DRUG DESIGN.

PACCO SLIDE 1

Per progettare un Farmaco (Drug Design)

E’ fondamentale CONOSCERE
•il Farmaco (cos’è un farmaco)

Drug Discovery & Development Process

• Drug Design
• Computational (Informatics) Approaches
Virtual Combinatorial Chemistry
Docking
Virtual Screening
• Combinatorial synthesis

Cosa si definisce FARMACO?

Un composto che interagisce con il sistema biologico per dare una risposta biologica.........

DRUG TARGET
•Enzimi
•Recettori
•Canali Ionici
•Trasportatori
•DNA

Farmaco: è qualsiasi sostanza chimica che abbia la capacità o almeno la possibilità di determinare una o più
variazioni funzionali se introdotta in un organismo vivente (definizione O.M.S.) Il farmaco quindi viene assunto per
prevenire o curare una malattia o un sintomo ma la speranza che per ogni situazione patologica esista un farmaco
in grado di curarla si è rivelata illusoria Il farmaco ha quindi un suo ruolo preciso, estremamente utile purché
risponda a tre presupposti:
•che sia efficace
•che sia sufficientemente sicuro
•che venga usato in modo corretto, assunto nei modi e nei tempi indicati

Quando un farmaco è efficace?

Quando è in grado di modificare il normale decorso di una malattia o di ridurre i sintomi
Quando un farmaco è sicuro ?
Non esiste un farmaco privo di tossicità
Per usare correttamente un farmaco si deve conoscere il suo indice terapeutico, cioè il rapporto tra i benefici che
può fornire e i rischi legati al suo impiego
E' chiaro che il beneficio atteso dalla somministrazione di un farmaco deve essere superiore ai rischi che tale
somministrazione può comportare (rapporto favorevole beneficio/rischio)
Prima di entrare in commercio, una sostanza che si è dimostrata attiva in laboratorio deve superare diverse tappe:
sperimentazione animale, sperimentazione su volontari sani, sperimentazione clinica sui pazienti

Cosa s'intende per uso corretto del farmaco? Il farmaco deve essere stato prescritto su risposta a reali
necessità e utilizzato secondo modalità che sfruttino al massimo l'efficacia terapeutica e riducano al minimo gli
effetti indesiderati.
Un uso improprio e non corretto dei farmaci si verifica per:
•la non utilizzazione o l'utilizzazione saltuaria del farmaco prescritto;
•l'interruzione prematura o l'uso troppo protratto;
•la modalità di assunzione sbagliata (in rapporto ai tempi di somministrazionee ai pasti);
•la dose non corretta (eccessiva o insufficiente);
•l'interazione con altri farmaci autoprescritti.

Fasi dello sviluppo di un farmaco

Fase preclinica
1.drug design
2.sintesi chimica
3. farmacologia
4.tossicologia
5.tecnica farmaceutica

Fase clinica
•Fasi 1/3

Obiettivo
sintetizzare molecole a struttura nota,
riproducibile, stabile, con caratteristiche
chimico fisiche idonee all’impiego terapeutico
nell’uomo, brevettabili

•Sintesi e purificazione di più molecole appartenenti a classi omogenee di composti Chimici

•Studio della loro stabilità
•Studio delle loro caratteristiche chimico-fisiche (solubilità, pH, idrofilia/lipofilia etc)
•Sintesi chimica
•Attività di screening

–Screening per attività

–Screening per tossicità

•Design e Sintesi di molecole più attive

•Design e Sintesi di molecole meno tossiche

La fase di screening farmaco/tossicologico è una delle fasi più critiche per il “time to market”, perché dalla sua
velocità e dalla sua accuratezza dipende l’ottimizzazione della sintesi chimica e l’identificazione dei composti da
sviluppare.

Screening di attività impiego di modelli farmacologici (in vitro od in vivo) scelti in funzione dell’attività target da
testare, scelta come criterio primario per la scelta dei composti da avviare allo sviluppo

Screening di tossicità prima valutazione del potenziale tossicologico dei composti in studio con DL50 o con
modelli in vitro

Identificazione dei composti da avviare alla fase di sviluppo successivo

Approfondimento farmacologico
-Studio delle forme farmaceutiche
– attività in differenti modelli in vitro ed in vivo
– attività in differenti specie animali
– identificazione dell’intervallo di dosi attive
– rapporto dose/effetto nelle diverse specie animali
– studio della durata dell’effetto farmacologico
– approfondimento del meccanismo d’azione
– farmacocinetica animale per differenti vie di
somministrazione in differenti specie

Approfondimento tossicologico
tossicità in differenti specie animali
– tossicità per differenti vie di somministrazione
– tossicità per periodi prolungati (da 4 settimane a 12
mesi)
– studio della tossicità nucleare (mutagenesi)
– studio sugli tossicità riproduttiva
– studio degli effetti farmacologici su altri organi ed
apparati (safety pharmacology)

• Studio e preparazione delle forme farmaceutiche da avviare alla sperimentazione umana

• Studio della stabilità dei composti nelle formulazioni scelte per l’avvio della sperimentazione umana

FASE CLINICA
• Identificato un razionale farmacologico
• Identificato un intervallo di dosi attive
• Identificata una via di somministrazione idonea alla terapia nell’uomo
• Identificata una forma farmaceutica con adeguata biodisponibilità e stabilità
• Identificato un profilo tossicologico adeguato alla patologia da trattare ed alla durata del
trattamento

Fase I-tollerabilità
– inizio degli studi dell’effetto di un farmaco sull’uomo
– studi condotti prevalentemente su volontari sani
obiettivo primario:
valutazione della sicurezza nell’uomo delle dosi potenzialmente terapeutiche
altri obiettivi:
informazioni preliminari di farmacocinetica e di farmacodinamica

Fase II-efficacia
primi studi nel paziente
obiettivo primario:
•dimostrazione preliminare di efficacia (vs placebo) e di sicurezza in pazienti delle dosi potenzialmente
terapeutiche

obiettivi secondari:
•identificazione dell’intervallo di dosi efficaci, degli intervalli di somministrazione e di un eventuale rapporto
dose/risposta
•identificazione delle possibili indicazioni terapeutiche

Fase III
Studi su ampia casistica di pazienti
obiettivo primario:
definizione delle dosi con il miglior rapporto rischio/beneficio (assoluto o comparativo verso terapie di riferimento)
obiettivi secondari:
definizione della posologia ottimale, approfondimento della sicurezza, interazioni cliniche con altri farmaci, studio
dei fattori che possono indurre differenti risposte terapeutiche (età, alterazioni epatiche o renali etc)
Fase IV
Fase di sviluppo post-registrativo, durante la fase di commercializzazione del farmaco
•Valutazione del rapporto rischio/beneficio e
•costo/beneficio del farmaco nell’ambito della pratica clinica
•Monitoraggio attivo e passivo del profilo di sicurezza
•Possibile identificazione di nuove indicazioni/forme farmaceutiche (in questo caso inizia una nuova fase di
sviluppo di fase II per le nuove indicazioni/forme)

NEW MOLECULAR ENTITIES

•80% dei costi di R&D sono attribuibili a fallimenti
•Meno dell’1% dei programmi di ricerca riesce ad identificare prodotti in grado di accedere al mercato
•7 su 10 dei farmaci sul mercato non sono in grado di recuperare gli investimenti iniziali di R&D
•Per soddisfare le aspettative degli investitori, un’azienda farmaceutica “top ten” dovrebbe portare sul mercato 3
nuovi farmaci all’anno
in realtà riesce verosimilmente a portarne soltanto 1
•Investimenti in R&D raddoppiati dal 1991 al 2001, andando ad incrementare in maniera pesantissima i costi fissi
delle azienda
HIT
una molecola organica iniziale capostipite di una nuova
classe di prodotti in un programma di ricerca
– Attività micromolare verso il target biologico
– Basso peso molecolare (es: MW 150-250)
– Assenza di gruppi funzionali indesiderati
– Trattabilità chimica ed espandibilità
– Spazio brevettuale sufficiente
–

LEAD
una molecola organica già parzialmente sviluppata (nel corso
dell’hit-to-lead process) che abbia la potenzialità di essere
testata in vivo
– Attività submicromolare verso il target biologico
– Attività in sistemi cellulari e possibilmente in modelli in vivo
– Proprietà chimico-fisiche predittive di buon comportamento in vivo (drug-likeness)
– Alcune proprietà ancora da ottimizzare per farne un prodotto di uso clinico (es. Solubilità, legame alle
proteine del plasma (PPB), stabilità metabolica….)

CARATTERISTICHE DI UN BUON FARMACO

ADME/Tox

drug failure in Clinical Development (>80%)

ADME/Tox
•Proprietà biofarmaceutiche insufficienti

(no drug-like), 39%

•Mancanza di efficacia (nell’uomo ), 29%
•Tossicità 21%
•Motivi commerciali, 6%

Sfruttabilità del brevetto di circa 10 anni

Individuare una strategia che consenta di:

Ridurre i tempi necessari per la selezione del candidate drug.
Ridurre i rischi dello sviluppo clinico

LA RICERCA IN AMBITO FARMACEUTICO

Obiettivo
La ricerca in ambito farmaceutico
Negli ultimi anni gli sforzi dell’industria farmaceutica si
sono focalizzati sulla riduzione dei tempi della Discovery
(identificazione di un nuovo lead) e sulla razionalizzazione
della fase di lead optimization (scelta del candidate drug)

RIDUZIONE DEI TEMPI IN RICERCA PRECLINICA

•Introduzione di nuove tecnologie in chimica e biologia
–Chimica Computazionale
–Chimica Combinatoria
–Saggi biologici in vitro automatizzati - HTS (primary activity & selectivity screen)
–Automazione nello Sviluppo Chimico
–Ingegneria delle particelle in Tecnologia Farmaceutica (nanoparticle formulations)
–Nuove forme di somministrazione nel drug delivery
•Miglioramento dei Processi
•Utilizzo di composti con elevate proprietà di sviluppabilità

PROCESSO DI DRUG DISCOVERY MODERNO

•Individuazione target
•Studi sulla proteina
•Drug design (tecniche computazionali innovative)
•Chimica combinatoriale
•Moderne tecniche di purificazione e caratterizzazione prodotti
•High-troughput screening

TARGET VALIDATION
Ogni malattia può essere legata eziologicamente e fenomenologicamente ad una proteina (enzima, recettore) che
è stata codificata (gene) e sintetizzata in modo sbagliato, in quantità sbagliata ed in una collocazione sbagliata.

La validazione del target è un fattore critico di successo, in quanto non è sufficiente identificare il
gene/enzima/proteina/ coinvolto in uno specifico processo patologico,
ma
anche dimostrare che la sua modulazione comporta
una riduzione della manifestazione morbosa.

Genomica consente in modo veloce di capire come il DNA, geni, proteine e le funzioni delle proteine sono
correlate sia in condizioni fisiologiche che patologiche
Progetto genoma :
•Maggiori informazioni su potenziali proteine target
•Terapie personalizzate

Biopharmaceutica farmaco biotecnologico, peptidi, proteine prodotti naturali

• processo di discovery più veloce
Farmacogenomica pazienti rispondono in modo diverso allo stesso farmaco
• terapie personalizzate
High-Throughput Screening
•Compagnie farmaceutiche hanno milioni di composti chimici
•High-throughput screening consente di testare 100,000 composti al giorno su una proteina target
•Alcune centinaia possono risultare attivi
•Maggiormente affidabili e riproducibili
•Si selezionano 2-3 classi di composti come drug candidates per identificare hit più potenti (affinità nell’ordine di
10-100 nM)

Test in vitro
•In vitro Target (primari, cellulari, funzionali, selettivi.....)
•In vitro ADME (epatostabilità, substrati e inibitori P450, permeabilità di membrana, protein binding....)
•In vivo (funzionale, secondario, comportamentale...)
•Tossicità
Caratteristiche fisiche (In silico ADME)

Hit Generation

Screening virtuale
–Capitalizzare collezioni di composti disponibili elettronicamente
–Generare dati di screening su composti virtuali e librerie virtuali
–Generare sottoinsiemi di composti da sottoporre a saggio a “low-throughput” (riduce dimensioni HTS)
•“Hit rate” potenzialmente più alto

Operativamente:
“Docking” di ciascun composto verso il target molecolare (deve essere nota la struttura 3D del target)
Ricerca di similitudine per sottostruttura (deve essere nota la struttura del ligando)
HIT GENERATION
•HTS - Screening di collezioni molto vaste (Company collection)
•Composti generati attraverso tecniche di chimica combinatoriale
•Librerie random
•Librerie targeted o biased
Librerie Random
–Mancanza di conoscenze circa la struttura del target molecolare
–Grande diversità rispetto alla collezione dei composti preesistenti
–Facilità di realizzazione chimica
•Molto spesso realizzate in fase solida
–Alto numero di componenti (1.000 - 5.000)
–Composti singoli (raramente miscele, comunque realizzati mediante tecniche di split & mix)
–Purezza chimica > 85%
–Testate per l’attività farmacologica primaria @1-10 mM

Librerie Targeted o Biased

–Conoscenze circa la struttura del target molecolare
–Contengono motivi strutturali ritenuti cruciali per l’interazione con il target molecolare (GPCRs, Kinases)
–Facilità di realizzazione chimica
•Spesso realizzate in fase solida
•Sempre più diffuso l’uso della chimica in soluzione
–Medio-alto numero di componenti (500 - 1.000)
–Composti singoli (raramente miscele, comunque realizzati mediante tecniche di split & mix)
–Purezza chimica >90%
–Testate per l’attività farmacologica primaria @1-10 mM
–Dovrebbero produrre un maggiore hit rate

Validare un hit significa:

–Dimostrarne la manipolabilità chimica
•Adatto al “rapid analoguing” (cioè sintetizzabile attraverso una via sintetica utilizzabile nella sintesi parallela in
fase solida o in soluzione)
•Max 5-7 passaggi sintetici
–Dimostrare l’esistenza di SAR all’interno di congeneri
•Librerie focused
–Dimostrarne la sviluppabilità farmaceutica
•CYP450, clearance metabolica in vitro, permeabilità al passaggio delle membrane
–Verificarne la brevettabilità

•Librerie Focused
–Progettazione guidata dalla SAR
–Basso numero di componenti (50-100)
–Composti rigorosamente singoli
•Sintesi in soluzione preponderante
–Alta purezza chimica (>95%)
–Saggiate per l’attività e selettività
–Saggiate in farmacocinetica (e pre-tox)
RIDUZIONE DEI TEMPI DI RICERCA
•Strutture semplici, sintesi più corte
•Proprietà chimico-fisiche appropriate
Composti solubili e veloci da formulare
•Alta selettività per il target molecolare
•Nessuna (o modesta) interazione con gli isoenzimi della famiglia CYP450
•Eccellenti caratteristiche di DMPK
•Complicazioni tossicologiche ridotte

Regole di Lipinski del 5

•Solubilità in acqua
•Permeabilità di membrana
•Attività Cytochrome P450
•Legame con proteine plasmatiche

Le caratterstiche ADME dovrebbero essere valutate prima possibile nel processo di Drug Discovery
•Regole empiriche
–Lipinski rules of 5 (MW, cLogP, #HD, #HA)
•Drug-likeness
–Ajay & Murcko (J Med Chem, 1998, 41, 3314-3324)
–Sadowski & Kubinyi (J Med Chem, 1998 , 41, 3325-3329)

The Lipinski “Rule of Five” (1)

❖ Peso Molecolare ≤ 500 (opt = ~350)
❖ Accettori legame H ≤10 (opt = ~5)
❖ Donatori Legame H ≤ 5 (opt = ~2)
❖ -2 < cLog P < 5 (opt = ~3.0)
❖ Rotatable Bonds ≤ 5

Log del coefficiente di partizione 1-Ottanolo/Acqua (logKOW)

•valutazione della biodisponibilità
–bilancio tra idrofobicità/idrofilicità
–idrofilico abbastanza da essere solubile in acqua (sangue)
–idrofobico abbastanza da oltrepassare la membrana cellulare
•Tipico range: da -3 (altamente idrofilico) a +7 (altamente idrofobico)

Gran parte di molecole drug-like hanno 2<LogP<4

Fino anni 70
Molti lead da prodotti naturali o serendipity
chimica e ipotesi determinavano la sintesi
Bottleneck: esperimenti in vivo
Fino anni 90
molecular modelling
modelli in vitro (inibizione enzimatica, binding recettoriale)
Bottleneck: sintesi mirata al farmaco
OGGI
Genomica, proteomica, bioinformatica
animali transgenici per proof of concept
structure-based e computer-based design di ligandi
data miming ( virtual screening di small-molecule libraries)
profilo ADMET (HTS e in silico)
Bottleneck: eccesso d’informazione, target validation
Fino anni 2000
gene technology
chimica combinatorilae
structure-based drug design
High-throughput screening(HTS)
Bottleneck: ADMET proprieties del lead

L’elevato carico di aspettative dell’industria farmaceutica ha portato amare delusioni e ad un rapporto conflittuale
con le tecnologie.
Non esiste una via “facile” per lo sviluppo del farmaco ma l’integrazione delle tecnologie ha portato ad un rapido
sviluppo della scienza della progettazione del farmaco.

“….is defined as an interdisciplinary science situated at the interface of organic chemistry and life sciences (such
as biochemistry, pharmacology, molecular biology,immunology, pharmacokinetics and toxicology) on one side and
chemistry-based disciplines (such as physical chemistry, crystallography, spectroscopy and computer-based
information technologies) on the other.”

Medicinal Chemistry

Il chimico medicinale fa parte di un team ma ha un ruolo chiave nel processo di Drug Discovery
DEVE
Conoscere il target disease
Conoscere le terapie competitive
Formulare nuove ipotesi per il nuovo farmaco
Sintetizzare, purificare, caratterizzare NE
Definire il lead compound
…………………
Interfacciarsi con le varie figure professionali

• La chimica medicinale si riferisce alla progettazione e alla produzione di composti che possono essere utilizzati
in medicina per la prevenzione, il trattamento o la cura di malattie umane e animali
• La chimica medicinale comprende tre passaggi critici:
• Una fase di scoperta consistente nell'identificazione e produzione di nuovi principi attivi solitamente denominati
composti di piombo. I conduttori possono provenire dalla chimica organica sintetica, da fonti naturali o da processi
biotecnologici.
• Una fase di ottimizzazione che si occupa principalmente della modifica sintetica della struttura di piombo al fine
di migliorare la potenza, la selettività e ridurre la tossicità. Le sue caratteristiche sono la creazione e l'analisi delle
relazioni struttura-attività (SAR).
• Una fase di sviluppo consistente in:
-La ottimizzazione del percorso sintetico per la produzione di massa
-Modificazione delle proprietà farmacocinetiche e farmaceutiche del principio attivo per renderlo idoneo all'uso
clinico. Questo può riguardare l'ottimizzazione delle proprietà associate a:
• Formulazione chimica
• solubilità
• Eliminazione di sapori o irritazioni sgradevoli
• Riduzione del dolore nel sito di iniezione

• Il chimico farmaceutico deve eccellere nella sintesi organica e nella comprensione degli approcci moderni
all'analisi di struttura-attività. Il chimico farmaceutico è coinvolto nella progettazione, sintesi, ottimizzazione e
selezione di nuovi composti di piombo
• Un sondaggio di una serie di rappresentanti delle assunzioni aziendali ha suggerito queste qualità desiderate:
-Possibilità di adattarsi a un team multidisciplinare
-Possibilità di cercare nuove molecole
-Aumentare la conoscenza di come sintetizzare le molecole per test biologici mirati
- Comprensione dei motivi per la produzione di composti
-Progetto di farmaci non studiato
-Insight in SAR con dati insufficienti
-Conoscenza in campi collaterali (fisiopatologia, biologia cellulare, genetica)
-Familiarità con nuove tecniche

❖ Drug Target
❖ Cenni di Farmacocinetica
❖ Progettazione di SMW (small molecular weight) Drugs
-Relazioni Struttura-Attività,
-Interazione drug-target
-Farmacoforo,
-Bioisosteria
-Strategie di lead optimization (case histories)
❖ Computer Aided DD

-3D pharmacophore identification

-In silico ADMET prediction
-Docking
-Virtual screening of database
-QSAR
❖ Approccio combinatoriale al Drug Discovery

PACCO SLIDE 2

The Drug – Target Interaction

•Protein as Drug targets (Enzymes, Receptors…….)

Misura degli effetti benefici del farmaco a basse dosi, rispetto ai suoi effetti dannosi a dosi elevate
Indice terapeutico
LD50 / ED50
Esistono differenze marcate negli LD50 di vari prodotti chimici. Alcuni provocano la morte a dosi di una frazione
di un microgramma (LD50 per la tossina botulinica è pari a 10 pg / kg); altri possono essere relativamente innocui
in dosi di diversi grammi o più.
I farmaci utili mostrano tossicità nei confronti di cellule estranee o anormali, ma non contro le normali cellule ospiti
- Principio di tossicità selettiva
lipidi
• Membrana cellulare
proteine
• Enzimi - inibitori reversibili e irreversibili
• Recettori - agonisti e antagonisti
• Canali ionici - bloccanti e modulatori
• Proteine di trasporto - inibitori dell'assorbimento
DNA (acidi nucleici)
• DNA - agenti alchilanti, agenti intercalanti,
substrati sbagliati (cavalli di Troia)

Siti cellulari di azione farmacologica

Poiché I farmaci agiscono modificando le attività dei loro recettori, i siti in cui agisce un farmaco e la portata della
sua azione sono determinati dalla posizione e dalla capacità funzionale dei suoi recettori.
La localizzazione selettiva dell'azione del farmaco all'interno dell'organismo non dipende quindi necessariamente
dalla distribuzione selettiva del farmaco.
Se un farmaco agisce su un recettore che serve funzioni comuni alla maggior parte delle cellule, i suoi effetti
saranno diffusi.
Se la funzione è vitale, il farmaco può essere particolarmente difficile o pericoloso da usare. Tuttavia, tale farmaco
può essere clinicamente importante.

Siti di azione farmacologica

Es. I glicosidi della digitale, importanti nel trattamento dell'insufficienza cardiaca, sono potenti inibitori di un
processo di trasporto degli ioni che è vitale per la maggior parte delle cellule. Come tali, possono causare tossicità
diffusa e il loro margine di sicurezza è pericolosamente basso.
Se un farmaco interagisce con i recettori che sono unici solo per alcuni tipi di cellule differenziate, i suoi effetti
sono più specifici.
Ipoteticamente, il farmaco ideale causerebbe il suo effetto terapeutico con tale azione. Gli effetti collaterali
sarebbero ridotti al minimo, ma la tossicità potrebbe non esserlo.
Se la funzione differenziata fosse vitale, anche questo tipo di farmaco potrebbe essere molto pericoloso. Alcuni
degli agenti chimici più letali noti (ad es. Tossina botulinica) mostrano tale specificità.
farmacodinamici
Studia l'interazione Drug-Target

• I lipidi come bersaglio del farmaco

Pochi esempi e lo stesso meccanismo d'azione:
rottura della parete cellulare
Es. Amfotericina B (agente antifungino topico) -prodotto naturale derivato da Streptomyces nodosus

L'amfotericina si lega all'ergosterolo con la parte idrofobica e ad un'altra molecola di amfotericina con la parte
idrofila.
Formazione di un tunnel idrofilo che consente il drenaggio del contenuto polare della cellula

proteine
• Enzimi - inibitori reversibili e irreversibili
• Recettori - agonisti e antagonisti
• Canali ionici - bloccanti e modulatori
• Proteine di trasporto - inibitori dell'assorbimento

Messaggeri (ormoni - neurotrasmettitori)

Insulina che si lega al recettore di membrana per regolare il metabolismo del glucosio
Canali proteici Regolazione della diffusione attraverso la membrana cellulare
Proteine di trasporto
per esempio, emoglobina - trasporto di ossigeno

Determinazione della struttura 3D

• Cristallografia a raggi X
• NMR (risonanza magnetica nucleare)
• Approcci computazionali (modelli – ipotesi)

Modelli
Modellazione di omologia (ipotesi: ripiegamento analogo per proteine appartenenti alla stessa famiglia di geni)
Caratterizzazione della dinamica molecolare

Protein Data Bank (PDB)

• Archivio: informazioni sulle forme 3D di proteine, acidi nucleici e complessi
• Ogni struttura depostata del PDB mantiene le coordinate 3D di tutti gli atomi di molecole
Il PDB contiene quasi 140.000 strutture

Classificazione delle strutture proteiche

Classificazione delle strutture del dominio delle proteine in 4 livelli principali:
Contenuto della struttura secondaria di classe
Orientamento lordo dell'architettura delle strutture secondarie
Topologia connessioni topologiche e n ° di strutture secondarie
Superfamiglia omologa strutture e funzioni molto simili
Famiglia di sequenze

Piega e dominio
domini
• Definiti come unità pieghevoli indipendentemente.
• Contrassegna spesso diverse unità funzionali.
• Separato dalle regioni del linker.
• Molte proteine hanno diversi domini "
• La maggior parte delle proteine si ripiega in strutture già note Alcune pieghe comuni - barile β / α - recettore 7-
TM - fascio 4-elica - domini β-sanwich (immunoglobulinico) ecc.

Livello di somiglianza delle proteine

Famiglia
- Omologia di sequenza primaria
• Super famiglia
-Soma l'architettura del dominio e lo stesso ordine dei diversi domini
• Piegare
-Regolamento simile di due domini

Drug Targets interactions

COME FUNZIONA un FARMACO?
definizioni
Enzima: biocatalizzatore endogeno; converte uno o più substrati in uno o più prodotti
Ligando / substrato: legame molecolare alla macromolecola biologica
Inibitore: Ligandi in grado di inibire il legame del substrato all'enzima, possono essere:
• diretto (competitivo) o indiretto (allosterico),
• reversibile o irreversibile

Gli enzimi sono catalizzatori altamente efficienti e specifici.

• Gli enzimi alterano la velocità, non gli equilibri.
• Gli enzimi stabilizzano gli stati di transizione.
• I tassi di reazione dipendono dalle concentrazioni di enzimi, substrati e dall'efficienza dell'enzima.

Catalizzatore: sostanza che aumenta il tasso di una reazione chimica

Gli enzimi sono catalizzatori biologici
Substrato: una sostanza chimica che subisce una reazione catalizzata da un enzima
Il catalizzatore prende parte alla reazione, ma viene recuperato invariato alla fine del processo

PERCHÉ una reazione può procedere lentamente senza un catalizzatore?

1. Comporta una separazione di carica sfavorevole nel
stato di transistione;
2. Riduce l'entropia (fusione di piccoli elementi costitutivi)
In che modo gli enzimi superano questi inconvenienti?
❖ Le cariche stabilizzanti, orientando correttamente i residui acidi e basici, ioni metallici e dipoli
❖ Dopo avere un'energia di attivazione inferiore attraverso la catalisi covalente
❖ Riducendo al minimo la perdita di entropia (i gruppi catalitici richiesti appartengono allo stesso enzima)
...... Senza enzimi le reazioni chimiche essenziali non sarebbe abbastanza veloce per sostenere la vita !!!

In che modo gli enzimi aumentano la velocità di reazione?

• Forniscono una superficie di reazione e un ambiente adatto;
• Portano i reagenti insieme e li posizionano
correttamente in modo che possano facilmente raggiungere le loro configurazioni dello stato di transizione;
• indeboliscono i legami nei reagenti;
• Possono partecipare al meccanismo;
• Formano interazioni più forti con lo stato di transizione rispetto al substrato o al prodotto;

Dove si svolge la catalisi?

Obiettivo del farmaco enzimatica
• Gli enzimi hanno siti specifici in cui avviene la catalisi enzimatica: siti attivi
• Dominio catalitico: sito con una forma specifica per il riconoscimento del substrato e la catalisi di reazione

Siti attivi:
La regione che lega il substrato.
Solo una piccola parte dell'enzima.
Formato da A.A. in diverse parti della sequenza.

Siti attivi:
Di solito forma una fessura o una tasca.
I substrati sono legati da più interazioni deboli.

PROBLEMI CHIAVE DEL SITO ATTIVO:

1. Piccola parte di tutti gli enzimi
2. Chiudi a.a. i residui possono essere molto distanti nella struttura primaria (pieghevole)
3. Il legame del substrato è ottenuto attraverso una serie di interazioni chiave deboli
4. Spesso costituito da cavità o tasche idrofobiche
5. La specificità vincolante è legata alla posizione degli atomi nel sito attiv
6. Tasto a.a. i residui sono conservati

I residui del sito attivo sono coinvolti in:

- Riconoscimento molecolare
-Meccanismo di reazione catalitico

Caratteristiche distintive
1- Potere catalitico
2- Specificità
3- Regolamento

1- Potere catalitico
• Effetto di prossimità
• Effetto di orientamento
• Tensione di deformazione

2- Specificità
• lucchetto e chiave
• adattamento indotto

Induced fit-Koshland

Quando la molecola del substrato è legata dall'enzima, i gruppi catalitici assumono una posizione geometrica
favorevole per formare lo stato di transizione.
Spiega come un enzima può riconoscere diversi substrati

2. Specificità
- Stereochimica
- Gruppi funzionali
- Legame

Legame del substrato a una porzione specifica della proteina: sito attivo
I residui del sito attivo sono coinvolti in:
- Riconoscimento molecolare
-Meccanismo di reazione catalitico

Le interazioni vincolanti
Obiettivo del farmaco enzimatica
Legami ionici
Legame idrogeno
Interazioni di Van der Waals
Dipolo / dipolo
Dipolo / dipolo indotto ....
PACCO SLIDE 3
DRUG Mechanism of Action
Enzymatic Inhibitors

Cinetica enzimatica
Obiettivo del farmaco enzimatico
A basse concentrazioni di substrato la velocità di reazione aumenta quasi in modo proporzionale alla
concentrazione del substrato
Ad alta concentrazione di substrato la velocità di reazione diventa quasi costante e si avvicina a una velocità
massima
Ciò riflette una situazione in cui è presente un substrato maggiore rispetto al sito attivo disponibile.
Michaelis - Menten Kinetic
L'equazione di Michaelis-Menten descrive la dipendenza della velocità di reazione di una reazione enzimatica
catalizzata dalla concentrazione del substrato
Modello per enzimi non allosterici proposti da Leonor Michaelis e Maud Menten nel 1913
Gli inibitori e gli induttori enzimatici sono sostanze in grado di modulare la cinetica enzimatica

Michaelis - Menten Model

Il modello cinetico spiega l'elevato aumento della velocità di reazione su un piccolo aumento di substrato (la
concentrazione dell'enzima è considerata costante).
La velocità massima (Vmax) viene raggiunta rapidamente una volta che la concentrazione del substrato può
consentire la saturazione completa degli enzimi. Qualsiasi ulteriore aumento del substrato avrebbe un effetto
limitato (non si verificheranno ulteriori reazioni enzimatiche / substrato).

A Vmax non sono disponibili più siti attivi enzimatici per l'incollaggio del substrato.

ES = intermedio di reazione con bassa energia di attivazione (effetto catalitico)

Assunzione
Una volta raggiunto lo stato di equilibrio dinamico, la concentrazione ES rimane costante
lo stato stazionario è raggiunto

Stato stazionario: il tasso di formazione del complesso enzima-substrato è uguale al tasso di rottura
Il tasso di formazione del prodotto è dato dalla quantità di complesso del substrato enzimatico che si scompone
in una unità di tempo
... una volta raggiunto lo stato stazionario Vmax è dato dal prodotto, Vmax = k2 [E] 0

... .allora la Michaelis-Menten può essere espresso come

La costante di Michaelis-Menten, KM, è uguale alla concentrazione alla quale la velocità di reazione è la metà del
suo valore massimo
Significato di KM
se [S] = KM ⇒v0 = VMAX / 2 ⇒ definizione operativa di KM
KM substrato conc. a quale tasso di reazione è la metà del valore massimo
Misura [S] in cui sono occupati i siti semi-attivi degli enzimi,
e quindi il substrato richiesto conc. perché si verifichi la catalisi
La costante di Michaelis-Menten è caratteristica per ciascun enzima
Indica l'affinità enzimatica per l'enzima:
Valore di KM basso: concentrazione di substrato inferiore necessaria per raggiungere la metà di Vmax,
Ciò significa un'elevata affinità tra enzima e substrato

Alto valore KM significa maggiore concentrazione del substrato necessaria per raggiungere la metà Vmax,
ciò significa debole affinità tra enzima e substrato

• Tracciamento lineare (numero ridotto di punti sperimentali necessari)

Inibizione enzimatica
inibitori:
I ligandi che inibiscono il legame del substrato all'enzima possono essere:
– reversibili o irreversibili,
– competitivi (alto [S] annulla l'effetto) o non competitivi
(non dipendenza da [S], cioè allosterico)

Inibizione reversibile
Inibitore competitivo
Abbassare la velocità di catalisi (riducendo il numero di molecole di enzima disponibili)
Inibitore non competitivo
Riduce il turnover l'enzima
L'inibitore è in competizione con il substrato naturale per il sito attivo
Concentrazione di inibizione IC50:
Concentrazione di inibitore (farmaco, tossina, ecc.) Necessaria per ridurre l'attività del bersaglio (enzima, cellula,
microrganismo) del 50%
IC50 - Parametro utile per confrontare l'efficacia nell'inibizione bersaglio. Misura di potenza comune nella scoperta
di farmaci.
Formula:

Determinazione IC50 mediante saggio FRET

L'emissione specifica del segnale è causata dalla vicinanza di due fluorofori
FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) si basa sul trasferimento di energia tra due fluorofori, un
donatore e un accettore, quando nelle immediate vicinanze (50 - 100 Å circa). In generale le porzioni di donatore
e accettore sono diverse, nel qual caso FRET può essere rilevato dall'aspetto della fluorescenza dell'accettore o
dalla estinzione della fluorescenza del donatore.
Il kit di analisi utilizza substrati di peptidi FRET marcati con 5-FAM (fluoroforo) e QXL® 520 (quencher).
In un peptide FRET intatto, la fluorescenza del 5-FAM viene neutralizzata da QXL® 520. Sulla scissione del
peptide FRET da parte del MMP, la fluorescenza del 5-FAM viene recuperata e può essere continuamente
monitorata all'eccitazione / emissione l.
L'inibizione dell'enzima riduce il clivaggio, quindi la fluorescenza viene letta.

Inibitori competitivi (reversibili)

Non covalente
Interazioni ligando / enzima
Tempo di permanenza più lungo nel sito attivo ----> Migliore inibizione
La conoscenza del sito di legame porta alla progettazione di inibitori più potenti
Inibitori competitivi (reversibili): Sulfonamidi
Sulphanilamide 1 ° esempio di antibatterico sintetico

Inibitore del diidropteroato sintetasi che blocca il

Biosintesi di tetraidrofolato
ACIDO TETRAIDROFOLICO
(Carrier di unità C, cofattore enzimatico che fornisce unità C per la biosintesi di acidi nucleici)
Sulphonammidi competono con PABA
Formano un intermedio che non viene riconosciuto dagli enzimi successivi
Sono selettivi per i batteri
Sono batteriostatici (impediscono la crescita cellulare e moltiplicano ma non uccidono
batteri)
Resistenza batterica (stafilococco, pneumococco ....) Aumento di PABA
sintesi, dosaggio di farmaci sulfa maggiore richiesto

Un inibitore reversibile non competitivo (allosterico) si lega a un sito diverso rispetto al substrato, inibendo la
formazione del prodotto

Inibitori irreversibili
Legame covalente irreversibile con l'enzima
Acilazione / alchilazione di Enzima a.a. residui (-CH2Cl + HO-Ser "-CH2-O-Ser)
Altamente tossico (gas nervino)
Tranne l'Aspirina !!!! (Acetilazione COX)

Infiammazione
L'infiammazione è una risposta protettiva al danno tissutale causato da traumi, agenti patogeni, ecc ...
L'infiammazione spiega la risposta del corpo alla lotta contro i microrganismi patogeni e gli agenti irritanti e per i
suoi sforzi nel processo di riparazione dei tessuti.
Le prostaglandine
Il meccanismo d'azione della maggior parte dei farmaci antinfiammatori comporta l'inibizione della sintesi delle
prostaglandine.
Le prostaglandine sono molecole lipidiche, simili agli ormoni, che controllano diverse funzioni del corpo.
 Le condizioni patologiche portano ad un aumento del livello di acido arachidonico,
Da qui l'aumento dell'attività della cicloossigenasi
La cicloossigenasi prodotta può essere indotta (COX-2) o costitutiva
(COX-1)
Le prostaglandine prodotte in condizioni patologiche causano effetti diversi
• Vasodilatazione
• Dolore, agendo sul CNS inducendo iperalgesia
• Edema

Aspirin®: forma la corteccia del salice a Bayer

Acetil acido salicilico (aspirina): il farmaco più usato al mondo. Il suo ruolo nella prevenzione delle malattie
cardiovascolari e cerebrovascolari è stato rivoluzionario e uno dei più grandi successi farmaceutici del secolo
scorso
La corteccia di albero di salice (Salix spp.) È stata usata come antidolorifico e antipiretico (infusione) oltre 3500
anni fa
- Grecia antica
- Tribù sudamericane

Aspirina - Caratteristiche del Farmaco

Acido debole, rapidamente assorbito dallo stomaco e dall'intestino tenue.
Effetti farmacologici
ANALGESICO: moderato antidolorifico
ANTIPIRETICO: riduce la febbre, ma non altera la normale temperatura corporea.
ANTI-INFIAMMATORIA: potente ad alte dosi

Aspirina: meccanismo di inibizione

Acetilazione irreversibile del gruppo ossidril del residuo di serina 530.
Il gruppo acetilico impedisce all'acido arachidonico di raggiungere il sito attivo dell'enzima (impedimento sterico).

Aspirina - Altre indicazioni terapeutiche

Inibizione irrefrenabile di COX da parte dell'aspirina
COX2 - Blocco della sintesi delle prostaglandine
COX1 - Blocco della sintesi di trombossani
Cellule nucleate
Inibizione superata dalla nuova biosintesi degli enzimi
Cellule nucleate
Inibizione superata dalla nuova biosintesi degli enzimi
piastrine
(cellule anucleate)
Antinfiammatorio
effetto
proprietà antiaggreganti piastriniche (la cardioaspirina previene l'infarto)

Un basso dosaggio a lungo termine di Aspirina blocca la sintesi di trombossano A2 nelle piastrine in modo
irreversibile, determinando un effetto antiaggregante che porta alla fludificazione del sangue.
Questa è una proprietà chiave per ridurre l'incidenza di attacchi di cuore
Effetto antiaggregante
Obiettivo del Farmaco enzimatico
Inibitori irreversibili
Penicilline (transpeptidase vengono acilate)
Altamente tossico per i batteri!

Inibitori irreversibili-Penicillina G

• Active verso Gram + (stafilococco, meningococco, gonorrea) non verso i Gram -

• Non tossico
• Inefficace per via orale (degradazione dello stomaco a pH acido)
• Sensibile alle beta-lattamasi (enzimi prodotti da batteri resistenti per degradare la stessa penicillina)
• Possono causare reazioni allergiche
• farmaco penicillina semisintetico in continuo sviluppo per prevenire la resistenza e ridurre gli effetti
collaterali (ad es. Cefalosporina, amoxicillina ..)

PBP - Proteine leganti la penicillina

• La sintesi della parete cellulare batterica è regolata da specifici enzimi (transpeptidasi, carbossipeptidasi,
ecc.) Denominati PBP, poiché possono legarsi agli antibiotici b-lattamici in modo covalente
• Ogni antibiotico b-lattamico si lega preferenzialmente a un PBP specifico. Il tipo e il numero di PBP
possono determinare la sensibilità o la resistenza di un batterio specifico a uno specifico antibiotico b-
lattamico.
PACCO SLIDE 4
La farmacodinamica studia gli effetti biochimici e il meccanismo d'azione della droga
obiettivi:
• Per identificare i siti di legame ai farmaci
• Definire le interazioni chemio-fisiche tra il farmaco e la cellula
• Per chiarire i percorsi di risposta

recettori
Macromolecole che riconoscono segnali fisici specifici (per esempio luce) e chimici (ad esempio ormoni,
neurotrasmettitori) per produrre risposta biologica mediante trasduzione del segnale intracellulare

Le condizioni fisiologiche sono regolate da un complesso sistema di comunicazione basato su molecole

messenger:
• La comunicazione cellulare viene eseguita rilasciando una «molecola di segnalazione»
• questo messaggero chimico è diffuso ed è riconosciuto dalle cellule bersaglio attraverso i recettori
• L'interazione tra la molecola di segnalazione e il recettore nella cellula bersaglio scatena la seconda cascata di
messaggeri ... ..
...... .. Risposta biologica attesa
(Ad esempio contrazione muscolare, degradaion di acidi grassi ...)
Comunicazione errata -----> Stato patologico

Messaggeri: neurotrasmettitori, ormoni

(diversi percorsi di rilascio e modalità di rilascio)
• Monoamine: acetilcolina, noradrenalina, dopamina, serotonina.
• Amminoacidi: GABA (Ac. Γ-amminobutirrico), acido glutammico, glicina
• Ioni: calcio
• Neuropeptidi encefaline, endorfine
• Ormoni stereoidali: mirati ai recettori cellulari

RECETTORI NEUROTRASMETTITORI
I neurotrasmettitori sono rilasciati dai neuroni nelle sinapsi
e interagiscono con i recettori delle cellule bersaglio localmente

In generale un neurone rilascia principalmente un tipo di neurotrasmettitore e il recettore è specifico per il segnale
rilasciato (ogni cellula possiede diversi recettori)
Ogni cellula bersaglio ha un gran numero di nervi che comunicano con esso e non tutti usano lo stesso
neurotrasmettitore

Recettori steroidei, recettori adrenergici

Gli ormoni sono secreti dalle ghiandole endocrine nel sangue che raggiungono diversi tessuti e organi.
Solo le cellule che esprimono il recettore ormonale produrranno una risposta biologica
Classificazione dei recettori basata sulla struttura e sul meccanismo di azione corrispondenti Classificazione per
localizzazione cellulare:
• Tansmembrane Receptors TM Situato all'interno della membrana cellulare Riconnessione di molecole idrofile
sul sito extracellulare Molecole di segnalazione idrofiliche - non in grado di passare il doppio strato lipidico della
membrana senza uno specifico mezzo di trasporto
• Recettori intracellulari Situato all'interno della cellula Molecole di segnalazione lipofiliche (ad es., Ormoni
stereidali) in grado di passare facilmente la membrana cellulare.

TIPI DI RECETTORI
Recettori transmembrana
• -Ricettori iototropici
(Recettori dei canali ionici: regolazione del flusso di ioni attraverso la membrana)
• -Rettori metabotropici
(la loro attivazione induce una cascata di reazioni intracellulari: regolazione della sintesi dei secondi messaggeri)
Recettori intracellulari

Classi di TM Receptors
• Recettori canale
• Recettore accoppiato a proteine G (GPCR)
• Recettore legato alla chinasi
Diversità
•Struttura
• Percorso
• Tempo di risposta
▪ Ms per canali ionici
▪ S per GPCR
 ▪ Min / h per le chinasi
Ligandi endogeni
• Ormoni
• neurotrasmettitori

Target del farmaco-recettore

RECETTORI METABOTROPICI
GPCR (7-TM) -la famiglia più numerosa
Trasformazione del segnale mediante attivazione della proteina G (proteina di segnalazione)
Non direttamente accoppiato a enzimi o canali ionici
G Proteine
Localizzato nella superficie della membrana interna
Eterotrimeri formati da 3 subunità a, b, g
La subunità può legare i residui guanidinici (GTP / PIL)
Esistente in diversi tipi e sottotipi
Le proteine G specifiche interagiscono con specifici recettori

Il sito di legame dei GPCR non è comune a tutti i ligandi

Esempio: sito monoblocco di monoamine

Via di trasduzione del segnale

1. Neurotrasmitter - legame del recettore

2. Cambiamento formativo
3.Receptor / G Protein binding, un cambiamento conformazionale di subunità (affinità del PIL inferiore, affinità
GTP più alta)
4. GTP sostituisce il PIL
5. Cambiamento formativo e aGTP scisso da bg
6.Attiva una subunità si lega agli effettori modulando la loro attività:
Amplificazione del segnale
1.a subunità idrolizza GTP (regolamento End of Effector)
2. Le 3 subunità si ricombinano
3. Legandosi al recettore

AMPLIFICAZIONE DEL SEGNALE

Dipende dal tipo di proteina G e a-subunità
La subunità a-GTP regola l'attività degli effettori enzimatici (adenilato ciclasi e fosfolipasi) e alcuni canali ionici

Attivazione della cascata delle reazioni enzimatiche

Secondo messenger:
c-AMP, IP3, DAG
Risposta biologica

RECETTORI METABOTROPICI

Principali bersagli proteici G (regolazione di diverse funzioni biologiche tramite GCPCR):

• adenilato ciclasi: enzima responsabile della formazione di cAMP;
• fosfolipasi C: enzima responsabile della formazione di
-inositolo fosfato
-diacylglicerol;
• Canali ionici: calcio e potassio

GPCRs ESEMPI

Una cascata di risposte

Un piccolo ormone, l'adrenalina (noto anche come epinefrina), svolge un ruolo cruciale nella risposta al "pericolo
di lotta o fuga"
L'adrenalina viene rilasciata dal midollo surrenale - una regione interna delle ghiandole surrenali, che si trovano
appena sopra i reni - nel flusso sanguigno
Quindi fluisce nell'intero organismo legandosi ai recettori adrenergici sulla superficie cellulare.
Quando l'abbronzatura del recettore adrenergico viene stimolata dall'adrenalina, trasmette il segnale nella cellula
alla proteina G.
Il messaggio viene comunicato agli enzimi di segnalazione, come ad esempio ladenilato ciclasi, che amplifica il
segnale producendo alti livelli di molecole di cAMP

Sotto uno sparo di adrenalina, tutta la nostra energia è utilizzata per affrontare il pericolo / l'emergenza.
Alcune funzioni sono potenziate: la frequenza cardiaca aumenta, più glucosio diventa disponibile nel sangue,
mentre altre funzioni sono temporaneamente sospese per gestire meglio la crisi.
Cellule diverse forniscono risposte diverse agli stimoli di adrenalina.
Le cellule del muscolo cardiaco sono attivate, ma le cellule del sistema digestivo sono inibite, in attesa di un
momento migliore per svolgere il loro ruolo.
Al fine di coordinare risposte così diverse, le cellule umane sintetizzano 9 tipi diversi di recettori adrenergici,
ognuno dei quali è in grado di esercitare un effetto leggermente diverso.
Il recettore adrenergico beta 2 descritto (file PDB 2rh1) stimola la produzione e la conversione di energia
(conversione del glicogeno della fonte di combustibile del corpo nel suo glucosio del carburante).
Altri tipi di recettori adrenergici inibiscono invece il consumo di energia.
Esprimendo diversi tipi di recettori sulla superficie della membrana, le cellule sono in grado di modulare
la loro risposta all'adrenalina e affrontare l'emergenza.

Tutti i recettori adrenergici sono GPCR

Sottotipi principali: α (α1, α2) e β (β1, β2)
I recettori α1 sono accoppiati alla fosfolipasi C ed esercitano gli effetti rilasciando il Ca2 + intracellulare;
I recettori α2 sono accoppiati ad una proteina Gi (inibente la proteina G) che inibisce l'azione dell'adenilato ciclasi
riducendo la formazione di cAMP, poiché inibiscono anche i canali ionici.
I recettori β1 sono accoppiati a una proteina Gs (stimolante la proteina G) che aumenta il livello di cAMP attivando
chinasi di proteine che inducono anche aumento del livello di calcio intracellulare
I recettori β1 sono accoppiati a una proteina Gs che attiva PKA

Biosintesi dell'adrenalina: l'adrenalina viene sintetizzata nelle ghiandole surrenali dall'a.a. tirosina.
Il percorso sintetico:
Il primo passo riguarda l'ossidazione dell'anello di tirosene benzene, che produce L-DOPA (di-idrossi-fenil-alanina).
La successiva decarbossilazione (perdita di CO2) produce dopamina. L'idrossilazione enantioselctive sulla
posizione benzilica forma noradrenalina. Infine, la metilazione primaria di ammina fornisce adrenalina.

Le molecole fisiologiche responsabili dell'interazione

con questo tipo di recettori sono le catecolamine:
adrenalina e non-adrenalina

L'adrenalina è in grado di attivare entrambi i recettori

αeβ
La noradrenalina è selettiva per i recettori α e β1
(nessuna regolazione β2 e β3)

Principali bersagli proteici G (regolazione di diverse funzioni biologiche tramite GCPCR):

• adenilato ciclasi: enzima responsabile della formazione di cAMP;
• fosfolipasi C: enzima responsabile della formazione di
• inositolo fosfato
• diacylglicerol
 • Canali ionici: calcio e potassio

Canali ionici come bersaglio delle proteine G

RECETTORI IONOTROPICI
(canale ionico recettore-ligando gated)

Canali ionici come bersaglio delle proteine G

L'apertura della porta di blocco è direttamente regolata dall'interazione delle subuinità della proteina G con il canale
ionico. Il meccanismo non coinvolge second messenger come cAMP o IP.
I canali ionici sono complessi costituiti da subunità glico-proteiche che attraversano la membrana cellulare. Il
centro del complesso è cavo ed è rivestito di a.a. per dare un poro idrofilo, selezionare per una o poche specie
ioniche.
I recettori muscarinici del muscolo cardiaco favoriscono l'incrocio di ioni calcio.
Nei neuroni, gli oppioidi analgesici riducono l'eccitabilità aprendo i canali K +
• Calcio, sodio e potassio controllano alcune funzioni cruciali nella cellula: ad esempio il calcio aiuta a regolare la
contrazione muscolare.
• Il canale ionico regola la via e la via d'uscita da tutti gli ioni nella e all'esterno della cellula.
Alcune tossine agiscono come analgesiche, interagendo con i recettori dei canali degli ioni nervosi, per bloccare
il cancello.
Bloccando i canali e il passaggio degli ioni non c'è più l'impulso elettrico.

Recettori colinergici

Atropina: trattamento generico contro l'intossicazione da gas nervino

L'atropina è un antagonista muscarinico dell'acetilcolina.
I gas nervini inibiscono irreversibilmente l'acetilcolina esterasi, bloccando la degradazione dell'acetilcolina.
Il neurotrasmettitore circolante causa la morte a causa di effetti nicotinici e muscarinici sulla muscolatura.
L'atropina antagonizza l'attività muscarinica dell'acetilcolina, limitando gli effetti di avvelenamento da gas nervino
Le forze militari che operano in aree ad alto rischio di contaminazione dei gas nervini sono dotate di siringhe
atropina per l'autosomministrazione immediata.

RECETTORI IONOTROPICI

Selettività del canale ionico

Il canale ionico può mostrare un'elevata selettività verso una specie o lasciare passare diversi tipi di ioni. (Na +, K
+, Ca 2+)
Gli ioni sono circondati da una corona di molecole d'acqua (solvatazione), il cui diametro è proporzionale alla
concentrazione e alla carica elettrica.
Raggio atomico più piccolo
Maggiore concentrazione di carica
Maggiore solvatazione
Carica: Na + = K +
Dimensioni (raggio atomico): Na + <K +
Idratazione (rapporto di dilatazione)

La selettività dipende da un filtro molecolare specifico, costituito da

polare a.a. residui (regione P), in grado di formare interazioni deboli
con lo ione.
Lo ione si dissocia da una parte rilevante della molecola di H2O, per legarsi
per pochissimo tempo (<s) al suo sito specifico e attraversa il canale
mosso dal gradiente elettrochimico.
CANALI DI POTASSIO

Sono state risolte le strutture tridimensionali del canale K + in forma chiusa e aperta (rispettivamente la risoluzione
3.6 e 1.9 Å).
Il canale K + è un tetramero formato da 4 subunità che formano il canale.
Ogni subunità ha 3 eliche principali transmembrane: elica interna, elica esterna e porus.
L'elica interna si apre al poroso centrale, mentre l'elica esterna si affaccia sulla membrana lipidica.
I loop posizionati dopo il termine C delle eliche del porus formano il filtro di selettività, che seleziona gli ioni.
Struttura tridimensionale del canale K + dello stato aperto:
• Le unità carboniliche sono dirette verso la superficie dei pori nel filtro di selettività per coordinare gli ioni K +;
• Catene laterali idrofobiche sono accesi a nucleo idrofobo che circonda il filtro, a stabilizzare gli atomi di ossigeno
che lega gli ioni K +.

RECETTORI COLINERGICI

Il recettore nicotinico (abbreviazione nAChR -

recettore nicotinico dell'acetilcolina) è un recettore
ionotropico che permette agli ioni di attraversare di
attraversare la membrana cellulare, dopo averli
legati con il suo ligando endogeno.

Il recettore muscarinico appartiene ai GPCR intracellulari mediate dal secondo rilascio di

La sua attivazione determina una cascata di reazioni messaggeri
Il neurotrasmettitore dell'acetilcolina viene rilasciato
dal neurone e attiva i recettori nicotinici che portano
alla contrazione dei muscoli striati.

SEGNALAZIONE - PUNTI CHIAVE

• I Messaggeri chimici sono in genere piccole molecole a basso peso molecolare;

• I recettori sono macromolecole biologiche
• Le forze coinvolte nella complessa formazione tra la molecola di segnalazione e i suoi recettori sono già ben
note:
o interazioni elettrostatiche,
o ione-dipolo e dipolo-dipolo,
o H Bond,
o carica di trasferimento,
o interazioni idrofobiche
o Le forze di der der Waals.
• La formazione del recettore ligando è un processo di equilibrio (segue la legge di azione di massa)

Il meccanismo di segnalazione è costituito da diverse fasi, che hanno diversa importanza per le diverse molecole
di segnalazione:
1. Biosintesi e deposito della molecola di segnalazione
2. Rilascio e trasporto della molecola di segnalazione
3. Molecola / recettore di segnalazione di interazione
o Accendere
o Release della molecola inalterata (nessuna reazione)
4. Reuptake della molecola di segnalazione inalterata
5. Rottura metabolica della molecola di segnalazione

TRASDUZIONE DEL SEGNALE

Il legame messaggero / recettore induce

• Cambiamento conformazionale del recettore
• Cambiamento di altri componenti della membrana cellulare
• Canali ionici
• Enzimi legati alla membrana
• Risposta biologica
Se un processo biologico è indotto dall'interazione tra una molecola di segnalazione e il suo recettore, moduleremo
idealmente la risposta biologica progettando molecole specifiche.

Il legame con il ligando causa il cambiamento conformazionale del recettore

o Agonisti: attività intrinseca
 o Antagonisti: non possiedono attività intrinseca
o Agonisti parziali: minore efficienza, induzione di un cambiamento conformazionale inferiore, l'effetto degli
agonisti è solo parzialmente raggiunto (nessun effetto massimo)

I farmaci possono modulare la risposta biologica tramite:

1) Stimolare o bloccare un recettore specifico usando agonisti selettivi o antagonisti

gli agonisti imitano la struttura della molecola di segnalazione e si legano al recettore (anche con
maggiore efficacia) causando la risposta biologica attesa;
gli antagonisti si legano al recettore senza determinare la risposta biologica attesa e inibendo il legame
della molecola di segnalazione se presente

2) Regolazione diretta dei livelli delle molecole di segnalazione: i livelli possono essere aumentati o diminuiti
interferendo con la biosintesi o i processi di degradazione della molecola di segnalazione, o modificando il deposito,
il rilascio e la ricaptazione.

SEROTONINA

Nel sistema nervoso centrale, la serotonina svolge un ruolo fondamentale nella regolazione dell'umore, del sonno,
della temperatura corporea, della sessualità e dell'appetito
La regolazione della serotonina è coinvolta in diversi disturbi neuropsichiatrici, come l'emicrania, il disturbo
bipolare, la depressione e l'ansia

Diverse condizioni depressive sono associate a carenza di livelli di serotonina (5-idrossitriptamina, 5HT) nel SNC.

Esistono oltre 15 tipi di recettori della serotonina, distribuiti nei diversi organi tra cui il sistema nervoso centrale.
La serotonina non è selettiva, interagisce con il maggior numero di recettori che può raggiungere, producendo una
vasta gamma di effetti nel sistema respiratorio, cardiovascolare e gastrointestinale ma non nel sistema nervoso
centrale.

Il sistema nervoso centrale è protetto dalla barriera emato-encefalica, che la serotonina non può attraversare.
• I recenti farmaci antidepressivi agiscono direttamente sul livello della molecola di segnalazione inibendo la
"ricaptazione" della serotonina nel nervo terminale (SSRI: Prozac, citalopram, ...)
• L'uso di agonisti (in grado di sostituire la serotonina entrando nel SNC e in modo selettivo con i recettori 5-HT2)
non ha portato a risultati soddisfacenti, mentre l'antagonizzazione del sottotipo 5-HT7 ha ricevuto un'attenzione
recente.
• I primi farmaci antidepressivi agiscono inibendo il catabolismo della serotonina catalizzato dagli enzimi MAO.
Tuttavia, il loro uso è limitato per effetti collaterali negativi. (I MAO influenzano i livelli di tutti i neurotrasmettitori e
bloccano il metabolismo della tiramina
MethyleneDioxyMethylAmphetamine principio attivo di Ecstasy (XTC) è stato sintetizzato per la prima volta nei
laboratori Merck nel 1912, mostra effetti psichedelici significativi
Mostra effetti neurotossici sui neuroni dopaminergici e serotoninergici che compromettono l'integrità del sistema
È principalmente un antagonista di siti serotoninergici: inibisce la ricaptazione e aumenta il rilascio di serotonina
(5-HT),
Dopo il massiccio rilascio di serotonina, l'MDMA causa un effetto opposto, poiché blocca la sintesi della
serotonina mediante l'inibizione dell'enzima triptofano idrossilasi

Questa inibizione è legata a diversi fattori:

- meccanismo di feed-back negativo prodotto da un deposito di serotinina;
- Legame irreversibile all'enzima di un metabolita di MDMA (chinoide altamente reattivo);
-La formazione di radicali liberi durante il metabolismo di MDAD bloccherebbe l'enzima ed è responsabile della
neurotossicità

SISTEMA ENDOCANNABINOIDE
CB1 e CB2 (recettori)
PLD e FAAH (enzimi)
AT (trasportatore)
AEA e AG (messaggeri)
Gli endocannabinoidi rappresentano una nuova
classe di modulatori, isolati dal SNC e dai tessuti
periferici.
AEA (anandamide) e 2-AG (2- arachidonoilglicerolo).
Recentemente anche 2-AGE (noladin, 2-
arachidonoyl glicerol-ehter) e NADA (N-
arachidonoyl-dopamina)
AEA imita gli effetti psicoattivi prodotti dalla cannabis
(cannabinoidi) che inducono relax e sonnolenza.
Derivato da "ANANDA" beatitudine interiore e
"AMIDE" per la struttura chimica.

PACCO SLIDE 5
RECETTORI COLLEGATI KINASE
INTERAZIONE DEL RECETTORE CON I FARMACI

La costante di associazione definisce l'affinità tra un farmaco e il suo recettore.

Negli studi di legame dei recettori la costante di dissociazione è tradizionalmente considerata e inversamente
correlata all'affinità di [D] per [R]

La costante di dissociazione KD definisce l'affinità di un farmaco per uno specifico recettore

Concentrazione necessaria per occupare il 50% dei recettori

Affinità (per confrontare le proprietà di due farmaci):

Agonista B Kd 1mM
Agonista A Kd 1 nM (10-3 mM)
Kd = concentrazione che porta ad un'occupazione del recettore del 50%

Per occupare il 50% dei recettori con il farmaco B la concentrazione richiesta è 3 di ordine superiore a quella di A

COMPETIZIONE
Se due farmaci si legano a un recettore in modo reversibile, c'è un'interazione competitiva che dipende dall'affinità
(Kd) e dalla dose

Studio della correlazione tra concentrazione e risposta del farmaco

CURVE DOSE / RISPOSTE
• risposta di livello
• risposta on/off

DOSE / RISPOSTA DEL FARMACO

La correlazione tra la dose somministrata di un farmaco e la risposta clinica può essere estremamente complessa.
Con accurati sistemi in vitro, la correlazione tra la concentrazione del farmaco e il suo effetto biologico può essere
semplificata e interpretata attraverso semplici modelli matematici.

la correlazione tra concentrazione di farmaci e risposta è semplificata dal modello di equazione di Michaelis
Menten

massimo effetto: massima risposta del sistema al farmaco - misura dell'efficacia

Concentrazione di farmaco EC50 richiesta per produrre una risposta pari al 50% del massimo effetto potenziale
Misura della potenza EC50

Efficacia = misura il massimo effetto potenziale

Potenza = valore EC50

POTENZA
La potenza spiega la dipendenza dell'effetto biologico dalla dose del Farmaco.
Corrisponde all'affinità della droga per il recettore.
La posizione dell'asse x sulla curva dose-risposta mostra la potenza del farmaco.
La potenza influenza la dose necessaria necessaria per produrre un certo effetto.

EFFICACIA
L'EFFICACIA rappresenta l'effetto massimo che un farmaco può produrre.
L'altezza della curva dose-risposta è responsabile dell'efficacia.
L'efficacia non dipende dalla dose, ma tiene conto delle proprietà intrinseche di un farmaco per indurre un certo
effetto. Le droghe A e B che agiscono da agonista sullo stesso recettore devono corrispondere a curve sigmoidali
parallele.
Agonisti A e B dello stesso recettore
Kd A <Kd B
A ha un'affinità maggiore di B
A è più potente di B
A e B hanno la stessa efficacia
(stesso effetto massimo)

EFFETTO TERAPEUTICO VS TOSSICO

Indice terapeutico
di una droga
(o rapporto terapeutico)
TI = TD50 / ED50
Sicurezza dei farmaci
TD1 / ED99
INDICE Terapeutico (TI)
È una misura della sicurezza dei farmaci
Il più alto è il TI più sicuro del farmaco
I farmaci con TI basso sono difficili da gestire

Esistono diversi modelli (Teorie) usati per spiegare l'interazione tra farmaco e recettore e la generazione
della risposta biologica
1. Teoria dell'occupazione dei recettori
2. Teoria dell'efficacia
3. Teoria dei recettori a due stati

TEORIA DEL RECETTORE

1. TEORIA DELL'OCCUPAZIONE
(Clark-Ariens-Stephenson)
l'effetto del farmaco è direttamente proporzionale al numero di recettori occupati e quindi alla concentrazione del
complesso farmaco-recettore
Max. Effetto: tutti i siti recettori sono occupati

In modo che KD = EC50

Concentrazione che produce il 50% dell'effetto massimo

Effetto farmaco correlato alla frazione dei recettori occupati.

Effetto massimo = occupazione del recettore al 100%
Determinazione della frazione occupata
Determinazione dell'effetto per ogni concentrazione di farmaco
Equazione generalizzata per ligando, L, con EC50 = K):
E = Emax · [L] / (Ec50 + [L])
dal momento che l'intensità della risposta di un recettore ad un farmaco è proporzionale alla concentrazione di
farmaci, si può affermare che:
• La risposta al farmaco e la curva del ligando del recettore si sovrappongono;
• La costante della formazione del complesso farmaco-recettore rappresenta la metà dell'effetto massimo
Diagramma fRL vs [D] e Max Effect% vs [D]
Concentrazione che produce la metà dell'effetto Massimo

Nella maggior parte dei casi l'effetto massimo è raggiunto occupando solo una frazione dei siti recettori
«Riserva per recettori o ricettori di riserva»
In questo caso EC50 <KD

ANTAGONISTI:
• Gli antagonisti mostrano affinità per il recettore, ma non hanno attività intrinseca al recettore. Un
antagonista che si lega al recettore in modo reversibile di azione di massa viene definito antagonista
competitivo.
• Poiché l'antagonista non ha attività intrinseca, una volta che si lega al recettore, blocca il legame degli
agonisti al recettore competendo per lo stesso sito o legandosi a un sito allosterico
• In entrambi i casi l'attività agonista è depleated

ANTAGONISTI:
Legano con alta affinità al recettore senza indurre una risposta biologica.
L'effetto farmacologico antagonista è dovuto alla sua capacità di inibire l'effetto ligando endogeno sullo stesso
recettore.

L'effetto ANTAGONISTA può essere:

"Sormontabile" (l'inibizione indotta viene superata aumentando la concentrazione di agonisti, ritornando all'effetto
iniziale, antagonista reversibile)
"Insormontabile" (l'inibizione indotta non può essere superata nemmeno a concentrazioni elevate di agonisti,
antagonista irreversibile)
Potrebbe essere competitivo o allosterico

La determinazione quantitativa dell'effetto antagonista è facilmente esemplificata dal grafico della curva farmaco-
risposta.

Un antagonista competitivo si lega al recettore in modo reversibile e può essere sostituito in presenza di un
eccesso di agonista secondo la legge di azione di massa.
Questo aspetto porta a rilevanti implicazioni farmacologiche.
L'intensità e la durata dell'effetto antagonista competitivo dipendono dalla concentrazione della frazione di farmaco
non legato e dalla concentrazione plasmatica.

DRUG DOSE - RESPONSE RELATIONSHIP

Modello di azione antagonista competitivo R (Recettore) C (conc. Antagonista) A (conc. Agonista)

LEGGE SULL'AZIONE DI MASSA:

• Con aumento di [C], l'equilibrio si sposta verso sinistra riducendo la concentrazione di RA del complesso
di efficacia;
• Con l'aumento di [A], l'equilibrio si sposta a destra riducendo la concentrazione del complesso RC inattivo

Come misuriamo l'EC50 in assenza di un effetto bilogico? ...

Definizione del DOSE RATIO, DR

DR superiore, affinità antagonista più elevata.

DR si riferisce alla concentrazione di antagonista C, mediante la seguente equazione (Schild):
Rapporto dose (DR) = 1 + [C] / KC

DOSE RATIO, DR
il fattore che aumenta la concentrazione di agonisti per produrre lo stesso livello di occupazione di equilibrio della
concentrazione di antagonista aumenta
Schild (1947)
La distanza tra le curve dipende dall'antagonista conc.

L'antagonismo competitivo sposta la curva agonista in modo parallelo

• L'effetto massimo è conservato,
• l'affinità agonista per il recettore (1 / K) diminuisce.
• modifica in EC50 apparente
• Distanza curve = DR

Un antagonista competitivo
riduce la potenza dell'agonista

DR = 1 + [C] / KC
antagonista non competitivo L'affinità agonista per il recettore non cambia, ma l'effetto massimo non può essere
raggiunto - ridotta disponibilità di siti recettori che non possono essere superati in modo competitivo
curva a ottenuta all'aumentare dell'agonista conc.
curva b ottenuta all'aumentare della concentrazione di agonista in presenza di una dose di antagonista fissa, che
si lega irreversibilmente

Riduzione dell'effetto massimo senza influire sulla potenza.

ANTAGONISMO NON COMPETITIVO

2. EFFICACIA O TEORIA DELL'ATTIVITÀ COSTITUTIVA

L'antagonismo non supporta la teoria dell'occupazione:
L'effetto non è solo correlato all'occupazione del recettore
• L'affinità per il recettore (indice di potenza) è correlata alla posizione della curva dose-risposta
• L'efficacia o attività costitutiva, indica la capacità del farmaco di indurre una risposta biologica dopo il
legame al recettore.
Valori di attività costitutiva: agonista = 1, antagonista = 0, agonista parziale tra 1 e 0)

ANTAGONISMO

Affinità senza efficacia: effetto misurabile solo in presenza di un agonista.

Curve dell'effetto di concentrazione A) superabile B) insormontabile

Affinità (definisce potenza)

Efficacia o attività costitutiva (capacità di indurre la risposta biologica basata sui cambiamenti conformazionali
del recettore)
Concetto di agonista parziale
Agonista inverso: induce una risposta farmacologica opposta all'agonista che commuta il recettore
costitutivamente attivo allo stato basale

Ligando endogeno (neurotrasmettitore, ormone ecc.)

Interagisce con i recettori producendo una risposta biologica
Agonisti: induce una risposta biologica per induzione dei segnali di trasduzione è dotato della stessa attività
costitutiva del ligando endogeno (a = 1).
Antagonista: farmaco che mostra affinità verso il recettore da parte di un'attività intrinseca (a = 0).
L'effetto biologico è esercitato inibendo l'azione endogena del ligando
Agonisti parziali: gli agonisti parziali si legano e attivano un recettore, ma non sono in grado di ottenere la
massima risposta possibile prodotta da agonisti completi (a <1).
Mostrano sia effetti agonistici che antagonisti. In presenza di un agonista completo, un agonista parziale agirà
come antagonista, facendo concorrenza con l'agonista completo per lo stesso recettore e riducendo così la
capacità dell'agonista completo di produrre il suo massimo effetto. L'equilibrio di attività tra effetti agonisti e
antagonisti varia da una sostanza all'altra, in base alle loro attività intrinseche. (Definito anche come "antagonista
parziale").
Agonisti inversi: un agonista inverso è un ligando che si lega allo stesso sito di legame recettore come un
agonista e non solo antagonizza gli effetti di un agonista, ma, inoltre, esercita l'effetto opposto sopprimendo la
segnalazione del recettore spontaneo (a = -1). Stabilizza la conformazione inattiva del recettore
Esempio: Ligando endogeno e agonista puro: contrazione.
Agonista inverso: rilassamento.

Perché i farmaci che si legano allo stesso recettore possono mostrare una diversa attività intrinseca?
3. TEORIA DEI RECETTORI A DUE STATI
Il recettore ha uno stato di riposo e uno attivo che
mostrano differenti affinità con le droghe.
Il legame preferenziale del farmaco a uno dei due
stati può spostare l'equilibrio determinando una
diversa attività intrinseca.

L'efetto farmacologico dipende dal complesso predominante del farmaco-recettore

L'effetto intrinseco (α) dipenderà dai relativi valori Kd del farmaco
(quindi sulla frazione legata) verso il recettore nei due stati conformazionali.

• Un agonista sarà una sostanza in grado di spostare l'equilibrio nella forma R *; un agonista inverso sarà
una sostanza in grado di spostare l'equilibrio nella forma R; un agonista parziale mostrerà caratteristiche
intermedie
• L'induzione della configurazione al R o R * può essere regolata anche da sostanze che non interagiscono
con il sito di legame del recettore (modulatori allosterici), ma con siti allosterici periferici. Questo tipo di
interazione produce cambiamenti conformazionali che possono alterare l'equilibrio di configurazione R /
R *.
 • Un recettore può assumere due conformazioni, chiamate R (attive) e T (inattive) che sono scambiabili.

• L'interazione farmaco-recettore può indurre la conformazione del recettore R e determinare una risposta
biologica o indurre la conformazione T senza indurre alcuna risposta.

DESENSIBILIZZAZIONE E SENSIBILIZZAZIONE
• Un'esposizione prolungata del recettore a un farmaco può causare desensibilizzazione mediante
rimozione del complesso D-R (tramite endocitosi) o mediante riduzione della sintesi del recettore.
• Un'esposizione prolungata del recettore ad un antagonista può causare sensibilizzazione poiché la cellula
aumenta la sintesi del recettore per bilanciare il blocco.

TOLLERANZA E DIPENDENZA

La sensibilizzazione può spiegare il fenomeno della tolleranza e della dipendenza

• Tolleranza: situazione in cui è richiesto un livello più alto di un farmaco per ottenere la stessa risposta
biologica. Se un farmaco agisce per sopprimere il legame di un messaggero chimico, allora la cellula può
rispondere aumentando il numero di recettori. Ciò richiederebbe un aumento della dose per riguadagnare
lo stesso livello di antagonismo. Rende conto degli effetti amplificati dopo l'interruzione della
somministrazione (cellula supersensibile a livello normale di messaggeri).
• Dipendenza: sintomi di astinenza angoscianti risultanti dalla cessazione di un determinato farmaco. In
caso di sensibilizzazione ciò continuerà fino a quando il numero di recettori ritornerà al livello originale
(diversamente dagli agonisti degli oppioidi)

RELAZIONE FRA CONCENTRAZIONE DI FARMACO E RISPOSTA

Relazione tra la concentrazione di un singolo ligando

e il suo grado di armonia con il recettore
Se è presente, con complessità C, un secondo
ligando antagonista che gareggia con reversibile con
il primo
A per lo stesso recettore, si ottiene la relazione
seguente:

la EC50 è ridotta di un fattore legato alla concentrazione di antagonista rispetto al rapporto di dose;
Per ottenere lo stesso effetto in assenza di antagonista, è necessario che la concentrazione [A] di agonista aumenti,
raggiungendo il valore [A *]

PACCO SLIDE 6

Cosa sono gli analgesici oppioidi?

Analgesici, o antidolorifici, che si legano ai recettori oppioidi che si trovano principalmente nel:
• CNS
• Tratto gastrointestinale
Esistono numerose classi generali di oppioidi:
• Op oppiacei naturali
Alcaloidi contenuti nella resina del papavero da oppio tra cui morfina, codeina e tebaina
• Oppiodi di semisintesi
Creato da oppiacei naturali come idromorfone, ossicodone e diacetilmorfina (eroina)
• Oppioidi completamente sintetici
Fentanil, metadone e tramadolo
• Peptidi oppioidi endogeni
Prodotto naturalmente nel corpo, come endorfine, encefaline, dinorfine e endomorfine

Panoramica

• History
• Morphine
• SAR di Morphine
• Drug Dissezione di morfina
• Morphine Analogues
• Recettori dei oppioidi e legame dei recettori
• Agonisti e antagonisti
• Peptidi oppioidi endogeni
• Il futuro

IL PRINCIPIO ATTIVO: LA MORFINA

• Prende il nome dal Dio greco, Morpheus (Dio dei sogni)

 • Ottimo per trattare il dolore opaco e costante piuttosto che il dolore periodico acuto
• Effetti collaterali:
➢ Eccitazione (massimizzare)
➢ Euforia
➢ Nausea
➢ La costrizione della pupilla
➢ Stipsi
➢ Tolleranza e dipendenza
➢ Depressione della respirazione (minimizzare)

• Gli effetti collaterali pericolosi sono quelli di tolleranza e dipendenza, alleati con gli effetti che la morfina
può avere sulla respirazione
• La più comune causa di morte per overdose da morfina è il soffocamento
• Questi effetti indesiderati in un farmaco sono particolarmente pericolosi e portano a gravi sintomi
di astinenza quando il farmaco non viene più assunto

MORFINA – SAR

ANALOGHI DELLA MORFINA - CODEINA

Etere metilico di morfina
• Affinità 0.1% di morfina
• Attività
-20% quello della morfina
• Pro-farmaco di morfina
-Metabolizzato da O-demetilazione nel fegato per produrre morfina
(nessuna attività analgesica se iniettata direttamente nel cervello)
• Tratta:
-Malattia moderata
-Coughs
-diarrea
• Commercializzato come:
-Tylenol® con codeina
-Hydrocodone
-Vicodin® (con Thebaine)

Morphine Analogues - Diamorphine (Heroine)

3,6-diacetil estere di morfina

• Attività:
-2x quello della morfina
• I gruppi polari sono nascosti, facilitando l'attraversamento di BBB.
-Diacetilmorfina viene metabolizzata in 6-monoacetilmorfina (6-MAM) e morfina nel cervello
• Tratta:
-Pain in pazienti terminali
• Effetti collaterali
-Euforia, dipendenza, tolleranza
• Precedentemente commercializzato come:
-Heroin, "droga" (Bayer)
 Prima sintetizzata nel 1874 da un chimico inglese, ma divenne popolare solo più di 20 anni dopo
Dal 1898 al 1910, sotto il nome di eroina, la diacetilmorfina è stata commercializzata come sostituto della morfina
non tossicizzante e sedativo della tosse

Morphine Analogues - Morphinans

Rimozione dell'anello D (ponte Ether rimosso)
•Attività:
-5x quello della morfina
•Vantaggio:
-Può essere preso per via orale
-Dura di più
- Più facile da sintetizzare
• Ma effetti collaterali aumentati:
-Alta tossicità, dipendenza comparabile
• Commercializzato come
-Levo-Dromoran®

Analoghi della morfina – Benzomorfani

Rimozione degli anelli C e D

•Attività
-Some come morfina (Met)
-4x + quello della morfina (Phe)
• Vantaggi
-Nessuna proprietà di dipendenza
-Non deprimere la respirazione
-Dura di più
•Effetti collaterali
-Allucinogeno
• Commercializzato come
-Prinadol, Norphen
-Fortale, Talwin NX

Analoghi della morfina - 4-fenilpiperidine

 Rimozione degli anelli B, C, D
•Attività:
-100 volte quello della morfina
• Vantaggi:
-Cross BBB in modo efficiente
-Veramente facile da fare
-Ripido inizio, breve durata
-Può essere somministrato in qualsiasi modo (IV,
orale, transdermico, buccale)

•Usato per:
-Anestesia
-Gestione del dolore cronica
•Effetti collaterali:
- Depressione respiratoria profonda
-Più avvincente dell'eroina
-Meno euforia, più sedazione
• Commercializzato come:
-Sufenta (usato in chirurgia)
-Carfentanil (utilizzato nella pratica veterinaria)
- "Percopop", OxyContin

Rimozione degli anelli B, C e D

modalità di rilegatura più flessibile e comune?
Fentanyl
• Attività
100 x quella di Morphine
• Molto lipofilico (incrocio BBB)
• Vantaggi:
- Può essere somministrato per via orale
- Effetti collaterali meno gravi
• Commercializzato come
- Dolophine®, Amidone®, Methadose®

Morphine Analogues – 4-phenylpiperidines

Removing Rings B,C and D

more flexible, common binding mode?
Fentanyl
• Activity

100 x that of Morphine

• Very lipophilic (BBB crossing)
• Advantages:
– Can be given orally
– Less severe side effects
• Marketed as
– Dolophine®, Amidone®, Methadose®

Morphine Analogues - Metadone

 Rimozione degli anelli B, C, D, E
•Attività
Paragonabile alla morfina
•Abituato a:
Superare la dipendenza da eroina o morfina
(purtroppo scambia solo la dipendenza)
• Vantaggi:
-Può essere somministrato per via orale
-A meno effetti collaterali gravi (emetici, costipazione)
• Commercializzato come
-Dolophine®, Amidone®, Methadose®

Conversione equianalgesica

• Morfina 10 mg
• Codeina 60 mg
• Hydromorphone 2mg
• Ossicodone 5-7,5 mg
• Metadone 1 mg

SAR – caratteristiche

Altri fattori importanti per il legame del recettore:

-Stereochemistry
• Gli enantiomeri di molti degli analoghi sono stati testati per l'attività analgesica. Nel complesso, non ne avevano.
-Rigidification
• Utilizzato per mantenere la formazione attiva ed eliminare le conformazioni alternative
• Aumenta la selettività per i recettori
RECETTORI - meccanismo d'azione

• L'eroina modifica l'azione della dopamina nel cervello.

• Una volta attraversata la barriera emato-encefalica, l'eroina viene convertita in morfina, che funge da agonista.
• Questo legame inibisce il rilascio di GABA dal terminale nervoso, riducendo l'effetto inibitorio del GABA sui
neuroni dopaminergici.
• L'aumentata attivazione dei neuroni dopaminergici e il rilascio di dopamina nella fessura sinaptica determinano
l'attivazione della membrana post-sinaptica.
• L'attivazione continua della via della ricompensa dopaminergica porta a sentimenti di euforia e "alti" associati
all'uso di eroina.
Agonisti e antagonisti

Peptidi oppioidi endogeni

• antidolorifici naturali del corpo
• Avere una leggera preferenza per il recettore δ
• Metodo alternativo per alleviare il dolore inibire le
peptidasi che le degradano thiorphan (ancora
nuovo)
• 3 tipi di EOP:
-Enkephalins
-Dynorphins
-Endorfine
Lunghezza da 5 a 33 a.a.

Il futuro

• Trova un agonista che si lega esclusivamente al recettore κ

• Esplorare ulteriormente i sottotipi di μ-recettore per vedere se alcuni di essi non causano effetti collaterali dannosi
• Recettori periferici di oppiacei - evitare l'ostacolo di BBB
• Bloccare i recettori postsinaptici coinvolti nella trasmissione di un segnale del dolore
• Agonisti per il recettore dei cannabinoidi: questi tipi di agonisti possono svolgere un ruolo nel potenziare gli effetti
degli analgesici oppiacei, permettendo di somministrare meno oppiacei

IL CASO DI ASSENZIO

Composizione chimica di absinth (Duke 1985).

• olio essenziale (fino all'1,7%)

• phellandrene, pinene, tujone (dal 3 al 12%),
• alcool di thujyl e suoi esteri (acetato, isovalerato e palmitane),
• isabolene, campene, cadinene, nerolo,
• azuleni: camazulene, 3,6-diidrochamazulene e 5,6-diidrochamazulene.
• L'erba contiene anche glucosidi amari:
• assenzio, acido ossalico, anabsintina, astabsina, artametina, acido succinico
• tannino, resina, amido, malati e alcuni sali

Il tujone è probabilmente il più importante composto biologicamente attivo dell'assenzio.

THUJONE
Gli effetti tossici di a-tujone nei mammiferi sono ben
stabiliti, ma la modalità di azione neurotossica è poco
conosciuta

Thujone - Ipotesi del meccanismo di azione

1. somiglianza strutturale con tetraidrocannabinolo - THC (del Castillo et al., 1975) non supportato
sperimentalmente (nessuna prova vincolante)
2.alfa-tujone blocca i recettori del cervello per l'acido gamma-aminobutirrico (GABA) - inibitore naturale degli
impulsi neve Senza l'accesso ai neuroni GABA sparare troppo facilmente e la loro segnalazione va fuori controllo.
• Il confronto con picrotoxinina, il classico antagonista del recettore GABAA, ha rivelato segni di avvelenamento
simili
• Riduzione della tossicità del diazepam, del fenobarbitale e dell'etanolo (Hold et al. - PNAS 2000)
LD50 di alfa-tujone nei topi è di circa 45 mg / kg
La curva di tossicità è molto pura
Con una dose di 30 mg / kg non è stata osservata morte
È stata registrata una dose di 60 mg / kg di mortalità al 100%
Oggi bere Absinth
 Il vecchio assenzio conteneva circa 260 ppm di alfa-tujone
L'assenzio presente in giornata ha generalmente meno di 10 ppm di questo composto

PACCO SLIDE 7
TEMI
FARMACOCINETICA

• Absorption
• Distribution
• Metabolism
• Excretion
• Toxicity

I pazienti possono soffrire di:

• I farmaci tossici possono accumularsi
• I farmaci efficaci potrebbero non avere alcun beneficio perché le dosi sono troppo piccole per stabilire una
terapia
• Un farmaco può essere rapidamente metabolizzato.

Studio della concentrazione di un farmaco e dei suoi metaboliti nei diversi fluidi e organi corporei per un periodo
di tempo, analizzando i processi che regolano:

Assorbimento
Distribuzione
Metabolismo
Exctretion
"Azione del corpo sulla droga"

L'efficacia del farmaco dipende dalla sua concentrazione nel sito target
Dosaggio troppo basso -> nessun effetto -> soglia di efficacia
Dosaggio troppo elevato -> effetto tossico -> soglia di tossicità

Finestra terapeutica: concentrazione di farmaco tra

le due soglie in grado di esercitare l'effetto
terapeutico
Indice terapeutico: rapporto tra tossicità e soglie di
efficacia

• Dose efficace (ED50) = dose alla quale il 50%

della popolazione mostra una risposta
• Dose tossica (TD50) = dose a cui il 50% è
tossico
• TI = TD50 / ED50 grado di separazione tra
dosi tossiche e terapeutiche

Processi che regolano il tempo richiesto per l'effetto del farmaco:

• apparenza
• durata
• intensità
Importante per: posologia e tossicità
Regime posologico - somministrazione di farmaci:
• Quanto?
• Come?
• Quante volte?
Nella maggior parte dei casi, un farmaco viene somministrato in un distretto dell'organismo (ad esempio l'intestino)
e deve raggiungere il sito di azione bersaglio in un altro distretto (ad esempio cervello)

Il farmaco si diffonde attraverso le barriere che separano i diversi compartimenti

Proprietà chemio-fisiche della droga

Vie di somministrazione (orale, intramuscolare, endovenosa ...)
Forma farmaceutica (capsula, compresse, soluzione ...)

ASSORBIMENTO

The Lipinski "Rule of Five" (1)

MW≤ 500 (opt = ~ 350)
H Bond Acceptors ≤ 10 (opt = ~ 5)
Donatori H Bond H ≤ 5 (opt = ~ 2)
-2 <cLog P <5 (opt = ~ 3.0)
Obbligazioni rotabili ≤ 5

Eccetto per la IV (endovenosa), l'assorbimento richiede l'attraversamento delle membrane per raggiungere il
flusso sanguigno
Diffusione passiva: legge di diffusione di Fick Equazione di Henderson-Hasseblech
Trasporto attivo: trasporti, vettori
Endocitosi ed esocitosi

DIFFUSIONE

DIFFUSIONE ACQUOSA:
Diffusione di una sostanza chimica attraverso la fase acquosa da una regione ad alta concentrazione ad una
regione a bassa concentrazione regolata dalla legge di Fick (concentrazione gradiente).
Per i farmaci caricati, la diffusione sarà influenzata anche dai campi elettrici circostanti (ad es. Il potenziale di
membrana).

DIFFUSIONE LIPIDICA: fattore principale che regola il trasferimento del farmaco tra diversi compartimenti per
l'alto numero di barriere lipidiche che separano i vari distretti dell'organismo.
Poiché la barriera separa i composti acquosi, la diffusione dipenderà dal coefficiente di ripartizione acqua / lipidi.
Per i composti acidi e basici la diffusione sarà influenzata dal pH (equazione di Henderson Hasselbach)

CARRIERS: sostanze solubili alte o basse (peptidi, a.a., glucosio, ormoni ecc ...) si legheranno a portatori specifici
per diffondersi attraverso le barriere (trasporto attivo o diffusione facilitata).
I vettori possono essere bersagli farmacologici o agire come trasportatori per far passare la droga attraverso le
membrane.

CARRIERS: la maggior parte delle cellule possiede trasportatori non selettivi in grado di eliminare le sostanze
esogene.
MDR1 (P glicoproteina tansporter- responsabile della resistenza multipla ai farmaci): cervello, testicoli, cellule
resistenti ai farmaci neoplastici);
(MDR = reattività multi-farmaco)
MPR2 (proteina di tipo 2 - responsabile della resistenza multipla ai farmaci): cellule renali resistenti ai farmaci e
neoplastiche;
(Proteina associata a resistenza multiresistente)

ENDOCYTOSIS il processo di cattura di una sostanza o di una particella dall'esterno della cellula inglobandola
con la membrana cellulare e portandola nella cellula
EXOCYTOSIS: il processo di vescicole che si fondono con la membrana plasmatica e rilasciano il loro contenuto
all'esterno della cellula

Neurotrasmettitori: i vesicli importano i in genere richiede circa 60 secondi.

neurotrasmettitori (cerchi rossi) dal citosol (fase 1)
usando un antiporter H + / neurotrasmettitore. Le
vescicole si spostano quindi nella zona attiva vicino
alla membrana plasmatica (passaggio 2) e "si
agganciano" a siti di membrana definiti interagendo
con proteine specifiche (passaggio 3). Un aumento
di Ca2 + citosolico innesca la fusione delle vescicole
ancorate e il rilascio di neurotrasmettitori nella
fessura sinaptica - esocitosi (passaggio 4). Le
proteine della membrana delle vescicole sinaptiche
vengono quindi specificamente recuperate mediante
endocitosi, utilizzando vescicole rivestite di clatrina
(passaggio 5). Il pelo di clatrina viene
depolimerizzato, producendo vescicole delle stesse
dimensioni delle vescicole sinaptiche. Queste nuove
vescicole sinaptiche sono quindi piene di
neurotrasmettitori (fase 1), completando il ciclo, che

Log P - esprime la capacità di attraversare la membrana lipidica poiché misura la lipoilicità del farmaco
(coefficiente di ripartizione ottanolo / H2O)

Non è un valore costante, dipende da

1. Metabolismo dei farmaci
2. Per l'acido debole e le sostanze basiche, il LogP dipende dal tasso di dissociazione e quindi dal valore del pH

Legge di FICK
(assorbimento passivo della diffusione)

Flusso molare: velocità di diffusione dal compartimento 1 al compartimento 2

C1 e C2: concentrazione di droga (D) nei due tipi (C)
D (coefficiente di diffusione): funzione di D e C (paragonabile al coefficiente di ripartizione)
A: superficie della membrana
d: spessore della membrana

(1) La più alta è la differenza di concentrazione nei due compartimenti, il più alto sarebbe il flusso netto (cinetica
di primo ordine).
(2) Diversi farmaci mostrano proprietà di penetrazione diverse in base al loro coefficiente di diffusione / partizione.
(3) Il flusso è direttamente proporzionale all'estensione della membrana di diffusione (la maggior parte delle
sostanze viene assorbita nell'intestino).
(4) L'attraversamento della membrana è più facile per gli strati più sottili.

Equazione di Henderson-Hasselbach
AH <-> A- + H +
Ka = ([A-] [H +]) / [AH]
Ka: rapporto tra forma dissociata e associata. Ka corrisponde al valore di pH quando la molecola è metà nel
dissociato e metà nella forma associata.
Un acido debole o base è in equilibrio tra la forma associata e dissociata.
AH: forma associata, più forma lipofila significa più facile assorbimento attraverso la membrana mediante
diffusione passiva
A-: forma dissociata, più idrofila e scarsamente assorbita dai meccanismi di diffusione passiva

Correla il rapporto di forma associato e dissociato di un acido debole o base con il Ka della molecola

pH-pKa = log A- / AH

ACIDI DEBOLI
per esempio. Acido benzoico pKa = 4

Gli acidi deboli sono più facilmente assorbiti nello stomaco (mezzo acido)

BASI DEBOLE
per esempio. anilina pKb = 5

Le basi deboli sono più facilmente assorbite nell'intestino (terreno di base)

Vie della Drug Administration

Parenterale
- Iniezione
- Respiratorio
- Attualità

Enterale (tratto gastrico)

- Rettale
- Orale

PERCORSI DI SOMMINISTRAZIONE FARMACO

IV: max. biodisponibilità, scarsa compliance
Orale: bassa biodisponibilità, maggiore compliance

ENTERAL: vie che riguardano l'apparato digerente. Assorbimento molto variabile e reddito da fattori e non tutti

SOMMINISTRAZIONE ORALE: 80% della preparazione farmaceutica.

Biodisponibilità limitata ma alta compliance (terapie croniche autonome)
 • Vantaggi: bassa tossicità, riduzione dei costi, assorbimento lento
• Inconvenienti: non adatto in caso di emergenza, oly per i farmaci lipofilici, non fornendo costante
concentrazione plasmatica

ENTERAL: somministrazione che coinvolge il tratto gastrointestinale.

AMMINISTRAZIONE ORALE: fattori che influenzano l'assorbimento
• Proprietà farmacologiche chemio-fisiche (pKa, diametro, lipofilia)
• Scioglimento di principio attivo (forma farmaceutica)
• Tasso di svuotamento gastrico (durante il digiuno, il tempo di latenza è di 30 minuti, quindi l'assorbimento
è più rapido. A pieno carico il tempo di ritardo è di 2-3 ore, quindi l'assorbimento è più lento). Il più alto
tasso di assorbimento è per la forma liquida somministrata a stomaco di digiuno.

PARENTERALE: non coinvolge il tratto gastrointestinale

Sottocutaneo (intradermiale) per uso diagnostico; amministrazione lenta
intramuscolare: iniezione di droga nel muscolo; buon assorbimento
endovenoso: max. bioavialability, controllando e mantenendo costante la concentrazione plasmatica del farmaco.

BIOAVAILABILITY (F)

Frazione del farmaco che è disponibile nella fornitura

di sangue dopo la somministrazione, senza subire
alcuna modifica chimica

Endovenoso (IV) = 100%

Sublingua = 90% - 100%
Intramuscolare (IM) = 70% - <100%
Sottocutaneo (SC) = 70% - <100%
Orale (OS, PO) = 5% - <100%
Rettale (PR) = 30% - <100%
Inalazione = 5% - <100%
Transdermal = 80% - <100%

LOG del coefficiente di ripartizione (P) -Octanolo / Acqua (logPOW)

• Valutazione della biodisponibilità
o Equilibrio corretto tra idrofilia e idrofobicità
o Abbastanza idrofilo per essere solubile in acqua (sangue)
o Abbastanza idrofobo per attraversare la membrana cellulare
-Intervallo tipico: da -3 (altamente idrofilo) a +7 (altamente idrofobo)
La maggior parte dei composti DRUG-LIKE: 2 <LogP <4

Dopo l'Assorbimento il farmaco subisce due processi principali, responsabili della diminuzione della sua
concentrazione plasmatica

Partendo dalla concentrazione plasmatica., Gli studi di distribuzione aiutano a comprendere la presenza di farmaci
nel sito target.
 • DISTRIBUZIONE ai tessuti d'organo
• ELIMINAZIONE tramite meccanismi di metabolismo ed escrezione (processi contemporanei)

VOLUME APPARENTE DI DISTRIBUZIONE (VD):

Ogni organo sarà in equilibrio con il plasma dopo che il volume totale di sangue sarà circolato in esso
PERFUSION (la velocità con cui il sangue viene erogato al tessuto, o il volume di sangue per unità di tempo - il
flusso sanguigno - per unità di massa tissutale) regola la velocità di equilibrio.

Il volume di distribuzione (Vd) è un concetto teorico che mette in relazione la quantità di farmaco nel corpo
(Q) con la concentrazione (C) di farmaco che viene misurata (nel sangue, nel plasma e non legato
nell'acqua dei tessuti).

Vd: è il volume di fluido "apparentemente" richiesto per contenere la quantità totale di farmaco in modo omogeneo
ad una concentrazione uguale a quella nel plasma (o sangue)

Vd = Q / c

Q = mg di farmaco somministrato
c = conc. plasmatico in mg / L
I farmaci con elevata biodisponibilità mostrano un basso volume di distribuzione

E’ un volume apparente in quanto non correlato al volume reale del corpo

Vd può superare il volume reale dei compartimenti corporei ed è il volume di fluido "apparentemente" richiesto per
contenere la quantità totale di farmaco del farmaco in modo omogeneo ad una concentrazione uguale a quella
del plasma (o sangue)
Farmaci con alto Vd = conc. > nei tessuti extravascolari rispetto al plasma
Farmaci con alto Vd = conc. > nel compartimento vascolare

Siti di metabolismo della droga: (parete intestinale), fegato, (organi)

Siti di eliminazione dei farmaci: reni (composti polari), bile, feci (lipofilo analoghi)

Farmaci, xenobiotici e loro metaboliti vengono espulsi dall'organismo per vie diverse:
• Escrezione di urina
• Escrezione fecale
• Escrezione respiratoria
• Escrezione di secrezione

il tasso di eliminazione dipende dalla concentrazione

plasmatica
C = C0e-kt (k = velocità costante dell'eliminazione)
Eliminazione di ordine zero (ordine pseudo zero) il
tasso di eliminazione è costante e indipendente dalla
concentrazione plasmatica
Eliminazione del 1 ° ordine Half life (t1 / 2) tempo in cui la concentrazione
plasmatica diminuisce del 50%

L'emivita di eliminazione è definita come il tempo necessario per la concentrazione del farmaco nel plasma o la
quantità totale nel corpo da ridurre del 50%. In altre parole, dopo una emivita, la concentrazione del farmaco nel
corpo sarà la metà della dose iniziale
Effetto terapeutico o tossico: influenzato dal metabolismo del farmaco e dalla formazione o meno di metaboliti
attivi
Anche l'emivita dei metaboliti dei farmaci può essere un parametro chiave (i metaboliti possono essere più attivi
rispetto al farmaco principale)
L'emivita di PROZAC (fluoxetina) è di 1-3 giorni; il principale metabolita (norfluoxetina) è più attivo con un'emivita
di 7-15 giorni !!!!

CLEARENCE

misurazione del volume di plasma da cui il farmaco viene completamente rimosso per unità di tempo dai processi
di eliminazione
CLEARENCE (ml / min) = U x V / [D] p
U = [D] per ml di urina
V = volume di urina espulso al minuto
[D] p = concentrazione di farmaco per ml di plasma

CLEARENCE TOTALE: somma della clearance in tutti gli organi coinvolti nel metabolismo ed escrezione dei
farmaci:
CLtot = CLhepatic + Clrenal + CLother

I principali sistemi di eliminazione dei farmaci sono rappresentati dall'escrezione di urina, bile e feci
Queste vie di eliminazione sono favorite per sostanze idrofile
Una conversione di molecole lipofile in idrofile è richiesta dalle reazioni chimiche

PROCEDURA DI BIOTRANSFORMAZIONE FARMACO:

METABOLISMO
Reazione chimica finalizzata alla conversione di substrati esogeni in composti più polari e solubili, eliminazione
finale.
METABOLISMO DROGA
deve produrre effetti sull'attività della droga

FARMACI BIOTRANSFORMAZIONI
FARMACO attivo -> Metabolita inattivo (caso più spesso)
FARMACO attivo -> metabolita attivo
FARMACO attivo -> Metabolita inattivo ma tossico
FARMACO inattivo -> Metabolita attivo
Acetanilide e fenacetina sono profarmaci di paracetamolo.
Entrambi subiscono l'idrolisi per produrre derivati anilina che possono causare metaemoglobinemia ed anemia
emolitica.
Le vie metaboliche primarie sono per O-coniugazione (O-solfato e O-glucuronide coniugato)
Il paracetamolo e la fenacetina possono essere sottoposti a metabolismo ossidativo attraverso il citocromo P450
(CYP450), per ottenere prodotti a base di N-idrossiammide.
I prodotti N-hydroxyamide possono perdere una molecola d'acqua per produrre N-acetilimmidoquinone (NAPQI).
Si ritiene che il NAPQI sia legato alle proteine epatiche e renali e causi epatotossicità e nefrotossicità.
In condizioni normali, l'N-acetilimmidoquinone viene coniugato nel fegato con l'aiuto del glutatione e quindi escreto
sotto forma di acido mercaptico o coniugati di cisteina.
In caso di sovradosaggio di paracetamolo, le riserve di glutatione possono esaurirsi a causa della formazione di
coniugato. Oltre il 70% di questo esaurimento, il metabolita N-acetilimmidoquinone reagirà con i gruppi tiolici. Ciò
si traduce nella formazione di addotti covalenti che producono necrosi epatica e necrosi tubulare renale.
I composti contenenti sulfidrile possono essere utili come antidoti per la tossicità correlata al sovradosaggio del
paracetamolo.
L'N-acetilcisteina ha tre scopi per il trattamento antidoto: (i) come sostituto del glutatione esaurito (ii) l'N-
acetilcisteina è il precursore del glutatione, può aiutare a reintegrare le riserve di glutatione perdute (iii) può reagire
con il N -acetilimidoquinone per neutralizzare la minaccia ed espellerla in modo sicuro dal corpo.

ESEMPI DI PRODRUGS

• LEVODOPA Utilizzato per il trattamento del morbo di Parkinson, precursore della dopamina. La
conversione metabolica (decarbossilazione) avviene nel sistema nervoso centrale, principalmente nei
terminali presinaptici dei neuroni dopaminergici. Nella pratica clinica viene somministrato con carbidopa
o benserazide, inibitori periferici delle decarbossilasi, per prevenire l'inattivazione prima che raggiunga il
SNC. La levodopa è molto più polare della dopamina, ma tuttavia può attraversare il BBB perché è un
amminoacido ed è riconosciuta dalle proteine carrier per gli aminoacidi.
• CODEINE Oppiode analgesico, profarmatore di morfina.
• ENALAPRIL-QUINAPRIL-FOSINOPRIL-RAMIPRIL ACE-inibitori che diventano attivi dopo la
conversione al corrispondente enalaprilato, quinaprilato, fosinoprilato, ramiprilato da esterasi del fegato.

Siti di biotrasformazione
Le biotrasformazioni sono regolate dalla catalisi ENZIMATICA
I sistemi enzimatici sono localizzati principalmente nel fegato
Anche il rene, il tratto gastrointestinale, la pelle ei polmoni mostrano a
attività metabolica rilevante
Le sostanze lipofile (più facilmente permeando la parete cellulare) sono
più soggetto alla biotrasformazione

Le biotrasformazioni di farmaci enzimatici sono classificate come segue:

FASE I REAZIONI (reazioni di funzionalizzazione)
• Convertire il composto progenitore in un metabolita più polare (= idrofilo) aggiungendo o smascherando i
gruppi funzionali (-OH, -SH, -NH2, -COOH, ecc.) Ad es. ossidazione
• Spesso questi metaboliti sono inattivi
• Può essere sufficientemente polare da essere facilmente escreto o reagire nelle reazioni di fase II (reazioni
di coniugazione)
Reazioni: ossidazione, riduzione, idrolisi, idratazione, isomerizzazione

REAZIONI DI FASE II
Sono anche chiamate reazioni di coniugazione o sintesi poiché accoppiano i substrati con diverse molecole
endogene reagendo con specifici gruppi funzionali.
Coniugazione con glucoronide, solfato, acetato, amminoacido, glutatione, acidi grassi
Per reazioni di fase II, il metabolita modifica le proprietà di solubilità e ionizzazione idonee ad accelerare
l'eliminazione in condizioni fisiologiche (pH).

PRINCIPIO ATTIVO CITOCROMO P450

Fase I Reazione (fegato)
OSSIDAZIONE
RIDUZIONE
IDROLISI
Metaboliti di fase I
-OH
-COOH
-NH2
-SH
Reazioni di Fase II
CONIUGAZIONE
Metaboliti coniugati
ELIMINAZIONE

FASE 1 REAZIONI

OSSIDAZIONI
Catalizzato da ossidasi (sistema enzimatico citocromo P450 dipendente) localizzato a livello microsomiale in
fegato, rene, polmone e intestino
Idrossilazione mediante introduzione diretta di una molecola di O2

Enzimi chiave: citocromo P450

Il sito attivo del citocromo P450 contiene un centro eme-ferro
Il citocromo ridotto (Fe2 +) mostra un picco di assorbimento a una lunghezza d'onda di 450 nm quando è legato
al monossido di carbonio.
La famiglia di geni P450 (CYP) ha differenziato (oltre miliardi di anni) garantendo il metabolismo di un numero
sempre crescente di sostanze chimiche, tossine e farmaci.

Enzimi chiave: citocromo P450

• Si trova nel fegato, nell'intestino tenue, nei polmoni, nei reni, nella placenta
• Consiste di> 50 isoforme
• Principale fonte di attività catalitica per l'ossidazione dei farmaci • È stato stimato che il 90% o più
dell'ossidazione dei farmaci umani può essere attribuita a 6 enzimi principali: • CYP1A2 • CYP2D6 •
 CYP2C9 • CYP2E1 • CYP2C19 • CYP3A4 In diverse persone e diverse popolazioni, attività di CYP
ossidasi differisce.

Le posizioni alliliche e benziliche sono punti di vulnerabilità metabolica.

SCH48461 è un potente inibitore dell'assorbimento del colesterolo.
Attacco metabolico si è verificato in un certo numero di posizioni tra cui idrossilazione benzilica. La sostituzione
dell'ossigeno per il carbonio C-3 è stata effettuata per rimuovere questo sito del metabolismo. Questo passaggio
tuttavia ha prodotto una frazione fenossi ricca di elettroni rispetto al gruppo fenilico originale e probabilmente rende
questa funzione più suscettibile all'idrossilazione aromatica.
Il blocco dell'ossidazione aromatica con fluoro introdotto nella posizione para è necessario per produrre l'eventuale
sostituzione più stabile.

La progettazione degli inibitori dell'assorbimento del colesterolo oralmente attivi combina sia il concetto di
prevenzione del metabolismo che la serendipità dei metaboliti essendo più attiva rispetto al farmaco genitore.
[J.Med.Chem. (1998), 41, 973-980]
Il metabolismo di SCH 48461 si verifica per idrossilazione aromatica (1), idrossilazione benzilica (2) e O-
demetilazione (3,4). Il metabolismo è bloccato in Ezetimibe all'1 e al 4

INDUZIONE ENZIMATICA
Definizione:
Eccessiva espressione di enzimi epatici in grado di metabolizzare farmaci specifici indotti dalla somministrazione
degli stessi farmaci, o da abitudini alimentari o tossine ambientali.
L'induzione può causare un aumento del metabolismo e dell'inattivazione dei farmaci che causano un effetto
ridotto (la cosiddetta tolleranza farmacocinetica).
L'induzione può a sua volta determinare un aumento dell'effetto farmacologico o un aumento della tossicità se il
mertabolite è farmacologicamente attivo o tossico.

P450 Inibizione dei citocromi

• Un farmaco può inibire gli enzimi P450 coinvolti nel metabolismo di altri farmaci
• Può aumentare la concentrazione di un altro farmaco nel siero
• Può portare a tossicità
• Forma in modo diverso l'induzione, l'inibizione enzimatica strat con la prima somministrazione della dose
di inibitore
• L'inibizione massima viene raggiunta allo stato stazionario (4-7 semi-lifes)

RIDUZIONI
Biotrasformazioni reduttive sono presenti al microsomiale epatico livello
Diversi composti nitro sono ridotti alle ammine, che a loro volta possono essere
ossidato in metaboliti di N-idrossilato, con proprietà tossiche.

IDROLISI
• Esterasi e Amidasi Hanno catalizzato l'idrolisi di esteri e ammidi; sono localizzati nel reticolo
endoplasmatico del fegato, nell'intestino e anche nel plasma. L'idrolisis ammidico di solito mostra una
velocità inferiore rispetto all'idrolisi dell'estere
• Proteasi e peptidasi Degradazione di proteine e peptidi; localizzato principalmente nello stomaco

REAZIONI DI FASE II

Reazioni di biosintesi in cui un metabolita di fase I si lega (covalentemente) a una molecola endogena (cofattore)
da specifici gruppi funzionali (-OH, -COOH, -NH2 e -SH) formando un prodotto coniugato (i rispettivi coniugati
sono più idrofili del genitore composti ).
Coinvolgono diversi enzimi. I substrati sono convertiti in derivati coniugati idrosolubili e ionizzabili (a pH fisiologico)
più conducono a composti adatti per l'eliminazione tramite escrezione biliare e urinaria

Principali reazioni di coniugazione:

Glucoronidazione o coniugazione di acido glucuronico
Acetylation
Coniugazione con Glycine
Coniugazione con glutatione (Glu-Cys-Gly)

Non solo nel fegato

• Coniugazione di -OH, -SH, -COOH, - gruppi funzionali CONH2 con acido glucuronico (glucuronidi)
• Coniugazione di gruppi -OH con porzioni di solfato
• Coniugazione di di -NH2, -CONH2, a.a., farmaci solfato con acetile
• Coniugazione di nitrati, epossidi, solfati con glutatione per formare glutatione-coniugati Tutte queste
reazioni portano a specie più solubili, facilitando l'escrezione (più o meno riassorbimento).

