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25/09/2019
Applicazioni di S. cerevisiae
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• biotecnologie industriali (processi fermentativi degli alimenti)
• modelli per la ricerca genetica e biologica di base, in quanto possiede geni
ortologhi (geni omologhi che possiedono un comune ancestore presenti in
specie distinte), le cui informazioni ottenute nel lievito, che è un organismo
semplice da manipolare, possono essere trasposte all' uomo.
Una coltura starter che viene utilizzata per un determinato processo per produrre un
certo prodotto, deve possedere un fenotipo desiderato:
• caratteri tecnologici (performance fermentativa)
• caratteri di qualità (aspetti sensoriali, ad esempio dovuti alla produzione di
composti aromatici desiderati per l' alimento)
Nella ricerca della migliore cell factory, si studiano le proprietà della cellula, la lista
dei tratti desiderati e si cercano le informazioni disponibili relative alle basi genetiche
del fenotipo desiderato. Una volta selezionato il set di fenotipi desiderati, si ricerca in
una certa nicchia ecologica un ceppo già selezionato dalla natura e si applicano
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tecniche di miglioramento genetico che possono essere:
• GE : (genetical engineering) nel caso la destinazione d' uso sia medico-
farmaceutica
• non-GE, nel caso in cui la destinazione d' uso sia alimentare
L' utilizzo di un approccio di ingegneria genetica, dipende anche dai determinanti
genici su cui devo agire:
• monogenici (unico gene)
• poligenici
• quantitativi, ossia un certo carattere fenotipico è determinato da un numero
elevatissimo di loci genici, per cui un approccio di ingenegneria genetica non è
l' approccio di elezione, ma si utilizza un approccio casuale (blind).
Il lievito Saccharomyches cervisiae è definito come organismo sicuro per l' utilizzo
umano (GRAS o PTS) sulla base della lunga storia d' uso, che ne comprova la
sicurezza.
(v. leggi su slide).
Un organismo è definito transgenico se possiede, in seguito ad approcci di ingegneria
genetica, del materiale genetico esogeno, ossia proveniente da organismi di specie
diverse, ed è definito organismo OGM.
Se un organismo possiede materiale genetico proveniente da ceppi della stessa specie
o ottenuto mediante delezioni o inserzioni, l' organismo è definito CISgenico e la
normativa al riguardo è ancora confusa (non si sa se definirlo OGM-free).
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un altra cellula aploide.
Al microscopio è possibile osservare sulla parete delle strutture denominate scars, che
sono I punti di distacco tra la cellula madre e la cellula figli, di precedenti divisioni
mitotiche cellulari. Una cellula di lievito generalment va incontro a 40 mitosi prima
di morire.
La dimensione di una cellula di lievito va da 4 a 7 μm.
Il generation time (tempo di generazione) è il tempo necessario alla popolazione
cellulare di raddoppiare il suo numero e per il lievito Saccharomyces cerevisiae è di
90 minuti circa.
Come detto, il lievito è un organismo diplontico, ossia può esistere come organismo
aploide oppure diploide, il che lo rende molto flessibile: il lievito può andare incontro
a sporificazione solamente se è in stato diploide; mentre se non può andare incontro a
sporificazione, questo può trovarsi in stato aploide, oppure può presentare difetti
genetici, oppure ancora può essere in forma di ibrido (un ibrido è un organismo che
possiede materiale genetico proveniente da specie differenti e che è sterile).
PARETE
La parete cellulare nei lieviti è una componente significatica, costituente fino al 30%
del peso secco della cellula in forma vegetativa e con spessore di circa 200 nm nella
cellula vegetativa. A partire dalla parte più interna della parete (più vicina alla
membrana cellulare, intracellulare) verso l' esterno, questa è costituita da glucano
(polimero del glucosio), che è una molecola strutturale planare con legami del tipo
β-1,3 (non presenta contorsioni ed ingombri sterici). Tra una catena di glucano ed una
catena adiacente, vi sono dei cross linker costituiti da legami β-1,6. Verso l' esterno vi
sono molecole di chitina, che è un polimero di N-acetilglucosammina β-1,4 linked.
Nella parte più esterna vi sono le mannoproteine. La chitina può essere presente nella
parete, come:
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• forma libera
• forma legata al glucano β-1,3, come nel collo dove avviene la divisione tra la
cellula madre e la cellula figlia
• forma legata al glucano β-1,6
La chitina aumenta quando I lieviti fanno mating, in risposta a concentrazioni di
feromoni.
Le mannoproteine sono proteine glicosilate con residui di mannosio in
corrispondenza di asparagina (link N) oppure di serina e treonina (link O).
Queste possono essere enzimi idrolasi, che scindono gli zuccheri situati all' esterno
della cellula, oppure che mediano l' agglutinazione di cellule di lievito mediante
formazione di interazioni non covalenti, oppure possono essere proteine del quorum
sensing, che fungono da sensori di stress esterni e mediano risposte della cellula a
breve termine (chiusura pori di membrana), oppure a medio/lungo termine, quali
modifiche del trascrittoma.
La cella di lievito che va incontro a meiosi e sporificazione, forma una struttura detta
asco, che è la cella madre che funge da sacco. Le pareti delle spore vanno incontro a
modificazioni, che la rendono una forma di resistenza agli stress ambientali.
La parete della spora, presenta una organizzazione invertita rispetto a quella della
cellula di lievito in forma vegetativa, in cui a partire dal lato più interno a quello più
esterno, si incontrano rispettivamente le mannoproteine, il glucano, I cross linker fino
al chitosano (a differenza della chitina della parete, di cui costituisce una variazione,
possiede glucosammina e non N acetil-glucosammina). Nella parte più esterna vi
sono dimeri di tirosina, la cui funzione non è ancora nota.
DNA
Le proteine nei lieviti sono sintetizzate da poliribosomi situati sulla superficie del
reticolo endoplasmatico. Una volta sintetizzate, queste sono trasportate all' interno
dell' RE dove vanno incontro a modificazioni post-traduzionali, quali glicosilazione,
folding mediato da chaperon, trimming. Queste passano poi mediante vescicole all'
apparato di Golgi dove subiscono ulteriori modificazioni post-traduzionali, quali
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mannosilazione e altre modificazioni con carboidrati.
Le proteine dall' apparato di Golgi, sulla base di peptidi segnale, che si trovano sulla
proteina, possono essere diretti ai vacuoli; alla cellula figlia, attraversando I punti di
gemmazione, mediante veicolazione su actina; alla membrana plasmatica; secrete all'
esterno della cellula. Ad esempio il peptide del feromone, che è destinato ad essere
secreto, possiede un peptide segnale, che se aggiunto a qualsiasi peptide, ne media l'
uscita dalla cellula.
PEROSSISOMI
METABOLISMO
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in presenza di ossigeno e di concentrazione di zucchero oltre una certa sogli
(per S.cerevisia è di 150 mg/l), si ha fermentazione. Questo è stato dimostrato
sperimentalmente sia in chemostato che in bach
• CRABTREE NEGATIVO, produce biomassa e anidride carbonica, ma non
etanolo
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Successo evolutivo dei lieviti
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acetaldeide ed è attivata nello shift diauxico
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binding cassets, ossia sistemi che usano l' ATP per entrare nei
perossisomi). La degradazione degli acidi grassi avviene 2 atomi di
carbonio alla volta.
La via dei pentosi fosfato, è sia una via catabolica che anabolica e produce
potere riducente come NADPH mediante l' utilizzo dei pentosi.
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Nei lieviti, a differenza degli organismi eucarioti superiori, non vi sono
interi cromosomi che regolano la sesssualità, ma loci genici, detti loci di
mating, che regolano la capacità della cellula di fae singamia.
04/10/19
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Nell' outcrossing, sono coinvolti 2 individui che originano gameti distinti e
si ha mating tra un gamete di un individuo ed un gamete di un altro.
09/10/19
Loci MAT
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meiosi.
• Spegne il gene α1
• reprime il gene Axl1
• spegne Flo 11, gene codificante per una flocculina (agglutinina), che
è una mannoproteina coinvolta nella capacità delle cellule di aderire
tra loro, generando biofilm. Questo è responsabile della crescita
filamentosa delle cellule aploidi, che è detto fenotipo “invasivo”, in
quanto è in grado di penetrare all' interno dell' agar, ed in certi tipi di
lieviti patogeni è responsabile della virulenza. Nelle cellule diploidi,
in starvation da azoto, l' adesione non è mediata da Flo11, ma da
adesine. Flo11 è attivo solo nelle cellule diploidi.
• reprime il repressore della meiosi RME1, attivando così la meiosi.
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11/10/19
L' evento scatenante dello switching del mating type è il taglio a doppio
filamento del DNA da parte dell' endonucleasi HO. Nel caso dell'
aploselfing l' endonucleasi HO è attiva solo nella cellula madre e permette
di effettuare lo switching del mating type, in modo da avere un locus MAT
opposto a quello della cellula figlia, che gli permette di fare mating.
L' evendo di taglio a doppio filamento del DNA da parte dell' endonucleasi
HO deve essere finemente regolato, altrimento questo porterebbe a tagli a
doppio filamento casuali non specifici, con danni alla cellula.
Il locus MAT è più grande dell' ORF (geni effettivamente codificanti la
proteina a o α), in quanto si ha la presenza di sequenze geniche non
codificanti (v.slide 72). La porzione codificante viene definita Y:
• Yα è la porzione codificante α1 e α2
• Ya è la porzione codificante a
Al 3' di Y, si ha la sequenza X di circa 700 bp; al 5' di Y si ha la sequenza
Z di circa 300 bp.
Queste regioni sono sempre presenti in tutti I loci MAT, sia quelli silenti
(HML presente nel braccio sinistro e HMR presente nel braccio destro),
che quelli codificanti. Queste regioni che sono identiche nei vari loci sono
responsabili di guidare il processo di gene conversion.
Il sito che viene riconosciuto dalla endonucleasi HO è molto conservato e
possiede la sequenza (CGCAAC). La caratterizzazione dei loci MAT è
molto complicata ed è necessario ricorrere ad un approccio di tipo
strutturale, valutando l' intorno del locus. Si deve notare che una piccola
porzione del gene α1 si sovrappone alla porzione Z ed una piccola
porzione del gene α2 si sovrappone alla regione X. Ne deriva che se voglio
fare una PCR per selezionare uno dei 3 geni Y, non devo utilizzare come
primer le sequenze X o Z, in quanto duplicherebbero tutti e tre I geni (le
regioni X e Z sono identiche), ma è necessario utilizzare delle regioni
fiancheggianti X o Z. In S, cerevisiae I geni fiancheggianti la cassetta
centrale codificante, sono TAF2 e BUD5.
Il gene che codifica per l' endonucleasi HO non è localizzata sul
cromosoma 3, ma su un altro cromosoma.
Il sito di riconoscimento per HO è localizzato sulla porzione Z e si ha una
rottura del DNA a double strands.
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Questo evento promuove il reclutamento sul filamento di esonucleasi che
generano delle porzioni di DNA a singolo filamento. In seguito Rad 51
(elemento trans) si lega al frammento di DNA a singolo filamento ed
ingaggia la ricerca della sequenza omologa codificante per il gene del
locus complementare (es il gene MAT a viene degradato e sostituito con il
gene complementare normalmente silente Yα nel locus HMLα e
viceversa). Gli elementi cis sono le sequenze X e Z. Questo promuove la
copia e la sintesi di un nuovo filamento.
Come detto una attività non regolata di HO, può generare instabilità
genetica e quindi questo evento è fortemente regolato.
Nelle cellule diploidi, in cui non si ha switching del mating type, l'
espressione dell' endonucleasi HO è inattivata dal complesso α1-a.
Inoltre il controllo di HO è determinato anche dalla identità sessuale della
cellula aploide, che può essere o a o α.
Inoltre è necessario che vi sia una regolazione dell' espressione di HO
anche tra cellula aploide madre o figlia: l' endonucleasi HO è attiva
solamente nelle cellule in cui è attivata la mitosi e ha subito almeno un
ciclo mitotico. Vi è un livello di controllo di HO legato al ciclo cellulare,
in quanto HO è espresso solamente nelle cellule in tarda fase G1.
I geni HML e HMR sono inattivati dalla eterocromatina in quanto se
attivati, potrebbero determinare una disregolazione della identità cellulare.
In S. cerevisiae ci sono 3 Kb attorno ad HML e HMR, che sono elementi
in cis ed in trans extra HML ed extra HMR, che reclutano I nucleosomi e si
compattano, rendendo la regione inattiva, al contrario dell' intorno di MAT.
HMR possiede 2 elementi cis, HMR-I (important) ed HMR-E (essential),
in cui HMR-E è essenziale per il silenziamento di HMR, mentre HMR-I,
se rimosso, ma HMR-E è presente, si ha comunque silenziamento, mentre
se HMR-E è assente, non si ha eterocromatina.
Le regioni E ed I sono presenti anche nell' intorno di HML, ma non si ha
distinzione tra regione essenziale ed importante.
Gli elementi trans coinvolti nel silenziamento sono: istoni, proteine sir e
proteine orc, che si legano all' origine di replicazione di un cromosoma
eucariotico e si legano agli elementi E, reclutano Sir1, che catalizza il
reclutamento di Sir2-Sir3 e Sir4. La Sir 2 è una deacetilasi ed è
responsabile del grosso dell' azione, che deacetila le lisine degli istoni nelle
regioni N-terminali di H3 e H4, permettendo il legame di Sir3-Sir4 e la
stabilizzazione del nucleosoma.
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A cascata si formano I successivi complessi e ciò diffonde lo stato
eterocromatinico lungo il DNA. Nei pressi di MATa non si ha la regione E
e non può attivarsi questo processo. Lo stato eterocromatinico delle
cassette laterali, genera un ingombro sterico, che impedisce l' accesso al
sito di taglio di HO.
Ricorda che lo switch del mating type, avviene per sostituzione del Locus
MAT, con il locus complementare e quindi la sostituzione deve essere
specifica. Ciò che determina la preferenza per un donatore sono:
• elementi cis: regione RE
• elementi trans, ossia I fattori trascrizionali SWI 4 e SWI 6 e le fork
head protein.
La regione RE (250 bp, composta da vari moduli trutturali, descritti con le
lettere dell' alfabeto) è un elemento che agisce in cis sul cromosoma 3,
vicino ad HML. La preferenza del donatore dipende dalla attivazione di
RE, che controlla la ricombinazione a livello del braccio sinistro del
cromosoma 3. Se la regione RE non è attivata, HMR è utilizzato come
donatore preferenziale. La regione C lega il complesso Mcm1-α2.
Nelle cellule α, il complesso Mcm1-α2 inibisce l' attacco delle fork head
proteins, portando alla inattivazione di RE: HML non verrà mai sceto, ma
verrà scelto HMR.
I ceppi eterotallici, non in grado di fare aploselfing, possiedono una
variante non funzionale di HO, detta ho.
Nella ibridizzazione, ciò che influenza la resa degli ibridi, oltre all'
incognita dovuto al fatto che è necessario utilizzare cellule di segno
opposto, ho che la cellula diploide originario poteva essere eterozigote per
HO (HO-ho). Le cellule aploidi risultanti possono presentare geni HO
oppure ho. Una cellula diploide omozigote per ho, non può fare
aploselfing, in quanto non può fare lo switching del mating type. Un ceppo
omotallico contenente un gene HO, può fare sia aploselfing che
outcrossing e ciò abbassa la resa di ibridizzazione.
Se il ceppo è eterozigote per HO (HO-ho) 2 gameti su 4 ereditano ho e non
possono effettuare aploselfing, tuttavia possono coniugare con una cellula
di segno opposto.
Se una cellula aploide (spora) germina più velocemente di un altra, vuol
dire che questa non risente del feromone generato dall' altra cellula.
Quindi anche la velocità di germinazione influenza la resa di
ibridizzazione.
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