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Professor Matera.
Questa mattina abbiamo parlato della parte generale dei protozoi sottolineandone il carattere morfologico
e accennando alla patogenesi dei protozoi più importanti; adesso parleremo nel dettaglio di due importanti
protozoi associati alle malattie dell’uomo: Giardia Lamblia e il Plasmodium della malaria.
GIARDIA LAMBLIA:
Osserviamo intanto che è un trofozoita di dimensioni abbastanza grandi: è lungo circa 12-13 micron e largo
7-8 micron. Presenta sulla faccia ventrale due nuclei, pari e simmetrici.
Tra i due nuclei, lungo l’asse longitudinale mediale si osserva l’assostile, e alla base dell’assostile possiamo
osservare i corpi parabasali e un grosso disco adesivo mediante il quale Giardia rimane adesa alla mucosa
intestinale. Per essere più specifici, la funzione adesiva del disco è però connessa anche alla presenza dei
flagelli , presenti in quattro paia, e che servono non solo per gli spostamenti all’interno della mucosa
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intestinale, ma anche per procurare, con il loro movimento, un vacuum, un vuoto, all’interno del disco
ventrale di Giardia che permette l’aderenza alla mucosa, dove tra l’altro avviene il nutrimento del
trofozoita. Per quanto riguarda i flagelli, ne sono presenti quattro paia e sono quindi in numero di otto, pari
e simmetrici: ci sono quelli anteriori, quelli ventrali, quelli posteriori e i due caudali.
Il movimenti tipico che determinano questi flagelli è definito “a foglia cadente”, ed è quindi un movimento
apparentemente disordinato. Per via di questo movimento è necessario utilizzare due fuochi nel
microscopio per tenere sott’occhio la Giardia, perché prima si riesce a vederla e un secondo dopo si è
spostata ed è fuori fuoco.
L’aspetto morfologico esteriore di Giardia viene detto “mascherone africano”, per via della presenza dei
due occhi, del naso e della bocca e per la presenza di queste strutture centrali nerastre.
-Il professore mostra varie slide per evidenziare i differenti tipi di colorazione utilizzati per il protozoo,
evidenziando nuovamente le strutture caratteristiche di Giardia. Tutti questi tipi di colorazione avvengono
ovviamente mediante l’esame delle feci che per l’appunto possono contenere trofozoiti o cisti.
Le feci conservate a 4°C rimangono inalterate anche una settimana.
Tra i vari coloranti risulta importante ricordare il LUGOL, utilizzato per marcare i polisaccaridi, e nello
specifico l’amido che diventa di colore rosso/marrone. D’altra parte nei trofozoiti ma anche nelle cisti sono
presenti dei vacuoli contenenti granuli di polisaccaridi e spesso proprio di amido. Mediante l’utilizzo del
Lugol ci aspetteremo inoltre di vedere i nuclei di Giardia completamente opalescenti, perché il Lugol non
colora gli acidi nucleici.
-Un'altra importante via che si può seguire nella diagnostica della Giardia Lamblia, è l’utilizzo di anticorpi
fluorescenti (ELISA, Enzyme-linked-immunosorbent-assay), dato che difatti esistono diversi antigeni
caratteristici di Giardia che possono essere riconosciuti, presenti soprattutto sulle pareti cistiche di Giardia
come per esempio il GSA-65 facendo comparire una banda di reazione.
-Infine una tecnica diagnostica che è stata utilizzata per molto tempo è l’enter-test che consiste nell’
ingerire una sorta di cubetto di gelatina connesso ad un filo che rimane adeso alla cavità orale mediante un
cerotto.Questo cubetto giunge fino a livello intestinale e viene ritirato lungo il tratto gastrointestinale dopo
due ore, per osservare se nel succo duodenale, che veniva posto su un vetrino, sono presenti o meno
trofozoiti.
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animali potenzialmente soggetti a giardiasi come cani, mucche e castori. Proprio questi ultimi, nuotando in
un ruscello che apparentemente risulta limpido e pulito, possono infatti rilasciare cisti appartenenti a ceppi
che possono facilmente infettare l’uomo e quindi possono trasmettere la malattia, qualora un viaggiatore
assetato decida di bere l’acqua del ruscello, ritenendola incontaminata. Se l’acqua raggiunge la
temperatura di ebollizione le cisti di giardia muoiono.
Un numero piccolissimo di cisti, circa 10 o 15, è in grado di contaminare un uomo.