GLUCURONIDAZIONE

Tra le reazioni più rilevanti per il numero di substrati reattivi e gruppi funzionali e per l'alta disponibilità del cofattore
coinvolto (acido uridindifosfoglucuronico)
SOLFATAZIONE

Importanti vie di coniugazione che trasferiscono solfati inorganici ad ossidrile Importanti vie di coniugazione che
trasferiscono il solfato inorganico ai gruppi di PEHNOL e ALCOOL che formano esteri o eteri di solfato.
Catalizzato da solfotransferasi

METILAZIONI
Diretto alla metabolizzazione di sostanze endogene; tuttavia pochi farmaci possono essere metilati da
metiltransferasi aspecifiche presenti nei polmoni e in altri tessuti.
CH3- trasferimento agli alcoli di ossigeno, ammine azoto e tioli di zolfo
Non favoriscono l'escrezione di farmaci

ACETYLATIONS
Rappresentano la via più importante di biotrasformazione per le arilamine.
Richiedono cofattori come acetil coenzima A.

substrati:
Ammine primarie aromatiche,
Idrazine, idrazidi, sulfonamidi,
Amni primari alifatici.
CONIUGAZIONE CON GLUTATHIONE
Glutatione tripeptide:

È considerato come uno degli agenti protettivi più rilevanti nel corpo.
Il gruppo sulfidrilico nucleofilo reagisce con composti elettrofili
che sono potenzialmente tossici (spesso prodotti da reazioni di fase I).
Enzima: glutatione-S-transferasi
Substrati: Epossidi, alo-alcani, nitro-alcani, alcheni, composti alogeno e nitro-aromatici

Fattori che influenzano il metabolismo:

1. Dose della droga
2. Fattori genetici, età, sesso ecc ...
3. Dieta
4. Percorso di amministrazione
5. Interazioni farmacologiche (induttori o inibitori di CYP450)
6. Gravidanza

INTERAZIONI DI FARMACO-FARMACO Questi sono definiti come gli effetti che un farmaco ha sull'attività di un
altro farmaco se entrambi i farmaci sono assunti insieme. Esempi sono Warfarin o metotrexato legati all'albumina
e alle proteine plasmatiche nel sangue e non disponibili per interagire con i loro obiettivi. Quando viene assunto
un altro farmaco che può competere per il legame con le proteine plasmatiche (ad esempio sulfonamide), allora
viene rilasciata una certa percentuale di farmaco precedentemente associato (warfarin o metotrexato),
aumentando la concentrazione del farmaco e il suo effetto.

PERCORSO DI ELIMINAZIONE DEL FARMACO

FARMACI, Xenobiotici e loro metaboliti sono espulsi da percorsi diversi

PRINCIPALE
RENE
FEGATO

SECONDARIO
POLMONI
INTESTINO
PELLE
LACRIME
SALIVA
LATTE

ESCREZIONE
• Percorsi di escrezione di farmaci particolari
• Latte per l'allattamento al seno
• Gli agenti volatili (anestetici) vengono escreti attraverso i polmoni
• Pochi farmaci sono escreti nelle feci. (Molto efficiente in condizioni di diarrea)
• I coniugati dell'acido glucuronico (MW ≥ 300KD) vengono principalmente escreti attraverso la bile
• -OH coniuga l'idrolisi (mediante β- glucuronidasi nell'intestino) per riformare il principio attivo che può
essere riassorbito e produrre un effetto aggiuntivo.
RENE
1. Filtrazione glomerulare
2. Escrezione tubulare (trasporto attivo)
-Urina è una rotta di escrezione privilegiata, ma non l'unica via
-La filtrazione glomerulare consente il flusso in urina solo di specie (farmaci) con un MW ≤ 25Kd
-L'escrezione tubulare regola il meccanismo di trasporto per i cationi e gli anioni.
-Riassorbimento passivo di farmaci liposolubili avviene attraverso cellule tubulari
NOTA: A pH basico gli acidi deboli sono in forma ionizzata, quindi meno riassorbiti a livello renale e più
rapidamente escreti. Viceversa, le basi deboli sono più facilmente riassorbibili.

CLEARENCE

Il tasso di escrezione di sostanze dal plasma aiuta a valutare l'efficienza dell'escrezione renale.
La clearance renale plasmatica indica la capacità renale di purificare il plasma da diverse sostanze.
La clearance renale di una sostanza (Cs) è il volume di plasma (che scorre nei reni) che i reni sono completamente
liberi da quel farmaco per unità di tempo
Ad esempio: il plasma che scorre nei reni possiede 1 mg / ml di una sostanza e 1 mg / min della stessa sostanza
viene escreta con le urine, il tasso di clearance è mg / min)

Principio di funzionamento:
Filtrazione poco selettiva di elevati volumi plasmatici seguita da un riassorbimento più selettivo di ca. Il 99%
dell'acqua filtrata e dei suoi soluti mediante la secrezione tubulare attiva di acidi e basi dal plasma al lume tubulare.

I reni ricevono un flusso ematico di circa 1,3 litri / min (25% di portata cardiaca)
FILTRAZIONE GLOMERULARE
Circa il 20% dei componenti acquosi viene filtrato a livello glomerulare con una velocità di filtrazione di ca. 125 ml
/ min (oltre 180 l al giorno)
Un farmaco che non subisce il riassorbimento o la secrezione tubulare avrà una clearance di 180 ml / min

Riassorbimento tubulare passivo

Possibile riassorbimento di farmaci e xenobiotici dal lume al sangue secondo conc. gradiente e coefficiente di
ripartizione.
Problemi
• Drug deve essere in forma libera (nessuna ionizzazione)
• Vota:
Farmaco conc. nel plasma Flusso ematico renale

Secrezione tubulare e riassorbimento

Trasporto attivo (carriers)
Anioni:
• Acido organico (penicillina, aspirina, solfuro glucuro-metaboliti)
• Sostanze endogene: acido urico
Cationi
• basi organiche (TEA, tiamina)
• basi endogene: colina, istamina
CARATTERISTICHE:
Carriers non selettivi
• Sottoposto a saturazione
• Sottoposto a concorrenza (oneri comparabili stesso legame di vettore)

1. Liquidazione di una sostanza completamente riassorbita

2. Liquidazione di una sostanza completamente filtrata e secreta

Cl = flusso plasmatico renale (PAH) (circa 650 ml / min) - escrezione totale

PHA viene completamente rimosso dal sangue che passa attraverso i reni (l'IPA viene sottoposto sia alla filtrazione
glomerulare che alla secrezione tubulare) e pertanto la velocità con cui i reni riescono a eliminare i PAH dal sangue
riflette il flusso plasmatico renale totale.

Per una clearance della sostanza completamente escreta è uguale al flusso ematico renale totale (FPR)
Cs = FPR = Cu x V / Cp = Us x V / Ps =
Poiché la velocità di filtrazione glomerulare (VFG) è pari al 20% del totale FPR, per ottenere una clearance
completa la sostanza deve essere secreta dai tubuli.
PAH (acido para-aminoppico) raggiunge quasi questa condizione (eliminazione del 90%)
U = FARMACO conc. nelle urine
V = volume urinario in 1 min.
P = droghe conc. nel plasma

Cl = 0 - Completa riassorbimento (glucosio)

Cl = flusso plasmatico renale (PAH)
Per filtrazione glomerulare e escrezione attiva
Cl = volume plasmatico ultrafiltrato - filtrazione glomerulare (inulina)
Nessuna secrezione di netiher senza legami proteici, non riassorbimento
Cl <volume plasmatico ultrafiltrato - Parzialmente riassorbito
Cl> volume del plasma ultrafiltrato - Parzialmente secreto

• Farmaci liposolubili, escreti a concentrazioni simili di plasma. Concentrazione principalmente a seconda

del volume di urina.
• Farmaci polari escreti nelle urine a concentrazioni più elevate rispetto alla concentrazione plasmatica,
deplementi di escrezione sulla filtrazione glomerulare piuttosto che sul volume urinario
• Farmaci coniugati, ho un comportamento simile a sostanze polari, e sottoposti anche a escrezione attiva
• Droghe ionizzanti, acidi e basi, escrezione dipendente dal pH

PACCO SLIDE 8
TEMI
DESIGN DEL FARMACO
• FONTI
• Rational Drug Design (identificazione Hit / Lead e ottimizzazione dei lead)
o Pharmacophore
o SAR
o Modifiche chimiche
o Isosterism / bioisosteria

• Serendipity
• Estrazione da fonti naturali
• Osservazione degli effetti clinici / metabolici / tossici di sostanze conosciute
• Rational Drug Design Process

SERENDIPITY

... è l'arte di scoprire nuove cose mentre cerchi qualcos'altro!

Non riguarda solo fortuna e fortuna: per cogliere i suggerimenti che portano alla scoperta, dobbiamo essere aperti,
inclini alla ricerca e prestare attenzione nel riconoscere il valore di esperienze che differiscono dalle aspettative
originali.
Le scoperte famose che sono diventate essenziali per il progresso scientifico sono state eseguite mentre cercavo
qualcos'altro.

LSD - (6aR, 9R) -N, N-dietil-7-metil-4,6,6a, 7,8,9-esaidroindol- [4,3-fg] chinolina 9-carbossammide

Sintetizzato da A. Hofmann nel 1938 per la prima volta (Sandoz Lab. - Novartis)

Derivato dell'acido lisergico contenuto nel fungo dell'ergot (micotossina di grano).

L'ingestione di Ergot causa la cosiddetta «febbre da pellegrino» o ergotismo e include allucinazioni nei sintomi
principali.
I suoi effetti psicotropi furono riconosciuti solo nel 1943 quando una goccia di LSD cadde sulla mano di Hoffman
causando il primo allucinatiosn.
Introdotto per la prima volta da Sandoz come farmaco psichiatrico, poi con Druwan a causa del suo uso extra-
clinico.

Inibitori competitivi: farmaci sulfanilici

Disulfiram – dietethithithiocarbamate - Abusato per trattare l'alcolismo

Utilizzato nella vulcanizzazione della gomma nel 1881.

I lavoratori che assumono l'alcol hanno mostrato effetti collaterali negativi come vomito,
alta sudorazione.
Disulfiram agisce inibendo l'aldeide deidrogenasi, blocca l'ossidazione
di alcol nella fase dell'acetaldeide durante il metabolismo dell'alcool. sangue
le concentrazioni di acetaldeide sono aumentate, seguite da arrossamento, sistemico
vasodilatazione, difficoltà respiratorie, nausea, ipotensione e altro
sintomi (sindrome dell'acetaldeide)

Penicellin

"È divertente ..." Alexander Fleming

Nel 1928, Fleming Fleming tornò da una vacanza di due settimane per scoprire che uno stampo si era sviluppato
su una piastra di coltura di stafilococco accidentalmente contaminata. Dopo aver esaminato la muffa, notò che la
coltura impediva la crescita di stafilococchi. Una volta estratto e isolato il composto lo chiamò penicillina (dallo
stampo di penicillium contaminante).
La scoperta della penicillina e il riconoscimento iniziale del suo potenziale terapeutico si sono verificati nel Regno
Unito, ma, a causa della seconda guerra mondiale, gli Stati Uniti hanno svolto il ruolo principale nello sviluppo
della produzione su larga scala del farmaco, rendendo così una sostanza salvavita in quantità limitata in una
medicina ampiamente disponibile.
PRODOTTI NATURALI DA PIANTE

Efedrina- (1R, 2S) -2- (metilammino) -1-fenil-1-propanolo

La pianta più antica è "Ma Huang" appartenente alla specie Ephedra usata usata in Cina più di 5000 anni fa per
scopi medicinali (infusione di rami essicati).
Il puro alcaloide fu isolato nel 1887 e commercializzato in Europa da LILLY nel 1925
Usato per trattare la tosse, la congestione nasale, l'asma, la rinite.
ATROPINE

Dalle radici e dalle foglie della pianta officinale di Atropa Belladonna

Effetti: antimuscarinico (antispastico) per il dolore colico, l'asma, la pertosse.
Midriasi oftalmica (1 goccia di soluzione 1: 40.000)
COCAINA

Dalle foglie di coca, pianta divina Incas

Effetti: lieve anestetico locale e vasocostrittore.
Blocca la ricaptazione della dopamina nel SNC -> azione narcotica.

Sildenafil (Viagra)
Sviluppato da Pfizer per l'ipertensione e l'angina trattamento
• Perdita di efficacia negli studi di fase II - ritorno a prove di fase I per studiare il massimo tollerato dose.

• In corso di aumento della funzione erettile in prove di fase II.

RATIONAL DRUG DESIGN PROCESS

Obbiettivo:
• Identificazione del lead (processo Hit to Lead)
• Strumenti di sintesi degli analoghi dell'ottimizzazione del piombo
Strumenti
• Modifica molecolare
• Sintesi combinatoria / parallela
• Computer in chimica farmaceutica
• QSAR
HIT: molecola capostipite di una nuova classe di
• Attività micromolare verso il bersaglio biologico
• Necessità per l'ottimizzazione della struttura
• Profilo ADMET quasi inesplorato

LEAD: sviluppato nel processo "hit to lead" e idealmente pronto per i test in vivo
• Sub-attività micromolare verso il bersaglio biologico
• Attività nei sistemi cellulari e nei modelli in vivo
• Predicted in vivo somiglianza droga
• Necessità di ottimizzare le proprietà per uso clinico (ad esempio solubilità, legame alle proteine
plasmatiche (PPB), stabilità metabolica ....)

LEAD COMPOUND
HTS

Test di un gran numero di composti chimici mediante un pool di analisi biologiche, in breve tempo grazie a saggi
automatizzati ad alta produttività
• Costoso
• Probabilità di errore elevata
• Controllo ridotto della purezza dei campioni
Il concetto di "farmacoforo" non è recente, è stato introdotto per la prima volta da Paul Ehrlich nel 1909 come "una
struttura molecolare che porta (phoros) le caratteristiche essenziali responsabili dell'attività biologica di un farmaco
(farmacologia)".
Questa definizione fu ulteriormente aggiornata nel 1977 da Peter Gund a "un insieme di caratteristiche strutturali
in una molecola che è riconosciuta in un sito recettore ed è responsabile dell'attività biologica di quella molecola".
Più recentemente, la raccomandazione ufficiale IUPAC del 1997 ha riassunto il concetto come segue: "Un
farmacoforo è l'insieme di caratteristiche steriche ed elettroniche necessarie per assicurare le interazioni
supramolecolari ottimali con uno specifico target biologico e per innescare (o bloccare) il suo risposta biologica "!
Il farmacoforo va oltre la struttura chimica della molecola.
I punti farmacoforici rappresentano le interazioni chiave che si verificano tra il farmaco e il suo bersaglio (recettore,
enzima ..)
Complementarità farmaco-recettore
Consideriamo che una classe di farmaci che condividono una specifica struttura comune condivide un sito attivo
su una proteina bersaglio.
Modello "Lock and Key"
• Interazione reversibile
Formazione di un complesso altamente specifico
• Interazione irreversibile
Modificazioni irreversibili indotte dal farmaco.

Maggiore è il numero e la forza delle interazioni, più il legame tra il ligando e la proteina bersaglio è più vicino.

Complementarità farmaco-recettore
Modello "Lock and Key"
Il chimico medicinale studia la "chiave" cercando di ottenere informazioni sul "lucchetto".
Gli studi di relazione struttura-attività forniscono informazioni sulla natura del recettore.

PACCO SLIDE 9

Fattori che influenzano (sottolineando) una specifica interazione con un recettore.

Stereochimica del FARMACO

• Isomerismo 1conformazionale
• Isomerismo 2-geometrico (cis / trans)
• Isomeria 3-ottico

ISOMERI CHIMICI
ciascuno di due o più composti con la stessa formula molecolare ma una diversa disposizione di atomi nella
molecola (sequenza o configurazione) e differenti proprietà chemio-fisiche.

ISOMERISM
STRUTTURALE: «Sequenza» diversa gli atomi sono legati in un altro ordine.
STEREOISOMERI Disposizione spaziale diversa degli atomi
ENANTIOMERI
DIASTEREOISOMERI

STEREOISOMERI
fatto degli stessi atomi collegati nella stessa sequenza ma con disposizione spaziale differente

Isomeri conformazionali
possono essere interconvertiti l'uno nell'altro semplicemente mediante rotazioni di singoli legami
Isomeri configurazionali
Può essere convertito l'uno nell'altro rompendo e riformando i legami atomici.
Isomerismo conformazionale
L'identificazione della conformazione del farmaco responsabile per l'associazione nel sito attivo del target biologico
fornisce informazioni chiave sull'interazione target del farmaco e sul meccanismo d'azione, aprendo la strada allo
sviluppo di nuovi farmaci.

Le informazioni sul meccanismo d'azione si basano su:

• Conoscenza della topografia del sito attivo (comune per gli enzimi, meno per i recettori)
• Conoscenza della conformazione del farmaco nel sito attivo, responsabile dell'attività (conformazione
attiva).

Spesso la conformazione attiva non corrisponde alla conformazione più stabile del farmaco (preferita dall'analisi
conformazionale) e nessun criterio generale può prevederlo
Per una molecola flessibile, la progettazione di analoghi più rigidi che rappresentano uno o più conformatori
specifici può fornire informazioni chiave.
Confrontando l'attività biologica degli analoghi con quella del composto progenitore otteniamo informazioni sulla
conformazione attiva.

Formazione di un complesso altamente specifico.

Isomerismo conformazionale- Distanze interatomiche.
La distanza tra gli atomi dipendono dalla conformazione.

Un recettore può legare solo una delle diverse conformazioni disponibili di un flessibile molecola: la conformazione
farmacoforica.

Conformational Isomerism- Interatomic distances

Da una prospettiva sterica: le transformazioni sono energeticamente favorito, rispetto a inclinato, eclissato e
parzialmente eclissato.

Per l'acetilcolina, la conformazione più stabile non è guidata da impedimento sterico (trans) ma dall'interazione
ione-dipolo tra l'azoto quaternario e la frazione C = O (inclinazione).

Identificazione della conformazione attiva.

• Cristalografia a raggi X
• Risonanza magnetica nucleare (NMR),
• Metodi teorici di analisi conformazionale:
Approcci che forniscono informazioni sulle conformazioni di legame preferite del ligando, indotte dal sito di legame
bersaglio.
Poiché non sono disponibili criteri assoluti per predire la conformazione attiva, l'analisi conformazionale è un punto
di partenza della ricerca.
• Modifica molecolare: restrizioni conformazionali.
Nessuna corrispondenza specifica può essere stabilita tra conformazione favorita e attiva.
Ognuna delle conformazioni energeticamente favorite può essere responsabile dell'interazione con il recettore.
Si presume che la conformazione ad alta energia pagherebbe un costo energetico troppo elevato per adattarsi al
recettore, essendo spiacevole.
Determinazione della conformazione.
TED (N, N, N, N'-tetrametil-N'-acetil etilendiammina iodure)
Trans TED è l'isomero più stabile,
Cis-TED si lega al recettore nicotinico
Barriera energetica conformazionale ca. 19 kcal / mol !!!

Restrizioni conformazionali
1) Per hermace sterico o interazioni elettrostatiche che stabilizzano una singola conformazione,
destabilizzando tutte le altre

2) Introduzione di legami doppi, tripli, cicli, forzando uno specifica geometria

Insieme alla modifica dell'isosterismo è uno degli approcci più sfruttati nella scoperta dei farmaci
VANTAGGI
• Informazioni sulla conformazione attiva,
• Progettazione di composti con selettività, affinità e potenza migliorate,
• Sviluppo di modelli più accurati di interazione farmaco-recettore per ligandi flessibili (cmpds lead o
endogeni)
SVANTAGGI
• La conformazione del sito attivo potrebbe non essere l'unica conformazione critica per l'attività biologica.
• Le conformazioni farmacodinamiche e farmacocinetiche preferite possono essere diverse.
• Le molecole d'acqua che circondano il farmaco possono forzare una conformazione che è rilevante per il
trasporto al sito attivo, ma che non può corrispondere alla conformazione del legame.
 • Viceversa, se il farmaco passa attraverso la membrana cellulare, la lipofilia della membrana può
stabilizzare una diversa conformazione da quella attiva, ugualmente importante per l'attività biologica.

alcuni casi la restrizione molecolare non impedisce il legame ma altri passaggi critici e una falsa interpretazione
negativa possono verificarsi (corretta conformazione attiva ma consegna compromessa).

Analoghi dell'acetilcolina (recettori nicotinici e muscarinici, e acetilcolina esterasi):

9 diverse conformazioni stabili.

Idealmente, possiamo sintetizzare l'analogo rigido per ciascuno conformazione e studia la sua affinità per i diversi
recettori.
Archer fu il primo a notare che era nicotinico e muscarinico attività di ACh erano dovute alle diverse conformazioni
la molecola può assumere.
Pensò al «congelamento» di specifiche conformazioni, di sintetizzando analoghi rigidi e testando i recettori
preferenza.

L'unico analogo che mostra un'attività paragonabile a ACh è il trans derativo 4, essendo l'isomero cis scarsamente
attivo.
Sintesi e studio farmacologico degli isomeri trans e cis di analogo ciclopropanico (ACTM)
• Trans isomero equipotente a AcH in Mreceptor e AChE
• Isomero Cis – inattivo.
L'analisi conformazionale in soluzione acquosa visualizzata che la configurazione gauche intorno al legame χ3 è
la più grande favorito a temperatura ambiente.
Diversi analoghi rigidi sono stati sintetizzati suggerendoli i recettori muscarinici preferivano la conformazione ach
di Ach.
La perdita di attività biologica può essere dovuta all'impegno sterico introdotto dalla restrizione conformazionale,
più che a uno spostamento del punto farmacoforico.
Gli studi sul profilo delle attività hanno concluso che la distanza ottimale tra il i punti farmacoforici (ammine e esteri
quaternari) sono: N-O: 4.4 Å (muscarinico) - 5,9 Å (nicotinico) a seconda del legame χ3 rotazione.

ISOMERIA OTTICA
• Enantiomeri o isomeri ottici: molecole identiche ad eccezione del fatto che non sono sovrapponibili alle loro
immagini speculari.
• Le molecole che hanno queste caratteristiche sono denominate COMPOSTI CHIRALI. Differiscono nella loro
reazione alla luce polarizzata in piano
• Un carbonio circondato da 4 diversi gruppi è chiamato centro chirale
• Una miscela 1: 1 di due enantiomeri si chiama RACEMATE è rappresentata da (RS), (DL) o (±) simboli. I singoli
enantiomeri sono preceduti da (R) o (S), (D) o (L), (+) o (-).

Effetto FARMACODINAMICO
Solo uno degli stereoisomeri è in grado di legare il bersaglio.

Effetto FARMACOCINETICA
• Metabolizzazione stereoselettiva mediante enzimi enantiospecifici (idrolasi, ossidasi, ecc ....)
 • Metà vita
• Permeazione della membrana
• Tossicità

MOLECULAR RECOGNITION
Due antipodi ottici attivati con un bersaglio chirale formano coppie di diastereoisomeri.

Racemate (±) A che interagisce con il composto chirale (-) B

Due diastereoisomeri
I processi di formazione del diastereoisomero possono differire in:
1. Velocità di reazione
2. Resa di reazione
Differenze relative a:
• Controllo cinetico: stabilità della struttura dello stato di transizione diastereomerica
• Controllo termodinamico: stabilità dei due stereoisomeri (prodotti)

Due isomeri deI FARMACO, cioè A e A ', che interagiscono con l'obiettivo biologico B, L'effetto causato dalle
corrispondenti interazioni (E1, E2) può essere descritto dalle seguenti equazioni:

Se A e A 'mostrano differenti caratteristiche chemio-fisiche (isomeri strutturali o geometrici o diastereomerici)

l'affinità per l'obiettivo del farmaco sarà diversa (KAAB ≠ KAA'B)
Gli effetti biologici possono differire da un punto di vista qualitativo sia da un punto di vista quantitativo.

Le lipasi hanno un riconoscimento selettivo per gli esteri mandelici (R, S): l'estere destrorso (S) è idrolizzato più
velocemente del mancino (R)

Nel 1933 Easson e Stedman proposero un modello tridimensionale per spiegare il

azione stereospecifica di farmaci chirali.
MODELLO DI ATTACCO A TRE PUNTI.
Eutomero (isomero più attivo) vs Distomer (isomero meno attivo).
Per l'adrenalina, la noradrenalina e i corrispondenti derivati, in alcuni tessuti, l'eutomero R (-) è 400 volte più attivo
del distomerero S (+)
R-Isomero
(a) Azoto ionizzato
(b) Anello aromatico (arricchito dai gruppi meta e para OH)
(c) gruppo idrossi benzilico di carbonio
S-Isomero
Solo due punti di interazione su 3 punti di legame che portano ad un'affinità ridotta
Può accadere che due enantiomeri mostrino la stessa attività biologica (anche la stessa potenza), ma più spesso
c'è una notevole differenza di tipo e potenza.

POSSIBILI SCENARI PER DUE ENANTIOMERI:

• Visualizzazione della stessa attività
• Uno attivo, uno inattivo
• Visualizzazione di diverse attività
La stereochimica può influenzare significativamente l'attività farmacologica
Esempio di FANS (farmaci anti-infiammatori non steroidei)

(+) - Ketoprofen (analgesico e

Antinfiammatorio)
(-) - Ketoprofen (analgesico)
(+) - Ketoprofene
(analgesico) (antinfiammatorio)

Motivazioni per lo sviluppo di un farmaco nella forma omochirale:

- Alto rapporto Eudismico
-Indice terapeutico basso
- Tossicità di distomer
- Assenza di interruttore chirale in vivo
Motivazioni per lo sviluppo di un farmaco in forma racemica:
- Attività sinergica di Enantiomeri
- Alto indice terapeutico
- Tossicità di Distomer molto scarsa
- Presenza di interruttore chirale in vivo
MANIPOLAZIONI STRUTTURALI

➢ Estensione della struttura

➢ Semplificazione della struttura
➢ Isosterine e bioisotopi
➢ Peptidomimetici

➢ Estensione della struttura

HIT to Lead & Lead Optimization
Variazione dei sostituenti
Omologia strutturale
Omologia arilica
Omologia del vinile
Modifiche steriche
ciclizzazione
dimerization
ibridazione
profarmaci

➢ Variazione di sostituenti

Uno dei primi approcci negli studi di legame al farmaco-recettore:

• sostituenti alchilici (lunghezza della catena e impedimento sterico) o
• anelli aromatici / eteroaromatici (posizione / natura dei sostituenti)

Metodologia comune negli studi QSAR (relazioni quantitative struttura-attività)

La sostituzione alchilica (Me, Et, Pr, i-Pr, t-bu) può fornire informazioni chiave sulle tasche idrofobiche e influenzare
la selettività
Variazione di sostituenti alchilici / estensione della struttura (serie omologhe)

Si deve notare che l'introduzione o l'allungamento delle catene alchiliche modifica il carattere lipofilo del composto
che influisce sul profilo di PD e PK.

Spesso, questa modifica può trasformare un agonista in un antagonista e viceversa

OMOLOGHI ARILICI
Anelli fusi o sostituenti aril vengono spesso introdotti per migliorare i lipofili e interazioni elettrostatiche.

RIGIDIFICAZIONE E STEREOISOMERIA

Tra le modifiche più spesso introdotte, che riguardano:

• Introduzione di doppi e tripli legami,
• Ciclizzazione delle strutture lineari
• Introduzione di centri stereogenici

Questo tipo di modifiche strutturali influenzano le proprietà steriche della molecola - Modifiche steriche.

STEREOISOMERISM
La forza motrice di questo tipo di modifica è il migliore effetto farmaco-dinamico raggiunto da un isomero specifico.
La selettività può anche essere raggiunta.
La modifica può alterare anche il profilo PK che influenza il metabolismo, l'assorbimento, ecc ...

Spesso introducendo complicate vie sintetiche per sintesi selettiva o isolamento dell'isomero bersaglio.

+ introduzione di elementi per la selettività recptoriale

- causando difficili percorsi sintetici / difficile isolamento degli isomeri.
La valutazione dei vantaggi e degli svantaggi diventa cruciale dal punto di vista industriale

OMOLOGIA DEL VINILE

Introduzione del doppio legame (distanziale aromatico o vinilico)

Quando l'effetto elettronico gioca un ruolo cruciale nell'attività di una molecola, il

introduzione di un gruppo vinilico o fenilico tra le due frazioni che esercitano questo effetto
può portare a omologo con attività conservata, provato che la sostituzione non lo fa
influenza la forma e il volume o le proprietà cruciali della molecola.

Ex. Anestetico (analoghi procaine)

L'effetto anestetico locale della procaina sembra strettamente dipendente dal gruppo carbonile
polarizzazione causata dall'anello benzene 4-ammino-sostituito; in realtà introduzione di a
il gruppo vinilico (preservazione della coniugazione) non influenza l'efficacia, mentre un gruppo metilenico
abbatte l'attività.

RIGIDIFICAZIONE DELLA STRUTTURA

Modifica della stereochimica e delle proprietà chemofisiche ai fini della SAR.

MODULAZIONE DELLE PROPRIETÀ CHEMIO-FISICHE.

Modifiche su misura volte a modulare la distribuzione elettronica e lipofila della molecola o all'introduzione di gruppi
funzionali possono aumentare le interazioni di legame per migliorare la potenza
L'approccio è basato sulle informazioni disponibili sul sito attivo e sulla chiave a.a. residui.
Approccio privilegiato per la struttura nota degli enzimi / recettori 3D.

• Legami covalenti, elettrostatici e ionici

 presentazione di una porzione in grado di migliorare l'affinità del ligando per l'obiettivo biologico.
• Distribuzione elettronica / lipofilica
sostituzione su misura delle unità per esplorare la distribuzione specifica di siti ricchi di elettroni o lipofili.

• ottimizzazione del LEAD

• Studio del bersaglio della droga interazioni e formulazione del farmacoforico ipotesi

• Effetti induttivi:
Electro withdrawing (-I) ed electro donating groups (+ I)
• Effetti mesomerici
Delocalizzazione di p elettroni in composti in possesso di doppi legami coniugati.
+ I gruppi R aumentano la densità elettronica
-R gruppi che diminuiscono la densità elettronica

Modulazione chimico-fisica

Tale modulazione è in grado non solo di otimizzare la struttura di una molecola ma di fornire ulteriori informazioni
sulle forze che presiedono le interazioni con il target biologico (ipotesi farmacoforica)
Ai fini di una valutazione più quantitativa degli effetti elettronici, lipofili e sterici (dove l'effetto sterico è da intendere
come ingombro sterico) di un gruppo sostituente, è utile prendere in considerazione le costanti σ, π che sono
quelle più largamente utilizzate per parametrizzare appunto queste grandezze chimico-fisiche
Questi ed altri parametri sono utilizzati per lo studio delle relazioni quantitative struttura-attività (QSAR), che a loro
volta sono un mezzo molto utile per valutare l'incidenza degli effetti elettronici, lipofili e sterici sull'azione di un
farmaco.

SEMPLIFICAZIONE DELLA STRUTTURA MOLECOLARE

Composti LEAD provenienti da fonti naturali
• Identificazione dei determinanti attivi (struttura semplificata)
 • Identificazione del farmacoforo

• Identificazione dei determinanti attivi (struttura semplificata)

• Identificazione del farmacoforo
Scopo: preservare il potente effetto analgesico, limitando la tossicodipendenza.

VANTAGGI
a) Identificazione di una struttura semplificata che può essere convenientemente sintetizzata su scala industriale,
preservando l'attività biologica.
b) Rimozione di parti non rilevanti che possono spiegare effetti collaterali o proprietà farmacologiche o
farmacocinetiche indesiderate.
c) Semplificazione dello stereoisomerismo che riduce il numero di possibili isomeri e quindi semplifica la sintesi,
PD e PK della molecola di piombo.
Aspec pertinente specialmente per gli isomeri ottici, considerando la complessità della sintesi stereoselettiva
(punto di vista industriale).

SVANTAGGI (rischi)
a) Perdita di attività. Introduzione di una flessibilità molecolare che può indurre un farmacoforo ad adattarsi ad altri
siti attivi. Per le famiglie di recettori, la perdita può interessare un singolo sottotipo o diversi.
b) Modifica significativa delle proprietà della PK, specialmente in termini di stabilità metabolica o distribuzione.

DIMERIZATION
Duplicazione di farmacoforo
-diretto (testa-testa, testa-coda, coda-coda)
da uno spaziatore o linker
La molecola derivata può subire una trasformazione metabolica in due identici
molecole - profarmaco con proprietà PK avanzate.

Duplicazione di farmacoforo
• diretto (testa-testa, testa-coda, coda-coda)
• da uno spaziatore o linker
Spesso il dimero esercita direttamente le proprietà farmacologiche desiderate, risultanti
più attivo (dicumarolo, esaclorofene);
questo è spesso ottenuto con una catena di polimetilene come spaziatore, in possesso di un adeguata
lunghezza

IBRIDAZIONE (FUSIONE DI ANELLI O API)

Due molecole, con un diverso meccanismo d'azione ma lo stesso effetto farmacologico, sono combinate da un
legame covalente in una singola entità chimica.
Se il legame può essere facilmente rotto a livello metabolico, ciascun farmaco eserciterà il suo effetto in base al
suo meccanismo d'azione.
L'ibridazione fornisce un vantaggio cinetico farmacologico (può prevenire gli inconvenienti di PK correlati alla
somministrazione del singolo farmaco)
Condizione richiesta: dosi dei due farmaci compatibili con il rapporto stechiometrico ibrido.

Esempio
Ampicillina (antibiotico beta-lattamico) e sulbactam (inibitore delle b-lattamasi) per formare sultamicillina,
facilmente idrolizzata dagli enzimi plasmatici.

Se il legame non subisce degradazione a livello metabolico, la molecola sarà una nuova attività chimica, portando
al seguente scenario:
1. Attivo secondo i meccanismi di azione appartenenti a ciascuna API
2. Attivo da un solo meccanismo
3. Completamente inattivo.

PROFARMACI

Esempio. Esterificazione di acidi e alcoli, acilazione di ammine, ecc.

La strategia consente la somministrazione di composti che non avrebbero proprietà PK adeguate senza la
derivatizzazione
Affrontare diversi problemi come sensibilità agli acidi, scarsa permeabilità della membrana, tossicità da droghe,
cattivo gusto, breve durata d'azione.
È importante assicurarsi che il profarmaco sia effettivamente convertito nel farmaco bersaglio una volta che è
stato assorbito nell'apporto di sangue.

* Esterificazione del gruppo ossidrile di ossazepam con anidride succinica da formare

il corrispondente emi-succinato (introduzione di un sito ionizzabile per favorire l'acqua
solubilità - farmaco quasi insolubile)
* Esterificazione di adrenalina con acido pivalico, aumentando la lipofilia del
molecola e permettendo l'uso oftalmico per il trattamento del glaucoma.

PACCO SLIDE 10
isosteria
La sostituzione isosterica è uno degli approcci più sfruttati nelle manipolazioni strutturali
Il principio di base del metodo è l'introduzione di sostituenti o gruppi con proprietà fisiche o chimiche simili che
producono proprietà biologiche sostanzialmente simili in un composto chimico.
Due molecole isotoniche dovrebbero essere biologicamente simili (forma simile, volume simile, ecc ...)

Isosterismo - definizioni
Langmiur (1919): stesso numero e stessa disposizione elettronica

Allen (1918): definito il numero molecolare di un composto in modo simile al numero atomico

Grimm (1925):
Il concetto di isoster è stato poi ampliato da Grimm con la dichiarazione
di «Idride Displacement Law»: aggiungendo un idruro lo pseudoatomo acquisisce le proprietà dell'atomo
successivo (numero atomico superiore)
Erlenmayer (1948): estese il concetto di Grimm definendo isoster come atomi, ioni e molecole in cui gli strati
periferici di elettroni.
L'isosterismo non si basa solo sul numero di elettroni nel guscio esterno, ma dipende dalla forma, dalla dimensione
e dalla polarità generali

Hinsberg (1916) ha introdotto il concetto di equivalenze ad anello.

Osservando l'elevata somiglianza tra le proprietà di benzene e tiofene (For esempio, il punto di ebollizione del
benzene è 81,1 ° C e quello del tiofene è 84,4 ° C), proposto la seguente equivalenza: -CH = CH- e -SThe
l'osservazione ha aperto la strada allo scambio isosterico tra diversi aromatici anelli: forma e volume simili

Studi successivi hanno evidenziato che il guscio di valenza non era la condizione chiave per l'isosterismo, poiché
il tipo di ibridazione aveva un'influenza più elevata sulla capacità di un gruppo di sostituirsi ad un altro
La somiglianza biologica supera le regole classiche dell'isosterismo.

Friedman (1951)
"Definiremo composti" bioisotonici "se corrispondono alla definizione più ampia di isosteri e hanno lo stesso tipo
di attività biologica."
Thornber (1979) Identificazione dei parametri chiave che fanno di un gruppo di molecole un gruppo di bioisoteri.

PERCHÉ I BIOISOSTERI?

Molte proprietà possono essere modulate con bioisosteri appropriati:

• Miglioramento della selettività
• Meno effetti collaterali
• Diminuzione della tossicità
• Miglioramento della farmacocinetica: solubilità / idrofobicità
• Aumento della stabilità metabolica
• Percorsi sintetici semplificati
• Composti di piombo brevettati

Burger (1970)

"I bioisoster sono composti o gruppi che possiedono quasi uguale shapess e volumi molecolari,
approssimativamente la stessa distribuzione di elettroni e che esibiscono proprietà fisiche simili come l'idrofobicità.
i composti influenzano gli stessi sistemi associati biochimicamente come agonisti o antagonisti e quindi producono
proprietà biologiche che sono legate l'una all'altra ".

Biosi-sti classici: atomo monovalente e gruppi

Scambio tra atomi di alogeno e gruppi -XHn con X = C, N, S, O
Ci sono diversi esempi di scambi di atomi di alogeni: il cloro è ben sostituito da gruppi come -CF3 o -CN.
Una sostituzione bio-isosterica molto comune è quella tra un gruppo amminico (-NHR) e un gruppo ossidrile (-OH)
per proprietà simili in termini di volume, impedimento sterico, formazione di legami idrogeno (accettori e donatori).
Per lo stesso motivo un'altra importante sostituzione bioisosterica in medicina. Chem. considera
l'interscambiabilità tra tiolo (-SH) e gruppo ossidrile (-OH), che è considerato come un'estensione dell'ammina-
idrossi.
I gruppi fluoro, metile, amminico e ossidrile possono spesso sostituire idrogeno nelle sostituzioni bioisosteriche,
grazie all'abilità bersaglio di sostituenti accomodanti con diversi chemio-fisici proprietà.

Biosi-sti classici: atomo e gruppi bivalenti

Sono inclusi: -O-, -S-, -NH -, - CH2-

Hanno portato a famose manipolazioni molecolari di successo:

Sostituenti
F, Cl, Br, I, CF3, NO2,
Metile, etile, isopropile, ciclopropile, t-butile,
-OH, -SH, -NH2, -OMe, -N (Me) 2
Collegatori
-CH2-, -NH-, -O-,
-COCH2-, -CONH-, -COO-
> C = O,> C = S,> C = NH
> C = NOH,> C = NOAlkyl
Gruppi e atomi nei sistemi ad anello
-CH =, -N =, -CH2-, -NH-, -O-, -S-
-CH2CH2-, -CH2-O-, -CH = CH-
Gruppi
-NHCOCH3, -SO2CH3
BIOISOSTERICI NON CLASSICI

Metodi teorici e computazionali hanno favorito la definizione di diversi bioisosterici di gruppi funzionali responsabile
per droga / obiettivo chiave interazioni, mediante analisi di sterico e motivi elettronici che determinano somiglianza
biologica

Un buon esempio di bioisosterismo è rappresentato dall'interscambiabilità del gruppo idrossile e solfonammide in

catecolamine, anche se può portare a inversione funzionale (alcuni sulfonamide-isosteris sono agonisti, altri
antagonisti)
CYCLYC BIOISOSTERS

La marcata somiglianza chemio-fisica tra benzene e tiofene dipende sulla struttura elettronica dell'atomo di zolfo,
che porta a diverse forme di risonanza, alcune molto simile all'orbito di carbonio Π orbitali: non è lo stesso per
furane (O) o pirrolo (N), meno utile come bioisostero benzene.

Proprio come la coppia benzene-tiofene, quella piyridina-tiazolica è un buon esempio di bioisosterismo

BIOISOSTERI - ESEMPI FAMOSI

La sostituzione dell'ammide con un doppio legame ha portato allo sviluppo di sulindac

da indometacina (NAIDS - inibitori COX).
Isolamento di isomeri geometrici e delucidazione della modalità bionding con COX

F come un isostere di H

Le proprietà uniche di F hanno portato alla sua diffusa applicazione nella progettazione di farmaci come
un isostere per H, poiché l'incorporazione di F può modulare in modo produttivo una gamma di
proprietà di interesse per i chimici medicinali.
Migliorare la stabilità metabolica

Effetto sul pKa

Come l'atomo più elettronegativo, F ha un effetto molto forte sull'acidità o sulla basicità dei gruppi funzionali vicini.
Effetto sulla conformazione molecolare

il legame C-F è più polarizzato e può influenzare i pregiudizi conformazionali tramite interazioni elettrostatiche
intramolecolari

-COOH isosteres
Isosteri di acido carbossilico sono stati studiati ampiamente. Questi studi sono in genere focalizzati su
• Aumentare la potenza
• Ridurre la polarità
• Aumento della lipofilia
• (migliorare la permeabilità della membrana)
• Miglioramento delle proprietà farmacocinetiche
• Ridurre il potenziale di tossicità
L'affinità di legame con il recettore in una serie di acidi bifenilici è abbastanza sensibile all'identità
dell'elemento acido.

-COOH isosteres (2,6-Difluorofenolo)

-Ammidi e isosteroli di esteri

Gli isidi di ammide sono stati tipicamente di interesse come mezzo per modulare la polarità e
biodisponibilità, mentre gli isoteri di estere sono stati spesso sviluppati per rispondere
problemi di metabolismo poiché gli esteri possono essere rapidamente tagliati in vivo.

-Amidi isosteres
La trifluoroetilammina può agire come un isostere di una porzione ammidica in peptidebased
molecole.

La somiglianza funzionale è basata su

- Ridurre la base dell'ammina senza compromettere
la capacità dell'NH di funzionare come donatore di legame H
- Il legame di CF3CH (R) NHR è vicino a 120 ° osservato per il teamide
- Il legame C-CF3 è polarizzato come il legame C = O

Isosteri di fosfato
Bioisosteri - restrizioni

Prima dell'avvento di CADD (progettazione assistita da computer), il bioisosterismo era

spesso determinato alla fine del processo.
I metodi computazionali aiutano a prevedere il bioisosterismo, identificando lo sterico e
determinanti elettronici dei gruppi.

Mappa del potenziale elettrostatico per metilacetato e 3,5-dimetil-1,2,4-ossadiazolo (aumento della

resistenza metabolica)

È stato identificato un criterio che non significa che sia assoluto, lavorando allo stesso modo in
diverse situazioni.
LIBRARY DESIGN/SINTESI
Target proteico sconosciuto: max. Generazione di biblioteca di diversità. Struttura 3D nota:
screening virtuale, sintesi della libreria focalizzata.

Usando x blocchi predefiniti per ciascun punto di diversità otteniamo xy cpds libreria analoghi di hit
/ lead. Tutte le informazioni biologiche raccolte per le manipolazioni strutturali di una serie di
analoghi portano allo studio della relazione struttura-attività e aprono la strada all'identificazione
del farmacoforo.

Usando x blocchi predefiniti per ciascun punto di diversità otteniamo xy cpds

• stesso scaffold (in rosso)

• Senza conoscere la via sintetica, possiamo ancora identificare gli elementi della diversità (in blu)
• Senza conoscere la via sintetica, non possiamo identificare i blocchi costitutivi.
STRATEGIE SINTETICHE

• Sintesi di Ellman
• 20 acil cloruri, 35 amminoacidi e 16 agenti alchilanti significano 11.200 (20x35x16) composti
• Libreria sintetica con metodo split-mix
• La sintesi parallela richiederebbe 11.200 x 6 reazioni.

Criteri per la selezione del building block

• Database di prodotti disponibili in commercio

• Software per la selezione di un sottoinsieme di n composti.

Caratteristiche principali dei blocchi predefiniti

 • Facile accesso (disponibile in commercio)
• I blocchi di costruzione dovrebbero consentire la progettazione di una rotta con reazioni che
sfruttano gruppi funzionali comuni
• Orthogonality (Compatibilità con le condizioni sintetiche di reazione strategica)
• L'ordine delle diverse fasi di reazione può favorire la sintesi

Proprietà chemio-fisiche

Diversità dei building block

Facilmente ottenuto con blocchi di costruzione disponibili in commercio

Funzioni fisico-fisiche dei blocchi predefiniti
Il numero del punto di diversità (y) dà un contributo maggiore al numero totale composto più del
numero di blocchi (x) utilizzato per la modifica chimica.

DRUG DESIGN DI PEPTIDI E PEPTIDOMIMETICI

I peptidi mostrano un grande potenziale farmaceutico come farmaci attivi e diagnostica in diverse
aree cliniche come endocrinologia, urologia, ostetricia, oncologia, ecc. E come eccipienti funzionali
nei sistemi di somministrazione di farmaci per superare le barriere cellulari e cellulari (Nestor, 2009).
Da un punto di vista farmaceutico, i peptidi si trovano da qualche parte tra le classiche sostanze
farmaceutiche organiche e biofarmaceutici ad alto peso molecolare.
Farmaci peptidici

L'uso farmacologico dei peptidi naturali è compromesso dalla scarsa biodisponibilità e scarsa stabilità
in condizioni fisiologiche

Principali inconvenienti nello sviluppo di un farmaco peptidico

• Libertà conformazionale
• Stabilità nel corpo (effetti metabolici)
• Stabilità in forma farmaceutica
• Assorbimento e somministrazione

Conformità e attività

I peptidi mostrano un'elevata libertà conformazionale e l'attività biologica è strettamente correlata

alla conformazione adottata.

Modificazioni molecolari dei peptidi

I peptidi soffrono di gravi problemi di biodisponibilità, metabolismo rapido, mancanza di attività

quando somministrati per via orale, rendendo complesso il loro uso terapeutico.
Abbiamo bisogno di sviluppare analoghi peptidici con proprietà farmacologiche migliorate e proprietà
farmacocinetiche adeguate: questi prodotti devono conservare completamente o solo in parte una
spina dorsale peptidica o avere una natura non peptidica, ma sono tutti definiti peptidomimetici
poiché conservano la potenza del composto del piombo, affinità e specificità.

PEPTIDOMIMETICA
Piccole catene proteiche progettate per imitare un peptide.
-Si tipicamente derivano dalla modifica di un peptide esistente o progettando sistemi simili che
imitano i peptidi (peptoidi e p-peptidi).
-La struttura chimica alterata è progettata per regolare vantaggiosamente le proprietà molecolari
quali, stabilità o attività biologica: migliore stabilità in vivo mediante resistenza alle peptidasi
- Queste modifiche comportano modifiche al peptide che non si verificano in modo naturale (come
le dorsali alterate e l'incorporazione di aminoacidi non naturali).

Scopo
• Identificazione di sostanze con una conformazione bloccata in grado di imitare l'effetto
biologico del peptide - -> migliore somiglianza del FARMACO

Processi
• Riconoscimento di focacoforo
• Design di una strategia analogica rigida (geometria fissa)

Strategie
• Singolo a.a. modificato
• Analoghi del peptide

Classificazione peptidomimetica
Peptidomimetici o pseudopeptidi di tipo I:
Questi sono sintetizzati dalla struttura del farmaco basato sulla struttura. Questi peptidomimetici
sono strettamente simili alla spina dorsale del peptide pur mantenendo gruppi funzionali che
rendono importanti i contatti con i siti di legame dei recettori. Alcune unità simulano brevi parti della
struttura secondaria del peptide, ad esempio b-turn e sono state utilizzate per generare composti
di piombo.

Peptidomimetici di tipo II o mimetici funzionali:

Questi peptidomimetici sono sintetizzati mediante modellazione molecolare e screening ad alto
rendimento (HTS), ecc. Si tratta di piccole molecole non peptidiche che si legano a un recettore
peptidico. La morfina è stato il primo esempio ben caratterizzato di questo tipo di peptidomimetico.

Peptidomimetici di tipo III o mimetici topografici:

Questi sono sintetizzati dalla struttura del farmaco basato sulla struttura. Possiedono nuovi modelli,
che sembrano estranei ai peptidi originali ma contengono i gruppi essenziali, posizionati su un
romanzo impalcatura non peptidica per servire da mimetici topografici.
Diversi inibitori della proteasi peptidomimetici di tipo III hanno progettato.

Peptidomimetici di tipo IV o mimetici non peptidici:

Questi sono sintetizzati dalla tecnica GRAB (Replacement Replacement Assisted Binding) del
farmaco design. Queste strutture potrebbero condividere caratteristiche funzionali strutturali dei
peptidomimetici di tipo I, ma si legano a una forma enzimatica non accessibile con peptidomimetici
di tipo I.

In un design peptidomimetico, l'introduzione di vincoli strutturali (cicli, sostituenti ingombranti,

residui non convenzionali a.a.) è una buona strategia per bloccare la conformazione, favorendo
quella bioattiva.
I β-turns costituiscono un'unità tetra peptidica, che causa un'inversione di direzione della catena
peptidica. Formalmente, le spire possono essere descritte dalla distanza tra il Cα del primo residuo
e il Cα del quarto residuo.

Mimetici della struttura secondaria: γ-Turn

Il legame H è formato tra l'ossigeno carbonilico del residuo i e l'azoto del residuo i + 2 (pseudociclo
a 7 membri)
Sono stati trovati peptidomimetici selettivi per ciascuno dei sottotipi recettoriali. La nostra
attenzione è stata attirata dalla serie di analoghi contenenti un residuo MeTrp …
Sono stati trovati peptidomimetici selettivi per ciascuno dei sottotipi recettoriali. La nostra
attenzione è stata attirata dalla serie di analoghi contenenti un residuo MeTrp …

PACCO SLIDE 11

CHIMICA COMBINATORIALE
Definizione: tecnologia di laboratorio e metodi che consentono la sintesi parallela di un numero
elevato di composti (da decine a migliaia o più) a partire da un pool di elementi costitutivi
Storia: Introduzione al Merrifield del 1962-1964 della sintesi del peptide in fase solida
1982-1988 Furka introduzione del metodo "split & pool", concetto di
sintesi peptidica combinatoria
1983 Frank sintesi di nucleotidi mediante metodo SPOT
1984 Geysen introduce il sistema "multipin"
1985 Houghten introduzione del sistema "bustine di tè"

Caratteristiche chiave di Cheministry combinatoria:

Sintesi di una vasta libreria di composti combinando un insieme di elementi costitutivi in un percorso
sistematico sintetico.
La sintesi combinatoria deve essere eseguita sia sintetizzando una miscela di composti unici in
ciascun reattore (Split e Mix) sia sintetizzando un composto per reattore (Parallel Synthesis).
Migliaia di composti sono facilmente sintetizzati e testati per l'attività (High Throughput
Screening) prima di una completa caratterizzazione analitica.
screening di librerie di elementi costitutivi.

Ricerca sistematica di piccoli peptidi biologicamente attivi mediante sintesi e

screening di miscele peptidiche.
Ricerca sistematica di piccoli peptidi biologicamente attivi mediante sintesi e
screening di miscele peptidiche.

Considerando il numero di amminoacidi naturali il numero di peptidi sintetizzabili

contenente n residui può essere espresso come:
Nn = 20n
Se i peptidi n-residui devono essere sintetizzati passo dopo passo, il numero complessivo di passaggi
sarebbe:
Sn = (n-1) 20n
Considerando un ciclo di accoppiamento completo (protezione e deprotezione) e ottimizzazione del
sintesi al numero minimo di passaggi richiesti, il numero complessivo di passaggi sarebbe:

Considerando i diversi test di screening da eseguire su ciascun peptide, con t numero di

test per ciascun peptide, il numero totale del test sarebbe:

Tn = t 20n

Numero di possibili peptidi (Nn) contenenti un numero diverso di residui (n), numero di passaggi
sintetici da eseguire in un processo ottimizzato (Sn) e numero di esperimenti di screening (Tn) per
dieci tipi di test diversi (t = 10)

La sintesi passo dopo passo non sarebbe conveniente !!!!

"La massa di una libreria di proteine ... supererebbe quella dell'universo di oltre duecento ordini di
grandezza"

Sintesi in fase solida: k è il numero di a.a. cambiato nella posizione I. La resina è divisa in porzioni
uguali di Ki. Ciascuna porzione è accoppiata con un k1 aa, il gruppo protettivo viene rimosso, le
parti di resina vengono unite e quindi nuovamente separate in porzioni uguali di K2 per reagire con
k2 a.a. Il numero di peptidi formati (numero di componenti nella miscela di peptidi) può essere
calcolato come segue:
Nn = k1.k2. . . . . . kn-1.kn
Se lo stesso numero (k) di aa viene modificato in ogni posizione, allora
Nn = kn
Il numero di passaggi sintetici per una miscela contenente peptidi Nn (considerando una reazione
separata per il primo aa) sarebbe:
Sn = k1 + k2 +. . . . + kn-1 + kn
Se lo stesso numero (k) di aa viene modificato in ogni posizione, allora
Sn = nK
Vantaggio della sintesi delle miscele peptidiche: il numero di passaggi richiesti può essere calcolato
aggiungendo il numero di a.a., mentre il numero di peptidi è dato dalla potenza di diversi a.a.
numero.
Esempio: la sintesi di una miscela di tetrameri preparata combinando 20 aa richiede solo 80
passaggi sintetici.
Allo stesso tempo si formerebbero anche oligomeri corti (400 dipeptidi, 8000 tripeptidi)
L'approccio tradizionale avrebbe richiesto 168400 passaggi sintetici, mentre in 80 passi sarebbero
stati sintetizzati solo 30 tetrapeptidi.

CombiChem Strategie sintetiche

• Sintesi split e pool
• Sintesi parallela
• Sintesi della miscela di reagente

Metodologie sintetiche in CombiChem

• Sintesi organica in fase solida
 • Soluzione e sintesi di fase liquida

Caratterizzazione delle Biblioteche Combinatorie

• Caratterizzazione analitica
• Hit identificazione da HTS
• Strategie per miscele composte: screening su sfere, deconvoluzione, codifica chimica

• Sintesi organica in fase solida: ogni blocco di costruzione, ancorato a un tallone, viene posto
in un reattore. Dopo la reazione tutti i composti sono miscelati in un unico reattore, lavati e
deprotetti. Le sfere vengono quindi protette in diversi reattori per eseguire una seconda fase
di reazione. Lo stesso processo: split, mix e split viene ripetuto fino a ottenere la libreria
desiderata. vantaggi:

• numero ridotto di reattori

• un composto di un tallone Metodo applicato alla sintesi delle librerie HT

Sintesi split-pool

• L'ottimizzazione di 6 reazioni porta alla sintesi di 9 composti

• Ogni composto è ancorato su un tallone consentendo la miscelazione della libreria

EXAMPLE
Sintesi parallela

I composti sono sintetizzati in parallelo usando reattori separati (sistema ordinato), un composto di
posizione uno
vantaggi
• Un reattore un composto
• Localizzazione significa identificazione composta
• Metodo automatizzato
• Condizioni vitali in soluzione o in fase solida

• L'ottimizzazione di 12 reazioni porta a 9 composti

• Separazione fisica dei composti della libreria in condizioni di fase solida o in soluzione.
Miscela di reagenti Sintesi

I composti sono sintetizzati utilizzando una miscela di elementi costitutivi nello stesso reattore.
vantaggi
• fattibile sia per la soluzione che per le reazioni in fase solida
svantaggi
• L'uso di miscele di reagenti richiede la conoscenza dei meccanismi di reazione e della cinetica.
• La stessa velocità di reazione
• Rendimenti diversi per composti diversi

Metodologie sintetiche CombiChem

• Sintesi organica in fase solida: il composto è ancorato su a

supporto solido (cordone di resina) mediante incollaggio covalente tramite un linker.
La scissione viene eseguita in condizioni di reazione specifiche per rilasciare il
prodotto desiderato in soluzione.

vantaggi
• Facilità di aggiunta di reagenti, lavaggio, filtrazione, agitazione e composti
porzionatura nei reattori.
• Maggiore velocità di reazione utilizzando un eccesso eccessivo di reagenti della soluzione
• Buona automazione

• Soluzione e sintesi organica in fase liquida: utilizzata per la sintesi di librerie di piccole
dimensioni e di miscele composte.
Approccio favorito dall'uso di reagenti supportati.
Applicato in reazioni multicomponente.
• L'uso di reagenti supportati da polimeri combina alcuni vantaggi dell'approccio alla fase solida alla
sintesi della fase della soluzione.
La maggior parte della sintesi organica in fase liquida si basa sulle proprietà chemio-fisiche del
polietilenglicole monometil etere, solubile in diversi solventi organici (reazioni di fase omogenea)
che cristallizza con solventi appropriati (facile purificazione e isolamento del composto target)

Perché sintesi su supporto?

• Il supporto polimerico reticullare, insolubile, viene gonfiato

in un solvente appropriato
• A (substrato legato con polimero), reagisce come nella soluzione
all'interfaccia sol-gel

1. Eccesso di reagente -> alto tasso e resa

2. Purificazione mediante lavaggio del polimero
3. Ridotti inconvenienti di solubilità
4. condizioni di "pseudo-diluizione"
5. Effetto dell'amplificazione di massa
6. Metodologia automatizzata

1. Eccesso di reagente -> alte rese

LA CONVERSIONE COMPLETA PU BE ESSERE FACILMENTE RAGGIUNTA ->
Sintesi MULTISTEP in buone rese
L'uso di un eccesso di reagenti è una buona strategia per forza la reazione al completamento
(sia in soluzione che in fase solida); La velocità cinetica della fase solida lenta (diffusione ..) è
aumentato a concentrazioni più elevate
IN SOLUZIONE
L'uso di 5 equivalenti di reagenti porta generalmente a una purificazione complessa di
il prodotto.
SU FASE SOLIDA
L'uso di 5 equivalenti è più facile, poiché l'eccesso viene rimosso da
lavare la resina con un solvente appropriato.
Le reazioni possono essere ripetute senza inconvenienti significativi.

2. Lavaggio del polimero

LAVAGGIO E FILTRAGGIO EVITARE:
•Estrazione
• Chormatography
•Cristallizzazione
•Evaporazione

3. Ridotti inconvenienti di solubilità

• Il supporto non è solubile (polimero reticolare)
• Un solvente appropriato consente il gonfiore e
permeazione solvente / reagenti
• Il substrato legato al polimero viene portato al solgel
interfaccia: è sufficiente che il polimero si gonfia
e non è necessario che il substrato sia solubile
• -> la solubilità dei prodotti intermedi liberi no
influire sulla reattività
4. condizioni di "pseudo-diluizione"
L'immobilizzazione del substrato sui mezzi di supporto polimerici insolubili
• La diffusione è compromessa
• Le reazioni intermolecolari sono compromesse
• Sono preferiti i prodotti intramolecolari
• Sono possibili eccezioni
5. Effetto dell'amplificazione di massa

6. Metodologia automatizzata
Automazione dell'intero processo sintetico su fase solida: aggiunta di reagenti e fasi di purificazione
• Sintesi peptidica
• Sintesi di oligonucleotidi.

Approcci computazionali nella progettazione di farmaci

Dati sperimentali, insieme ad approcci computazionali, forniscono strumenti utili per

• La progettazione di potenziali farmaci,
• Lo studio dei sistemi biologici
• Conoscenza del meccanismo di interazione bersaglio-ligando
Correlazione dell'attività delle molecole con conformazione e cambiamenti conformazionali

COMPUTATIONAL APPROACHES IN DRUG DESIGN

GEOMETRIA MOLECOLARE

La maggior parte degli approcci di modellazione molecolare e computazionale richiedono la

conoscenza della geometria specifica dei composti studiati: disposizione delle molecole
tridimensionali
STRETTO RAPPORTO TRA GEOMETRIA MOLECOLARE E PROPRIETÀ MOLECOLARI

Geometria molecolare
Forma tridimensionale che una molecola occupa nello spazio
Coordinate
Coordinate cartesiane
coordinate x, y, z di ciascun atomo nella molecola
Coordinate esterne
Posizione reciproca degli atomi

Coordinate
• Coordinate esterne
• Distanza di legame
• Angolo di legame
• Angolo torsionale o diedro

Determinazione della geometria molecolare

Metodi sperimentali
• NMR, raggi X.
Mehods computazionali
• Generazione di energia minima coordinate

Metodi di meccanica quantistica

Permettono lo studio delle proprietà chemio-fisiche ed elettroniche delle molecole sfruttando i
principi della chimica quantistica (ad esempio l'equazione di Schrödinger)
Le molecole sono costituite da atomi caratterizzati da nuclei carichi positivamente circondati da
elettroni.
Gli elettroni del guscio esterno interagiscono insieme per formare orbitali molecolari, caratteristici
in ciascun legame chimico.
• Ab-initio:soluzione complete eq. Schrödinger.
• Semi-empirici: risoluzione approssimativa

Basato su Ligand
Struttura 3D di destinazione nota

LB Virtual screening (LBVS)

 • basato sulla forma
• struttura basata sulla similarità
• basato sulla sottostruttura
• basato sul farmacoforo

Structure based
Struttura 3D di destinazione sconosciuta
• SB Virtual Screening (SBVS)
• Docking
• Dinamica molecolare

- QSAR (relazione quantitativa struttura-attività)

SCREENING VIRTUALE
• Lo screening virtuale è l'analogo computazionale o in silico dello screening biologico
• L'obiettivo è quello di segnare, classificare o filtrare un insieme di strutture utilizzando una o più
procedure computazionali
•Può essere usato
-Per aiutare a decidere quali composti analizzare (sperimentalmente)
-Che librerie da sintetizzare
-Che composti da acquistare da un'azienda esterna
-Per analizzare i risultati di un esperimento, come una run HTS

❖ Moderna procedura in silico applicata alla scoperta di farmaci per identificare "composti a
impatto virtuale" con potenziale attività verso un bersaglio biologico.
❖ Aiuta la valutazione simultanea di diverse librerie di composti (milioni di molecole) disponibili
in commercio o progettate specificamente.
❖ Lo screening virtuale può essere eseguito applicando diversi metodi computazionali:
o Screening Screening farmacologico
o Docking molecolare e altro ancora
❖ È un processo a più fasi, in cui diversi criteri di filtro vengono applicati in sequenza.

Lo screening virtuale riduce le dimensioni del pagliaio selezionando:

Composti o biblioteche che sono o simili al piombo, o simili a farmaci, o che hanno il potenziale di
biodisponibilità orale, o sono simili a un piombo o che si adattano al sito di legame di una
determinata proteina
dalle regole (ad esempio le regole di biodisponibilità di Lipinski), analisi di somiglianza, analisi del
farmacoforo, o docking and scoring.

La chimica medicinale tradizionale era basata sull'ottimizzazione di pochi composti attivi (LEAD)
Oggi CADD consente la ricerca di nuove strutture tra enormi database di composti proprietari o
commercialmente disponibili. Le strutture 2D contenute nel database vengono convertite in 3D
Sono stati calcolati diversi descrittori 1D, 2D e 3D. Il database 2D 2D consente ricerche di
sottostrutture (query). Le proprietà 3D portano a domande basate sul farmacoforo.

OBBIETTIVI
• Alta affinità e selettività
• Fattibilità sintetica
• Applicazione di filtri per la rimozione di composti con gruppi altamente reattivi
• biodisponibilità orale
-Lipinski rules (rule of 5)
• Buone proprietà PK
• Mancanza di effetti tossici e collaterali.

Screening virtuale
Passi

1. Preparazione del database per lo screening virtuale:

2. Selezione dell'approccio computazionale

-LBVS
-SBVS
Metodologie computazionali per l'identificazione di composti biologicamente attivi da basi di dati di
piccole molecole:
LBVS: nuovi ligandi potenzialmente attivi per uno specifico target biologico saranno identificati da:
• Somiglianza con ligandi attivi noti
• Ipotesi di farmacoforo

Metodologie computazionali per l'identificazione di composti biologicamente attivi da basi di dati di

piccole molecole:
SBVS: l'obiettivo è identificare nuovi ligandi potenzialmente attivi verso uno specifico target
biologico di 3D conosciuto. Mediante i composti di docking molecolare vengono selezionati in base
al punteggio energetico (spesso in base a più punteggi energetici: CONSENSUS SCORE METHOD)

Pre-elaborazione del database del composto

a) Eliminazione di:
• Duplicati
• Gruppi reattivi (es. Gruppi elettrofili, chelanti ionici, accettori di Michael); atomi
indesiderabili (ad esempio complessi organometallici);
• Funzioni tossiche
b) filtri di somiglianza tra droghe ("regola dei cinque" di Lipinski)
c) Equilibri tautomerici (o tautomeri predominanti)
d) Equilibrio di dissociazione / protonazione di acidi e basi
e) Equilibri protomerici (ad esempio imidazolo)
f) 2D-3D - Generazione di configurazioni corrette o alternative, enantiomeri, diastereomeri
g) In silico ADMET (opzione)
h) Carattere simile a piombo / farmaco (opzione)
i) Selezione per diversità chimica (opzione).

a) Garbage Filter
Gruppi indesiderati che possono produrre colpi di screening in vitro falsi positive

Composti altamente reattivi (potenzialmente soggetti a idrolisi, reazioni con specie nucleofile
biologiche ....), Meno stabili e potenzialmente tossici, possono essere filtrati anche mediante
ispezione visiva: 3 (o più) anelli aromatici fusi, 4 (o più) alogeni; epossidi, chinoni, idrazidi, azidi .....

Definizione drug-likeness
Un potenziale candidato farmaco deve possedere:
-MW ≤ 500
-LogP ≤ 5
-H donatori legame idrogeno ≤ 5 (somma di gruppi OH e NH)
-Accettatori di legami idrogeno≤ 10 (somma di N, carbonile, gruppi carbossilici)
-N ° di legami ruotabili <10 (flessibilità molecolare).

Previsione del profilo ADME-T in silico: solubilità in acqua mimimun, permeabilità intestinale minima
richiesta, assenza di inibizione dei canali hERG, legame limitato alle proteine plasmatiche, ecc ....
Dissociazione degli acidi e protonazione delle basi
Regole di Sadowski (AstraZeneca)

• carica permanente: acidi, ammidine, guanidine, quart. N, ...

• cariche negative: acidi idrossamici, azoto acido (ad es. Sulfamidici attivate), ...
• cariche positive: ammine di base, imidazoli, piridine, ...
• restrizioni di protonazione
numero massimo di cariche permanenti per molecola
numero massimo di "atomi di carica totale massima" caricabile
numero massimo di cariche nello stesso squillo
nessuna spesa identica in posizioni adiacenti

PACCO SLIDE 12

Progettazione di farmaci basati sul ligando

• Identificazione del HIT (nuovi scaffold)
• Hit-to-lead
• Ottimizzazione dei lead (librerie focalizzate)
Approccio computazionale - LBVS
Screening virtuale basato sulla similarità
• Data una struttura di riferimento attiva ordinare un database di composti sulla somiglianza con il
riferimento
• Selezionare i composti top ranking per i test biologici
• Richiede un modo per misurare la somiglianza di una coppia di composti Ma la somiglianza è
intrinsecamente soggettiva, quindi è necessario fornire una base quantitativa, una misura di
somiglianza, per le strutture di classificazione Non esiste una singola misura di somiglianza.
Componenti di una misura di somiglianza
Descrittori molecolari
• Valori numerici assegnati alle strutture
• Proprietà fisico-chimiche, ad es. MW, logP, Polar Surface Area (PSA), ....
• Proprietà 2D: impronte digitali, indice topologico, sottostrutture comuni massime
• Proprietà 3D: impronte digitali, campi molecolari
Coefficiente di similarità:Una misura quantitativa di somiglianza tra due insiemi di descrittori
molecolari.
DESCRITTORI MOLECOLARI
La struttura molecolare è rappresentata da un insieme di descrittori molecolari che quantifica le
proprietà chemio-fisiche che sono rilevanti per l'attività biologica o per il comportamento
farmacocinetico.
Un descrittore può essere considerato come la rappresentazione matematica della struttura e delle
proprietà fisico-chimiche.
Per ogni serie di composti viene definito un insieme di numeri per costruire i corrispondenti modelli
chemiometrici, che vengono poi analizzati e valutati con metodi statistici specifici.
❖ 1D: descrittori derivati da formula chimica grezza, gruppi funzionali, ecc ....
❖ 2D: descrittori di atomi che formano la molecola e del legame corrispondente: n. di atomi
pesanti (C, X, N, O ..), n. di legami girevoli, n. di gruppi funzionali o anelli, MW, logP, SlogP,
carica formale, VDW, volume, densità, descrittori di superficie, ecc ...
Impronte digitali 2D: molecole rappresentate come vettori binary

Ogni bit nella stringa di bit (vettore binario) rappresenta un frammento molecolare. La lunghezza
tipica è ~ 1000 bit
• La stringa di bit per una molecola registra la presenza ("1") o l'assenza ("0") di ciascun frammento
nella molecola
• Originariamente sviluppato per accelerare la ricerca della sottostruttura - affinché una
sottostruttura della query sia presente in una molecola di database, ogni bit impostato su "1" nella
query deve essere impostato su "1" nella struttura del database
• La similarità si basa sulla determinazione del numero di bit comuni a due strutture

Coefficienti di similarità

Coefficiente tanimoto per stringhe di bit binari

-C bit impostati in comune nella struttura di riferimento e del database

-R bit impostati nella struttura di riferimento
-D bit impostati nella struttura del database
Forma più complessa da utilizzare con dati non binari, ad esempio vettori di proprietà fisico-chimiche
Esistono molti altri tipi di coefficiente di similarità che possono essere applicati, ad esempio
coefficiente coseno, distanza euclidea, indice Tversky.

Limitazioni dei descrittori 2D tradizionali

DESCRITTORI MOLECOLARI

❖ 3D: descrittori che derivano informazioni geometriche trattenute dalle coordinate 3D di una
o più molecole: energia di solvatazione, energia potenziale, PSA, superfici idrofile e idrofile,
forma molecolare, aree esposte ai solventi, ecc.
❖ Descrittori focacoforici: basati sul numero di funzioni responsabili dell'interazione farmaco-
bersaglio (risposta biologica).
I principali gruppi funzionali sono riassunti in pochi punti, considerando i donatori e gli
accettori del legame H, le interazioni idrofobiche.

... ..Conclusioni
Il concetto di farmacoforo è un approccio di successo e ben noto per la progettazione di farmaci (sia
a base di ligando e struttura), sia per lo screening virtuale.
Sono stati stabiliti diversi metodi per descrivere i farmacofori che mostrano differenze e capacità
significative nel loro modo di descrivere le caratteristiche chimiche come elementi costitutivi dei
farmacofori.
È importante che la rappresentazione della caratteristica chimica utilizzata rifletta le interazioni che
sono importanti per il bersaglio rappresentato, e alcune rappresentazioni di caratteristiche chimiche
sono più universali di altre.
La parte computazionale della modellizzazione del farmacoforo, diverse tecniche di allineamento
utilizzate per la delucidazione del farmacoforo e lo screening virtuale, è notevolmente migliorata
con la disponibilità di nuovi pacchetti software.
L'uso di nuovi algoritmi ha portato a ottimizzazioni delle prestazioni negli ultimi anni, portando a
moderni approcci di riconoscimento di modelli che sono in grado di eseguire il sovrapposizione di
farmacofori e molecole in una frazione del tempo che era necessario per approcci precedenti.

I descrittori farmacoforici sono usati per definire un farmacoforo, compresi i legami H, i siti di
interazione idrofobica ed elettrostatica, definiti da atomi, centri anulari e punti virtuali.

• Generazione dell'ipotesi farmacoforica:

• Selezione di composti attivi verso il bersaglio molecolare
• Analisi farmacoforica e identificazione delle caratteristiche 3D responsabili dell'interazione con il
recettore
• L'ipotesi Farmacoforica 3D viene utilizzata come query.
• La query viene utilizzata per analizzare i database molecolari 3D per identificare i risultati
corrispondenti alla query farmacoforica
• I composti di attacco sono visivamente ispezionati alla ricerca di fattibilità sintetica, test di legame,
possibilità di ulteriore ottimizzazione per sviluppare un composto di LEAD.

1. Generazione del database per lo screening virtuale

2. Generazione del farmacoforo

...... Più recentemente, la raccomandazione ufficiale IUPAC del 1997 ha riassunto il concetto come
segue:
"Un farmacoforo è l'insieme delle caratteristiche steriche ed elettroniche necessarie per assicurare
le interazioni supramolecolari ottimali con uno specifico target biologico e per innescare (o bloccare)
la sua risposta biologica"!

Punti di farmacoforo (definizioni)

❖ Gruppi idrofobici alifatici (Van der Waals)
(metile, etile, isobutile ecc.)
❖ Gli alogeni (Cl, Br) sono considerati idrofobi se legati a gruppi alchilici, arilici o acrilici
❖ Gruppi aromatici idrofobici (accatastamento, interazioni p-p)
Set di atomi appartenenti ad un anello aromatico.

Punti di farmacoforo (definizioni)

❖ Positivamente chrged group (+)
Interazioni ioniche (sali di ammonio quaternario). Gruppi di base influenzati da equilibri pKb.
❖ Gruppo a carico negativo (-)
Interazioni ioniche. Gruppi acidi influenzati da pKa equlibria.

Le caratteristiche comuni sono identificate per un insieme di composti attivi, la ricerca farmacofora
cerca quelle conformazioni che portano alla migliore corrispondenza con i punti farmacoforici, per
ogni molecola.
Una volta generata l'ipotesi, le conformazioni che mappano l'ipostesi devono essere vicine alla
minima conformità energetica
Un insieme di molecole inattive viene utilizzato come controllo negativo per verificare l'ipotesi.
Complessità della ricerca farmacoforica
- Un singolo gruppo funzionale può corrispondere a più di una caratteristica farmacoforica, in base
alle sue proprietà:
- Cl (idrofobico, accettore di legame H)
- COOH (H bond acceptor / donor, gruppo con carica negativa)
- arile (idrofobo, aromatico)

Vantaggi della ricerca farmacofora

-Differenti gruppi funzionali possono esercitare interazioni simili con il bersaglio.
- L'analisi del bioisosterismo svolge un ruolo cruciale

Ricerca farmacofora, I passaggi chiave

a) Studi conformazionali
b) Analisi delle caratteristiche
c) Selezione delle caratteristiche
d) Mappatura dell'ipotesi

a) Studi conformazionali
Attivo vs conformazione preferita
Uso di analoghi rigidi
Ridotta flessibilità conformazionale
Sondaggio della conformazione attiva.
Ricerca farmacofora
Conversione 2D-3D e analisi conformazionale
- Le conformazioni sono minimi di energia locali di una molecola
- Genera una struttura di partenza
- Prova lo spazio conformazionale
- Ridurre al minimo la struttura se necessario
Problemi nella definizione di farmacoforo
• Ionizzazione e dissociazione
(Regole di Sadowski, ACS Boston, 2002)
• Forme tautomeriche e protomeriche
(programma AGENT, ETH di Zurigo, riconoscimento di tautomeria ChemoSoft, ChemDiv)
• Proprietà dell'accettatore di ossigeno e di zolfo
(esteri, eteri aromatici, ossazoli, isossazoli, tiazoli, ecc.)

CASE STUDY
ACh: relazione struttura-attività (SAR) e modelli di recettori
Dagli anni '70 sono stati eseguiti diversi tentativi per definire il modello farmacoforico di Ach
Poiché la struttura del recettore 3D non era nota, l'ipotesi del farmacoforo era basata su insiemi di
ligandi inattivi / attivi.
Recettore della nicotina: una delle prime analisi computer-based recuperabili in letteratura
(Sheridan, RP, Nilakantan, R .; Dixon, JS, Venkataraghavan, RJ Med. Chem. 1986, 29, 899-906)
aveva identificato tre punti vertice di un triangolo (A, B, C);
Condizione da verificare: presenza dei punti identificati nelle molecole appartenenti al set (analisi di
sovrapposizione),
Se l'assunzione fatta per definire il farmacoforo è vera, qualsiasi molecola dell'insieme che non
soddisfa i criteri applicati suggerisce una definizione errata dei punti A, B, C.
Se diverse sovrapposizioni soddisfano i criteri applicati, l'insieme deve essere ingrandito per
ottenere una soluzione unica.
Le molecole sono state incluse nel set di test in base alla loro diversità strutturale
e alla loro ridotta flessibilità; tuttavia nessuno di questi è abbastanza rigido da condurre a
ipotesi farmacoforetica da sola.
Definizione dei punti:
A. ammonio quaternario o ammina terziaria caricata;
B. Accettore di legame H (atomo elettronegativo);
C. frazione carbonilica (eccetto la nicotina);
La linea che collega B a C mostra la direzione del dipolo locale.
Per la cistina, solo l'enantiomero (-) soddisfa il farmacoforo
requisiti geometrici.

Per la nicotina entrambi gli enantiomeri sono attivi, anche se il (-)

l'enantiomero (eutomero) è 10 volte più attivo del (+)
enantiomero (distomer).
SOMIGLIANZA MOLECOLARE

Come si calcola?
Valutazione quantitativa della somiglianza / dissomiglianza delle strutture
❖ Richiesta una forma numericamente trattabile
❖ Descrittori molecolari, impronte digitali, chiavi strutturali
Sequenze / vettori di bit o valori numerici che possono essere confrontati mediante funzioni di
distanza, metriche di somiglianza.
La struttura di ogni molecola può essere codificata da un'impronta digitale numerica
Ogni numero / valore econdisce una proprietà specifica (ad es. Presenza di un anello aromatico)
Per metrica si confrontano le diverse stringhe valutando la similarità dei composti.
Esempio 1: chemical fingerprint

❖ Encodes topological properties of the chemical graph: connectivity, edge label (bond type),
node label (atom type)
❖ Allows the comparison of two molecules with respect to their chemical structure

Costruzione
1.Tutti i passaggi 0, 1, ..., n passi nel grafico chimico
2.generare un array di bit per ogni marcia con il numero di bit impostato.

Esempio 2: fingerprint del farmacoforo

❖ Encode le proprietà farmacofore delle molecole come conteggi di frequenza di coppie di punti
di farmacoforo a una determinata distanza topologica
❖ Consente il confronto di due molecole rispetto al loro farmacoforo

Costruzione

1. Figura il tipo di punto di farmacoforo in atomi

2. Calcolare la lunghezza del percorso più breve tra ogni coppia di atomi.

La colorazione degli atomi basata sul punto di tipo farmacoforo: accettore, donatore, idrofobico,
nessuno.
Case study: Inibitori dell'integrasi dell'HIV-1.

Gli inibitori dell'integrasi agiscono bloccando l'integrasi, una proteina che l'HIV ha bisogno di inserire
il suo materiale genetico virale nel materiale genetico di una cellula infetta (reazione di trasferimento
del filamento di cDNA virale sul DNA ospite)
Le reazioni catalitiche mediate da IN sono essenziali per il processo di replicazione dell'HIV-1 e per
l'infezione virale sostenuta.

• Diversi inibitori IN di prima generazione sono in varie fasi degli studi clinici. S-1360 (3), un
bioisostere -decetoacido, è stato il primo inibitore di IN ad entrare negli studi clinici umani ...... .3
ha mostrato una potente attività antivirale contro una varietà di isolati clinici dell'HIV-1 ...
Sfortunatamente, 3 non hanno dimostrato efficacia in pazienti con infezione da HIV-1 a causa della
sua instabilità metabolica
• GS-9137 (2) era in fase avanzata di studi clinici (ora Elvitegravir)
• Il primo farmaco approvato dall'FDA negli Stati Uniti a partire da ottobre 2007, raltegravir (1), ha
mostrato una potente attività antivirale contro un ampio gruppo di isolati clinici di HIV-1, compresi
isolati resistenti a quasi tutti i farmaci antiretrovirali clinicamente utilizzati …

Identificazione farmacoforo
Un'analisi approfondita delle caratteristiche strutturali degli inibitori dell'acido 3-carbossilico del
chinolonico indica la presenza di diverse caratteristiche farmacoforiche.
• una caratteristica negativamente ionizzabile:
gruppo chinolone 3-carbossilato
• una funzione accettore H-bond: il -bketone,
• due caratteristiche aromatiche idrofobiche:
due anelli aromatici,
• una funzione di donatore H-bond:
l'NH dell'anello del chinolone (cpd 4)
o un OH dalla sostituzione in poi
N1 dell'anello del chinolone in cpd 5-7 e 2,
• una caratteristica idrofoba alifatica:
un gruppo isopropilico di
sostituzione su N1 dell'anello chinolonico in
composti 7 e 2.

L'analisi della relazione struttura-attività mostra che la variazione della sostituzione su N1 dell'anello
chinolonico ha un'influenza marginale sull'inibizione IN, in particolare dai composti 6-7 e 2.
È interessante notare che la variazione è fortemente correlata alla potenza antiretrovirale dei
composti. L'effetto marginale della sostituzione su N1 del nucleo del chinolone sull'inibizione
dell'attività catalitica IN indica che questa parte della molecola potrebbe non essere impegnata in
forti interazioni con IN.
Curiosamente, il pattern di sostituzione su N1 del nucleo di chinoloni ha contribuito in modo
significativo alle proprietà fisico-chimiche favorevoli dei composti, che hanno portato a un notevole
miglioramento dell'attività antiretrovirale dei composti.
È stato fornito a HIPHOP un set di allenamento costituito da cinque inibitori della chinolone 3-
carbossilato IN per la generazione dei modelli di farmacoforo a funzionalità comune (composti 4-7
e 2, Tabella 1).
HIPHOP ha generato 10 comuni
presentano ipotesi di farmacoforo.
È interessante notare che tutte e 10 le funzionalità comuni
i modelli di farmacoforo sono compresi
quattro caratteristiche vale a dire.
❖ una caratteristica negativamente ionizzabile (NI),
❖ una funzione H-bond acceptor (HBA),
❖ due caratteristiche idrofobiche aromatiche (HRA).

L'effetto marginale di sostituzione su N1 del nucleo di chinoloni sull'inibizione dell'attività catalitica

IN indica che questa parte della molecola potrebbe non essere impegnata in forti interazioni con
IN
Invece, il pattern di sostituzione su N1 del nucleo del chinolone ha contribuito in modo significativo
alle proprietà fisico-chimiche favorevoli dei composti, che ha portato a un notevole miglioramento
dell'attività antiretrovirale dei composti
Sostituzioni N1 non considerate nel modello farmacoforo.

Identificazione farmacoforo
una caratteristica negativamente ionizzabile (NI),
una funzione H-bond acceptor (HBA),
due caratteristiche idrofobiche aromatiche (HRA) ..........
Algoritmo HIPHOP all'interno del pacchetto software Catalyst (Accelrys, Inc.)

• Simile alla classe degli acidi -bdiketo degli inibitori di IN, 2 e dei suoi analoghi
creduto di interagire con gli ioni del sito attivo Mg2 + e quindi interrompere IN
attività catalitiche. I gruppi carbossilato e -betto del chinolone 3-
Si propone che gli inibitori dell'acido carbossilico siano coinvolti nella chelazione di
sito attivo ioni Mg2 +.
• L'orientamento delle caratteristiche HBA e NI nell'ipotesi del farmacoforo
(una delle 10 ipotesi generate da HIPHOP) è coerente con il
meccanismo di associazione proposto degli inibitori di chinolone 3-carbossilato IN.

.... Inoltre, Hypo 1 ha recuperato con successo un gran numero di noti

In inibitori da un database interno di piccole molecole (dati non
mostrato).
Ricerca nel database
...... .. Sulla base di una ragionevole disposizione delle sue principali caratteristiche farmacoforiche
e della sua capacità di distinguere gli IN inibitori noti,
abbiamo selezionato Hypo 1 da utilizzare come query di ricerca per recuperare nuovi
composti con disposizione ottimale delle caratteristiche farmacoforiche e diversi scaffold strutturali
da un database di piccole molecole disponibili in commercio. ... .Hypo 1 ha recuperato i
composti del 1978 da un database di 362 260 molecole disponibili in commercio
Un composto può essere recuperato come colpo solo quando tutte le caratteristiche del farmacoforo
sono mappate dalle caratteristiche chimiche del composto
Un numero inferiore di HIT, lo 0,54% del database di destinazione, indica il carattere distintivo di
Hypo1 nel recupero dei composti.
Il valore di adattamento farmacoforo è stato calcolato per tutti i risultati utilizzando Hypo1.
200 composti su 1978 colpi mappati su Hypo 1 con un valore di adattamento g 1,50 e sono stati
selezionati per ulteriori analisi
Esame visivo ... è stato eseguito per garantire
le caratteristiche farmacoforiche sono ragionevolmente
mappato sulle caratteristiche chimiche dei composti.
l'orientamento delle caratteristiche NI e HBA nello stesso piano è stato monitorato per ciascun
composto dopo la mappatura dell'Hypo1 sui composti.
Inoltre, tutti i composti con caratteristiche chimiche e strutturali interessanti sono stati agganciati
al sito attivo IN per prevedere il loro possibile orientamento vincolante e le interazioni specifiche
con residui di amminoacidi del sito attivo.
Gli orientamenti vincolanti previsti e le possibili interazioni esercitate dai composti all'interno del
sito attivo IN sono stati ispezionati visivamente
...... abbiamo selezionato 56 risultati per valutare l'attività inibitoria di IN utilizzando un test in vitro.
La selezione primaria è stata effettuata sulla base del valore di adattamento farmacoforo dei
composti e sull'orientamento relativo delle principali caratteristiche chimiche dei composti quando
mappati da Hypo1.
Abbiamo anche considerato l'orientamento vincolante previsto dei composti all'interno del sito attivo
IN e le interazioni chiave esercitate dai composti con residui di amminoacidi prominenti nel sito
attivo IN come criterio di selezione aggiuntivo.
56 Hit dal farmacoforo sono stati acquistati da un venditore di sostanze chimiche commerciali.
• Dei 56 testati, 11 composti hanno inibito le attività catalitiche IN con un valore IC50 <100 μM.
• 5 su 11 composti attivi hanno inibito l'attività di trasferimento del filamento di IN con un valore
IC50 <20 μM.
Inibitori dell'integrasi HIV-1
Tasso di successo 19,6%
Mappatura dell'ipotesi 1 (Hypo 1) della caratteristica comune a base di acido 3-carbossilico a base
di chinoloni sui composti 8 (A), 9 (B) e 17 (C), che esibivano una potente attività inibitoria
dell'integrasi dell'HIV-1.

È stato osservato un chiaro accordo tra le caratteristiche farmacoforiche di Hypo1 e le caratteristiche

chimiche dei composti attivi.
• Considerando le nuove caratteristiche strutturali e l'interessante dose dipendente
Nel profilo inibitorio del composto 8, abbiamo progettato una struttura-attività
studio delle relazioni attorno al nucleo del composto.
• Abbiamo definito una sottostruttura minima (sottostruttura A) importante per l'IN
attività inibitrice del composto 8 per cercare in un database di commercio
disponibili piccole molecole.Una ricerca utilizzando la sottostruttura A come una query ha recuperato
cinque analoghi del composto 8 (Tabella 3).
• Simile al composto 8, i suoi analoghi 19-23 hanno mostrato un profilo inibitorio molto forte nei
confronti sia dell'elaborazione 3'-process che delle reazioni di trasferimento dello strand di IN,
indicando una relazione struttura-attività coerente in questo piccolo insieme di composti.
... .. I gruppi di tetrazolo e pirazolone del composto 8 interagiscono con il
sito attivo Mg2 +, che è in accordo con la mappatura del farmacoforo.
Tuttavia, l'ossigeno carbonilico, al posto dell'azoto pirazolone, interagisce
con l'Mg2 +.
Considerando la sua nuova struttura, abbiamo deciso di estendere lo screening
di analoghi del composto 9.

Una ricerca utilizzando la sottostruttura B non ha trovato composti analoghi nel database
commerciale di piccole molecole. Tuttavia, una ricerca usando la sottostruttura C, una sottostruttura
potata B, ha recuperato un gran numero di composti con varie somiglianze al composto 9.

CONCLUSIONI
Abbiamo sviluppato un modello di farmacoforo dell'acido 3-carbossilico a quattro funzioni utilizzando
un set di allenamento composto da analoghi candidati clinici 2. Abbiamo utilizzato con successo il
farmacoforo dell'acido 3-carbossilico del chinolone nella scoperta di nuovi inibitori IN con diversi
scaffold strutturali. Ulteriore ottimizzazione dei composti attivi con caratteristiche strutturali
suscettibili fornirebbe inibitori IN di seconda generazione con
potenziamento della potenza nei confronti dei ceppi di HIV-1 resistenti agli inibitori della prima
generazione IN.

PACCO SLIDE 13

Docking molecolare

• Un metodo di progettazione di farmaci basati sulla struttura (SBDD)

 - "struttura" significa "usare la struttura proteica"
• Metodo computazionale che simula il legame di un ligando con una proteina
•Dato...

• Prevede ...
• La posizione della molecola nel sito di legame
• L'affinità di legame o un punteggio che rappresenta la forza del legame

Docking molecolare

Metodi computazionali per la predizione della struttura 3D dei complessi ligando-proteina.

Insieme di tecniche che consentono la simulazione delle interazioni tra sistemi diversi (ad es. Sito
enzimatico acitve e nuovo potenziale inibitore) e la valutazione di tali interazioni.

Considerando due molecole con strutture 3D note, le domande di linking molecolare:

❖ Le due molecole si legano l'una all'altra?
❖ Quale è l'energia vincolante?
❖ Quale è la forma 3D del complesso?
L'attracco molecolare consente una progettazione razionale del farmaco predicendo quale è la
conformazione attiva e come interagisce con il bersaglio (enzima, recettore, DNA, canale ionico ...)

L'ancoraggio aiuta a chiarire il processo di riconoscimento molecolare coinvolto nelle diverse

interazioni che portano all'effetto biologico
❖ Enzima <-> substrato
❖ Anticorpo <-> dell'antigene
❖ Recettore <-> ligando (agonista, antagonista)
I dati di riferimento del complesso di ligandi proteici vengono recuperati da X-ray, NMR

Docking molecolare - campi di applicazione

• Target macromolecolare - recettore ligando / enzima modulatore / inibitore a basso MW

• Ligando recettore macromolecolare macromolecolare
Interazione proteina-proteina, DNA - proteina, DNA - DNA.
• Obiettivo MW basso - ligando MW basso (ad esempio β-Cdx)

La simulazione della piccola molecola si pone nel sito attivo bersaglio biologico: esplorare la libertà
conformazionale della molecola nella cavità bersaglio. Un punteggio energetico è associato alla
conformazione di ogni molecola per la valutazione di ciascuna combinazione possibile di ligando-
bersaglio.

Campo farmaceutico:
❖ Studiare la modalità vincolante dei candidati al farmaco;
❖ Affinità predittiva (Ki) per il bersaglio;
❖ Designing di composti selettivi;
❖ Optimizing lead compounds;
❖ Selezionare librerie secondarie per lo screening in vitro.

"...... posiziona due molecole in modo che interagiscano favorevolmente l'una con l'altra"
Irwin D. Kuntz et al., Journal of Molecular Biology 1982, 161, 269-288.

"...... Il processo computazionale di ricerca di un ligando che sia in grado i adattarsi sia
geometricamente che energeticamente al sito di legame di una proteina"
M. Teodoro, G.N. Phillips Jr e L. Kavraki Conferenza internazionale IEEE su robotica e automazione (ICRA),
Seoul, Corea, pp.960-900, 2001.

"... La rappresentazione computazionale del riconoscimento molecolare di proteine-ligandi"

Erickson et al., Journal of Medicinal Chemistry 2004, 47, 45-55

Interazioni che guidano l'associazione tra le molecole

❖ van der Waals
❖ Electrostatic
❖ Legami idrogeno
L'ancoraggio mira a determinare la geometria del complesso intermolecolare. L'energia vincolante
rappresenta la differenza di energia tra il complesso e le due specie separate. Il solvente (acqua)
influisce profondamente sul legame. L'entropia ha un enorme impatto sul legame.
Interazioni a corto raggio implicano un'elevata complementarietà geometrica tra superfici di
contatto: docking geometrico.

Concetto di compatibilità:

❖ Compatibilità geometrica: compatibilità della forma molecolare tra il ligando e il suo sito di
legame.
❖ Compatibilità chimica: numero massimo di interazioni chimiche favorevoli e numero minimo
di interazioni sfavorevoli tra il ligando e il suo sito di legame.

❖ Flessibilità della molecola nella cavità del recettore (sito di legame) per identificare possibili
geometrie di legame. La maggior parte dei metodi di ancoraggio si basa su campi di
forza
❖ I campi di forza tengono conto delle interazioni tra ligando / bersaglio e possibili distorsioni
prodotte dal legame molecolare.
❖ Algoritmi di docking basati su campi per cercare il minimo globale dell'energia di interazione
tra ligando e bersaglio.

Rigido - Rigido
Corrispondenza della forma proteica del ligando, basata sulla complementarietà geometrica.

DOCK (Kuntz ed altri 1982) primo programma di attracco

Basato sulla complementarietà della forma e sui ligandi rigidi.
Docking rigido basato sulla forma
• Un'immagine negativa della cavità è costruita riempiendola di sfere
• Le sfere sono di dimensioni variabili
• Ciascuno tocca la superficie in due punti
• I centri delle sfere diventano potenziali posizioni per gli atomi di ligando

Gli atomi di ligandi sono abbinati ai centri della sfera in modo che le distanze tra gli atomi siano
uguali alle distanze tra i centri della sfera
• Le corrispondenze vengono utilizzate per posizionare il ligando all'interno del sito attivo
• Se non ci sono scontri sterici, il ligando viene segnato.

• Sono possibili molte mappature (pose) diverse

• Ogni posa viene valutata in base alla bontà dell'allattamento
• La posa con il punteggio più alto viene presentata all'utente

Processo in due fasi

1. Generare un gran numero di pose, orientamenti e conformazioni di una molecola nel sito di
legame
2.Selezione e utilizzo dell'approccio di ancoraggio più preciso. Impiegando la migliore funzione di
punteggio per discriminare tra pose corrette e non corrette, in un lasso di tempo adeguato.

Data la struttura proteica 3D di input (soluzione a raggi X o NMR) e i composti target, il successo
del processo di screening dipenderà da due parametri:
1) algoritmo di ricerca
2) funzione di punteggio
GOLD, GLIDE, AutoDock e FlexX ...
Le conformazioni di ogni molecola vengono generate al volo dall'algoritmo di ricerca durante il
processo di docking Evita di considerare le conformazioni che non si adattano Ricerca sistematica
esagerata troppo dispendiosa dal punto di vista dello spazio di ricerca Un metodo comune è quello
di utilizzare metodi di ricerca stocastici Questi non garantiscono una soluzione ottimale, ma una
buona soluzione entro un periodo di tempo ragionevole. Stocastico significa che incorporano un
grado di casualità

Funzione di punteggio

C = interazioni steriche;
Ch = interazioni idrofobiche;
Ce = interazioni elettrostatiche;
Edes = energia di desolvation.

Funzioni di punteggio

❖ Sono disponibili una gran varietà di funzioni di scoring (GOLD, GLIDE, MOE, FLEX, GLUE,
LIGBUILDER) o empiriche (Score, X-Score).
❖ I metodi devono essere accurati e deve poter registrare i valori sperimentali (costante di
affinità ...).
❖ I metodi devono riuscire un modellare un intervallo chimico ampio e diversificato.
❖ Un limite intrinseco di una data funzione di punteggio è che il campo di applicabilità è
strettamente dipendente dal tipo e dalla natura chimica del training set analizzato.

La funzione di punteggio perfetta sarà ...

• Calcola accuratamente l'affinità di legame
-Verrà consentito di identificare gli attivati in uno schermo virtuale
-È in grado di classificare gli attivati in termini di affinità
• Segnare le posizioni di un attivo superiore alle posizioni di un inattivo
-Sarà attivo più alto di inattività in uno schermo virtuale
• Segnare la posa corretta dell'atleta più alta di una posa errata dell'attivo
-Sarà possibile identificare la posa corretta del soggetto attivo
Le funzioni di punteggio possono essere suddivise nelle seguenti classi:
-Forcefield-based
• Basato sui termini dei campi di forza della meccanica molecolare (GoldScore, DOCK,
 AutoDock)
-Empirical
• Parametrizzato contro affinità vincolanti sperimentali (ChemScore, PLP, Glide SP / XP)
-Basato sulla conoscenza dei potenziali
• Basato su analisi statistiche delle distribuzioni pairwise osservate
PMF, DrugScore, ASP

Funzione di punteggio

GoldScore

Shb_ext (punteggio di legame idrogeno proteina-ligando), Svdw_ext (legante proteico-ligando

der Waals score), Shb_int (punteggio di legame idrogeno interno) e Svdw_int
(punteggio interno di van der Waals)

ChemScore

Shbond, Smetal, Slipo segna per Hbond, coordinazione degli ioni metallici, lecca-lofico
interazioni ,; Punteggio Hrot per la riduzione dell'entropia - vincoli conformazionali vincolanti

Valutazione di un programma di docking

Prendi un noto complesso proteico-ligando dal PDB

• Estrarre il ligando
• Ridurre al minimo la conformazione del ligando
• Ricollegarsi alla proteina
• Confrontare la posa ancorata con i dati sperimentali

Il risultato ancorato (rosso) è sovrapposto alla struttura del cristallo dei raggi X (sperimentale)
RMSD = radice quadrata della media di (la differenza tra una particolare coordinata nel cristallo e
quella coordinata nella posa)
Entro 2.0Å RMSD considerato taglio per la precisione

The GOLD result (dark) superimposed on the Xray structure (light)

Convalida GOLD
-305 complessi trovati nel file PDB (dataset CCDC / Astex)
-Ligando estratto dal complesso
-Ligando ridotto al minimo
-Indietro alle proteine
- Predizione dell'OLDO confrontata con la struttura cristallina originale
~ 72% di successo usando criteri rigorosi
Gestire le conformazioni proteiche
• La maggior parte dei software di docking tratta la proteina come rigida
-Riduzione approssimativa del recettore
• Questa approssimazione potrebbe non essere valida per un particolare complesso proteina-ligando
come ...
-La proteina può deformarsi leggermente per adattarsi a diversi ligandi (adattamento indotto dal
ligando)
-Le catene laterali protette nel sito attivo possono adottare diverse conformazioni
• Alcuni programmi di docking consentono la flessibilità della catena laterale delle proteine
-Per esempio, le catene laterali selezionate possono subire una rotazione torsionale attorno ai legami
aciclici
-Aumenta lo spazio di ricerca
• I movimenti proteici più ampi possono essere gestiti solo da ancoraggi separati a diverse
conformazioni proteiche.

Inconvenienti tecnici
-Proteine sono circondate da molecole d'acqua.
-Le molecole di acqua possono interagire con i ligandi.
-Le molecole di acqua possono competere con i ligandi
-Le molecole d'acqua possono mascherare le regioni leganti

-Predicting la quantità di molecole d'acqua.

-Predicting la loro posizione.
-Predicting loro movimento.
-Predendo l'effetto idrofobico.

La BIOINFORMATICA riguarda l'analisi dei dati biologici mediante tecniche informatiche.

I diversi campi di applicazione comprendono analisi di sequenze nucleotidiche (genomi), sequenze
di peptidi (proteomica), interazioni di molecole biologiche (interactome), studio della funzione e
della struttura di macromolecole.

Perché la struttura di una proteina è così interessante?

Come studiamo una struttura proteica con metodi sperimentali?
Come studiamo una struttura proteica mediante metodi computazionali?

La biologia strutturale riguarda le leggi fondamentali che governano il ripiegamento delle proteine
e la biologia computazionale è focalizzata sullo sviluppo di metodi per la predizione di strutture di
proteine 3D.
La sequenza amminoacidica di una proteina codifica la struttura tridimensionale. Dovremmo essere
in grado di progettare un algoritmo per prevedere la struttura 3D di una proteina dalla sequenza
1D.
Questo obiettivo è il più complesso e ambizioso tra i diversi compiti di bioinformatica e non è stato
pienamente raggiunto.

-The a.a. la codifica in sequenza determina la struttura nativa.

-La struttura proteica nativa rappresenta l'energia minima priva di proteine.

Modellazione di omologia
Determinazione della struttura proteica mediante metodi computazionali
Assunzione
Sequenze proteiche simili spesso portano a strutture simili. L'alta identità corrisponde alla
somiglianza 3D.
Il modello 3D di una proteina sconosciuta viene generato utilizzando una proteina omologa come
modello o modello 3D.
Diversi protocolli sono applicati nella modellazione dell'omologia.

In base alla somiglianza di sequenza con una struttura cristallina conosciuta, viene generato il
modello 3D di una proteina sconosciuta.
La proteina nota viene utilizzata come MODELLO di modellazione.
È la tecnica più affidabile per generare un modello 3D.

insieme di tecniche di allineamento tra la sequenza (1D) e la struttura (3D) basata sul potenziale
recuperato da strutture note. la filettatura viene applicata quando le proteine note non mostrano un
grado di similarità adatto, sebbene sia meno affidabile della modellazione di omologia.
-I metodi di inizializzazione si basano sulla simulazione delle forze e delle energie potenziali degli
atomi che formano la proteina di interesse. Questi metodi mirano a comprendere i fenomeni chemio-
fisici che governano il ripiegamento della proteina.
L'affidabilità di un modello 3D costruito dalla modellazione dell'omologia dipende dall'identità della
sequenza tra le due proteine.
L'affidabilità è valutata in termini di differenza tra la struttura prevista e la soluzione sperimentale.
La qualità e l'affidabilità del modello dipendono strettamente dalla somiglianza tra le proteine scelte.
Più è alta l'identità della sequenza, più alta è la somiglianza ..
Per identità di sequenza oltre il 30% delle strutture sono considerate simili.
1) Analizzare la sequenza proteica di interesse al fine di identificare possibili regioni a spirale o
transmembrana che devono essere trattate separatamente, come domini descreti che saranno
elaborati separatamente.
2) Identificazione di una o più proteine che mostrano una buona identità di sequenza (> 30%) con
la proteina bersaglio (o con i suoi domini).

3) L'allineamento è il passo più critico per l'accuratezza del modello: per l'identità della sequenza
≥70%, l'allineamento può essere eseguito facilmente con procedure automatizzate.

Per valori di somiglianza inferiori deve essere eseguito manualmente.

4) Identificazione dei principali frammenti di catena che sono conservati tra le due strutture.
5) Modellazione delle regioni variabili struturali (principalmente loop) che collegano le regioni di
strie secondarie conservate.
I loop possono essere estremamente diversi, poiché ospitano la maggior parte degli inserimenti,
delle eliminazioni e della sostituzione del modello generato.
6) Modellizzazione delle catene laterali della proteina bersaglio sulle catene laterali della proteina
modello.
7) Ottimizzazione del modello: risoluzione degli inconvenienti struturali (scontri sterici)
manualmente o mediante minimizzazione energetica o dinamica molecolare.

MOLECULAR DYNAMICS (MD)

Le proprietà macroscopiche sono spesso determinate dal comportamento a livello molecolare.
Le informazioni quantitative e / o qualitative sul comportamento macroscopico delle macromolecole
possono essere ottenute dalla simulazione di un sistema a livello atomistico.
Le simulazioni di dinamica molecolare calcolano il moto degli atomi in un assieme molecolare
utilizzando la dinamica newtoniana per determinare la forza netta e l'accelerazione sperimentate da
ciascun atomo. Ogni atomo i in posizione ri, è trattato come un punto con massa mi e una carica
fissa qi
Nella dinamica molecolare una molecola è descritta come una serie di punti carichi (atomi) collegati
da molle (legami).
Per descrivere l'evoluzione temporale delle lunghezze dei legami, degli angoli di legame e delle
torsioni, anche il non legame di van der Waals e le interazioni elettrostatiche tra atomi, usiamo un
campo di forza.
Il campo di forza è una raccolta di equazioni e costanti associate progettate per riprodurre la
geometria molecolare e le proprietà selezionate delle strutture testate.
❖ Tecnica computazionale importante, basata su campi di forza della meccanica molecolare,
che consente lo studio dinamico di proteine, peptidi, acidi nucleici ...
I sistemi biologici sono dinamici e soggetti a vibrazione, rotazione, stiramento ...
❖ Molecular Dynamics consente il calcolo del moto degli atomi in un assieme molecolare, in
funzione del tempo, secondo la dinamica newtoniana.
❖ MD fornire informazioni su:
proprietà termodinamiche / energetiche
proprietà dinamiche
campionamento conformazionale
❖ Un esperimento DM segue un percorso temporale nell'esplorazione dello spazio
conformazionale di una determinata proteina.
❖ Il tempo è un parametro chiave, la simulazione Dt di ogni fase deve essere sufficientemente
piccola da consentire la simulazione del movimento (ad es. Lo stiramento del legame) a tutti
i legami (1 f = 10-15 s; 1 p = 10-12 s).
Durante la simulazione DM, la forza applicata a ciascun atomo nel sistema viene calcolata nel tempo,
in accordo con la dinamica di Newton.
Fi = dV / dxi
V = energia potenziale
Xi = posizione dell'atomo I.
Derivando l'equazione su ogni intervallo di tempo (2Δt, 3Δt ..) viene determinata la traiettoria di
un atomo.
Le barriere di energia potenziale proteica vengono superate in MD applicando un'energia cinetica
iniziale, che segue la distribuzione di Maxwell-Boltzmann:

f (T, v) = frazioni di particelle con velocità v alla temperatura T

K = costante di Boltzmann
m = particelle di massa

A una temperatura di atomi di temperatura fissa sono definiti in base alla distribuzione di Boltzmann.
Temperature più elevate significano energia cinetica media superiore, le barriere energetiche sono
più facilmente superabili.
L'esperimento MD è composto da 4 passaggi
1.Minimizzazione: riconciliare la struttura osservata con il campo di forza utilizzato (T = 0) e
applicare la distribuzione di Maxwell-Boltzmann a tutti gli atomi (preparando il punto di partenza
più stabile).
2. Aumentare la temperatura del sistema - aumentare il movimento degli atomi fino al
raggiungimento della temperatura di simulazione desiderata (tempo richiesto 10-50 ps).
3. Equilibratura T = costante, assicurarsi che il sistema sia stabile e nel suo stato di equilibrio alla
temperatura definita. L'energia cinetica e potenziale diventano le stesse, il sistema può essere
studiato secondo i suoi parametri cinetici nel tempo: movimento e posizione degli atomi, flessibilità
globale, rotazione torsionale, ... ..
4. Passo di raffreddamento (lento): per ridurre lo stress applicato durante l'innalzamento della
temperatura e per produrre gli stati conformazionali più stabili.
Il risultato di una simulazione MD è espresso da un gran numero di conformazioni che vengono
campionate a intervalli regolari, minimizzate e analizzate in termini di energia potenziale.
Tutte le informazioni provenienti dalla simulazione MD possono essere tracciate contro il tempo.
I tempi di indagine sono piuttosto lunghi e diverse CPU lavorano in parallelo.
❖ La tecnica è estremamente utile per esplorare lo spazio conformazionale di macromolecole
la cui struttura sperimentale non è stata determinata.
❖ MD è sfruttato per studiare in dettaglio i motivi di legame delle interazioni ligando / proteina
o meccanismo di trasporto ione attraverso i canali cellulari