FOSFORILAZIONE OSSIDATIVA

L’ultima fase consiste nella cattura dell’energia, viene definita “catena di trasporto degli
elettroni” e avviene sulla membrana mitocondriale interna. Questa fase indica l’ossidazione del
NADH e del FADH2 da parte dell’ossigeno. Poiché questa ossidazione è fortemente esotermica,
libera una grande quantità di ATP (infatti il 90% di ATP contenuto nella molecola di glucosio,
viene liberata in questa fase) e ovviamente non può avvenire una reazione diretta, altrimenti non ci
sarebbe la possibilità di trasformare gradualmente l’energia liberata in ATP, quindi, anche in questo
caso, ad ossidare NADH non è direttamente l’ossigeno ma sono altri intermedi che successivamente
vengono riciclati; poi come ultimo step c’è l’intervento dell’ossigeno.
Quindi, questa catena di trasporto, è l’ossidazione indiretta di NADH.

Come si sintetizza ATP?

La forma di energia, che alla fine verrà convertita in ATP, è il gradiente protonico: queste
proteine, che compiono il processo di ossidazione nel corso della catena di trasporto, sono anche
pompe protoniche.
Precedentemente abbiamo analizzato altri tipi di pompe protoniche che per spostare gli ioni H+
utilizzavano l’energia dell’ATP; invece, queste pompe protoniche, catalizzano reazioni spontanee di
ossido-riduzione utilizzando di conseguenza l’energia liberata per spostare gli ioni H+, ottenendo in
questo modo un gradiente protonico.
Quindi l’obiettivo di questa fase è realizzare l’ossidazione finale degli intermedi che si sono formati
nella glicolisi, nel ciclo di Krebs e nell’ossidazione del piruvato, cioè NADH.
Questa fase avviene nella membrana mitocondriale interna, quella che possiede le “creste
mitocondriali”; a differenza del ciclo di Krebs, in questo caso, gli enzimi e le proteine sono situati
l’uno di fianco all’altro, situati proprio secondo un’organizzazione logistica sulla membrana
mitocondriale interna; queste sono delle proteine trasportatrici di elettroni, che catalizzano reazioni
di ossido-riduzione e quindi sono pompe protoniche.

Figura 1- catena di trasporto degli elettroni

Si tratta di quattro complessi (indicati con i numeri romani da I a IV) e due sistemi di
connessione (l’ubichinone e il citocromo c).
I primi sono dei complessi proteici e alcuni di essi (in particolare I, III, IV) formalmente sono
pompe protoniche che spostano ioni H+ e che formano un gradiente protonico nello spazio fra le
due membrane e la parte interna del mitocondrio (la matrice mitocondriale).
La prima reazione di questa catena degli elettroni prevede la rigenerazione del NAD+ (a questo
punto si hanno 10 equivalenti di NADH: 8 da ciclo di Krebs + piruvato e 2 dalla glicolisi) dal
complesso della NADH-deidrogenasi, questa catalizza una reazione di ossido-riduzione, la
reazione avviene con il substrato NADH che diventa NAD+ e con il corrispettivo ossidante che è
l’ubichinone (o coenzima Q). In questa reazione vengono liberati H+ da NADH, questi ioni
vengono pompati nello spazio intermembrana e quindi la proteina, come detto in precedenza, funge
da pompa protonica.

Figura 2- ubichinone

L’ubichinone è simile ad un sistema aromatico, è una sorta di dichetone sull’anello aromatico.

