|
 
 

I trasportatori ABC rappresentano la famiglia di trasportatori di membrana più

grande, presenti in tutti gli organismi viventi.

Molti trasportatori ABC hanno importanza clinica, alcuni sono responsabili della
resistenza ai chemioterapici, altri traslocano i polipeptidi antigenici dal citoplasma
al reticolo endoplasmatico nei processi che coinvolgono il complesso maggiore di
istocompatibilità (MHC).

Nei batteri i trasportatori ABC sono principalmente coinvolti nell¶!
 di

nutrienti, sebbene contribuiscano anche all¶esportazione di tossine e sostanze
nocive, contribuendo alla resistenza multipla agli antibiotici.
L¶enorme varietà di sostanze
trasportate dagli ABC si riflette
nella bassa omologia di sequenza
dei domini transmembrana

Ciò che lega tra loro i membri

di questa famiglia sono dei
motivi di sequenza altamente
conservati nella cassetta ABC,
molti dei quali direttamente
coinvolti nel legame e
nell¶idrolisi dell¶ATP.

A fianco sono allineate le

cassette ABC di diversi
trasportatori con evidenziate le
sequenze conservate.
 Cell (2000) 101,789-800

I processi di riparazione del DNA interrotto su entrambi i filamenti richiedono un

complesso proteico formato da Rad50/Mre11/Nbs1.

Di questo complesso, Rad50 e Mre11 sono presenti in tutti gli organismi viventi.
 La proteina Rad50 da 150 kDa è
un dominio catalitico/legame per
l¶ATP (Rad50cd) interrotto da un
motivo a eptade ripetuta lungo
600-900 residui.

Due motivi, Walker A e Walker B, sono posti rispettivamente all¶N e al C terminale.

Questa sequenza modulare suggerisce che due proteine Rad50 si assemblino in

maniera antiparallela, in modo da formare due motivi Rad50cd unite da un segmento
r
 r
.

I domini Rad50cd di tutte le sequenze Rad50 ortologhe hanno similarità di sequenza

con le ABC-ATPasi, indice di una struttura e un meccanismo di catalisi comune.
La prima struttura che analizziamo è Rad50 isolata da G
r rr! !

!.

Per studiare la biochimica di Rad50, due segmenti corrispondenti all¶N terminale

(residui 1-152) e al C terminale (residui 735-882) furono coespressi.

In tutti i passaggi di purificazione, i due segmenti copurificavano come un unico

complesso di circa 35kDa, chiamato il dominio catalitico di Rad50 (Rad50cd).

In presenza di ATP, due

domini Rad50cd si uniscono
per formare un omodimero
del peso di circa 60kDa.

La presenza di ATP è inoltre richiesta per legare il DNA, come dimosta l¶esperimento
di 


 riportato in figura. In assenza di ATP Rad50 non lega il DNA (parte
sinistra). L¶aggiunta di ATP induce il legame Rad50cd-DNA, come evidenziato dalla
minor mobilità elettroforetica del DNA (parte destra). In presenza di detergente (S), il
complesso viene separato.
 Î 


|
Due molecole di Rad completa (150kDa) in disposizione antiparallela
formano due ³teste´ che rappresentano due domini Rad50cd. Ogni Rad
contribuisce a fornire l¶N terminale ad un capo e il C terminale all¶altro
capo della struttura.

Rad50cd è formata quindi dal segmento N e dal

segmento C terminale della proteina Rad, privata del
lungo tratto r
 r
.
Rad50cd è quindi formato da due segmenti,
N terminale e C terminale che si uniscono a
formare una struttura con due lobi.

Il lobo I è formato principalmente dal

segmento N terminale, i cui filamenti A
(7,6,5,4,1,2) si impaccano contro l¶elica A.

Il lobo II è formato principalmente dal

segmento C terminale in conformazione A

A 
r
dovuto all¶impaccamento
delle eliche E,F,G tra due foglietti beta, uno
formato dai filamenti 11,12,3,13,14 e l¶altro
formato dai filamenti 8,9,10.

I due lobi sono uniti nel foglietto beta

centrale, che è formato dal filamento 3 del
segmento N terminale e i filamenti
11,12,13,14 del segmento C terminale.
Il sito di legame per il nucleotide, indicato
come ansa P (chiamato anche motivo di
Walker A o G  ) è nel Lobo I, vicino
all¶interfaccia tra i due lobi.