Giardia viene di base considerato come un patogeno tropicale, ma mediante le forme di resistenza,
rappresentate dalle cisti, che consistono un doppio o anche triplo involucro che protegge il protozoo
dall’ambiente esterno, riesce anche a sopravvivere in ambienti tutt’altro che tropicali. E’ per esempio
comune la presenza di cisti di Giardia nelle gelide acque dei laghi Canadesi, ma risultano altamente diffuse
anche a San Pietro Burgo, a Leningrado ed in Olanda.
Perché in Olanda? Perché l’acqua è poco controllata e perché è un territorio con moltissimi campagne.
-E’ importante ricordare che a differenza di altri protozoi, Giardia non penetra all’interno della flora
intestinale. Giardia anche se si riproduce in modo molto abbondante, rimane sempre alla superficie del
tratto gastrointestinale e l’unica penetrazione, sempre che si possa chiamare tale, è il tentativo di
penetrazione all’interno dei globuli bianchi.
-Il professore mostra un’immagine, ottenuta da un microscopio elettronico a scansione, che rappresenta un
villo della mucosa intestinale completamente tappezzato da trofozoiti.
Da quest’immagine, era stato dedotto che il malassorbimento determinato dalla presenza di Giardia
all’interno del tratto gastrointestinale ,fosse dovuto per l’appunto all’occlusione meccanica dei villi, ossia il
fatto che i trofozoiti ricoprissero i villi e non ne permettessero la funzione.
Ci si è però poi resi conto, a seguito di un calcolo che teneva conto della superficie dei trofozoiti, del
numero massimo di trofozoiti presenti all’interno dell’organismo, della superficie del villo, e del numero dei
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villi del tratto gastrointestinale, che era completamente impossibile ricoprire totalmente tutti i villi, e che
quindi il problema del malassorbimento non era di natura meccanica; in sostanza non tutti i villi sono
coperti totalmente da trofozoiti.
MALARIA:
Introduzione: La malaria è una malattia infettiva, provocata da parassiti protozoi del tipo Plasmodium, non
contagiosa. Non è contagiosa perché la trasmissione della malattia avviene tramite vettori migratori e nello
specifico tramite zanzare del genere Anopheles di sesso femminile, fondamentali per il ciclo vitale del
Plasmodium che prevede difatti il passaggio attraverso due ospiti: Il primo ospite è rappresentato da un
soggetto a sangue caldo, l’uomo, da cui la zanzara Anopheles ingerisce del sangue infetto; il secondo ospite
è rappresentato da un soggetto a sangue freddo, ossia la zanzara stessa, che poi inoculerà il sangue infetto
in un altro individuo.
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Classificazione dei Plasmodi: E’ importante saper analizzare il plamodium dal punto di vista parassitologico
e chimico, iniziando dalla tassonomia e ricordando il regno, che è quello dei Protozoi, il phylum, che è
Apicomplexa, la classe, quella degli sporozoi, il genere, ossia plasmodium, e infine le quattro differenti
specie, responsabili di differenti forme di malaria: Plasmodium Falciparum, causa della malaria terzana
maligna, Plasmodium vivax e Plasmodium Ovale, responsabili della malaria terzana benigna, ed infine
Plasmodium malariae, coinvolto nella malaria quartana.
MALARIA IN ITALIA
La malaria in Italia è stata combattuta ed estirpata negli anni ’50, in quelle zone, come per esempio le foci
delle fiumane Calabresi, o in provincia di Grosseto, nella zona della Maremma, in cui risultavano presenti
molte zanzare di tipo Anopheles a seguito della presenza di molte paludi. Benché sia stata compiuta
un’opera di disinfestazione ed eliminazione di tali zanzare, non per questo bisogna pensare che sia
impossibile il ripresentarsi della malaria in Italia; potenzialmente sono presenti tutti i fattori necessari per il
ripresentarsi di tale malattia infettiva, perché comunque, anche se diffuse a macchia di leopardo, esistono
tuttora zona con una piccola componente di zanzare Anopheles.
In tal senso, se per esempio un persona extracomunitaria, plausibilmente infetta, proveniente da Centro
Africa o dal Centro America, si trasferisce nei nostri paesi, ed entra in contatto con una zanzara Anopheles,
tale zanzara può essere vettrice di malattia , migrando fino ad un raggio di 2 km (massimo spazio che la
zanzara può percorrere). Tra l’altro è anche probabile che l’extracomunitario trasferitosi in Italia, sia
apparentemente non malato, perché ha sviluppato una sorta di compromesso evolutivo con il parassita: il
parassita sopravvive all’interno dell’organismo, e l’organismo riesce a controllare gli eccessi delle
replicazioni e quindi le le fasi più acute della malattia, mantenendosi in condizioni di apparente sanità.