Questo coenzima Q10 si chiama così perché possiede un’unita isoprenica, a 5 atomi di carbonio,
presa 10 volte ( quindi con 50 carboni). Una delle sue caratteristiche fondamentali è la apolarità
perché gli permette di spostarsi nella membrana mitocondriale interna.
Il NAD che è stato ossidato si trova nella matrice del mitocondrio, perché serve per il processo del
ciclo di Krebs (serve anche fuori dalla matrice ma nella lezione precedente abbiamo visto come
viene rigenerato per essere utilizzato durante la glicolisi).
La forma ridotta dell’ubichinone è l’ubichinolo, uno stimolante del metabolismo, che possiede una
struttura aromatica e degli idrogeni in più: questi ultimi non vengono prodotti ma sono ottenuti dalla
reazione del secondo complesso.
La seconda reazione (quindi nel complesso II) avviene per trasformare il FADH2 in FAD;
l’ossidante è sempre l’ubichinone, che subisce sempre la stessa reazione.
Il secondo complesso ha una particolarità, non fa fuoriuscire ioni H+, nonostante il FAD li abbia
persi, questo accade perché gli ioni ottenuti vengono spostati per ottenere l’ubichinolo, prodotto
della prima reazione (mentre gli ioni ottenuti nella prima reazione fuoriescono). Tutti gli H+ per
trasformare l’ubichinone in ubichinolo vengono presi quindi dalla seconda reazione. Questa
caratteristica fa sì che questo complesso proteico non possa essere definito pompa protonica.
Il secondo complesso ha anche altre peculiarità, è l’unico complesso fisicamente aggregato al
ciclo di Krebs: il FADH2 nel ciclo di Krebs si produce solo in una reazione, nella succinato
deidrogenasi (che trasforma il succinato in fumarato), questo enzima si trova proprio unito al
complesso II; questo vuol dire che appena viene prodotto FADH2, il complesso II subito provvede a
ritrasformarlo, sono fisicamente adiacenti.
A questo punto l’ubichinolo viaggia nella membrana, per questo viene definito sistema di
connessione. La sua caratteristica che lo fa spostare all’interno della membrana la ricava dalla
catena a 50 atomi di carbonio.
Raggiunge quindi il complesso III (o citocromo bc1).
 Figura 3- complesso III

Tutte le molecole che si chiamano citocromo possiedono al loro interno una porfirina con un
metallo al centro, “cromo”, d’altronde, richiama il colore e questo infatti viene dato proprio dal
metallo.
Quindi arrivato nel complesso III, l’ubichinolo raggiunge il citocromo cb1, quest’ultimo ha la
funzione di rigenerare l’ubichinone così che possa tornare ai complessi I e II per risvolgere le
prime due reazioni. L’ossidante di questo complesso è il citocromo c, la sola proteina presente nella
catena di trasporto che non è una proteina di membrana, quindi, che è capace di spostarsi ma non
è integrale ( l’ubichinone è invece una molecola organica). Il citocromo c quindi è parzialmente
inserita nella membrana, è una molecola piccola e dato che deve spostarsi nella membrana possiede
una forma globulare e espone all’esterno amminoacidi apolari, sennò non può viaggiare all’interno
di essa.
Arrivato al complesso IV, quest’ultimo rigenera il citocromo c e attraverso un trasferimento
all’interno del complesso IV gli elettroni arrivano all’ossidante finale, ovvero l’ossigeno. A questo
punto l’ossigeno subisce la reazione di riduzione e diventa acqua.

* NOTA BENE
I veri ossidanti del complesso III sono i metalli posti all’interno della porfirina, ad esempio Fe3+
che viene ridotto a Fe2+, ma per farlo ritornare ad essere Fe3+ il citocromo c, che contiene Cu2+, lo
rigenera con una reazione di ossido-riduzione, ma a sua volta il citocromo c si è modificato a Cu+
durante questa reazione e di conseguenza deve essere rigenerato e quindi raggiunge il complesso IV
dove trova un altro Fe3+ che ossida il Cu+ ottenendo il citocromo c di partenza e Fe2+ , alla fine
quest’ultimo ione, insieme al complesso IV stesso, verrà rigenerato dall’ossigeno che diventerà
acqua.

OSSERVAZIONI
● Il complesso III è una pompa protonica perché dato che viene rigenerato l’ubichinone
dall’ubichinolo quest’ultimo perderà i protoni acquistati che verranno poi “cacciati” fuori.
L’ossigeno reagisce con gli ioni H+ e diventa H2O.

● Il complesso IV in realtà non è una vera e propria pompa protonica ma contribuisce a creare
il gradiente ( gradiente = differenza di concentrazione).

Come si può creare il gradiente?

Ci sono due modi:
- Quello di spostare gli ioni da un lato all’altro
 - Quello di consumare ioni H+ da un lato
Infatti, il complesso IV fa sì che l’ossigeno reagisca con gli ioni H+ così che si crei questo gradiente
protonico, quindi, consuma gli ioni dall’interno della membrana mitocondriale interna. Le vere
pompe protoniche quindi sono il primo e il terzo complesso.
● Il complesso IV si chiama citocromo c ossidasi ( è un enzima fondamentale)

All’interno dei complessi III e IV avvengono delle reazioni di ossido riduzione, quello che succede
è che un rame ossida un ferro, poi un ferro ossida il rame e poi il ferro ossida il ferro.

Ma com’è possibile che un Fe3+ del terzo complesso venga ossidato da Fe2+ del secondo complesso
secondo questa reazione:
Fe3+(IV) + Fe2+(III) 🡪 Fe2+(IV) + Fe3+(III) ?
In soluzione, non ha senso questa reazione perché i potenziali di riduzione e ossidazione sono fissi.
Ha senso in questo caso perché se il ferro si trova all’interno di strutture come le porfirine, il suo
potenziale può essere graduato e quindi un ferro può essere più ossidante di un altro.

Figura 4- sistemi porfirinici

Hanno tutte dei potenziali di ossidazione differenti.

Figura 5- proteine ferro-zolfo

Un’altra possibilità è data dalle proteine ferro-zolfo.

Il metallo centrale della porfirina forma un composto di coordinazione con l’azoto, si immagini che
quella proteina strategicamente aggiunga 4 cisteine e quindi il composto di coordinazione lo formi
con lo zolfo, il ferro sta all’interno della proteina e viene coordinato dagli atomi di zolfo di 4
cisteine ( la valenza di coordinazione è sempre la stessa, cambia la valenza ionica).
Queste proteine stanno all’interno del complesso IV.
* NOTA BENE
La cisteina :
- È precursore dell’acido pantotenico del coenzima A;
- È importante per formare i ponti disolfuro;
- Viene implicata nella formazione delle proteine ferro-zolfo.

Figura 6- potenziali standard di riduzione

Questa diapositiva ci riporta quantitativamente la tendenza ad ossidare o a ridurre, in chimica

questo si misura con i potenziali standard di riduzione.

L’enzima citocromo c ossidasi corrisponde al complesso IV. È uno degli enzimi filogeneticamente
più antichi, ovvero versioni diverse ma simili, di questo enzima, è presente in tutti gli esseri viventi.
È il primo enzima che troviamo che ha come substrato un gas (O2).
Come fa l’enzima ad avere come substrato un gas se non ha una tasca dove può entrare questa
molecola biatomica?
Lui ha dei gruppi che somigliano all’eme, quindi è lo stesso centro metallico che si trova nell’eme
che cattura O2, quindi, viene catturato da questo sistema porfirinico.
Nell’eme però l’ossigeno viene solo trasportato, non avviene nessuna reazione, mentre in questo
enzima, reagisce per dare H2O.
Lo ione -CN e CO sono considerati veleni mitocondriali perché si sostituiscono all’ossigeno sia
dell’eme sia all’enzima citocromo c ossidasi; bloccano la produzione di energia.
Nella glicolisi abbiamo visto l’enzima fosfofruttochinasi che regolava il processo; nel ciclo di Krebs
abbiamo visto invece che le reazioni degli enzimi 3 e 4 sono quelle più importanti e che hanno degli
effettori allosterici e degli inibitori allosterici;
Questo processo viene regolato? O nel momento in cui inizia non si può più fermare?
È molto meno regolato, è interesse della cellula rigenerare il NAD e il FAD, ma c’è una forma di
regolazione a livello locale che consiste nel bloccare proprio il citocromo c ossidasi, ovviamente
non come fanno il cianuro o il monossido di carbonio ma in maniera reversibile. Anche in questo
caso si utilizza un gas che però forma un legame reversibile con il citocromo c ossidasi, questo è il
monossido di azoto: può essere rimosso a seconda della sua concentrazione e in base alle esigenze,
anche questa è una forma di regolazione. NO è un mediatore utilizzato nel nostro organismo come
mediatore, è uno stimolante della contrazione muscolare.
Quando entra in gioco il citocromo c ossidasi è una fase fondamentale perché quest’ultimo entra in
contatto con una molecola estremamente reattiva, O2. L’ossigeno potrebbe causare danni,
producendo radicali reattivi all’ossigeno che si chiamano ROS, quelli che causano lo stress
ossidativo. Essendo reattivi possono causare danni alle strutture cellulari, però, la presenza di questi
è un segnale cellulare dello stato ossidativo quindi non può essere portata a 0 la sua concentrazione,
quindi, serve per sapere quanto ossigeno serve al mitocondrio.
Arrivati a questo punto si deve sintetizzare ATP.

Mitchell fu colui che scoprì come riusciva ad essere sintetizzato ATP arrivati in questa fase, ovvero
ha spiegato come il gradiente elettrochimico, tra lo spazio intermembrana e la matrice, viene
convertito in ATP.

Figura 7- enzima F0F1 ATPasi

La parte fondamentale è riposta nell’enzima F0F1 ATPasi ( più piccola macchina nota in natura.
Viene definita macchina perché converte l’energia). Questo enzima prende ADP e gli aggiunge un
gruppo fosfato, quindi, è una fosforilazione non a livello del substrato. Questa reazione richiede
energia e la prende proprio dal gradiente elettrochimico.
Questa proteina converte diverse forme di energia.
Nella membrana mitocondriale interna si trova la prima subunità di questa proteina, è una subunità
che al centro possiede una sorta di cavità e grazie a questa riesce a far passare gli ioni H+. (la
membrana interna è impermeabile agli ioni quasi sempre).
Gli ioni H+ inducono un cambio conformazionale alla proteina che quindi ruota.
Perché c’è questa rotazione?

Si immagini al centro di questa molecola tantissime lisine ( amminoacido basico che contiene NH3)
vicine tra loro, quando entrano gli H+ si caricano positivamente e quindi si respingono e inducono
la rotazione della proteina. Il movimento viene trasmesso alla parte F1 e questo movimento
meccanico viene convertito in energia per la sintesi di ATP.

*NOTA BENE
La prima forma di energia che si converte è il gradiente elettrochimico in energia meccanica poi
questa viene convertita in energia chimica per prendere un fosfato e attaccarlo all’ADP,
sintetizzando ATP.
Jagendorf fu un chimico che inizialmente smentì la teoria chemiosmotica di Mitchell ma che
successivamente, con alcuni esperimenti, la dimostrò.
L’esperimento è volto a dimostrare che il gradiente protonico è la forma di energia che serve per
sintetizzare ATP.

ESPERIMENTO 1
Jagendrof isolò un mitocondrio dalla cellula ponendolo in un mezzo liquido a pH =9. Dopo un po’
la matrice, lo spazio intermembrana e la membrana esterna si trovavano tutti allo stesso valore di
pH (9), istantaneamente pose il mitocondrio in un mezzo liquido a pH=7 determinando un gradiente
protonico (perché all’interno della matrice il pH era ancora 9 quindi c’era una concentrazione di
H3O+ maggiore all’esterno). Dopo questo osservò che nel mitocondrio iniziò a sintetizzarsi ATP.
Quindi con questo primo esperimento dimostrò che l’energia necessaria per sintetizzare ATP era
quella del gradiente protonico.

