propor-


Elenco Sistemi Hitachi di C.C. Sistemi Hitachi di IMM. Sistemi INTEGRA
zionalmente. La proteolisi porta alla liberazione nel pla- dei parametri H.912/917/Mod. P800 H.2010/Mod. E170 400 PLUS/800
_________________________________________________
sma dei recettori solubili della Transferrina (sTfR). La con-
Ferro
centrazione plasmatica della forma solubile risulta diret- _________________________________________________
tamente proporzionale alla concentrazione del recettore UIBC/TIBC
_________________________________________________
di membrana. Transferrina
_________________________________________________
Ferritina
Aptoglobina _________________________________________________
La Aptoglobina una proteina che ha funzione di tra- Recettori TfR
_________________________________________________
sporto nei confronti della Emoglobina. Aptoglobina
_________________________________________________
La piccola quantit di Emoglobina che si libera nel san-
Ceruloplasmina
gue in condizioni normali viene legata appunto allApto- _________________________________________________
globina. Una riduzione del livello plasmatico di Aptoglo- Vitamina B12
_________________________________________________
bina libera indice di emolisi intravascolare. Acido Folico
serico ed eritrocitario
Ceruloplasmina
Di questa proteina stata dimostrata una attivit ferro-
I benefici di un ricco pannello integrato sui sistemi
ossidasica.
di analisi RD
Svolge infatti una importante funzione come acceleratore
Roche Diagnostics con i suoi sistemi analitici di chimica
della velocit di ossidazione dello ione ferroso (forma di
clinica e di immunochimica (linea strumentale Hitachi e
deposito) in ione ferrico (forma di trasporto). Linteresse
INTEGRA) offre un ampio pannello di test, che, parallela-
diagnostico della Ceruloplasmina, per quanto riguarda il
mente ai parametri ematologici, permette la realizzazio-
metabolismo del Ferro, legato alla ossidazione di que-
ne di un quadro clinico molto ricco per la diagnosi e il
sto metallo dopo il suo rilascio da parte dei siti di depo-
monitoraggio delle anemie.
sito, e quindi alla sua disponibilit per il legame con la
Il carico di lavoro, il TAT (turn around time), lautomazio-
Transferrina.
ne dei test e la riduzione dei costi sono punti essenziali
per il laboratorio.
Vitamina B12 e Acido Folico
Un maggior grado di consolidamento dei test che fanno
Vitamina B12 e Acido Folico giocano un ruolo molto
parte del profilo diagnostico dellanemia, sui sistemi
importante nella sintesi proteica.
automatici del laboratorio, permette ai laboratoristi di
Un abbassamento dei livelli serici di queste due sostanze
produrre risultati analitici in minor tempo e con maggior
pu determinare nei globuli rossi unalterazione del
accuratezza, e ai clinici di inquadrare meglio la patologia
metabolismo e quindi una ridotta capacit di rigenera-
predisponendo pi mirati interventi terapeutici.
zione.
Carenza di Vitamina B12 e Folati causa diretta di anemia.

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Roche Diagnostics per la coagulazione:


Affidabilit, Innovazione e Libert

Il settore della Coagulazione richiede professionisti attenti e capaci in grado di orientare un settore che nel laboratorio
ancora in fase di crescita.
Le nuove tecnologie affiancano cos quelle gi consolidate e generano un modello che risponde alle moderne esigenze
gestionali del laboratorio.
In questo panorama Roche Diagnostics si propone come azienda fortemente impegnata nel settore offrendo ai suoi Clien-
ti un mix tra reagenti e strumenti di elevata qualit. Ci permette di soddisfare diversi bisogni: eseguire al meglio la rou-
tine di laboratorio, approfondire i test coagulativi tramite la biologia molecolare, applicare la diagnostica coagulativa nei
reparti ed arrivare sino allautomonitoraggio dello stesso paziente.
LAffidabilit del dato clinico garantita da un sistema di misura brevettato utilizzato dai propri strumenti ad alta tec-
nologia, flessibili ed utilizzabili da qualsiasi laboratorio.
LInnovazione rappresentata sia dalla evoluzione continua dei reagenti e degli strumenti per il laboratorio di coagula-
zione di routine sia nellambito dellapprofondimento diagnostico per lo studio delle mutazioni genetiche strettamente cor-
relate, ad esempio alle trombofilie come nel caso del Fattore V di Leiden e il Fattore II.
In quest ultimo caso Roche Diagnostics mette a disposizione innovativi test in PCR Real Time.
La Libert viene offerta al paziente attraverso i sistemi di Self Monitoring, che rendono il possessore pi autonomo nel
controllo della terapia. Libert che viene anche offerta al clinico che pu muoversi nei reparti o nel proprio doctor office
mantenendo la certezza della qualit del risultato sia per il controllo della terapia anticoagulante (PT) sia per parametri
durgenza come il D-Dimero.

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La piena realizzazione
del progetto Modular

Nel numero 10 di ESADIA, pubblicato a Maggio 2002, Il Modular SWA rappresenta la possibilit di avere, in un
sono state ripercorse le prime tappe seguite dal proget- unico sistema, moduli di chimica clinica (moduli D o P) e
to Modular. moduli di immunochimica (moduli E).
Tale progetto prevedeva lintroduzione sul mercato del Lacronimo S.W.A. sta per Serum Work Area (area di
sistema Modular SWA passando attraverso due fasi lavoro del siero) e il Modular SWA rappresenta la massi-
distinte. Le due fasi comprendevano lintroduzione ma espressione di consolidamento su un unico sistema
sequenziale dapprima dei sistemi Modular di chimica cli- analitico dei test eseguibili su un campione di siero.
nica (Modular D e P), proposti al mercato a partire dal
1999, e successivamente dei sistemi Modular di immuno- La Serum Work Area comprende infatti tutti quei setto-
chimica (Modular E), proposti a partire dal 2001. ri analitici nei quali pu essere potenzialmente impiega-
Nella seconda met del 2002 si arrivati al completa- to il siero per la determinazione di esami, spaziando dai
mento della terza e ultima fase del progetto Modular test di Chimica Clinica, Elettroliti, Proteine specifiche, Far-
che rappresentata dallintroduzione sul mercato del maci e Droghe dAbuso, agli Ormoni, ai Marcatori Tumo-
sistema Modular SWA. rali, alle Malattie Infettive e ai Marcatori Cardiaci.

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In un mercato in cui la complessit e la molteplicit delle errore e permette una migliore tracciabilit del campione.
richieste di analisi ha portato ad un progressivo aumen- Il migliore e pi razionale utilizzo del personale di labo-
to dei sistemi analitici dedicati a diverse tipologie di test, ratorio (sia tecnico che laureato) da maggior spazio ad
il sistema Modular, e in particolar modo il Modular SWA, altre attivit quali la didattica, la formazione, la sicurez-
risponde contrastando questa tendenza e proponendo un za e il controllo di qualit.
unico sistema analitico in grado di gestire tutte queste Tutto questo stato possibile anche nei laboratori in cui
richieste. ad un Modular di chimica clinica stato aggiunto un
Consolidare pi aree analitiche in una significa ridurre il modulo di immunologia, permettendo di ottenere tutti i
numero di provette per singolo campione, minimizzare vantaggi fin qui descritti, senza impatti negativi sulla
gli errori pre-analitici e post-analitici, semplificare il flus- gestione routinaria del laboratorio.
so dei campioni nel laboratorio, gestire un minor nume-
ro di strumenti analitici, aumentare la produttivit ridu-
cendo il Turn Around Time (TAT), migliorare la congruen-
za dei dati analitici, ridurre ed ottimizzare gli investi-
menti e i costi di gestione del laboratorio oltre che ridur-
re il numero di fornitori e semplificare le procedure TUTTE PER UNO

amministrative.
Modular SWA, dalla seconda met del 2002, ad oggi
stato introdotto in un elevato numero di laboratori. Si
tratta di realt molto diverse tra loro, pubbliche e priva-
te, con carichi di lavoro ed esigenze naturalmente molto Chimica Clinica Proteine Specifiche

diverse.
Modular SWA ha fornito in ognuna di queste realt una
soluzione ottimale, perch per ognuna di esse stata pro-
posta la configurazione di moduli e di test che pi si I
TUTT
adattata alle richieste del cliente. PER
SWA
Immunochimica Immunochimica
Per il Modular, infatti, a differenza di quanto succede con
gli strumenti non modulari, non esiste una risposta
unica alle necessit del laboratorio. La composizione dei
moduli e il pannello dei test possono essere modificati a Modular SWA stato proposto ai laboratori solo dopo
piacere. E inoltre, possibile implementare il sistema, in che i sistemi separati di chimica clinica e di immunologia
tempi successivi, aggiungendo uno o pi moduli o modi- avevano dimostrato affidabilit e qualit. Le installazioni
ficando il tipo di moduli gi presenti, senza tuttavia del Modular SWA eseguite ad oggi stanno dimostrando
incorrere in tutti gli svantaggi che si hanno quando si che lunione di questi sistemi ha portato alla stessa affi-
cambia la strumentazione (utilizzo di reattivi diversi, dabilit e qualit, caratteristiche consolidate dei sistemi
software diversi, training del personale). RD/Hitachi.
In tutti i casi, i vantaggi portati da Modular SWA sono
principalmente di tipo organizzativo e, a ricaduta, econo-
mico.
I laboratori hanno quindi, la possibilit di trasferire su un
unico strumento test che vengono eseguiti su strumenta-
zioni diverse.
Questo permette di ridurre il tempo dedicato al training
del personale e, permettendo nel contempo, un miglior
utilizzo dello stesso strumento da parte di pi persone
(vedi urgenze).
Il consolidamento di pi test rende possibile un notevole
risparmio di provette, semplifica le procedure di accetta-
zione e di prelievo ai reparti, riducendo le possibilit di

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Cobas Integra 400 plus e Abuscreen OnLine


a
di II generazione: il non plus ultra
per lo screening delle droghe dabuso

Il problema droga allalba del nuovo millennio non e psicofarmaci.


accenna a ridursi: le statistiche mostrano anzi un preoc- Nel complesso le statistiche evidenziano un incremento
cupante incremento del fenomeno, a fronte di una mino- degli utilizzatori di droghe: a fronte di un calo nel con-
re attenzione dei media e dellopinione pubblica. Si sumo di eroina, cresce invece notevolmente il consumo di
assistito infatti nellultimo decennio ad una progressiva cocaina, cannabinoidi ed ecstasy, con una sempre mag-
normalizzazione del fenomeno: alle piazze dello spaccio giore diffusione di queste sostanze fra i minorenni.
si sono sostituite nuovi innumerevoli punti di smercio pi Ed in particolare sui giovani e giovanissimi che si devo-
silenziosi e meno visibili. Il mercato si diversificato, riu- no concentrare gli sforzi di tutti gli operatori del settore
scendo a trasformare le droghe in beni di consumo. Il affinch luso occasionale di droga non abbia tempo e
consumatore ha oggi una vasta scelta di sostanze fra modo di trasformarsi in abuso e dipendenza.
cui scegliere, legali ed illegali insieme, e la poliassunzio- A questo proposito, il laboratorio analisi stesso riveste un
ne una pratica sempre pi diffusa. I cocktails sono costi- ruolo molto importante, che non limitato alla sola
tuiti da droghe classiche, come cocaina o cannabinoidi, identificazione di consumatori abituali e cronici o al
da droghe emergenti, come lecstasy, oltre che da alcool monitoraggio delleventuale trattamento terapeutico cui

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essi sono sottoposti, ma anche e soprattutto di diagno-


si precoce dei nuovi utilizzatori occasionali.
La probabilit che i primi contatti di una persona con le
sostanze dabuso non abbiano seguito, sono maggiori
tanto prima si riesce ad intervenire con adeguato soste-
gno ad opera anche dei diversi attori sociali.

Il dosaggio delle sostanze dabuso nei campioni biologici


rappresenta un valido strumento a questo scopo, se in
grado di evidenziare con certezza lavvenuta esposizione
del soggetto in esame con la sostanza.E quindi indispen-
sabile eseguire analisi cromatografiche, che risultano
per particolarmente complesse e costose.
E pertanto di primaria importanza poter disporre di un
test preliminare di screening dotato di un alto livello di
specificit e che sia sufficientemente semplice da automa-
tizzare, al fine di analizzare un alto numero di campioni
in modo efficiente ed economico. banza del campione. Nel caso in cui nel campione pre- Fig. 1
E in questo contesto che si inserisce la ormai trentenna- sente la sostanza target (positivo), questultima compete
le attivit di Roche Diagnostics, impegnata a sviluppare con le microparticelle per gli anticorpi liberi. Come conse-
tecnologie nel settore droghe dabuso che siano rispon- guenza, la sostanza target lega lanticorpo impedendo
denti alle crescenti aspettative di qualit e praticit del cos la formazione di macroaggregati e lassorbanza viene
laboratorio di tossicologia. proporzionalmente ridotta in funzione della concentra-
Con il marchio Abuscreen, Roche Diagnostics si fatta zione della droga presente (Fig. 1 e 2).
conoscere presso gli operatori del settore a partire dal Attraverso questo meccanismo dazione, con Abuscreen
1972 con una innovativa, per quel periodo, linea di rea- OnLine possibile misurare un ampio range di concen-
genti per il dosaggio delle droghe dabuso in RIA (Radio trazioni per le diverse sostanze ricercate, con un bilancia-
Immuno Assay) in grado di offrire ai pionieri di questo mento ottimale fra sensibilit e specificit, tale da garan-
tipo di indagini il primo sistema di analisi applicabile in tire una elevata capacit discriminante intorno hai valori
routine. Fino alla dismissione di questa linea, avvenuta decisionali.
nel 1997, il metodo veniva giudicato dagli utilizzatori La diffusione della luce regolata da una funzione mate- Fig. 2
molto affidabile nello screening urinario e nelluso medi-
co-forense.
Nel 1991 Roche Diagnostics introduce sul mercato la linea
Abuscreen OnLine, basata sulla tecnologia KIMS (Kinetic
Interaction Microparticles in Solution) messa a punto nei
propri laboratori di ricerca negli Stati Uniti. Questa tec-
nologia, continuamente, aggiornata negli anni, presenta
notevoli vantaggi sia dal punto di vista analitico che di
praticit operativa non solo rispetto ai metodi RIA, ma
anche rispetto ai metodi EIA lanciati agli inizi degli anni
80.
I reagenti OnLine sono applicati su entrambe le linee dei
sistemi Integra e Hitachi di Roche Diagnostics.
Essi sono basati su un metodo immunochimico in fase
omogenea, e su un principio di competizione. Quando un
campione negativo, gli anticorpi liberi si legano con le
microparticelle con adesa la droga in esame, dando ori-
gine a macroaggregati in grado di aumentare lassor-

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matica, in base alla quale tanto maggiore la dimensio- disponibile il Metadone II.
ne delle particelle tanto maggiore sar la luce dispersa. La seconda generazione costituisce un ulteriore migliora-
Sulla base di questo principio facile intuire che la for- mento delle performances dei test.
mazione di aggregati particellari consente uno scattering La nuova formulazione del reagente di seconda genera-
di luce elevato e quindi particolarmente sensibile. zione, in cui lanticorpo adeso alla superficie delle
Lelevata pendenza della curva di calibrazione garantisce microparticelle e non pi in soluzione nel reagente,
uneccellente discriminazione in particolare in prossimit migliora la stabilit del reagente, che per il metadone
del cut-off. Lelevata accuratezza comporta un minor sar di ben 12 settimane a bordo degli analizzatori Inte-
numero di campioni da inviare allanalisi di conferma, gra 400 plus e Integra 800.
con un notevole risparmio per il laboratorio, sia per I miglioramenti non sono solo di ordine pratico e gestio-
quanto riguarda i costi che i tempi di risposta. nale, ma incidono anche sulla qualit dei risultati, grazie
Laggregazione di microparticelle in soluzione rende il ad un incremento di precisione:
test estremamente robusto poich lavvenuta reazione
Oppiacei Metadone
comporta un vero e proprio cambio dello stato fisico nella _____________________________________________
soluzione. Precisione Nella serie Tra serie Nella serie Tra serie
_____________________________________________
La tecnologia KIMS mostra, inoltre, una notevole robu- I generazione 2,5% 4% 3% 4%
stezza nei confronti delle sostanze adulteranti che pi _____________________________________________
comunemente vengono utilizzate per negativizzare i cam- II generazione 1,8% 3,1% 2% 2,5%

pioni. A fronte di campioni adulterati il comportamento


dei test Online non subisce mediamente variazioni (nes- Da segnalare inoltre una miglior specificit e sensibilit
sun effetto), ad eccezione di alcune sostanze particolar- degli OnLine di IIa generazione, oltre che unaumentata
mente aggressive che inducono a risultati positivi, corret- linearit, come mostra la tabella, che riduce ripetizioni e
tamente classificati alla successiva analisi di conferma diluizioni.
(Fig. 3).
Un altro importante vantaggio della tecnologia KIMS Linearit Oppiacei Metadone
___________________________________________
lassenza di effetto gancio, a conferma di una totale affi-
I generazione 600 ng/ml 600 ng/ml
dabilit e sicurezza del risultato. ___________________________________________
Ad ulteriore supporto dellinteresse di Roche Diagno- II generazione 2.000 ng/ml 2.000 ng/ml
stics per questo settore, sta per essere immessa in com-
mercio la seconda generazione dei reagenti OnLine, che Inoltre, in virt del fatto che gli OnLine di IIa gen. sono
sostituir, entro il prossimo anno la linea attuale per bi-reattivi, mentre la generazione precedente era tri-reat-
lo screening delle droghe dabuso. Il primo test della tiva, la produttivit dei sistemi Integra nel dosaggio delle
2 generazione (Oppiacei II) gi in commercio da droghe dabuso viene ad essere raddoppiata: Cobas Inte-
tempo e a partire dal mese di giugno prossimo sar gra 400 plus ora in grado di produrre 300 risultati
allora, mentre Cobas Integra 800 ne produce 600!.
Risulta evidente che la linea Cobas Integra in grado di
Adulterante esito
soddisfare le esigenze di ogni tipologia di laboratorio
analisi, offrendo sistemi adeguati al carico e alla moda-
Sale nessuno
_____________________________________ lit di lavoro di ogni laboratorio.
Aceto nessuno Per quanto riguarda il laboratorio di tossicologia o
_____________________________________
comunque il laboratorio che sceglie di dedicare un siste-
Proteine nessuno ma allo screening delle droghe dabuso, Cobas Integra
_____________________________________
Aspirina nessuno 400 plus, in particolare, il sistema ideale in grado di
_____________________________________
sostenere un carico di lavoro fino a 100.000 determina-
Benedril nessuno zioni allanno. Per carichi superiori, il sistema pi indica-
_____________________________________
Glutaraldeide positivo to Cobas Integra 800.
_____________________________________ E ci grazie allintegrazione di 4 tecnologie in un unico
Candeggina positivo sistema:
_____________________________________
Fig. 3 - assorbanza per la determinazione di enzimi e substrati,

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fra cui la creatinina nelle urine per la valutazione del- mesi). In virt di ci, le calibrazioni sono richieste solo al
lintegrit del campione cambio di lotto e a parit di lotto, ogni 12 settimane.
- potenziometria diretta ed indiretta per la determinazio- Per diversi test vi la possibilit di scegliere fra cut-off
ne di sodio, potassio, cloro e litio diversi, a seconda delle esigenze del cliente, con la dispo-
- turbidimetria per la determinazione delle droghe dabuso nibilit di controlli multiparametrici con concentrazioni
- fluorescenza polarizzata per il monitoraggio terapeutico coerenti ai cut off in uso.
di un pannello completo di farmaci, fra cui benzodiaze- Per laboratori che invece scelgono di consolidare lanalisi
pine e barbiturati nel siero, oltre che salicilati e aceta- delle droghe con la routine di chimica clinica, Cobas Inte-
minofene gra 800 pu rispondere molto bene alle esigenze di un
Cobas Integra 400 plus consente lesecuzione di un pan- laboratorio di medie dimensioni, mentre Modular la
nello completo di Droghe dabuso con la possibilit di soluzione per grosse routine.
estendere la misurazione ai parametri di tossicologia sie-
rica. Roche Diagnostics conferma in modo tangibile linteresse
Il sistema semplice da utilizzare, pronto alluso 24 ore che ha sempre rivestito in questo settore, investendo
su 24 e consente una sicurezza totale del risultato grazie costantemente nella ricerca per poter garantire agli ope-
alle cuvette monouso che evitano qualsiasi tipo di trasci- ratori del settore una sempre migliore e rinnovata offer-
namento, al sensore di coaguli che assicura una corretta ta, orientata ai criteri di qualit e convenienza organizza-
dispensazione del campione ed al nuovo sistema ICVC tiva per il laboratorio.
(Integrated Cassette Volume Check) che garantisce la cor- Ci auguriamo in questo modo di poter dare un contribu-
retta dispensazione dei reagenti. to positivo nella gestione delle problematiche complesse
A ci dobbiamo aggiungere le caratteristiche di conve- che il laboratorio di tossicologia deve affrontare quoti-
nienza operativa dei reagenti OnLine, che rendono Cobas dianamente.
Integra 400 plus davvero ineguagliabile. I reagenti, liqui-
di e pronti alluso, sono caratterizzati dalla pi elevata
stabilit a bordo presente oggi sul mercato (dai 2 ai 3

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NT-proBNP: il contributo del Laboratorio


nello Scompenso Cardiaco
gia risulta spesso difficile da diagnosticare, in quanto la
sintomatologia caratteristica, quale mancanza di fiato,
gonfiore agli arti inferiori ed affaticamento non affat-
to specifica della patologia e, nei casi pi lievi, pu ri-
sultare addirittura assente.
Oggi circa il 2 % della popolazione occidentale (circa 10
milioni di persone) soffre di scompenso cardiaco sinto-
matico, ed una situazione ancor pi critica si ritrova nei
soggetti con oltre 70 anni, dove la prevalenza pu arri-
vare fino al 10 %.
Le spese ospedaliere costituiscono quindi una quota rile-
vante dellonere economico correlato a questa patologia,
dal momento che essa altera profondamente sia la qua-
lit della vita che laspettativa di vita dei pazienti pi
gravi, provocando di conseguenza un costante aumento
dei ricoveri e delle degenze ospedaliere.
I mezzi abitualmente utilizzati dai medici per una dia-
gnosi iniziale di scompenso cardiaco sono lesame fisico
del paziente, lECG ed i raggi X al torace, anche se di re-
Lo scompenso cardiaco la risultante di numerose condi- cente sono state introdotte tecniche pi sofisticate, ma
zioni cliniche quali malattie coronariche e sue conse- molto specialistiche, quali lecocardiografia, langiografia
guenze (ad es. infarto miocardico), ipertensione, difetti nucleare e la risonanza magnetica cardiaca.
alle valvole e affezioni primarie del muscolo cardiaco. Nessuna di queste tecniche tuttavia, nella pratica clinica
Le pi frequenti cause di insufficienza ventricolare sini- quotidiana, risultata essere completamente affidabile e
stra restano comunque lipertensione e le malattie coro- totalmente applicabile per una diagnosi precoce di di-
nariche. Lo sviluppo dellinsufficienza cardiaca general- sfunzione ventricolare.
mente lento ed una forma asintomatica pu richiedere Anche lattuale gold standard, e cio lecocardiografia,
anni prima di essere riconosciuta, poich nella prima presenta infatti alcuni inconvenienti poich necessita
fase della malattia si verifica una ipertrofia del muscolo della disponibilit costante di attrezzatura adeguata
cardiaco che consente una eiezione non scompensata del oltre che di personale altamente qualificato (con costi
sangue dal ventricolo sinistro. Questo evento chiamato elevati), e non neppure utilizzabile sulla totalit dei
disfunzione diastolica del ventricolo sinistro. potenziali pazienti (presenza di adiposit o di enfisema).
Quando la patologia progredisce si verifica poi una dila- Nonostante i significativi sviluppi nella comprensione
tazione del ventricolo sinistro associata ad una della fisiopatologia e nel trattamento dello scompenso
ridotta frazione di eiezione. cardiaco, esso rappresenta ancora uno dei problemi sani-
Questo evento chiamato disfunzione sistolica del ven- tari in cui le esigenze mediche non sono state completa-
tricolo sinistro. Ed a questo stadio della malattia che i mente soddisfatte (Tab.1)
pazienti diventano frequentemente sintomatici.
Lo scompenso cardiaco costituisce oggi uno dei maggiori Le nuove Linee Guida Europee (ESC Guidelines)
problemi sanitari mondiali ed anche la sola patologia Per venire incontro a tali esigenze, la European Society
cardiovascolare la cui prevalenza ed incidenza sono in of Cardiology nel 2001 ha istituito una apposita task
continuo aumento. Nelle sue fasi iniziali questa patolo- force avente lobiettivo di definire proprio le nuove

