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MIGLIORAMENTO GENETICO DEI LIEVITI

Docente: Lisa Solieri

25/09/2019

Nell' industria alimentare in cui si utilizzano processi ferementativi, è necessario


utilizzare colture starter. Si è sviluppata la necessità di creare banche dati, in cui le
collezioni microbiologiche sono caratterizzate da informazioni relative al ceppo ed il
ceppo stesso.
La specie del microorganismo (lievito o batterio), viene caratterizzata mediante indizi
ottenuti con tecniche diverse (biochimiche e biologia molecolare), in modo da
ottenere il sequenziamento dei marcatori filogenetici ed I caratteri fenotipici.
I microorganismi utilizzati nelle colture di interesse industriale per fermentazioni
alimentari, sono:
• LIEVITI (eucarioti; DOMINIO: eucaria)
• BATTERI LATTICI (procarioti, quali batteri lattici utilizzati nell' industria
casearia e probiotici)
• BATTERI ACETICI (procarioti)
I lieviti sono organismi unicellulari eucarioti appartenenti ai funghi, ma che si
differenziano da questi, in quanto durante la riproduzione sessuale (meiosi) NON
danno corpi fruttiferi, ma I gameti sono contenuti in una struttura detta asco. Durante
la divisione cellulare mitotica, I lieviti si possono dividere per:
• gemmazione, in cui la cellula figlia è più piccola rispetto alla cellula madre
(budding yeast, quale Saccharomyces)
• o per scissione binaria (fission yeast, quale Schizosaccharomyces).
Quindi I lieviti presentano diversi fenotipi, risultanti dalla interazione tra genotipo ed
ambiente (pseudo ifa, mitosi, meiosi).
Le specie di lieviti utilizzate nelle fermentazioni alimentari, prendono il nome di
Saccharomyces sensu strictu.

(V. tassonomia slide 4, prima dispensa).


(V. storia dispense)
(Pichia pastoris ora si chiama Komagaetella pastoris)

Applicazioni di S. cerevisiae

• biotecnologie industriali (cell factory necessarie per la produzione di beni di


interesse commerciale: ad esempio espressione eterologa di proteine (es
insulina di interesse terapeutico) e di enzimi)

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• biotecnologie industriali (processi fermentativi degli alimenti)
• modelli per la ricerca genetica e biologica di base, in quanto possiede geni
ortologhi (geni omologhi che possiedono un comune ancestore presenti in
specie distinte), le cui informazioni ottenute nel lievito, che è un organismo
semplice da manipolare, possono essere trasposte all' uomo.

Il S. cerevisiae permette, partendo da substrati zuccherini ottenuti dagli scarti di


industrie, di ottenere metaboliti primari (ad esempio bioetanolo, metaboliti secondari
(ad esempio acido succinico), espressione eterologa di proteine e biotrasformazioni in
vivo.
(I lieviti non Saccharomyces utilizzati nelle biotecnologie industriali, prendono il
nome di non conventional yeast).
Per bioprocesso si intende la bioconversione di un substrato nel prodotto desiderato
in condizioni anaerobiche, ossia mediante fermentazione (senza respirazione).
Le fermentazioni utilizzate sono:
• fermetazione alcolica
• fermentazione acido lattica
• fermentazione malo-lattica (vini rossi).

La coltura starter è la coltura che si associa ad un processo fermentativo ed è una


preparazione microbica di un gran numero di cellule.
L' obbiettivo di una coltura starter è di rendere il processo fermentativo EFFICIENTE
e VELOCE.
Il processo di selezione di colture microbiche che soddisfino queste esigenze, è un
processo sequenziale:
• selezione di un aliquota di coltura di un processo fermentativo che casualmente
è avvenuto con successo e utilizzo in altri processi fermentativi (ad esempio
impasti acidi), che è ancora una coltura complessa di lieviti e batteri lattici.
• Dopo successive selezione si ottiene una coltura starter.
• Coltura starter funzionale, ossia una coltura che conferisce al prodotto finale
delle caratteristiche aggiuntive e funzionali salutistiche (ad esempio vengono
utilizzati batteri lattici che fermentano e producono peptidi antiipertensivi).

Una coltura starter che viene utilizzata per un determinato processo per produrre un
certo prodotto, deve possedere un fenotipo desiderato:
• caratteri tecnologici (performance fermentativa)
• caratteri di qualità (aspetti sensoriali, ad esempio dovuti alla produzione di
composti aromatici desiderati per l' alimento)
Nella ricerca della migliore cell factory, si studiano le proprietà della cellula, la lista
dei tratti desiderati e si cercano le informazioni disponibili relative alle basi genetiche
del fenotipo desiderato. Una volta selezionato il set di fenotipi desiderati, si ricerca in
una certa nicchia ecologica un ceppo già selezionato dalla natura e si applicano

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tecniche di miglioramento genetico che possono essere:
• GE : (genetical engineering) nel caso la destinazione d' uso sia medico-
farmaceutica
• non-GE, nel caso in cui la destinazione d' uso sia alimentare
L' utilizzo di un approccio di ingegneria genetica, dipende anche dai determinanti
genici su cui devo agire:
• monogenici (unico gene)
• poligenici
• quantitativi, ossia un certo carattere fenotipico è determinato da un numero
elevatissimo di loci genici, per cui un approccio di ingenegneria genetica non è
l' approccio di elezione, ma si utilizza un approccio casuale (blind).

Il lievito Saccharomyches cervisiae è definito come organismo sicuro per l' utilizzo
umano (GRAS o PTS) sulla base della lunga storia d' uso, che ne comprova la
sicurezza.
(v. leggi su slide).
Un organismo è definito transgenico se possiede, in seguito ad approcci di ingegneria
genetica, del materiale genetico esogeno, ossia proveniente da organismi di specie
diverse, ed è definito organismo OGM.
Se un organismo possiede materiale genetico proveniente da ceppi della stessa specie
o ottenuto mediante delezioni o inserzioni, l' organismo è definito CISgenico e la
normativa al riguardo è ancora confusa (non si sa se definirlo OGM-free).

27/09/19

Struttura dei lieviti

I lieviti sono organismi eucarioti unicellulari eterotrofi, con richieste nutrizionali


semplici. A seconda delle condizioni ambientali, I lieviti possono andare incontro a
differenziamento cellulare:
• stato ANAMORFO, in cui I lieviti non vanno incontro a riproduzione sessuale,
ma si dividono per mitosi.
• Stato TELEOMORFO in cui I lieviti vanno incontro a divisione cellulare
sessuale per meiosi e successiva sporificazione in seguito a stress esterno
(carenza di zuccheri). Le spore sono contenute in una struttura detta asco e
circondate da un involucro coriaceo che gli permette di soppravvivere agli
stress ambientali. La struttura che si osserva, costituita da 4 spore contenute
nell' asco, è detta tetrade.
• Strutture multicellulari, dette pseudoife, in cui più cellule di lievito che fanno
budding, sono unite tra di loro a formare strutture lineari oppure ramificate.
• Shmoo: è una sorta di ponte coniugativo, che si forma quando le cellule
formano ibridi e quindi serve a fare la coniugazione tra una cellula aploide ed

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un altra cellula aploide.
Al microscopio è possibile osservare sulla parete delle strutture denominate scars, che
sono I punti di distacco tra la cellula madre e la cellula figli, di precedenti divisioni
mitotiche cellulari. Una cellula di lievito generalment va incontro a 40 mitosi prima
di morire.
La dimensione di una cellula di lievito va da 4 a 7 μm.
Il generation time (tempo di generazione) è il tempo necessario alla popolazione
cellulare di raddoppiare il suo numero e per il lievito Saccharomyces cerevisiae è di
90 minuti circa.
Come detto, il lievito è un organismo diplontico, ossia può esistere come organismo
aploide oppure diploide, il che lo rende molto flessibile: il lievito può andare incontro
a sporificazione solamente se è in stato diploide; mentre se non può andare incontro a
sporificazione, questo può trovarsi in stato aploide, oppure può presentare difetti
genetici, oppure ancora può essere in forma di ibrido (un ibrido è un organismo che
possiede materiale genetico proveniente da specie differenti e che è sterile).

Struttura della cellula di lievito

La cellula di lievito, che è un organismo eucariote unicellulare, possiede le seguenti


strutture:
• PARETE
• MITOCONDRI (a differenza di altri organismi eucarioti, nei lieviti, non sono
la sede della β-ossidazione degli acidi grassi, che avviene esclusivamente nei
perossisomi)
• NUCLEO contenente il materiale genetico, costituito da 12 Megabasi di DNA
organizzato in 6000 geni suddivisi in 16 cromosomi nella forma aploide. Il
genoma del lievito è molto compatto, contenente pochi introni e poche regioni
intergeniche, caratteristiche che lo hanno reso il candidato ideale come primo
microrganismo il cui DNA è stato completamente sequenziato.

PARETE

La parete cellulare nei lieviti è una componente significatica, costituente fino al 30%
del peso secco della cellula in forma vegetativa e con spessore di circa 200 nm nella
cellula vegetativa. A partire dalla parte più interna della parete (più vicina alla
membrana cellulare, intracellulare) verso l' esterno, questa è costituita da glucano
(polimero del glucosio), che è una molecola strutturale planare con legami del tipo
β-1,3 (non presenta contorsioni ed ingombri sterici). Tra una catena di glucano ed una
catena adiacente, vi sono dei cross linker costituiti da legami β-1,6. Verso l' esterno vi
sono molecole di chitina, che è un polimero di N-acetilglucosammina β-1,4 linked.
Nella parte più esterna vi sono le mannoproteine. La chitina può essere presente nella
parete, come:

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• forma libera
• forma legata al glucano β-1,3, come nel collo dove avviene la divisione tra la
cellula madre e la cellula figlia
• forma legata al glucano β-1,6
La chitina aumenta quando I lieviti fanno mating, in risposta a concentrazioni di
feromoni.
Le mannoproteine sono proteine glicosilate con residui di mannosio in
corrispondenza di asparagina (link N) oppure di serina e treonina (link O).
Queste possono essere enzimi idrolasi, che scindono gli zuccheri situati all' esterno
della cellula, oppure che mediano l' agglutinazione di cellule di lievito mediante
formazione di interazioni non covalenti, oppure possono essere proteine del quorum
sensing, che fungono da sensori di stress esterni e mediano risposte della cellula a
breve termine (chiusura pori di membrana), oppure a medio/lungo termine, quali
modifiche del trascrittoma.
La cella di lievito che va incontro a meiosi e sporificazione, forma una struttura detta
asco, che è la cella madre che funge da sacco. Le pareti delle spore vanno incontro a
modificazioni, che la rendono una forma di resistenza agli stress ambientali.
La parete della spora, presenta una organizzazione invertita rispetto a quella della
cellula di lievito in forma vegetativa, in cui a partire dal lato più interno a quello più
esterno, si incontrano rispettivamente le mannoproteine, il glucano, I cross linker fino
al chitosano (a differenza della chitina della parete, di cui costituisce una variazione,
possiede glucosammina e non N acetil-glucosammina). Nella parte più esterna vi
sono dimeri di tirosina, la cui funzione non è ancora nota.

DNA

Il DNA della cellula di lievito è suddiviso in:


• DNA MITOCONDRIALE
• DNA CROMOSOMICO PRESENTE NEL NUCLEO
• DNA PLASMIDICO EXTRACROMOSOMICO (ORI di 2 μ)
• RETROTRASPOSONI Ty
• ELEMENTI EXTRACROMOSOMICI contenenti geni killer, che producono
tossine killer attive contro lieviti non convenzionali e che sono forme non
stabili.

SISTEMA SECRETORIO E VACUOLI

Le proteine nei lieviti sono sintetizzate da poliribosomi situati sulla superficie del
reticolo endoplasmatico. Una volta sintetizzate, queste sono trasportate all' interno
dell' RE dove vanno incontro a modificazioni post-traduzionali, quali glicosilazione,
folding mediato da chaperon, trimming. Queste passano poi mediante vescicole all'
apparato di Golgi dove subiscono ulteriori modificazioni post-traduzionali, quali

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mannosilazione e altre modificazioni con carboidrati.
Le proteine dall' apparato di Golgi, sulla base di peptidi segnale, che si trovano sulla
proteina, possono essere diretti ai vacuoli; alla cellula figlia, attraversando I punti di
gemmazione, mediante veicolazione su actina; alla membrana plasmatica; secrete all'
esterno della cellula. Ad esempio il peptide del feromone, che è destinato ad essere
secreto, possiede un peptide segnale, che se aggiunto a qualsiasi peptide, ne media l'
uscita dalla cellula.

PEROSSISOMI

I lieviti crescono in presenza di ossigeno: nei perossisomi avviene la sintesi di specie


reattive dell' ossigeno (ROS) e la loro inattivazione, mediante gli enzimi
detossificanti catalasi e glutatione perossidasi. I lieviti risultano positivi alla reazione
della catalasi, per cui se viene aggiunta una goccia di acqua ossigenata (perossido di
idrogeno), si ha la formazione di bolle. I perossisomi sono anche sede del
metabolismo primario di fonti di carbonio inusuali, quali metanolo, come in Pichia
pastoris e della β-ossidazione degli acidi grassi e del ciclo dell' acido glioxidico.

METABOLISMO

Catabolismo degli zuccheri: I carboidrati possono entrare nella cellula in 2 forme:


• le idrolasi extracellulari scindono I disaccaridi all' esterno della cellula ed I
monomeri entrano nella cellula mediante I trasportatori degli esosi
• Oppure possono entrare come disaccaridi, che vengono poi scissi in
monosaccaridi dalle idrolasi intracellulari.
Ne segue la glicolisi, che genera il piruvato, questo può subire 2 destini differenti:
• entrare nel ciclo di Krebs, mediante l' azione della piruvato deidrogenasi, che
avviene nei mitocondri (resa netta 36 molecole di ATP)
• subire una fermentazione alcolica, in seguito alla conversione del piruvato
medinate la piruvato decarbossilasi (resa netta 2 molecole di ATP)
La regolazione del passaggio del piruvato alle 2 vie, è mediato da:
• concentrazione degli zuccheri
• concentrazione di ossigeno
Il lievito S.cerevisiae, a differenza di altri lieviti, è un organismo fermentativo
facoltativo (anaerobio facoltativo).
Un organismo aerobio obbligato, in presenza adi ossigeno, consuma zuccheri,
produce biomassa, ma NON produce etanolo.
Un organismo anaerobio facoltativo, consuma zuccheri, produce biomassa e produce
etanolo.
Un microorganismo ferementatore facoltativo, sulla base del suo comportamento in
risposta alla presenza di zuccheri, si può distinguere in:
• CRABTREE POSITIVO (è un carattere di specie), come S. cerevisiae, in cui

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in presenza di ossigeno e di concentrazione di zucchero oltre una certa sogli
(per S.cerevisia è di 150 mg/l), si ha fermentazione. Questo è stato dimostrato
sperimentalmente sia in chemostato che in bach
• CRABTREE NEGATIVO, produce biomassa e anidride carbonica, ma non
etanolo

Quindi un organismo CRABTREE POSITIVO, in presenza di concentrazioni di


zuccchero sotto la concentrazione threshold, consuma ossigeno, tanto quanto rilascia
anidrode carbonica (RESPIRA). Veros la concentrazione soglia, il consumo di
ossigeno rimane stabile, ma aumenta il rilascio di anidride carbonica (FERMENTA).
Per concentrazioni zuccherine sopra la soglia, il consumo di ossigeno rimane stabile,
ma la concentrazione di anidride carbonica rilasciata sale a picco (FERMENTA).

02/10/19
Successo evolutivo dei lieviti

L' evoluzione di Saccaromyces cerevisiae risale a 100 milioni di anni fa,


con lo sviluppo contemporaneo delle piante da fiore e da frutto. La
spiegazione del comportamento crabtree positivo del lievito S. cerevisie si
deve al vantaggio evolutivo che esso rappresenta.

Ipotesi “Make-accumulate-consume (MAC)”

Secondo l' ipotesi MAC, una presenza anche minoritaria di lieviti in


substrati zuccherini in cui si ha la presenza di microorganismi competitori,
porta alla conquista della nicchia ecologica del lievito sui competitori. Il
lievito è in grado di produrre alcol rapidamente e con alta efficienza,
inibendo lo sviluppo di lieviti e batteri apiculati competitori.
In seguito alla diminuzione del livello di glucosio, dovuto al suo consumo,
le cellule diventano derepresse e subiscono una fase stazionaria, in cui si
ha la sintesi di enzimi necessari all' ossidazione dell' etanolo
precedentemente prodotto (shift diauxico).
Saccaromyces cerevisiae possiede 2 geni paraloghi, ossia geni omologhi
presenti nella stessa specie, generati da eventi di duplicazione genica.
Questi 2 geni codificano per 2 enzimi:
• Adh1, che è l' enzima che converte l' acetaldeide in etanolo. Questo è
costitutivamente attivo ed ha una kM elevata per l' etanolo.
• Adh2, è un gene silente, che possiede una kM elevata per l'

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acetaldeide ed è attivata nello shift diauxico

Rate/yield trade-off hypothesis (RYT)

Secondo questa ipotesi per un organismo è necessario raggiungere un


compromesso tra resa (yield), ossia il rapporto tra ATP prodotto e substrato
utilizzato e velocità (rate), ossia l' ATP prodotto nell' unità di tempo.
Il compromesso è determinato dal fatto che la respirazione ha costi e
vincoli strutturali, ad esempio I sistemi di membrane mitocondriali,
rappresentano spazi limitati (bottleneck)..
Quindi il lievito, nella condizione di una concentrazione di zucchero
elevata, che portava a saturazione dei processi della respirazione,
“poteva andare incontro a 2 scelte”:
• o attivare processi fermentativi (crabtree positivo)
• o aspettare che il sistema si sgolfi (crabtree negativi)

