Lezione 09/03/22

martedì 15 marzo 2022 10:40

INTRODUZIONE ALL'ISTOLOGIA
L'ISTOLOGIA studia come appaiono microscopicamente le cellule, le quali si organizzano per formare tessuti.

L'organizzazione del corpo è:

• Cellule

• Tessuti: è un insieme di cellule con la stessa formula e funzione, con la stessa origine embrionale.
Nei mammiferi sono presenti 4 tipi di tessuti:
○ Connettivo: formato da cellule diverse
Hanno molta matrice extracellulare (ambiente in ci sono immerse le cellule)
Ha funzione di sostegno e protezione
○ Muscolare: formato da cellule muscolari
Hanno poca matrice extracellulare, lo spazio tra le cellule muscolari è poco
Ha funzione di movimento
○ Nervoso: le cellule sono i neuroni
non hanno matrice extracellulare
hanno la funzione di trasmissione dell'impulso nervoso
○ Epiteliale: hanno cellule poliedriche (forme e dimensioni diverse), tendono ad aggregarsi tra loro
Hanno poca matrice extracellulare, lo spazio tra le cellule è poco
ha funzione di secrezione, movimento e protezione

• Organi

• Sistemi e apparati: gli apparati umani sono 11

○ Formati da tessuti uguali, come sistema scheletrico e muscolare
○ Formati da tessuti diversi, come apparato digerente (fatto principalmente dal tessuto epiteliale)

CENNI STORICI:
l'istologia nasce nel momento in cui l'uomo ha avuto a disposizione i microscopi e nel momento in cui si ha avuto la possibilità di preparare colorazioni per le cellule.

Camillo Golgi (italiano) fu il primo studioso ad utilizzare colorazioni per cellule da studiare poi con il microscopio. Con la colorazione e l'osservazione dei neuroni egli vinse
il premio Nobel per la medicina.
Il premio Nobel è stato condiviso con Cajal (spagnolo), che osservando al microscopio i tessuti ha notato il modo in cui le cellule si connettevano le une alle altre.
La disputa tra i Golgi e Cajal era sulla trasmissione dell'impulso nervoso:
• Golgi pensava fossero mediate da contatto diretto. l'assone va a diretto contatto con la membrana citoplasmatica del neurone successivo
• Cajal notò che la trasmissione dell'impulso avveniva mediante sinapsi: uno spazio tra i neuroni.
Vinse la teoria di Cajal. Quindi la trasmissione dell'impulso nervoso avviene per liberazione di un neurotrasmettitore rilasciato nello spazio neurosinaptico.

DIMENSIONI DELLE CELLULE:

Una cellula si misura in micrometri, dove 1 µm = 1×10⁻⁶ m, cioè un

milionesimo di metro e mille volte più piccolo di un millimetro.

Organismi pluricellulari:
• Un globulo rosso umano ha il diametro costante per età e sesso
di 7,5/8 µm. In un preparato istologico sono facili da notare,
perché un vaso sanguigno passa sempre in un tessuto;
osservandoli si può dare una scala dimensionale di quello che
stiamo osservando

• Cellula uovo (ovocita): nei mammiferi sono le cellule più grandi,

il diametro è circa 110 µm.

• Spermatozoo: cellula umana più piccola, infatti la testa è di

circa 5µm.

Dopo l'ovocita ci sono altre cellule con dimensioni elevate:

• Adipociti: 50/100 µm
• Motoneuroni: 80 µm

Organismi unicellulari:
• Ameba gigante: cellula più grande che raggiunge i 1-5 mm di
lunghezza.

Caratteristiche delle cellule:

• Dimensioni: 10-40 µm
• Forme: svariate (piatte, rotonde, poliedriche)
• Posizione del nucleo: importante per identificare la cellula

Perché le cellule sono piccole?

Le cellule devono mantenere un rapporto predefinito tra superficie e volume, all'aumentare del diametro aumenta anche il volume (con esponente 3).
Quindi:
• La diffusione per osmosi e gli scambi chimici sarebbero troppo lenti nel viaggiare e nel diffondersi, non garantendo la vita della cellula e dell'organismo (dato che il
metabolismo della cellula deriva da scambi chimici).
• Il movimento fisico della singola cellula, in caso di volume elevato, non sarebbe possibile perchè il peso sarebbe elevato.
 • Il movimento fisico della singola cellula, in caso di volume elevato, non sarebbe possibile perchè il peso sarebbe elevato.
I limiti sono quindi strutturali e funzionali.