In questa posizione, il legame/idrolisi

dell¶ATP potrebbe essere accoppiato con dei
cambiamenti conformazionali sul lobo II.
Quando la Rad50cd fu cocristallizzato con
l¶analogo non idrolizzabile dell¶ATP (AMP-
PNP) o in presenza di ATP ma assenza di
magnesio dal mezzo di cristallizzazione, la
struttura rivelò la presenza di omodimeri.

Le subunità del dimero sono unite in

modalità testa coda, in cui ogni Lobo II si
interfaccia con il Lobo I del Rad50cd
opposto.

L¶interfaccia del dimero corre

diagonalmente nella struttura, formando
un lungo solco di 65 Å, profondo 12 Å e
largo 22 Å.
 L¶ATP è legato all¶interfaccia del dimero,
bloccato tra l¶ansa P di un Rad50cd e una
sequenza conservata chiamata motivo
firma dell¶altro Rad50cd.

Mutazioni nel motivo firma (residui da

792 a 797) eliminano la dimerizzazione
di Rad50cd, indicando il ruolo
fondamentale che questi residui hanno
in Rad50.

In presenza di ATP sono quindi ipotizzabili due strutture

che Rad50 completa può assumere: una singola struttura
formata da due monomeri di Rad50 antiparalleli si
ripiega e unisce le due teste, oppure due dimeri di Rad50
si uniscono testa a testa.
 Il motivo firma contatta il fosfato M
dell¶ATP con la catena laterale della
Ser793 e l¶azoto della Gly795.

In questo modo il motivo firma

potrebbe funzionare come un
sensore del fosfato M presente
sull¶altra molecola.

Il Mg++ è legato ai fosfati M e A

dell¶ATP e ai residui Ser37 e
Gln140.

Due molecole di acqua sono legate al Mg++ , di cui una lega Asp822 e Glu823 presenti
sulla sequenza chiamata Walker B.

Una terza molecola di acqua, legata dall¶ossigeno della catena principale di Tyr827 e
dall¶N del residuo di Gln140 è posizionata per un attacco in linea sul fosforo del fosfato M.
Sovrapponendo le strutture ottenute in
assenza ed in presenza di ATP, è evidente
una rotazione del lobo II rispetto al lobo I.

Una rotazione dell¶elica F del lobo II

sposta di 9Å il motivo firma e produce il
cambiamento conformazionale che
promuove l¶associazione dei dimeri
Rab50cd e il reciproco legame dell¶ATP.
Le Tyr827 sono presenti in una regione chiamata D  (per dimerizzazione).
Queste regioni sono continue con il segmento Walker B. Osservando la struttura, si
nota che le molecole di acqua legate dai residui del Walker B sono parte del cluster
che coordina il Mg++ in un sito dell¶ATP, mentre l¶acqua legata da Tyr 827 è pronta
per l¶attacco in linea sul fosfato M dell¶altra molecola di ATP. E¶ molto probabile che
il D  leghi l¶idrolisi di una molecola di ATP in un sito all¶idrolisi dell¶ATP
nell¶altro sito.
La struttura dimerica di Rad50cd suggerisce un meccanismo
per spiegare il legame al DNA indotto dall¶ATP.
Il solco che si forma quando Rab50cd dimerizza è
carico positivamente e potrebbe rappresentare la
superficie in cui il DNA viene legato.

Rad50 è associata ad un altro fattore proteico, Mre11,

probabilmente con interazioni dovute alla regione
r
 r
.

Il legame con l¶ATP indurrebbe lo stato dimerico che

lega il DNA (complesso Rad50/Mre11).
L¶idrolisi dell¶ATP sarebbe attivata da una
segnalazione durante il meccanismo di riparazione del
DNA.
L¶idrolisi dell¶ATP provocherebbe il rilascio del
DNA.

G

 

       
 Science (2002) 296,1091-1098

Analizziamo la struttura del trasportatore BtuCD di † r 
.

Questo complesso è un trasportatore ABC che media l¶!
 di vitamina B12.
L¶unità funzionale del trasportatore di
vitamina B12 è formata da due copie per
ciascuna delle subunità BtuC e BtuD.

Ciascuna subunità BtuC, in rosso e

viola, è formata da 10 eliche
transmembrana.

Le subunità BtuD, in blu e verde,

sono esposte al lato citoplasmatico,
posizionate sulle subunità BtuC.
 La disposizione dimerica
della cassetta ABC del
trasportatore BtuCD
ricorda quanto visto nel
dimero di Rad50.

Le due subunità BtuD sono

allineate in modo che il P
 dell¶una si contrappone
al motivo firma dell¶altra.

E¶ quindi molto probabile che queste regioni siano responsabili del legame con l¶ATP.
In BtuD, sono presenti tutte le sequenze coinvolte
nel ciclo dall¶ATP dei trasportatori ABC:
WalkerA
WalkerB
Dloop
Motivo firma
Qloop
Switch

Nel cristallo sono presenti due molecole di

ciclotetravanadato, legate nel sito dell¶ATP.

Sovrapponendo strutturalmente BtuD e Rad50

nella zona del sito di binding dell¶ATP, due
molecole di vanadato occupano la posizione dei
fosfati
e A dell¶ATP.
 Struttura di BtuC

Ognuna delle due subunità transmembrana BtuC ha dieci eliche transmembrana, per un
totale di venti eliche. Generalmente i trasportatori ABC hanno un numero di eliche
transmembrana inferiore.

Questa differenza potrebbe essere dettata dalle dimensioni delle molecole che vengono
trasportate.

BtuCD trasporta la vitamina B12,

una molecola di grandi dimensioni.
 Le eliche transmembrana sono
impaccate tra loro in maniera
piuttosto intricata.

Le eliche quattro e cinque sono

connesse da un 
citoplasmatico che forma il
 al centro del trasportatore.

Un altro  citoplasmatico molto importante è quello tra le eliche sei e sette. Questo
 si struttura in due corti segmenti ad alfa elica indicati come L1 e L2, che hanno
numerosi contatti con le subunità della cassetta ABC.
 L¶interfaccia tra le due subunità di
membrana BtuC è data
dall¶impaccamento antiparallelo
dell¶elica cinque con l¶elica 10
dell¶altra subunità.
Queste eliche formano una cavità
che si apre verso il periplasma, in
grado di contenere una molecola di
vitamina B12. L¶interno della cavità
è formato da residui idrofobici.
I residui del  ( tra elica 4
citoplasma e 5) chiudono l¶accesso al
citoplasma.

Il  separa l¶accesso al canale

dalla larga cavità citoplasmatica
formata tra le regioni
transmembrana e la cassetta ABC.
 

 




 

Le regioni di contatto tra BtuC e la cassetta

ABC sono formate dalle corte alfa eliche
presenti nel  (L1 e L2) che connette elica
sei e elica sette di BtuC
e le regioni che fiancheggiano il
Q nella subunità BtucD.

Il motivo L  (L1 e L2) è conservato nelle

subunità di membrana dei trasportatori ABC.
 

 


 

Per iniziare un ciclo produttivo di trasporto, il

primo passaggio deve essere l¶accoppiamento tra il
legame della vitamina con delle variazioni nel sito
di legame del nucleotide.

Nel caso di un ³importo´, come per la vitamina

B12, questo segnale deve essere trasmesso
attraverso i domini transmembrana sino al sito di
legame dell¶ATP.

In un secondo passaggio, l¶idrolisi dell¶ATP deve essere accoppiata alla traslocazione del
substrato.

Poiché sono le subunità di membrana a formare il , il ruolo della cassetta ABC è
quello di modificare la conformazione del canale utilizzando l¶energia liberata
dall¶idrolisi dell¶ATP.
 Se si confrontano strutturalmente la struttura
del cristallo di Rad50cd, che rappresenta una
cassetta ABC con ATP legato, con la struttura
del dimero BtuD, che rappresenta una cassetta
ABC senza nucleotide legato, emergono delle
differenze strutturali che possono spiegare il
meccanismo di apertura.

In Rad50, il P ed il motivo firma sono più

vicini di 4 Å rispetto a BtuD, indicando che il
legame con ATP è causa di una chiusura delle
subunità della cassetta ABC.

Poichè le subunità BtuD sono strettamente legate alle subunità di membrana BtuC,
questo si tradurrebbe in una forza che, attraverso il  L, apre il .

Il meccanismo funzionerebbe perché le subunità transmembrana sono impaccate tra

loro è quindi la forza applicata si tradurrebbe in una deformazione della struttura , ma
non in una dissociazione del complesso.

G

          

 PNAS (2002) 99,16642-16647

La maggior parte dei trasportatori ABC batterici sono deputati all¶importo di nutrienti.
Le molecole da trasportare sono legate in maniera specifica da proteine che le
veicolano sul complesso ABC e innescano il ciclo di traslocazione del trasportatore.

La proteina trasportatrice resta legata sul

complesso ABC finchè uno o entrambi i
prodotti di idrolisi dell¶ATP non sono stati
rilasciati, impedendo al substrato di permeare
dal lato ³sbagliato´ della membrana.

Analizziamo la proteina BtuF, che trasporta

la vitamina B12 sul complesso ABC BtuCD.
BtuF è formata da due domini, in cui un
foglietto A centrale formato da cinque
filamenti è circondato da alfa eliche.

I due domini sono uniti da un segmento ad

alfa elica (indicato dall¶asterisco).

Una singola molecola di vitamina B12 è

legata in un profondo solco tra i due
domini.
Sei residui aromatici, tre per
ciascun dominio, contattano la
B12 nel sito di legame.
Nel fondo del sito di legame c¶è
una rete di legami a idrogeno
che coinvolge molecole di
acqua, B12 e residui della
proteina.
Di questi, Trp66 e Trp85 sono posti ai lati del
gruppo benzimidazolico della B12.
Ci sono anche legami a idrogeno diretti tra
gruppi laterali della B12 e l¶azoto di Ala32, la
catena laterale di Asp242 e la catena laterale di
Arg246.
Il legame di BtuF con il trasportatore ABC BtuCD
è stato dimostrato



, mescolando un eccesso
di proteina BtuF a BtuCD in presenza di vitamina
B12 e sottoponendo a gel filtrazione la soluzione

Il primo profilo di eluizione è riferito al solo

trasportatore di membrana BtuCD. Il
corrispondente SDS page evidenzia che BtuC
forma due bande, una del monomero e una del
dimero, indicando la forte interazione che tiene
unita la struttura transmembrana del
trasportatore ABC.
Il secondo profilo si riferisce a BtuF da solo. Il
picco è ritardato rispetto a BtuCD.

Il terzo profilo di eluizione si riferisce alla


. Sono presenti due picchi, uno ³pesante´
che contiene tutti gli elementi del complesso
BtuCD/BtuF e uno che contiene l¶eccesso di
BtuF non legato.
˜

  


L¶interazione tra due residui di glutamato (72 e 202)

presenti nei due domini di BtuF con due zone di carica
opposta in BtuCD (Arg56 e 59 sull¶elica due e Arg295
sull¶elica 9 di BtuC) posiziona la vitamina B12 in asse
con il canale di conduzione del trasportatore ABC. Le
sequenze di proteine leganti B12 e trasportatori ABC
mostrano conservazione di questi residui.
G

      
 Nature (2006) 443,180-185

Analizziamo adesso la struttura di Sav1866, un trasportatore ABC di Î

 r rr!
!
! responsabile dell¶estrusione di antibiotici.
Come abbiamo visto, l¶architettura generale dei trasportatori batterici è formata da
due subunità transmembrana che formano il canale di permeazione, e due subunità
citoplasmatiche che idrolizzano ATP.

Le proteine batteriche che conferiscono multi-resistenza ai farmaci vengono invece

espresse come ³semi-trasportatori´ in cui una subunità transmembrana è fusa con
una subunità legante ATP.
Il trasportatore completo viene formato dall¶unione di due ³semi-trasportatori´; si
tratta quindi di un omodimero.