Nella condizione di pressione selettiva, dovuto alla presenza di altri


microorganismi competitori per lo stesso substrato, la strategia di
attivazione dei processi fermentativi, che sono processi a bassa resa, ma
che comunque sottraggono substrati ai competitors, rappresentava un
evidente vantaggio evolutivo.
(V. metabolismo). L' acetoino ed il diacetile conferiscono un carattere
rancido indesiderato nei processi fermentativi alimentari. Una strategia è
spingere questi elementi alla loro interconversione in 2,3 butandiolo, che è
un prodotto inerte.
Il piruvato e l' α-acetolattato costituiscono lo scheletro carbonioso
necessario alla sintesi degli amminoacidi.
Oltre al' etanolo, vi sono altri prodotti della fermentazione alcolica, ossia
gli alcoli superiori, in cui il numero di atomi di carbonio è superiore a 2 e
che presentano un peso molecolare maggiore ed un punto di ebollizione
più elevato (ad esempio alcol aromatici, derivano dalla fenilalanina).
(V. Erlich pathway).
La β-ossidazione ed il ciclo dell' acido glioxilico avvengono nei
perossisomi. Anche il consumo di elementi carboniosi inusuali in alcuni
microorganismi, quale il metanolo, avviene nei perossisomi. Il ciclo dell'
acido glioxilico coinvolge degli enzimi del ciclo di Krebs.
Gli acidi grassi entrano nei perossisiomi mediante sistemi ABC (ATP

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binding cassets, ossia sistemi che usano l' ATP per entrare nei
perossisomi). La degradazione degli acidi grassi avviene 2 atomi di
carbonio alla volta.
La via dei pentosi fosfato, è sia una via catabolica che anabolica e produce
potere riducente come NADPH mediante l' utilizzo dei pentosi.

Ciclo vitale dei lieviti

I lieviti sono organismi eucarioti unicellulari appartenenti ai funghi, che


possono andare incontro a riproduzione non sessuale di tipo vegetativo e
riproduzione sessuale, ossia mediante l' incontro di 2 aplotipi con diverso
materiale genico, ottenuti mediante meiosi e singamia (mating).
I lieviti possiedono dei determinanti genici della sessualità della cellula.
Questi determinano la trasmission alla progenia del materiale genetico.
Il processo di singamia avviene per:
• haploid selfing: ossia un processo di singamia tra individui (gameti)
identici (cloni)
• diploid selfing: ossia singamia tra prodotti diversi della singola
meiosi o prodotti di meiosi diversi nello stesso individuo
(inbreeding)
• outcrossing: ossia 2 individui diversi che fanno 2 meiosi ed il
prodotto delle 2 meiosi fanno singamia (ibridizzazione)
I lieviti detti omotallici, fanno tutti e 3 questi processi.
I lieviti eterotallici, compiono solamente alcune di queste.
I lieviti compiono diversi tipi di divisione a seconda che il lievito si trovi
in forma aploide o diploide:
• aploide: budding assiale, ossia la cellula figlia si genera accanto alla
scar di nascita. La nuova cellula madre fa la seguente gemmazione
accanto alla scar di nascita. Il pattern risultante è di tipo assiale e
questo favorisce il mating, che può essere fatto solo da cellule
aploidi.
• Diploide: budding bipolare, ossia la cellula figlia gemma in
posizione distale rispetto alla cicatrice di nascita. La nuova cellula
può fare la successiva divisione o in posizione prossimale o distale.
Questa conformazione non favorisce il mating, ch non può avvenire
tra cellule diploidi.

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Nei lieviti, a differenza degli organismi eucarioti superiori, non vi sono
interi cromosomi che regolano la sesssualità, ma loci genici, detti loci di
mating, che regolano la capacità della cellula di fae singamia.

04/10/19

Il budding può avvenire sia nelle cellule aploidi che diploidi.


• Le cellule aploidi a e α presentano un pattern di budding assiale,
ossia la cellula madre bud nell' immediata vicinanza dell' ultima
cellula figlia e la cellula figlia bud verso la sua cellula madre
• le cellule diploidi, presentano un pattern di budding bipolare , in cui
la cellula madre può fare budding ad uno dei poli o nella sua
vicinanza e la cellula figlia bud distante dalla madre.
Il budding bipolare favorisce l' espansione della colonia in caso di
condizioni limitanti di nutrienti, favorendo la ricerca di nutrienti.
Le proteine essenziali per il budding assiale sono geni aploidi, che sono
spenti nelle cellule diploidi. Le proteine essenziali per il budding bipolare,
sono caratteristiche per le cellule diploidi. Vi sono poi proteine essenziali
per entrambe le crescite.
Vi sono proteine che veicolano le proteine citoscheletriche verso il sito
assiale di budding, queste sono: Axl1 e Bud3,4,5 e 10. Senza di queste lo
sviluppo del budding in cellule aploidi è di tipo bipolare.
Vi sono proteine che regolano il budding bipolare che veicolano le proteine
in posizione distale nelle cellule diploidi.
Vi sono proteine essenziali per entrambi I processi di budding, quale
CDC42, che si accumulano nel punto di budding e fanno si che si
accumulino le septine ed I filamenti di actina.
I geni che determinano l' identità sessuale della cellula sono I geni MAT,
che determinano il tipo di budding, assiale o bipolare e quindi una
divisione di tipo aploide o diploide (quindi non mating competente).
Aploid selfing: si ha un processo di mitosi di una cellula aploide, seguito
da successiva singamia tra I 2 aplotipi identici ottenuti.
Diploid selfing: ossia singamia tra 2 gameti diversi ottenuti da 2 eventi
differenti della stessa meiosi o tra 2 eventi meiotici indipendenti nello
stesso individuo. Si può avere singamia all' interno dello stesso asco
(automixing intratetrade), oppure intertetrade quindi tra gameti
leggermente diversi (anfimixing).

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Nell' outcrossing, sono coinvolti 2 individui che originano gameti distinti e
si ha mating tra un gamete di un individuo ed un gamete di un altro.

09/10/19
Loci MAT

I loci MAT che caratterizzano la sessualità dei lieviti, sono fattori


trascrizionali di 2 tipi: MAT a e MATα.
Nei lieviti, al contrario degli organismi eucarioti superiori, non vi sono
interi cromosomi che caratterizzano la sessualità, ma loci MAT che sono
localizzati sul cromosoma 3, in posizione vicina al centromero.
Nelle diploidi vi è locus MATα ed un locus MATa, presenti sulle 2 copie di
cromosomi 3 omologhi.
Negli organismi aploidi, si ha solo un cromosoma 3 che codifica o per il
locus MATα o per il locus MATa.
• Il locus MATa contiene 1 gene, che viene trascritto in direzione 5'-3'
• il locus MATα contiene 2 geni: MATα 1 e MATα 2, che vengono
trascritti in direzione opposta e sono separati da una regione
intergenica, che contiene I 2 promotori dei 2 geni.
L' identità a, determinata dal locus MATa è in default, ciò significa che l'
assenza dei geni α è sufficiente a determinare un fenotipo a.
MATα1 è un regolatore positivo, ossia un fattore trascrizionale attivatore
dei geni α specifici. Al contrario il gene MATα2 codifica per un repressore,
in grado di spegnere I geni a-specifici.
Nelle cellule aploidi vi è una proteina costitutivamente attiva, chiamata
MCM1. Quando l' attivatore trascrizionale MAT α1 si lega con la proteina
MCM1, questo complesso attiva I geni α specifici. Quando il fattore
trascrizionale con funzione di repressore α2 viene espresso, questo si lega
com MCM1 e spegne I geni a-specifici. L' eterodimero α1-α2 è in grado di
spegnere I geni α1, che bloccano il budding assiale e portano al
commitment verso la meiosi.
Il complesso MCM1-STE12, attiva I geni a .
Il complesso α2-a:
• attiva IME4, che è un gene paralogo di IME1, mediante la
repressione del gene codificante il suo RNA antisenso. Il gene IME4
in condizioni normali viene prodotto, ma il suo mRNA, viene
inattivato da un RNA antisenso. Il gene IME4 attivato induce la

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meiosi.
• Spegne il gene α1
• reprime il gene Axl1
• spegne Flo 11, gene codificante per una flocculina (agglutinina), che
è una mannoproteina coinvolta nella capacità delle cellule di aderire
tra loro, generando biofilm. Questo è responsabile della crescita
filamentosa delle cellule aploidi, che è detto fenotipo “invasivo”, in
quanto è in grado di penetrare all' interno dell' agar, ed in certi tipi di
lieviti patogeni è responsabile della virulenza. Nelle cellule diploidi,
in starvation da azoto, l' adesione non è mediata da Flo11, ma da
adesine. Flo11 è attivo solo nelle cellule diploidi.
• reprime il repressore della meiosi RME1, attivando così la meiosi.