DIVERSI MODI PER GUARDARE LE CELLULE

Sono cellule morte, fissate su un vetrino.

Colorate in modi diversi:
• Molecole fluorescenti: mettono in evidenza strutture particolari
Proteine nucleo: giallo
Proteine citoscheletro: rosso
• Coloranti che si legano a proteine del nucleo e del citoplasma:
mettono in evidenza la struttura della cellula.

MICROSCOPI
Microscopio ottico: non si distinguono bene le varie cellule.
Si guardano cellule vive.
Microscopio elettronico: si riesce a vedere l'interno della cellula.
Si guardano cellule morte.
Coloranti: sfruttando molecole fluorescenti per colorare cellule morte in modo da osservare i vari elementi interni con più facilità

l'istologia sfrutta le lenti per ingrandire le cellule.

MICROSCOPIO OTTICO
• Lenti: per ingrandire il campione da studiare.
• Oculare: sfruttando le lenti che hanno un ingrandimento fisso, di solito 4x di ingrandimento
• Obbiettivi: danno diversi ingrandimenti (4x, 10x, 20x
Se ho un 4x in obiettivo e un 10x in oculare ho un ingrandimento di 40 volte, perché devo moltiplicare.
• L'illuminazione è garantita dalla luce
• le viti macrometriche: mettere a fuoco il campione.
• La vite micrometrica: spostare il campione

Per aumentare i confini si aggiunge il contrasto di fase,

ciò consente di creare una linea luminosa intorno alla
cellula.

Come di prepara il campione perda osservare al microscopio ottico

Il preparato istologico è sempre su cellule morte ma fissate:

1. Biopsia: prelevare il campione

il taglio deve essere ottimale, attraverso strumenti idonei.

2. Fissazione: deve essere fatta il prima possibile per bloccare le attività metaboliche; gli enzimi e le attività proteiche devono essere bloccate
○ Bisogna indurire i tessuti per vitare il collasso.
○ Avviene attraverso l'aldeide formalina (o formaldeide): attraverso il cross-link la formalina lega le proteine (lisina) e ha un effetto indurente, bloccando
l'azione degli enzimi e garantendo il mantenimento della struttura
○ Per 24 ore va lasciato in questo aldeide
○ Deve esserci il giusto rapporto tra fissativo e campione: Quantità fissativo = rapporto 1:10
○ Deve essere fatto rapidamente per evitare che gli enzimi presenti degradino il
tessuto
Inadeguata fissazione: alterazione della morfologia cellulare

Caratteristiche: deve essere compatibile con il tessuto che si sta studiando e con le colorazioni che avverranno successivamente
Ci possono essere fissativi:
○ Agenti chimici:
□ Organici: formalina. La formalina è un formaldeide al 40% in soluzione acquosa. In realtà basta usarla al 10% in una soluzione fisiologica. Se lo
mettessi solo in acqua per l'osmosi ci sarebbe la distruzione del campione.
 mettessi solo in acqua per l'osmosi ci sarebbe la distruzione del campione.
□ Inorganici
○ Agente fisico: congelamento o calore

3. Disidratazione: l'acqua tende a degenerare il tessuto, quindi bisogna rimuovere l'acqua.

○ si mettono i campioni a concentrazione crescente di etanolo (scala alcolica), passando il campione in varie concentrazioni (70%, 90% e 100%)
○ l'etanolo spazza via l'acqua.

4. Diafanizzazione: L'ultimo passaggio deve essere tramite il solvente xilene (tossico).

○ Lo xilene spazza l'alcool ed è solubile nella paraffina.