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Linee Guida per la Diagnosi ed il Trattamento dello Tabella 1


Scompenso Cardiaco Cronico (ESC Guidelines). ESIGENZE MEDICHE PER LO SCOMPENSO CARDIACO
Il risultato di questo lavoro stato pubblicato sullEuro-
pean Heart Journal ed ha, tra laltro, per la prima volta Un test obiettivo ed affidabile per lidentificazione dei pazienti con disfunzione
introdotto limpiego sistematico dei Peptidi Natriuretici ventricolare (sistolica e diastolica), in particolare dei pazienti nello stadio iniziale
quale supporto al processo diagnostico per lo Scompen- della patologia.
____________________________________________________________________
so Cardiaco.
Nello scompenso cardiaco infatti, i livelli presenti nel Un marcatore pi accurato per la stratificazione del rischio nei pazienti con
sangue dei Peptidi Natriuretici Cardiaci ANP e BNP risul- scompenso cardiaco cronico.
____________________________________________________________________
tano sensibilmente aumentati (proporzionalmente al
grado dello scompenso) a causa del sovraccarico volume- Un test semplice e riproducibile per il monitoraggio della terapia, che permetta
trico e dellaumentata pressione nel miocardio. di ottimizzare ed affinare il trattamento stesso.
Poich poi il BNP viene rilasciato principalmente dal
ventricolo (mentre lANP dallatrio), esso risulta essere
anche il marcatore pi specifico nei confronti di una so- diatamente scisso da una proteasi nel frammento N-Ter-
spetta disfunzione ventricolare (Fig 1). minal proBNP (NT-proBNP) e nel peptide BNP biologica-
mente attivo (Fig.2).
Questo fatto pu rivelarsi estremamente utile ai fini dia- Lemivita in vivo di NT-proBNP e di circa 60-120 minuti
gnostici, ed stato infatti recepito dalle Linee Guida ed pertanto pi elevata rispetto a quella di BNP che
(ESC Guidelines) emanate dalla European Society of Car- inferiore ai 20 minuti.
diology. Numerosi studi hanno evidenziato che la concentrazione
Queste hanno indicato proprio nella determinazione di BNP e di NT-proBNP risulta aumentata nei pazienti
preliminare dei Peptidi Natriuretici, unitamente o in al- con disfunzione ventricolare, e che il livello di questi
ternativa ai tradizionali ECG e RX torace (gi diffusamen- marcatori risulta direttamente correlato con la gravit
te utilizzati per la ricerca di danni al miocardio) la discri- dello scompenso cardiaco.
minante per decidere se effettuare o meno sul paziente Poich stato anche dimostrato che il 50% circa dei
un accertamento diagnostico pi approfondito, con lim- soggetti con insufficienza respiratoria presenta sintomi
piego di tecniche strumentali pi sofisticate quali leco- del tutto simili a quelli dello scompenso, pur in totale
cardiografia, la risonanza magnetica o langiografia nu- assenza di una patologia cardiaca, diviene spiegabile
cleare, oppure se ricercare le cause in altre direzioni sulla come mai una elevata percentuale (attorno al 40%)
base dei sintomi presenti. delle diagnosi iniziali di Scompenso Cardiaco non risulti
Un elevato livello dei Peptidi Natriuretici sar infatti in- poi confermata dagli accertamenti diagnostici strumen-
dicativo della presenza di una sottostante disfunzione tali pi approfonditi eseguiti successivamente. Fig 1
cardiaca, ma richieder necessariamente indagini pi ap-
profondite per una conferma della diagnosi.
Viceversa, un livello normale dei Peptidi Natriuretici ten-
der virtualmente ad escludere la presenza di una di-
sfunzione cardiaca, dal momento che stato dimostrato
il loro elevato valore predittivo negativo.

N-Terminal proBNP
Il BNP (Brain Natriuretic Peptide), cos denominato per-
ch originariamente rinvenuto nel cervello di maiale
(anche se prodotto prevalentemente nei ventricoli car-
diaci) viene sintetizzato sotto forma di pro-ormone de-
nominato appunto proBNP.
Dopo stimolazione dei cardiomiociti, ad esempio a se-
guito di distensione delle pareti ventricolari, il pro-or-
mone proBNP viene rilasciato in circolo e quindi imme-

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Prestazioni del test Elecsys ProBNP


Automazione completa sui sistemi Elecsys e Modular
E170
Durata del test in solo 18 minuti

Elevata sensibilit analitica (5 pg/ml) e funzionale

(< 50 pg/ml)
Ampio intervallo di misura, fino a 35.000 pg/ml senza

diluizione
Notevole precisione analitica intra ed inter-assay

(CV inferiori al 4%)


Eseguibile su siero oppure plasma con eparina od EDTA

Perch Roche Diagnostics ha scelto NT-proBNP


e non BNP ?
NT-proBNP si distingue dagli altri peptidi natriuretici per
alcune caratteristiche esclusive che lo rendono estrema-
mente pi pratico nellimpiego diagnostico e quindi pre-
Fig 2 Dal momento per che la presenza di determinati sinto- feribile per lo sviluppo di un test destinato a divenire,
mi costituisce spesso il principale indicatore per decidere molto probabilmente, di impiego routinario in ogni la-
il trattamento di un paziente, pu talvolta accadere che boratorio.
soggetti sintomatici, ma esenti da qualsiasi disfunzione Una licenza esclusiva stata pertanto acquisita da Roche
cardiaca, vengano dai Medici di base inutilmente indirizzati Diagnostics per lo sviluppo e la commercializzazione del
ad ulteriori accertamenti cardiologici, oppure direttamente test immunologico Elecsys ProBNP per il dosaggio del
sottoposti ad una specifica terapia per lo scompenso. frammento NT-proBNP che, pur vantando un analogo si-
gnificato clinico ed impiego diagnostico, presenta nume-
Per tali motivi il dosaggio di NT-proBNP pu rivelarsi di rosi vantaggi rispetto al peptide BNP :
grande aiuto per:
Minor variabilit biologica intra-individuale
Escludere (o confermare) una diagnosi iniziale di di- Concentrazione nel sangue da 10 a 100 volte pi elevata
sfunzione cardiaca in soggetti con sintomi tipici dello Pi lunga emivita in vivo ( 1 - 2 ore )

scompenso. Minima dipendenza dalle modalit del prelievo

Stratificare il rischio nei pazienti scompensati cronici Miglior stabilit in vitro fino a 3 giorni a temperatura

Valutare il rischio di morte nei pazienti con sintomi di ambiente e 5 giorni a 4 - 8 C


una Sindrome Coronarica Acuta (SCA) Nessun problema per conservazione e trasporto dei

Guidare il trattamento terapeutico del paziente, evi- campioni


tando nel contempo casi di eccessi di trattamento Completamente automatizzabile, anche congiunta-

sulla base di un semplice sospetto e non della effettiva mente agli altri marcatori cardiaci
presenza di uno scompenso cardiaco. Facilmente integrabile nel normale flusso di lavoro di

ogni laboratorio.
Il test Elecsys ProBNP In conclusione, il valore del test Elecsys ProBNP, che il
Roche Diagnostics ha gi dal 2002 messo a disposizione Laboratorio Analisi pu oggi fornire al Cardiologo in
del Laboratorio Analisi il nuovo test Elecsys ProBNP, pochi minuti, consente sicuramente una miglior gestio-
con tecnologia ECLIA (Elettrochemiluminescenza), in ne complessiva del paziente con scompenso cardiaco, a
grado di dosare proprio il frammento NT-ProBNP. In partire dalla diagnosi iniziale fino al suo pi efficiente
pochi minuti, in maniera completamente automatizzata trattamento e monitoraggio terapeutico.
e con le stesse modalit operative di un normale test Il tutto anche con un sensibile contenimento dei costi
immunologico di routine, si rende cos questo dosaggio sanitari conseguente alla possibilit di una pi mirata
disponibile a qualsiasi laboratorio dotato di un sistema richiesta di costosi esami strumentali, spesso anche
Elecsys o Modular E 170. causa di lunghe liste di attesa per i pazienti.

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IVR0305

14
MAGGIO 2003

Rivista di attualit diagnostiche

in questo numero
Anemie:
aspetti clinici e
Roche Diagnostics
Viale G.B. Stucchi, 110
diagnostici
20052 Monza (MI)
www.roche-diagnostics.it