ESPERIMENTO 2
La seconda dimostrazione fu quella rivolta alla dimostrazione dell’enzima F0F1 ATPasi.
Jagendorf isolò dalla cellula un organello con una pompa protonica (esempio: vacuolo), creò
artificialmente un gradiente protonico; sullo stesso organello, dopo aver constatato che non si
sintetizzava ATP, installò la F0F1 ATPasi e riuscì a osservare la sintesi di ATP.
Nella glicolisi si liberano 2 equivalenti di ATP, 2 NADH che entrano nel mitocondrio con lo
shuttle malato aspartato, sopra è presente il piruvato che entra nel mitocondrio con il simporto
H+ piruvato. Successivamente avviene tutto nella matrice e sulla membrana mitocondriale interna:
nella matrice avviene il ciclo di Krebs che utilizza il piruvato, l’acetil-coenzima A è l’ultima forma
di glucosio che poi viene liberato come CO2, si produce anche in questa fase qui poco ATP, però si
produce una grande quantità di NADH e FADH2, a questo punto ci sono i complessi I, II, III e IV
che servono a costituire la catena di trasporto di elettroni, si crea poi il gradiente protonico e per
ultimo, attraverso l’enzima F0F1ATPasi, l’ADP diventa ATP, quest’ultimo si trova, quindi, nella
matrice del mitocondrio.
La creazione delle creste è fondamentale perché consente di porre al suo interno un maggior
numero di complessi ( migliaia su un mitocondrio). Nella cresta si crea il gradiente protonico più
facilmente perché il volume preso in considerazione è minore, riuscendo così ad avere
concentrazioni di ioni H+ diverse più facilmente.
Inoltre, la cresta, fa sì che l’enzima F0F1 ATPasi si trovi esattamente sotto ai complessi, da una
parte i complessi pompano ioni H+ e dall’altra escono, questa è una disposizione strategica di
F0F1 ATPasi rispetto ai complessi, se non ci fosse sarebbe difficile farlo attraversare.
Il bilancio energetico finale quindi è pari a 36 o 38 ATP.
Glicolisi= 2ATP
Ciclo di Krebs= 2ATP
Fosforilazione ossidativa= 32 o 34 ATP
Questi numeri sono solo indicativi in realtà, il numero effettivo è molto più vago.

- Il numero sarebbe corretto se venisse utilizzato lo shuttle malato aspartato allora sarebbero
34, se invece si utilizzano altri, che sono meno efficienti, se ne formano 32.
- Nelle cellule eucariotiche il piruvato entra con gli ioni H+ e li consuma, quindi, per questo
fa produrre meno ATP; quindi il simporto del piruvato consuma ATP.
- Gli ioni H+ possono attraversare la membrana interna senza passare per l’enzima F0F1
ATPasi, quindi, questo è un altro consumo di energia.

Quindi il numero veritiero di ATP sarebbe 30-32.

*NOTA BENE
Il gradiente protonico viene utilizzato tramite la termogenina per riscaldare l’organismo.

L’ATP si trova nella matrice del mitocondrio e deve fuoriuscire.

La membrana interna del mitocondrio è piena di enzimi che si chiamano ATP-ADP-translocasi, la
cellula ha scelto questo sistema perché all’interno della matrice l’ADP viene trasformato in ATP,
dopo un po’ finisce l’ADP; quindi l’ATP esce dal mitocondrio e si scambia con l’ADP che entra
nella matrice per la sintesi di nuove molecole di ATP.
Queste proteine si sono evolute con l’eucariogenesi. La matrice del mitocondrio per il batterio
costituiva il suo citoplasma, quindi, questo sistema per il batterio era perfetto; non va più bene
quando il mitocondrio entra nella cellula eucariotica, l’ATP deve uscire.

L’ultima parte è costituita dai metabolismi alternativi. Tutti i processi analizzati finora sono tutti
aerobi, quindi con presenza di ossigeno come ossidante. Esistono anche batteri aerobi, come se il
mitocondrio fosse il batterio stesso: glicolisi e ciclo di Krebs lo fanno sulla membrana mentre la
catena di trasporto degli elettroni la fanno sulla loro membrana ( che poi è diventata la membrana
del mitocondrio). Questi batteri possiedono due membrane, di cui quella interna fatta a creste, oltre
ad avere la parete.
Si chiama respirazione anaerobia, una respirazione cellulare fatta da batteri e il cui ossidante non
è l’ossigeno, alcuni batteri utilizzano ad esempio NO3-.
C’è un’altra possibilità di respirazione che è la fermentazione, è un processo in cui ci sono cellule
impossibilitate ad effettuare la respirazione o perché non hanno le strutture o perché in quel
momento non c’è disponibilità dell’ossigeno e quindi l’energia si ricava solo dalla glicolisi, lo fanno
alcuni batteri anaerobi, che possono essere obbligati ( come il batterio che causa il tetano), e quindi
se entra in contatto con O2, molecola offensiva, il batterio muore, lo fanno anche gli anaerobi
facoltativi o anche funghi unicellulari.