Le basi genetiche delle malattie

mitocondriali
Valeria Tiranti
U.O. Genetica Medica e Neurogenetica

Corso di aggiornamento Malattie Mitocondriali

Congresso AINPeNC e AIRIC
Bologna 23 maggio 2019
Mitocondri: la centrale energetica della cellula
DNA mitocondriale (mtDNA)
 Il sistema di connessione nucleo-mitocondrio
Physiological
effectors
mtDNA Transcription/Replication
& Translation

Assembly
factors

Nuclear

C
Respiratory
Factors mtDNA

Q
Respiratory Heme, etc.
subunits
Nucleus

Cofactors, Substrates Mitochondrion

Feed-back
Le subunità della catena respiratoria codificate dal mtDNA

DNA
mitocondriale
umano

7 proteins 2 proteins

1 protein 3 proteins

COMPLEX II

COMPLESSO I COMPLESSO III COMPLESSO IV ATP SINTASI

45 subunità 11 subunità 13 subunità 16 subunità
mtDNA: 7 mtDNA: 1 mtDNA: 3 mtDNA: 2
nDNA: 38 nDNA: 10 nDNA: 10 nDNA: 14
 Classificazione genetica delle malattie mitocondriali

Difetti del DNA mitocondriale

• Geni correlati alla sintesi proteica mitocondriale (rRNAs, tRNAs)

• Geni codificanti proteine strutturali MRC
• Grosse delezioni

Mutazioni DNA nucleare

•Geni codificanti proteine strutturali MRC

•Geni codificanti fattori d’assemblaggio MRC
•Geni codificanti enzimi per biosintesi di lipidi o cofattori
•Geni codificanti per fattori importanti per mantenimento mtDNA
•Geni codificanti per fattori per la sintesi proteica mitocondriale
•Geni coinvolti nella biogenesi/dinamica mitocondriale
•Geni coinvolti in altre attività: detossificazione, import, apoptosi
 DNA nucleare versus DNA mitocondriale
 Il DNA mitocondriale viene replicato in modo asincrono durante tutto il ciclo
cellulare in modo non coordinato con la sintesi del DNA nucleare
 Il DNA mitocondriale è privo delle proteine istoniche ma è compattato in complessi
nucleoproteici definiti NUCLEOIDI
 Il DNA mitocondriale umano non ha introni
 Il contenuto in GC del mtDNA è spesso diverso da quello del DNA nucleare
(separabili per densità)
 L’mtDNA viene duplicato dalla DNA polimerasi gamma
 Trascrizione: due grandi molecole di RNA sono tagliate successivamente per dare i
singoli mRNA, tRNA e rRNA
 La presenza di ribosomi permette al mitocondrio di svolgere una propria sintesi
proteica
 I meccanismi di riparazione del DNA sono meno efficienti nei mitocondri

Il mtDNA può essere sottoposto a livelli elevati di

radicali dell’ossigeno che agiscono come mutageni
Il tasso di mutazione del mtDNA è circa 10 volte
maggiore di quello nucleare
mtDNA umano

T
F
D-loop Cyt.b
12S
V
P
E
ND6
16S ND5
16569 bp
13 Mit genes, 24 Syn genes
LUUR Asynchronous replication LCUN
SAGY
ND1
Polycistronic transcription H

Autochthonus genetic code

Q ND4
I In situ translation
M
Maternal
A inheritance
N
ND2 Polyplasmy
C ND4L
Y R
ND3
W SUCN G
COIII

COI ATPase6/8
D COII K
Eredità paterna

9
 “Le Regole Mitocondriali”

• Eredità materna
• Eteroplasmia
• Segregazione mitotica casuale
• Effetto soglia
 Omoplasmia ed eteroplasmia
Ogni cellula contiene migliaia di mitocondri e ogni mitocondrio
contiene copie multiple di mtDNA (2 -10). Di solito queste copie sono
identiche, una condizione che viene definita di omoplasmia.

omoplasmia

eteroplasmia

Tuttavia molecole di DNA mutate possono coesistere con molecole

wild-type, una condizione che viene definita eteroplasmia.
 “Le Regole Mitocondriali”

• Eredità materna
• Eteroplasmia
• Segregazione mitotica casuale
• Effetto soglia

12
 “Le Regole Mitocondriali”

• Eredità Materna
• Eteroplasmia
• Segregazione mitotica
casuale
• Effetto Soglia

10% 30% 50% 70% 90%

nessun fenotipo fenotipo patologico
 Difetti del DNA mitocondriale

• Geni correlati alla sintesi proteica mitocondriale (rRNAs, tRNAs)