Capacità della cellula di lievito di fare aploselfing, ossia la capacità della


cellula di fare mating con se stessa: Come fa una cellula α a fare mating
con un altra cellula α oppure una cellula a con una cellula a (ricorda che
una cellula con un determinato fenotipo (a oppure α) può fare mating solo
con una cellula di fenotipo opposto)?
Sul cromosoma 3 oltre al locus MAT, nel braccio di sinistra e di destra
rispetto al centromero, vi sono:
• a sinistra il locus HML, che è normalmente silente (eterocromatina) e
porta l' informazione α (sequenziato è identico al MATα, ma inattivo)
• a destra, vi è il locus HMR, che è silenziato (eterocromatina) e che
sequenziato è identico al locus a.
Questi sono detti loci donatori. Quando una spora germina, si ha divisione
mitotica, la cellula madre fa switch del mating type, mediante una
endonucleasi HO, che scinde il suo locus MAT e si ha riunione del DNA,
mediante il legame del locus complementare (o HML oppure HMR)
normalmente silente. Così, in seguito al mating, si ha una cellula
omozigore per tutti I geni, tranne che per il locus MAT, che sarà
eterozigore MAT a e MATα. Il processo di switching del mating type è di
tipo interconversione genica. L' evento scatenante è il doppio taglio dell'
elica di DNA da parte della endonucleasi HO ed è un processo altamente
orchestrato (cit.).

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11/10/19

L' evento scatenante dello switching del mating type è il taglio a doppio
filamento del DNA da parte dell' endonucleasi HO. Nel caso dell'
aploselfing l' endonucleasi HO è attiva solo nella cellula madre e permette
di effettuare lo switching del mating type, in modo da avere un locus MAT
opposto a quello della cellula figlia, che gli permette di fare mating.
L' evendo di taglio a doppio filamento del DNA da parte dell' endonucleasi
HO deve essere finemente regolato, altrimento questo porterebbe a tagli a
doppio filamento casuali non specifici, con danni alla cellula.
Il locus MAT è più grande dell' ORF (geni effettivamente codificanti la
proteina a o α), in quanto si ha la presenza di sequenze geniche non
codificanti (v.slide 72). La porzione codificante viene definita Y:
• Yα è la porzione codificante α1 e α2
• Ya è la porzione codificante a
Al 3' di Y, si ha la sequenza X di circa 700 bp; al 5' di Y si ha la sequenza
Z di circa 300 bp.
Queste regioni sono sempre presenti in tutti I loci MAT, sia quelli silenti
(HML presente nel braccio sinistro e HMR presente nel braccio destro),
che quelli codificanti. Queste regioni che sono identiche nei vari loci sono
responsabili di guidare il processo di gene conversion.
Il sito che viene riconosciuto dalla endonucleasi HO è molto conservato e
possiede la sequenza (CGCAAC). La caratterizzazione dei loci MAT è
molto complicata ed è necessario ricorrere ad un approccio di tipo
strutturale, valutando l' intorno del locus. Si deve notare che una piccola
porzione del gene α1 si sovrappone alla porzione Z ed una piccola
porzione del gene α2 si sovrappone alla regione X. Ne deriva che se voglio
fare una PCR per selezionare uno dei 3 geni Y, non devo utilizzare come
primer le sequenze X o Z, in quanto duplicherebbero tutti e tre I geni (le
regioni X e Z sono identiche), ma è necessario utilizzare delle regioni
fiancheggianti X o Z. In S, cerevisiae I geni fiancheggianti la cassetta
centrale codificante, sono TAF2 e BUD5.
Il gene che codifica per l' endonucleasi HO non è localizzata sul
cromosoma 3, ma su un altro cromosoma.
Il sito di riconoscimento per HO è localizzato sulla porzione Z e si ha una
rottura del DNA a double strands.

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Questo evento promuove il reclutamento sul filamento di esonucleasi che
generano delle porzioni di DNA a singolo filamento. In seguito Rad 51
(elemento trans) si lega al frammento di DNA a singolo filamento ed
ingaggia la ricerca della sequenza omologa codificante per il gene del
locus complementare (es il gene MAT a viene degradato e sostituito con il
gene complementare normalmente silente Yα nel locus HMLα e
viceversa). Gli elementi cis sono le sequenze X e Z. Questo promuove la
copia e la sintesi di un nuovo filamento.
Come detto una attività non regolata di HO, può generare instabilità
genetica e quindi questo evento è fortemente regolato.
Nelle cellule diploidi, in cui non si ha switching del mating type, l'
espressione dell' endonucleasi HO è inattivata dal complesso α1-a.
Inoltre il controllo di HO è determinato anche dalla identità sessuale della
cellula aploide, che può essere o a o α.
Inoltre è necessario che vi sia una regolazione dell' espressione di HO
anche tra cellula aploide madre o figlia: l' endonucleasi HO è attiva
solamente nelle cellule in cui è attivata la mitosi e ha subito almeno un
ciclo mitotico. Vi è un livello di controllo di HO legato al ciclo cellulare,
in quanto HO è espresso solamente nelle cellule in tarda fase G1.
I geni HML e HMR sono inattivati dalla eterocromatina in quanto se
attivati, potrebbero determinare una disregolazione della identità cellulare.
In S. cerevisiae ci sono 3 Kb attorno ad HML e HMR, che sono elementi
in cis ed in trans extra HML ed extra HMR, che reclutano I nucleosomi e si
compattano, rendendo la regione inattiva, al contrario dell' intorno di MAT.
HMR possiede 2 elementi cis, HMR-I (important) ed HMR-E (essential),
in cui HMR-E è essenziale per il silenziamento di HMR, mentre HMR-I,
se rimosso, ma HMR-E è presente, si ha comunque silenziamento, mentre
se HMR-E è assente, non si ha eterocromatina.
Le regioni E ed I sono presenti anche nell' intorno di HML, ma non si ha
distinzione tra regione essenziale ed importante.
Gli elementi trans coinvolti nel silenziamento sono: istoni, proteine sir e
proteine orc, che si legano all' origine di replicazione di un cromosoma
eucariotico e si legano agli elementi E, reclutano Sir1, che catalizza il
reclutamento di Sir2-Sir3 e Sir4. La Sir 2 è una deacetilasi ed è
responsabile del grosso dell' azione, che deacetila le lisine degli istoni nelle
regioni N-terminali di H3 e H4, permettendo il legame di Sir3-Sir4 e la
stabilizzazione del nucleosoma.

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A cascata si formano I successivi complessi e ciò diffonde lo stato
eterocromatinico lungo il DNA. Nei pressi di MATa non si ha la regione E
e non può attivarsi questo processo. Lo stato eterocromatinico delle
cassette laterali, genera un ingombro sterico, che impedisce l' accesso al
sito di taglio di HO.
Ricorda che lo switch del mating type, avviene per sostituzione del Locus
MAT, con il locus complementare e quindi la sostituzione deve essere
specifica. Ciò che determina la preferenza per un donatore sono:
• elementi cis: regione RE
• elementi trans, ossia I fattori trascrizionali SWI 4 e SWI 6 e le fork
head protein.
La regione RE (250 bp, composta da vari moduli trutturali, descritti con le
lettere dell' alfabeto) è un elemento che agisce in cis sul cromosoma 3,
vicino ad HML. La preferenza del donatore dipende dalla attivazione di
RE, che controlla la ricombinazione a livello del braccio sinistro del
cromosoma 3. Se la regione RE non è attivata, HMR è utilizzato come
donatore preferenziale. La regione C lega il complesso Mcm1-α2.
Nelle cellule α, il complesso Mcm1-α2 inibisce l' attacco delle fork head
proteins, portando alla inattivazione di RE: HML non verrà mai sceto, ma
verrà scelto HMR.
I ceppi eterotallici, non in grado di fare aploselfing, possiedono una
variante non funzionale di HO, detta ho.
Nella ibridizzazione, ciò che influenza la resa degli ibridi, oltre all'
incognita dovuto al fatto che è necessario utilizzare cellule di segno
opposto, ho che la cellula diploide originario poteva essere eterozigote per
HO (HO-ho). Le cellule aploidi risultanti possono presentare geni HO
oppure ho. Una cellula diploide omozigote per ho, non può fare
aploselfing, in quanto non può fare lo switching del mating type. Un ceppo
omotallico contenente un gene HO, può fare sia aploselfing che
outcrossing e ciò abbassa la resa di ibridizzazione.
Se il ceppo è eterozigote per HO (HO-ho) 2 gameti su 4 ereditano ho e non
possono effettuare aploselfing, tuttavia possono coniugare con una cellula
di segno opposto.
Se una cellula aploide (spora) germina più velocemente di un altra, vuol
dire che questa non risente del feromone generato dall' altra cellula.
Quindi anche la velocità di germinazione influenza la resa di
ibridizzazione.

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