[Nelle aree endemiche i bimbi sono protetti per i primi 6 mesi dall'immunità passiva materna, data dagli
anticorpi ereditati dalla madre, poi si ha una progressiva acquisizione di una "semi-immunità", per
successive esposizioni alle infezioni del plasmodio. Si hanno ricorrenti attacchi di malaria, dall'età di pochi
mesi fino a 5-10 anni, prima di raggiungere uno stato di semi-immunità. Questa semi immunità ovviamente
non è presente nei soggetti che non sono mai entrati a contatto con la malaria e che risultano essere
soggetti pienamente vulnerabili].
Per tale ragione, risulta ancora più difficile prevenire un caso di malaria.
In Italia c’è stato solo un caso di malaria autoctona dopo gli anni ‘50. Essa si è originata proprio in provincia
di Grosseto, che, come accennato prima, è una zona storicamente malarica.
Qui, si era stabilito un gruppo di extracomunitari , portatori di malaria, in una capanna distante meno di 2
km da una casa rurale dove abitava una bambina che non era mai stata all’estero; Il contatto ravvicinato tra
la casa e la capanna ha permesso ad una zanzara Anopheles, di pungere l’extracomunitario e in seguito la
bambino trasmettendole la malaria.
Quindi ci sono tutti i fattori: c’è l’arrivo di persone dall’estero, c’è la presenza di anopheline, specialmente
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nelle coste ioniche della Calabria, e poi ci sono persone che ormai non sono più come le persone degli anni
sessanta e settanta; difatti tutte quelle persone che avevano 20-30-40 anni negli anni ’50 erano
potenzialmente immuni proprio perché la malaria era endemica fino agli anni ’50 ed erano quindi venuti a
contatto con il parassita malato. Tutte le persone nate invece dopo gli anni 50, non essendo più venuti a
contatto con il parassita malarico, sono assolutamente vulnerabili perché il loro sistema immunitario non
presenta alcuna sorta di immunità acquisita.
Una volta punto l’ospite, gli sporozoiti, stretti e lunghi, entrano nel torrente circolatorio fino al
raggiungimento degli epatociti del fegato, dando così inizio della fase epatica. La fase epatica ha una durata
differente a seconda del tipo di Plasmodium, in falciparum per esempio è molto breve mentre in malariae è
abbastanza lunga.
Durante la fase epatica gli sporozoiti si dividono per fissione binaria determinando la formazione dei
merozoiti, che sono particolari forme vegetative di trofozoiti, particolarmente ricchi di organuli.
La fase epatica è seguita da un rilascio che dura due giorni, dovuto alla rottura degli epatociti e al alla
fuoriuscita dei merozoiti tissutali (parassiti asessuati).
Quindi, se osserviamo il fegato, durante la fase epatica osserviamo gli sporozoiti che, con replicazione e
riproduzione soltanto per fissione binaria, ossia in modo asessuato, formano i merozoiti che ritroviamo nel
parenchima epatico.
Dopo la fase epatica abbiamo la fase ematica: I merozoiti passano dal fegato al torrente sanguigno ed
invadono tutti i capillari, tutti i vasi più piccoli per lo più di cervello, cuore e Rene. Essendo questi vasi molto
piccoli, può capitare che ammassi di plasmodi occludano il lume dei capillari o delle venule; in questo
modo, il parenchima cerebrale che deve essere continuamente nutrito, non essendolo più per l’occlusione
meccanica , può andare incontro ad episodi di ischemia. A livello del torrente sanguigno, quel che i
merozoiti fanno è ovviamente attaccarsi ai globuli rossi per entrarvi, infettarli e poi fuoriuscirne ed andare
ad infettare altre emazie. Inizialmente i merozoiti si attaccano in maniera non orientata , a caso, e solo
successivamente c’è l’orientamento, mediante il conoide, la parte appuntita, che cerca di penetrare nel
globulo rosso. Inoltre possiamo osservare, associati al complesso apicale, i rhoptries e i micronemi, che
sono dei sacchettini che scaricano i loro succhi (probabilmente similari agli enzimi lisosomiali) all’interno del
globulo rosso. In seguito a ciò si ha la formazione all’interno del globulo rosso del vacuolo parassitoforo e la
chiusura della membrana citoplasmatica del globulo rosso come nulla fosse successo. All’interno del
vacuolo i merozoiti si dividono inizialmente mediante scissione binaria e, ciclo asessuato, e si parlerà
dunque di trofozoita. Per essere più specifici, in realtà, dentro il vacuolo ci sarà la maturazione del
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trofozoita ad anello, ossia del “ring”. Esso rappresenta la forma precoce, giovanile del trofozoita.