• Geni codificanti proteine strutturali MRC

• Grosse delezioni

Mutazioni eteroplasmiche Mutazioni omoplasmiche

 Carta mutazionale 14787D4bp
14846G->A
15243G->A
3241T->C 15244G->A
1555A->G 15059G->A
3243A->G
3250T->C
3251A->G
583G->A
606A->G 15915G->A
15293A->G
15084G->A
15168G->A
D
1606G->A 618T->C 15257G->A
3252A->G
1642G->A 15498G->A
3254C->G T 12311T->C
3260A->G
3264T->C
1644G->T
12S
F D-loop Cyt.b 15498D24bp
15615G->A
15723G->A
12315G->A
12320A->G E
3271T->C 12301G->A
3271DT V 15762G->A
P
3288A->G
3291T->C
3302A->G
16S
15990C->T E
ND6
15812G->A
ND5
13513G->A
L
4269A->G 13514A->G
3303C->T 14709T->C
4274T->C
4285T->C
4309G->A
4295A->G
LUUR
3460G->A
7bp inversion
14484T->C
14459G->A
LCUN
H
SAGY E
4298G->A ND1
4300A->G 7445A->G
4320C->T Q 7511T->C ND4 11778G->A
I 11832G->A
5692A->G 7472Cins

4409T->C
M

ND2
A
N
5703G->A

5814A->G ND4L
15bp deletion
9537Cins
T
C R
Y 9957T->C
ND3
5521G->A W SUCN G
5537Tins
5540G->A
COIII 9997T->C
10044A->G I
5549G->A COI ATPase6/8
D COII K
7543G->A 8851T->C
8313G->A 8993T->G
5bp deletion
6930G->A 7671T->A
8328G->A
8342G->A
8993T->C
9176T->C
O
8344A->G 9176T->G

Mutazioni del mtDNA

8356T->C
8363G->A
8296A->G
N
colpiscono almeno 1:5000 S
nati
Mappa Nosologica

1555A->G
DEAFNESS (aminoglycosides)
D
cyt. b mutations
MYOGLOBINURIC
T

12S
F D-loop Cyt.b MYOPATHY
E
V
P
3243A->G
MELAS
CPEO
16S
E
ND6
ND5 L
DDM 3460G-A
11778G->A
14484T->C
LUUR
LHON
LCUN
H
SAGY E
ND1
tRNA-Ile mutations PEO, KSS, Pearson
CARDIOPATHY Q ND4
I
M

ND2
A
N
ND4L
T
C R
Y ND3
W SUCN G
COIII I
COI ATPase6/8
tRNA-Ser mutations D COII K
8993T->G
DEAFNESS
8344A->G NARP/MILS
MERRF O
N
S
 Mutazioni punto eteroplasmiche
Eredità materna
Correlazione quantitativa tra % di mutazione e gravità del fenotipo
 Delezioni singole
PEO sporadica:
D solo nel muscolo
PEO, miopatia prossimale

Kearns Sayre :
D prevalentemente nel muscolo
esordio giovanile, PEO, miopatia
atassia, retinite pigmentosa,
C1 1 2 3 4 5 6 7 C2 danno neurologico progressivo
arresti cardiaci

Pearson's:
D in tutti i tessuti
pancitopenia neonatale
D mtDNA danno pancreatico.
Può evolvere in KSS

Sporadiche, Eteroplasmiche
Correlazione qualitativa tra mutazione e fenotipo: KSS, PEO, Pearson
Correlazione con la distribuzione tissutale del mtDNA deleto
Nella PEO (e spesso nel KSS) sono riscontrate solo nel muscolo
Nessuna correlazione quantitativa tra % o dimensioni della delezione e gravità del
fenotipo
 Mutazioni punto omoplasmiche

1555A->G, 12S rRNA aminoglycoside-induced

deafness
Sordità indotta da aminoglicosidi

LHON Leber’s Hereditary Optic Neuropathy

Atrofia ottica ereditaria, degenerazione specifica di
cellule ganglionari della retina
Mutazioni primarie:
nt.3460 (ND1), 11778 (ND4), 14484 (ND6)
 Mutazioni del mtDNA
1988: prima mutazione del mtDNA.

MELAS
Oggi più di 200 mutazioni descritte,
sei le più frequenti:
LHON
• m.3460G>A ND1
• m.11778G>A ND4
NARP/MILS • m.14484T>C ND6
• m.3243A>G tRNAL
MERRF • m.8344A>G tRNAK
• m.8993T>G ATP6

LHON: atrofia ottica bilaterale, esordio acuto.

MELAS: emicrania, stroke-like, acidosi lattica, demenza, atassia, epilessia, miopatia,
diabete, sordità, bassa statura.
MERRF: epilessia mioclonica, miopatia, atassia, atrofia ottica, sordità, demenza,
cardiopatia, lipomatosi.
NARP: neuropatia, retinite pigmentosa, atassia, debolezza muscolare, ritardo
sviluppo, epilessia, demenza.
MILS: sindrome di Leigh matrilineare, ritardo sviluppo, epilessia, dismorfismi,
miopatia.
Classificazione genetica delle malattie mitocondriali
Difetti del DNA mitocondriale DNA
mitocondriale
• Geni correlati alla sintesi proteica mitocondriale (rRNAs, tRNAs)
• Geni codificanti proteine strutturali MRC
• Grosse delezioni