Sav1866 mostra omologia di sequenza con trasportatori ABC umani responsabili

della resistenza delle cellule cancerose ai chemioterapici.
La struttura è formata dalle
due subunità, i cui domini
transmembrana (TMDs) e
leganti nucleotidi (NBDs)
sono in forte interazione.
Ogni subunità ha quindi un dominio di membrana
(TMD) formato da sei eliche e un dominio che lega
nucleotidi (NBDs) che è la cassetta ABC. I due domini
sono legati da un polipeptide che esce dalla elica sei
della regione TMD.
I due domini NBD delle due subunità
sono strutturalmente simili a quelli degli
altri trasportatori ABC.

Questi domini NBD espongono

all¶interfaccia le sequenze responsabili
del legame e dell¶idrolisi dell¶ATP
organizzate nella disposizione testa-coda
tipica delle cassette ABC.
 La caratteristica delle cassette ABC è la
presenza di due siti in cui avviene l¶idrolisi
dell¶ATP formati dal P  di una subunità e
il motivo firma dell¶altra.

Nel cristallo di Sav1866 sono presenti due

molecole di ADP, legate dai P  e dai
motivi firma delle subunità opposte.

La sovrapposizione strutturale del sito legante

nucleotidi tra Sav1866 e un trasportatore ABC
di un archeabatterio cristallizzato in presenza di
ATP =˜  mostra che le conformazioni
delle sequenze coinvolte sono molto simili.

Al contrario, la sovrapposizione con il

trasportatore di vitamina B12 BtuCD evidenzia
un sostanziale allontanamento dei due motivi in
assenza di nucleotidi legati.
Ogni dominio TMD attraversa con sei eliche la
membrana; in questo modo la regione
transmembrana è formata da dodici eliche, in
accordo con la topologia di un trasportatore
ABC canonico.

Circa a metà del doppio strato lipidico, il fascio

di eliche diverge in due ³ali´.

Piuttosto che rappresentare un singolo dominio

TMD, ciascuna delle ali è formata dalle eliche
1-2 di una subunità e le eliche 3-6 dell¶altra.

I segmenti transmembrana sono connessi da

 extracellulari (ECLs) corti e da lunghi 
intracellulari (ICLs) che sono strutturati ad alfa
elica e prolungano le eliche transmembrana di
circa 25 Å nel citoplasma.
  !




I cambiamenti conformazionali
generati dal legame e
dall¶idrolisi dell¶ATP sono
trasmessi dai domini NBD ai
domini TMD attraverso
interazioni non covalenti nella
regione di interfaccia.

I domini TMD di Sav1866 contribuiscono a questa interfaccia principalmente tramite

due  , ICL2 e ICL1.

Entambi i  contengono delle eliche corte (indicate come r ! 



) orientate
parallelamente alla membrana, che sono responsabili dei contatti con i domini NBD.
E¶ interessante notare che le r ! 



contattano principalmente il dominio NBD
della subunità opposta.

Ritornando un attimo indietro, nel

trasportatore (un ³importatore´) della
vitamina B12 BtuCD, i domini
transmembrana contattano solo un dominio
legante ATP, formando una larga cavità
citoplasmatica.

L¶architettura dei  ICL e delle

r ! 


 è probabilmente conservata
tra gli esportatori ABC, come suggerito
dalla significativa similarità di sequenza
nelle regioni corrispondenti.
I domini NBD contattano i domini TMD principalmente attraverso il Q , come
osservato nell¶importatore BtuCD.

Ci sono due importanti

eccezioni date dai residui
conservati Tyr391 e
Glu473.

Glu473 è particolarmente interessante, in quanto

interagisce con entrambi i  ICL1 e ICL2 e fa
parte di una sequenza conservata nei soli
esportatori ABC chiamata X- .

Poiché l¶X- precede il motivo firma,

probabilmente risponde al legame e all¶idrolisi
dell¶ATP e trasmette il cambiamento
conformazionale agli ICL.

La mancanza della sequenza X- negli importatori batterici ABC dipendenti da





 (come il sistema BtuCD-BtuF) suggerisce che esistano meccanismi di
accoppiamento diversi tra importatori ed esportatori ABC.
Ú

"


Una larga cavità è presente tra i due domini

transmembrana.

Nonostante sia spostata verso il citoplasma, la

cavità è accessibile dal lato extracellulare.

La presenza di cariche sui residui che ne

compongono la superficie indicano che la cavità
rappresenta un percorso di uscita più che un sito
di legame per molecole idrofobiche.
 ˜

 
Il meccanismo di trasporto più semplice implica due stati: una conformazione aperta verso
il citoplasma con il sito di legame per il substrato esposto verso l¶interno della cellula, e
una conformazione con una tasca di estrusione aperta verso il periplasma.

La struttura di Sav1866 indica che lo stato di forte interazione dei domini leganti
nucleotidi è accoppiato alla conformazione aperta verso il periplasma.

In questa conformazione, i substrati legati possono spostarsi verso

il lato periplasmatico della membrana o entrare nella fase acquosa
esterna, a seconda della loro idrofobicità.

L¶idrolisi dell¶ATP dovrebbe riportare il trasportatore nello stato

aperto verso il citoplasma.

La quantità di ATP richiesta e il numero di molecole estruse per

ogni ciclo sembrano dipendere dalle dimensioni del substrato.
 L¶architettura dell¶interfaccia tra i domini di
membrana e la cassetta ABC di Sav1866 impone un
modello diverso da quanto generalmente proposto (a)
per i trasportatori ABC.

Le due subunità di Sav1866 interagiscono in maniera

intricata, con il dominio legante nucleotidi in
interazione con il dominio transmembrana (attraverso
i ICL) della subunità opposta (b).

In più, ogni ala della regione transmembrana è formata da eliche appartenenti ad entrambe
le subunità.

E¶ difficile immaginare che le due subunità possano associarsi e dissociarsi come proposto
in alcuni modelli di funzionamento del trasportatore.
 Science (2009) 323,1718-1722

La glicoproteina P (chiamata anche MDR1 o ABCB1) detossifica le cellule esportando

centinaia di tossine diverse.

Data la sua azione, è implicata nei fenomeni di multiresistenza ai farmaci

chemioterapici (!

!

r, abbreviata MDR).

Recentemente è stata cristallizzata la glicoproteina P (P-gp) di topo, che ha una

identità di sequenza dell¶87% con la proteina umana.
P-gp è costituita da un unico peptide in cui sono presenti i
due domini TMD (ognuno contribuisce con sei eliche
transmembrana) e i due domini NBD.

La struttura presenta un conformazione aperta verso il

citoplasma, organizzata in due metà simmetriche.

I domini NBD sono distanti circa 30 Å.

Nelle figure a fianco è presentata la struttura vista dai due

lati. Nella regione transmembrana, due aperture
permettono l¶ingresso di molecole idrofobiche
direttamente dalla fase di membrana.

Nella regione idrofobica, la cavità ha un volume di circa

6000 Å3 e può contenere almeno due composti
simultaneamente.

Su 73 residui accessibili nella cavità, 15 sono polari e

solamente due potenzialmente carichi.
 P-gp distingue tra differenti
stereoisomeri dell¶inibitore QZ59.

QZ59-RRR QZ59-SSS
P-gp è stata cristallizzata in presenza
di queste due forme di inibitore.
Come possiamo vedere, una forma si
lega in stechiometria 1:1 con la
proteina (QZ59-RRR), mentre
dell¶altra forma (QZ59-SSS)
vengono legate due molecole per
proteina.

Questi co-cristalli indicano che la conformazione aperta verso il citoplasma è competente

per il legame al substrato.

E¶ interessante notare che la co-cristallizzazione con QZ59 è stata possibile solo

immettendo l¶inibitore fin dall¶inizio, mentre molecole più piccole possono entrare nella
cavità anche quando il cristallo è già formato.
E¶ quindi possibile che in membrana la cavità possa essere ancora più grande.
P-gp è anche una ³flippasi´ che muove in maniera unidirezionale i lipidi dallo strato
interno allo strato esterno della membrana.

P-gp, attraverso le aperture nella porzione idrofobica del foglietto interno, potrebbe
scansionare questa zona del doppio strato e selezionare l¶ingresso nella cavità di alcuni
lipidi e molecole idrofobiche.

La conformazione presente in questi cristalli rappresenterebbe P-gp in uno stato di

pre-trasporto.

Durante il ciclo catalitico, il legame

dell¶ATP, stimolato dalla presenza di
substrati nella cavità, indurrebbe
l¶avvicinamento dei domini NBD.

Il cambiamento strutturale porterebbe

all¶apertura verso il lato extracellulare.