Eso è caratterizzato da un nucleo lungo e stretto con forma ad anello, ma anche mitocondri, plastidi e
ribosomi. Quando il trofozoita matura, si ha un accorciamento di nucleo, mitocondri e plastidi e potremo
osservare anche due grossi pigmenti di emoglobina, che sarebbero il residuo metabolico del metabolismo
dell’emogoblina.
L’ultima formazione precedente al gametocita è poi lo schizonte: all’interno di ciascun globulo rosso
ciascun trofozoita passati molti giorni sireplica e forma un ammasso di trofozoiti, a volta disordinato a volte
ordinato, che nel suo complesso è costituito fino a 18-30 trofozoiti e che prende il nome di Schizonte.
Infine dopo molto tempo, spesso dopo settimane ma talvolta anche dopo anni, si differenziano nelle forme
sessuate: due elementi totalmente diversi che sono i gametociti maschili e femminili che rimangono nel
sangue e possono essere disponibili per un’altra zanzara che punge la persona portatrice.
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Clinica della malaria terzana benigna da ovale:
Casi rarissimi, quasi inesistenti: risultano essere lo 0,5% dei casi di malaria mondiali all’anno.
La prepatenza dura 15 giorni, l’incubazione ne dura 17.
La parassitemia parte da nove mila e arriva massimo fino ventimila, un numero esiguo rispetto ai due
milioni di emazie parassitarie del falciparum.
Parossismo febbrile è ogni tre giorni perché si parla sempre di una terzana.
Sintomi: corrispondono a quelli della terzana maligna
Clinica della malaria quartana:
La quartana è sempre benigna, l’agente eziologico è il plasmodium malarie.
Prepatenza: dura sedici giorni
Incubazione: 28 giorni e per tale ragione subdola dato che per esempio si torna da un viaggio in Africa
pensando di non aver contratto nulla ma dopo 28 giorni inizia la malattia.
La Parassitemia è bassa: 6.000/20.000
Parossismo febbrile : si verificaogni 72 ore e dato che si contano sia il primo che l’ultimo giorno tale
malaria prende il nome di quartana
I principali sintomi sono il disorientamento e convulsioni ma si verificano anche gli altri sintomi caratteristici
della malaria.
Possono verificarsi recidive anche dopo 10 anni in questo tipo di malaria, anche se un altro caso ancor più
eclatante è quello di vivax che presenta recidive anche dopo 15 anni. Queste lunghissime recidive si
spiegano per la presenza degli ipnozoiti ossia forme dormienti e quindi latenti di plasmodium che sono
presenti nel fegato e che possono essere presenti per 5-10 anni per poi riprendersi.
Falciparum:
-Le emazie del falciparum non sono mai ingrandite rispetto a quelle non parassitarie,
-Le forme ad anello sono fini, delicate, e possono avere più di un nucleo, anche quattro. Caretteristica di
questi anelli è la tricromia: la parte centrale dell’anello è azzurrino-trasparente, la parte che forma l’anello
celeste intenso, e la massa cromatinica, ossia il castone è fucsia;
-Il trofozoita ha una forma irregolare, talvolta con due nuclei e si osserva la presenza dei granuli di Mauer
sparsi nel citoplasma del globulo rosso.
-I gametociti sono a forma di banana
-gli schizonti maturi presentano da diciotto fino a trenta merozoiti.
Vivax:
-Emazie parassitarie molto ingrandite rispetto alle emazie non parassitarie.
-Forma ad anello irregolare
-Sparsi nel citoplasma osserviamo sono granuli molto piccoli, metaboliti dell’emoglobina, detti granuli di
Schüffner.
-Schizonte è anch’esso molto irregolare da 18 gino a a 30 merozoiti.
- I Gametociti maschile e femminile sono molto simili a globuli bianchi e quindi difficili da riconoscere.
Plasmodium malariae:
-Forme ad anello ingrandite, squadrate e compatte, soprattutto forme di bande.
-Schizonti regolari si hanno una caratteristica forma a margherita con 8-10 merozoiti che formano i petali
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della margherita.
I gametociti femminile e maschile assomigliano a globuli bianchi e sono quindi difficilmente distinguibili
Plasmodium Ovale:
-Emazia ingrandita rispetto alla non parassitata e hanno una caratteristica forma a cometa.
-Per quanto riguarda gli schizonti abbiamo schizonti, essi sono composti da 8 10 merozoiti.
-Gametociti maschili e femminili sempre uguali a globuli bianchi.
DIAGNOSI IN LABORATORIO:
La goccia spessa: La prima goccia di sangue si fa cadere, la seconda pure, e la terza si fa cadere sul vetrino.
La goccia sul vetrino viene allargata con l’angolo di un altro vetrino, in maniera tale che la goccia si
“defibrinzzi” e che la coagulazione avvenga in modo tardivo (si allontana il fibrinogeno), in più allargando la
goccia ci sarà un superficie più estesa e uno strato più sottile da leggere.
La goccia spessa deve essere processata in questo modo: si aggiunge il primo colorante, normalmente
eosina, e lo immergiamo nell’eosina ben dieci volte, si lascia cadere l’eccesso (si fa “tapping”) per poi
passarlo nel secondo colorante, nel Giemsa, che è più violento, dove lo immergiamo altre 5 volte. Dopo
aver fatto cadere l’eccesso, la mettiamo nell’acqua distillata, lo facciamo asciugare e lo leggiamo. In
sostanza, nel caso della goccia spessa saltiamo il passaggio dal fissativo, il che provoca l’emolisi massiva e
per tale ragione nella goccia spessa vediamo un marasma grigio azzurrino dove qua e là occhieggiano i
globuli bianchi che non si sono ancora lisati e qualche protozoo se il campione è positivo. Nella goccia
spessa però non possiamo fare diagnosi di specie ma possiamo dire solo se ci sono o no plasmodi malarici.
Per fare diagnosi di specie bisogna allestire lo striscio sottile.
Striscio sottile:
Nel caso dello striscio sottile il processamento avviene in modo diverso perché la prima immersione è nel
fissativo, metanolo, per mantenere integre sia le cellule del sangue che protozoi, e non ci deve essere
emolisi. Se saltiamo il fissativo, come per esempio facciamo nella goccia spesso, provochiamo emolisi
massiva che è fissato e che dopo la dissezione viene immerso nell’eosina, poi nel giemsa, poi nel’acqua
distillata per poi essere osservato al microscopio.
Questo processo ci permette di osservare genere e specie del Plasmodium.
Test di laboratorio: oltre l’emoscopia oggigiorno sono disponibili alcuni test immunocromatografici per la
diagnosi di laboratorio di malaria che prendono il nome di “Immuno capture assay”, che si basano sul
riconoscimento di specifici antigeni dei plasmodi.
I due più sono quelli che identificano l’enzima lattato deidrogenasidel plasmodium (PLDH), oppure una
specifica proteina ricca di istidina(l’Histidine-Rich).
Questi test producono tre bande:
La comparsa della prima banda testimonia che il test è effettuato correttamente.
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La comparsa della seconda banda specifica il genere dell’antigene, quindi plasmodium
E la terza banda è invece specifica per l’antigene di specie, e quindi per esempio il falciparum.
Esistono anche Test di Biologia Molecolare per indentificare diverse specie di plasmodi come la PCR e ma
multiplex PCR che amplificano geni che codificano per RNA identificanti i protozoi.
Terapia malaria:
Per curare la malaria si può utilizzare clorochina se non si è stati infetti di ceppi resistenti.
Nel caso di malaria cerebrale con forme comatose, bisogna utilizzare la chinidina gluconato prestando
attenzione all’ipoglicemia che essa può causare se iniettata endovena.
E’ infatti consigliato passare dalla forma endovena a quella orale appena possibile.
Nel caso di ceppi resistenti si utilizza la tetraciclina che è un antibiotico antibatterico. Si utilizza un
antibatterico perché dentro il merozoita troviamo organuli, quali i mitocondri, che essendo di origine
batterica, vengono degradati dall’antibiotico. Questo antibiotico antibatterico penetra facilmente a livello
endocellulare. La morte non è subitanea perché il mitocondrio è l’organulo deputato al rifornimento
energetico, e quindi la morte si verifica dopo uno due giorni; infine il protozoo viene colpito con un farmaco
antimalarico.
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