Mutazioni DNA nucleare

• Geni codificanti proteine strutturali MRC
• Geni codificanti fattori d’assemblaggio MRC
• Geni codificanti enzimi per biosintesi di lipidi o cofattori
• Geni codificanti per fattori importanti per mantenimento mtDNA
• Geni codificanti per fattori per la sintesi proteica mitocondriale
• Geni coinvolti nella biogenesi/dinamica mitocondriale
• Geni coinvolti in altre attività: detossificazione, import, apoptosi
250
Geni nucleari associati a
patologie mitocondriali

200

2001 Shoudbridge
150
2004 Zeviani&Didonato
100 2006 Zeviani&Carelli
2011 Ghezzi&Zeviani
50 2014 Rotig
2015 Turnbull&Rustin
0 2016 Mayr et al.
1995
1996
1997
1998
1999
2000
2001
2002
2003
2004
2005
2006
2007
2008
2009
2010
2011
2012
2013
2014
2015
2016
1- Difetti in geni nucleari codificanti componenti strutturali della catena respiratoria
2- Difetti in geni codificanti fattori coinvolti nell’assemblaggio dei complessi della
catena respiratoria

Cogliati S et al, JMB 2018

 3- Difetti in geni codificanti enzimi per la sintesi di lipidi e cofattori

Fattori relati alla biosintesi dei lipidi

TAZ (or G4.5) encodes an acyl–coenzyme A

synthetase/transacylase (tafazzin)

Nature Genetics 12, 385 - 389 (1996)

A novel X-linked gene, G4.5. is responsible for Barth syndrome
Silvia Bione, Patrizia D'Adamo, Elena Maestrini, Agi K. Gedeon, Pieter A. Bolhuis & Daniela Toniolo
Fattori relati alla biosintesi di cofattori
Fattori relati alla biosintesi dei centri FeS

Frataxin Iron storage protein Friedreich ataxia

ABC7 Iron exporter X-linked ataxia/sideroblastic anemia
ISCU FeS scaffold protein Myopathy with lactic acidosis
NFU1 FeS cluster scaffold Weakness, lethargy, and severe lactic acidosis
BOLA3 reductases interacting Cardiomyopathy and epileptic encephalopathy
with glutaredoxins MMDS
IBA57 maturation of 4Fe-4S Leukodystrophy
ISCA2 proteins
4- Difetti in geni codificanti fattori coinvolti nel mantenimento del
mtDNA

Mantenimento del
pool nucleotidico

SSBP1

Apparato di replicazione
del mtDNA
Viscomi & Zeviani, JIMD (2017); 587-599
 Southern blot analysis

Alterazioni qualitative: delezioni Alterazioni quantitative: deplezione

Ct MD MD SD Ct Dep Dep
AD or AR SPORADIC AR
5- Difetti in geni codificanti fattori coinvolti nella sintesi proteica mitocondriale
mtDNA translation takes place in mitochondria

The protein apparatus is provided

by specific nuclear genes

The RNA apparatus is provided

by mtDNA genes (tRNAs, rRNAs)
Mayr et al. /
6- difetti in geni codificanti fattori coinvolti nella dinamica mitocondriale

Bueler et al. 2010

 Fusion Fission

Myopathy, ataxia Encephalopathy

MSTO1 MFF

CMT4A

Mitofusins 1 e 2, MFN1 e MFN2

CMT2A

Optic atrophy 1, OPA1 Encephalopathy

OA Dynamin-related protein 1, DRP1

 7- Miscellanea THE GENES

Apoptosi
AIF1 Programmed cell Progressive mitochondrial encephalomyopathy with muscle
death inducer, NADH- mtDNA depletion
dependent
Prenatal ventriculomegaly and infantile encephalomyopathy
oxidoreductase

Detossificazione
ETHE1 Exploitation and Encephalopathy, microangiopathy, chronic
detoxification of sulfide diarrhea, ethylmalonic aciduria

Import delle proteine all’interno dei mitocondri

TIMM8A Transporter of X-linked deafness–dystonia (Mohr–
carrier proteins Tranebjaerg syndrome)

DNAJC19 Mitochondrial Cardiomyopathy with ataxia

import
GFER Sulfhydryl oxidase, Myopathy, cataract, sensorineural
mitochondrial hearing loss, and developmental delay
import
La genetica delle malattie mitocondriali

Difetti del DNA mitocondriale

•Geni coinvolti nella sintesi proteica
(rRNAs, tRNAs)
•Geni che codificano subunità dei
complessi respiratori
•Delezioni
 UO Genetica Medica e Neurogenetica
direttore Franco Taroni

SS Genetica dei Disturbi del

Movimento e dei Disordini del
Metabolismo Energetico
Barbara Garavaglia
Federica Invernizzi
Eleonora Lamantea
Chiara Reale
Celeste Panteghini
Manuela Spagnolo
SS Patologia Molecolare delle
Malattie Mitocondriali
Valeria Tiranti
Ivano Di Meo
Camille Peron
Chiara Cavestro
Tommaso Cabassi
Antonello Manocchio
Costanza Lamperti
Silvia Marchet
Alessia Catania
Laboratorio di Genetica Istituto
Besta/Università degli Studi di
Milano
Daniele Ghezzi
Alessia Nasca GRAZIE
Andrea Legati