5. Infiltrazione e inclusione: si immerge il campione in paraffina liquida

○ Diversi passaggi in paraffina calda
○ La paraffina occupa lo spazio precedentemente occupato dall'H2O e dall’alcol
○ La paraffina fredda si indurisce e permette di sezionare il campione
○ Lascio solidificare e si formerà il blocchetto con il campione detto incluso

6. Taglio al microtomo:
○ si taglia il campione di paraffina con uno spessore di 3/5 micron.
○ La luce può così passare attraverso e il tessuto mantiene la struttura 3D di un solo
strato cellulare.
○ Si trasferisce in una vaschetta di acqua tiepida (perché la paraffina galleggia)
○ si raccoglie con un vetrino
Non è ancora colorato

Molto importante è il taglio, perché al microscopio vediamo in 2D,

ma il nostro campione è in 3D.Il taglio può avvenire:
 rispetto a una sezione longitudinale (lungo l'asse principale)
 trasversale
 Obliquo

In base al taglio che faccio vedrò cose diverse: per esempio nel caso dell'osso tagliato
longitudinalmente, quello che vedrò saranno due bordi e il centro quasi vuoto.
Se lo taglio trasversalmente vedremo un anello circolare. Vedrò invece un anello
obliquo se lo taglio con sezione obliqua.
Questo avviene per tutti i preparati, anche per esempio nel caso della
ghiandola sudoripara della pelle:

7. Colorazione: la classica colorazione prevede l'utilizzo di ematossilina e eosina

È una colorazione bicromica che si basa sul diverso valore di pH dei vari tessuti e dei vari organelli costituenti la cellula
 l'ematossilina: colore violetto.
- Ha un'affinità per molecole cariche negativamente, in particolare ha affinità per il nucleo
dove ci sono DNA e RNA che sono acidi nucleici non neutri ma negativi, quindi attirano l'ematossilina.
- Se una cellula si colora di violetto, viene detto basofilo.
Non è "tutto o niente": In questo caso il nucleo è più viola del citoplasma proprio perché contiene DNA e RNA
che sono molto negativi, però anche nel citoplasma c'è un po' di violetto, questo vuol dire che non è tutto
positivo lì.
- Acidi nucleici e ribosomi: basofili perché carichi negativamente

 l'eosina: ha colore rosa.

- ha affinità per molecole cariche positivamente, in generale sono le proteine del citoplasma.
- Se una porzione di tessuto o di una cellula si colora di rosa viene detta acidofila o eosinofila
- Le proteine del citosol generalmente sono acidofile

Sezione di pancreas colorato con ematossilina ed eosina

Il pancreas è un tessuto epiteliale ghiandolare, ad altissima densità di cellule. Non

ci sono spazi bianchi.
In violetto ci sono i nuclei e attorno più rosa sono i citoplasmi.

Foto solo con ematossilina Foto solo con eosina

È importante combinare insieme questi due coloranti. Consentono di distinguere le
due strutture. Con l'ematossilina il citoplasma rimane bianco. Con l'eosina il nucleo
rimane bianco

I lipidi sono solitamente bianchi alla colorazione di ematossilina ed eosina, non vengono colorati

Altri tipi di colorazioni:

 Giemsa per striscio sangue:
 rimane bianco

I lipidi sono solitamente bianchi alla colorazione di ematossilina ed eosina, non vengono colorati

Altri tipi di colorazioni:

 Giemsa per striscio sangue:
pochissimi viola perché i globuli
rossi non hanno il nucleo

 PAS (Acido Periodico-Reattivo di Schiff):

Per sostanze ricche in zuccheri (muco e glicogeno).

Il muco si colora di rosso.

 Per evidenziare le fibre si utilizza:

◊ Fibre Elastiche: resorcina e fucsina
◊ Fibre reticolari: impregnazione argentica per le fibre reticolari.

Sezione arteria linfonodo

 Per evidenziare contenuti lipidici si utilizza Sudan Black o Osmio: colora in nero grassi, lipidi, mielina.
Questo perché i lipidi non incorporano coloranti acquosi.

 Per evidenziare i collegamenti delle cellule nervose si utilizzano argento e oro.

Esiste anche la colorazione tricromica: per quando si mette in evidenza la parte delle
fibre collagene che riempiono tutti i tessuti e fanno da cuscinetto tra due tessuti.
Queste colorazioni rendono le fibre collagene di colore blu

Si utilizzano talvolta colorazioni cito-istochimiche che danno maggiori informazioni sul contenuto
e la natura delle sostanze specifiche della cellula ma anche riguardo alla presenza di agenti
biologici all'interno del tessuto (per esempio microbatteri).

8. Coprivetrino: è importante metterlo per proteggere il nostro preparato

ALCUNI ESEMPI DI TESSUTI: