L’influenza dell’ambiente

Se volessimo farci un'idea delle condizioni ambientali in cui gli enzimi

si trovano ad operare, avremmo bisogno di conoscere numerosi
parametri.

Enzimi Alcuni tra questi possono influenzare la loro attività in misura rilevante:

L’influenza dell’ambiente • la concentrazione del substrato

• la temperatura

• il pH

• la presenza di inibitori e/o di attivatori

La concentrazione di substrato La concentrazione di substrato

La dipendenza dell’attività enzimatica dalla concentrazione di Quando la concentrazione del substrato è molto
substrato è espressa matematicamente dall’equazione di bassa, è possibile trascurare [S] rispetto a KM senza
Michaelis-Menten, nella quale: commettere un grosso errore.

v ⋅ [S ] La velocità iniziale diventa allora direttamente

v0 = max proporzionale a [S].
K M + [S ]
vmax
[S] ≪ KM v0 = ⋅ [S ]
KM
Leonor Michaelis and Maud Leonora Menten
 La concentrazione di substrato La concentrazione di substrato
Quando la concentrazione del substrato è molto alta, si può Di solito, nelle condizioni cellulari, la concentrazione del
trascurare KM rispetto a [S]. substrato è molto minore dei valori di saturazione.
La velocità iniziale raggiunge il suo valore massimo ed è
Quando [S] = KM , l’enzima lavora al 50% delle sue possibilità.
INDIPENDENTE da [S].

Si dice che l’enzima lavora in condizioni di SATURAZIONE, in

quanto è stato completamente convertito nel complesso col substrato ed vmax ⋅ [ S ] vmax
ogni ulteriore aumento di [S] risulta inefficace. Proprio questo fenomeno v0 = =
ha indotto a formulare l’ipotesi della formazione reversibile del 2 ⋅ [S ] 2
complesso enzima-substrato come 1° stadio della catalisi.

KM, quindi, è la concentrazione di substrato che fa

[S] ≫ KM ν0 = νmax assumere alla reazione metà della velocità massima
(è espressa in moli o millimoli o micromoli).

La concentrazione di substrato La concentrazione di substrato

Il grafico completo è una curva monotona crescente che tende asintoticamente
a raggiungere νmax.
La sua FORMA è profondamente influenzata dal valore di KM.

MINORE è KM, più rapidamente viene raggiunta νmax e quindi la saturazione.

Ciò si spiega con una MAGGIORE AFFINITA’ tra enzima e substrato.

KM [S] (ν0 /νmax) 100

0,01 0,1 90,9%

0,05 0,1 66,7%

0,1 0,1 50%

Il fattore vo/vmax rappresenta la frazione di siti attivi
occupati, ovvero la percentuale di saturazione.
In particolare, la KM indica la concentrazione
DIPENDENZA DELLA FORMA DELLA CURVA DI MICHAELIS-MENTEN DAL VALORE DI K
Affinità alta: KM=0,01; affinità media: KM=0,05; affinità bassa: KM=0,1
approssimativa del substrato in condizioni fisiologiche.
 Effetto della temperatura Effetto della variazione del pH
Finché un enzima è stabile (capace di mantenere la conformazione La maggior parte degli enzimi mostra un'attività MASSIMA
attiva), la velocità della reazione che esso catalizza AUMENTA ad un valore del pH ben definito, diverso da un enzima
CON LA TEMPERATURA in modo esponenziale. all'altro.
Tuttavia, superata una certa temperatura, si osserva un RAPIDO Allontanandosi dal pH ottimale si provoca una diminuzione
CROLLO dell'attività, dovuto ad un fenomeno comune a tutte le
proteine: la DENATURAZIONE TERMICA.
dell'attività, che può anche annullarsi: a valori estremi di
pH gli enzimi, come tutte le proteine, si denaturano.
Numerose applicazioni:
nella PASTORIZZAZIONE
nella STERILIZZAZIONE
Il trattamento ad alte temperature
permette di distruggere parzialmente o
totalmente gli enzimi che impediscono la
conservazione di molti alimenti.

Interpretazione
Effetto della variazione del pH strutturale della
dipendenza dal pH
Anche se piuttosto rari, esistono comportamenti anomali, come
quello dell'enzima idrolitico colinesterasi. Cambiamento della
conformazione del sito attivo
Il pH ottimale NON coincide necessariamente con quello
fisiologico: ciò potrebbe consentire alla cellula di utilizzare piccole
variazioni di pH per REGOLARE l'attività enzimatica a seconda
delle necessità metaboliche.
Difficoltà di formazione del
I fattori strutturali ritenuti complesso enzima -
responsabili della dipendenza substrato.
dell'attività dal pH sono stati
individuati nella presenza di gruppi
Abbassando il pH al di
funzionali acidi e/o basici sia nel sotto di 7 il carbossilato si
substrato sia nell'enzima (ed in trasforma nel suo acido
particolare nel suo sito attivo). coniugato e l'enzima si
disattiva (reversibilmente).
 Effetto di inibitori/attivatori Effetto di inibitori/attivatori
Gli INIBITORI/ATTIVATORI sono composti chimici o ioni
metallici capaci di DIMINUIRE/AUMENTARE la velocità di Gli INIBITORI REVERSIBILI instaurano interazioni
una reazione enzimatica influenzando il legame del substrato e/ non covalenti di associazione/dissociazione tra substrato
o il numero di turnover*, quindi i valori di KM e Vmax. ed enzima e si dividono in:
Lo studio della loro influenza ha fornito informazioni - inibitori competitivi
preziose sul meccanismo della catalisi enzimatica ed in - inibitori acompetitivi (o incompetitivi)
particolare sulla specificità degli enzimi nei confronti del - inibitori misti
substrato e sulla natura dei gruppi funzionali coinvolti nella
catalisi. Gli INIBITORI IRREVERSIBILI (inattivatori) generano
Secondo la natura degli effetti che producono, gli inibitori alterazioni stabili (covalenti) dell’enzima, come la
vengono di solito classificati in REVERSIBILI ed diminuzione della concentrazione dell’enzima attivo.
IRREVERSIBILI.
*Rappresenta il numero di moli di substrato S convertite nel prodotto P da una mole di enzima nell’unità di tempo

Inibitori competitivi Inibitori competitivi

Grazie alla loro somiglianza strutturale col substrato, Ad esempio, il malonato è un inibitore competitivo della succinato
competono con esso per legarsi reversibilmente al sito deidrogenasi (ciclo dell’acido citrico); il malonato strutturalmente
attivo dell'enzima. assomiglia al succinato ma non viene deidrogenato dall’enzima.

Se sono privi del legame suscettibile di rottura, tipico dei

normali substrati, non subiranno modificazioni.
Se invece possiedono quel particolare legame, si
comporteranno da substrati veri e propri, ma anche da
inibitori competitivi nei confronti degli altri substrati.
Quindi, elevate [S] possono annullare l’effetto di
inibizione. Infatti, se [S] aumenta, aumenta la probabilità
che il substrato si leghi all’enzima invece dell’inibitore.
 Inibitori competitivi Inibitori competitivi
Trasformando l’equazione di Michaelis-Menten dipendente dall'inibitore, in forma
di DOPPI RECIPROCI, otteniamo:

1 α ⋅ KM 1 1
= +
v0 vmax [ S ] vmax
Eq. di MM dipendente dall’inibitore

La rappresentazione grafica (grafico dei doppi reciproci) della precedente

equazione fornisce una retta, la cui pendenza è αKM/vmax, con intercetta sull'asse
delle ascisse pari a -1/αKM e intercetta sull'asse delle ordinate pari a 1/vmax.

All’aumentare di α, quindi all’aumentare della concentrazione di

inibitore, v0 diminuisce e vmax viene raggiunta più lentamente.
Dal momento che Kapp = α KM > KM, il risultato dell’azione degli
inibitori competitivi, è un aumento della KM apparente.

Inibitori competitivi Inibitori acompetitivi (o incompetitivi)

Il grafico dei doppi reciproci: conclusioni. Questo tipo di inibitori si lega in modo reversibile solo al complesso
• all'aumentare della concentrazione di I, enzima-substrato ES ma non all’enzima libero.
la velocità decresce (1/v0 aumenta); Queste molecole si legano ad un sito dell'enzima diverso da quello attivo,
• più grande è il valore di α e più elevata detto SITO ALLOSTERICO.
deve essere la concentrazione di [S]
Così facendo provocano un CAMBIAMENTO nella CONFORMAZIONE
necessaria per poter raggiungere la vmax;
dell'enzima, che lo rende meno attivo.
• quando [S] diviene infinitamente
grande, v = vmax e quindi non è L’inibitore non deve necessariamente assomigliare al substrato: esso
influenzata da I perché tutto l'enzima è provoca distorsione del sito attivo che rende l’enzima inattivo quindi
nella forma ES; influenza la funzione catalitica, non il legame del substrato.

• la vmax non è influenzata da I, infatti tutte le rette mostrano la stessa intercetta

sull'asse y. Questo fatto è specifico per l'inibizione competitiva e può essere usato
per distinguere l'inibizione competitiva da altri tipo di inibizione. Questi inibitori
si riconoscono dal fatto che l'effetto di inibizione può essere attenuato
aumentando della concentrazione di substrato. Ciò significa che la velocità
massima ottenibile NON cambia, ma viene raggiunta PIU' LENTAMENTE.
Inibitori acompetitivi (o incompetitivi) Inibitori acompetitivi (o incompetitivi)

Gli effetti degli inibitori incompetitivi non scompaiono

aumentando la concentrazione del substrato, pertanto la
L’inibitore fa diminuire la vmax sottraendo parte del complesso velocità massima DIMINUISCE, in misura tanto maggiore
ES dirottandola verso la formazione del complesso ESI. quanto più alta è la concentrazione dell'inibitore.

Inibitori misti (o non competitivi) Inibitori misti (o non competitivi)

Le molecole dell’inibitore vanno a legarsi in un sito differente dal sito
attivo o con l’enzima libero o con il complesso ES ma comunque in una
zona diversa dal sito attivo, detta “ sito allosterico”. In entrambi i casi la
presenza dell’inibitore nel sito allosterico deforma il sito attivo
diminuendone l’efficacia.
La velocità della reazione viene diminuita, mentre non viene modificata
la KM perché il sito attivo non viene occupato dall’inibitore.
Sia il complesso EI che ESI sono inattivi, ma loro formazione è comunque
Osservando il grafico qui sopra si nota che in presenza dell’inibitore la KM
reversibile.
non viene modificata perché il sito attivo non è occupato da I mentre
Ci sono due possibili tipi di interazione viene diminuita la vmax perché l’efficienza dell’enzima è rallentata.
tra inibitore ed enzima:
Anche in questo caso è possibile determinare se una sostanza agisce da
• i siti di legame di I e S sono vicini,
inibitore non competitivo riportando sul diagramma i valori di diverse
• l’inibitore causa un cambio
esperienze con quantità crescenti del presunto inibitore; inoltre
conformazionale in E che influenza il
legame di S.
l’inibizione non regredisce con l’aumentare della concentrazione del
substrato.
 Inibitori misti (o non competitivi) Inibitori irreversibili
Gli inibitori irreversibili provocano alterazioni stabili (covalenti e
irreversibili) dell’enzima con la conseguente reale diminuzione
della concentrazione dell’enzima attivo. L'enzima viene
trasformato in un suo derivato STABILE ED INATTIVO, ben diverso
dal normale complesso enzima - substrato.
La velocità massima diminuisce per qualsiasi [S] senza variare KM.
Il grafico dei doppi reciproci mostra lo stesso andamento
dell’inibizione mista, tuttavia si può distinguere da quest’ultima per
due motivi:
1) inibizione non istantanea, ma varia nel tempo (aumenta man
mano che si forma EI).
2) la diluizione non dissocia EI e non si restaura attività enzimatica.

Inibitori irreversibili
INIBITORI INIBITORI
INIBITORI MISTI
COMPETITIVI ACOMPETITIVI

SITO DI LEGAME • Si lega al sito attivo e • Si lega a un sito diverso • Sono molecole capaci di
impedisce il legame del da quello del substrato, legare sia l'enzima libero
substrato. presente solamente nel che il complesso enzima-
A questo meccanismo d'azione è dovuta la pericolosità di certe sostanze: • L'effetto è quello di complesso ES: interagisce substrato
diminuire la solo con ES e non con E.
• il DIISOPROPILFLUOROFOSFATO è usato nella preparazione di concentrazione di enzima
terribili armi chimiche, dette GAS NERVINI. Disattivando l'enzima libero disponibile a
reagire.
acetilcolinesterasi, che catalizza l'idrolisi dell'acetilcolina a colina, esso • Sono simili al vero
blocca la trasmissione degli impulsi nervosi; substrato
SCHEMA DI REAZIONE
• gli ioni di alcuni METALLI PESANTI (Hg, Pb, Ag) possono reagire con i
gruppi -SH dei residui di CISTEINA, ossidandoli ai corrispondenti solfuri
-S-S-.
L'inibizione o l'attivazione di alcuni enzimi da parte di specifici metaboliti TIPI DI ENZIMI solo negli enzimi con due solo negli enzimi con due
costituisce un importante FATTORE di REGOLAZIONE del o più substrati o più substrati

METABOLISMO. Ad esempio, i cosiddetti substrati suicidi, a seguito RIDUZIONE l'effetto dell'inibitore può anche se [S] è grande non l’inibizione non
della reazione catalitica, producono sostanze analoghe al substrato che DELL’INIBIZIONE essere annullato si può superare l’effetto di regredisce con l’aumentare
aumentando la inibizione perché della concentrazione del
presentano gruppi reattivi in grado di formare legami covalenti con gruppi concentrazione di l’inibitore non si lega dove substrato.
funzionali del sito attivo, inibendolo irreversibilmente. substrato. si lega il substrato
 INIBITORI
COMPETITIVI
TIPO DI AZIONE • influenza sia il legame del
substrato che la funzione
catalitica.
vmax e KM •all'aumentare della
concentrazione di inibitore la kM
apparente aumenta e quindi
diminuisce la velocità della
reazione v0.
• l’affinità dell’enzima verso il
substrato appare diminuita
• vmax non è influenzata da [I]
GRAFICO
INIBITORI
INIBITORI MISTI
ACOMPETITIVI
• questo tipo di inibizione • influenza sia il legame del
risulta generalmente substrato che la funzione catalitica.
dall'effetto ALLOSTERICO,
in cui l'inibitore si lega ad un
sito differente dell'enzima e
produce una modificazione
allosterica dell'enzima
• influenza la funzione
catalitica, non il legame del
substrato
•diminuiscono di uno stesso • vmax diminuisce
fattore all'aumentare della • kM può aumentare o diminuire
concentrazione di inibitore:
vmax/kM è costante.
• la velocità massima
diminuisce, in misura tanto
maggiore quanto più alta è la
concentrazione dell'inibitore.