LIBRO BIANCO

SUI BIOFILM

Quale è il loro impatto sull’industria alimentare?

Come influenzano la sicurezza alimentare?
Come controllare la loro presenza ed eliminarli?
SOMMARIO

Biofilm, una presenza comune e pericolosa ............................................3

Cosa sono i biofilm? ........................................................................................ 4
Fasi della formazione di un biofilm .............................................................5
Di cosa sono fatti i biofilm? ............................................................................7
Raccomandazioni per controllare i biofilm ...............................................8
Biofilm multi-specie nelle industrie alimentari ....................................... 9
Biofilm e agenti patogeni di origine alimentare..................................... 11
Listeria monocytogenes ....................................................................... 11
Salmonella ................................................................................................ 12
Campylobacter........................................................................................ 12
Pseudomonas spp.................................................................................. 13
Staphylococcus spp .............................................................................. 14
Strumenti rapidi per controllare ed eliminare i biofilm....................... 15
Rilevamento dei biofilm ....................................................................... 15
Rimozione dei biofilm ........................................................................... 16
Storie di successo sulla rimozione dei biofilm ....................................... 17
Controllo dei biofilm in un impianto di imbottigliamento ....... 18
Controllo dei biofilm su superfici aperte ....................................... 19
Conclusioni ........................................................................................................20

Autori:
Enrique Orihuel Iranzo, Ramón Bertó Navarro, Juan José
Canet Gascó, Fernando Lorenzo Cartón, Alma Milvaques
Cucart and Maria Sanz Puig

2 CHRISTEYNS
Biofilm, una presenza
comune e pericolosa
Una delle principali preoccupazioni per quanto riguarda l’igiene
nell’industria alimentare è la formazione di biofilm. Le condizioni
ambientali presenti all’interno di un’industria alimentare favoriscono
in molti casi la presenza di una varietà microbica molto diversificata,
che può comprendere microrganismi patogeni in grado di formare
biofilm, come Listeria monocytogenes, Salmonella enterica,
Escherichia coli o Pseudomonas aeruginosa.
Malgrado la presenza di biofilm sia comune a qualsiasi tipo di industria
alimentare, esistono una serie di condizioni che ne favoriscono la
presenza: superfici porose o con imperfezioni, ambienti con un alto
livello di umidità, residui di materia organica o depositi di calcare e
ovviamente una contaminazione microbica.
La presenza di biofilm è particolarmente preoccupante perché,
all’interno di un biofilm, i microrganismi sfruttano una barriera
protettiva che li protegge da tutti i tipi di stress ambientale, nonché
dall’azione degli agenti antimicrobici comunemente utilizzati nelle
industrie alimentari nei processi di pulizia e disinfezione. All’interno
della matrice polimerica del biofilm la penetrazione e la diffusione dei
principi attivi microbicidi è difficile e, pertanto, solo i microrganismi
che si trovano nella regione più esterna del biofilm saranno esposti
a una concentrazione letale del prodotto. La parte rimanente dei
microrganismi verrà in contatto con una concentrazione subletale
del disinfettante che, non solo non sarà in grado di eliminarli, ma
potrebbe anche provocare la comparsa di cellule resistenti.

3 CHRISTEYNS
Cosa sono
i biofilm?
I biofilm sono colonie di microrganismi uniti tra loro e adese a un
substrato solido, che fornisce loro stabilità, nutrienti e protezione.
Sono circondati da una matrice mucillaginosa formata da un
conglomerato di diversi tipi di biopolimeri - noti come Extracellular
Polymeric Substances (EPS) - che costituiscono il supporto della
struttura tridimensionale del biofilm.
Un biofilm consente alle cellule microbiche uno stile di vita
completamente diverso rispetto allo stato planctonico, facilita
la crescita dei microrganismi e li protegge da fattori ostili, come i
disinfettanti, consentendone la sopravvivenza.
Le sostanze esopolimeriche (EPS) sono fondamentali per la
formazione di un biofilm e con la loro molteplicità forniscono
diverse funzioni che consentono la sopravvivenza delle cellule nel
biofilm contro le aggressioni esterne e la loro capacità di espandersi.
La complessità della matrice di un biofilm e il livello di protezione
che questo stile di vita fornisce ai microrganismi fanno sì che la
loro formazione rappresenti un rischio significativo per la sicurezza
alimentare e che il controllo del biofilm richieda l’applicazione di
specifiche procedure igieniche, nonché l’uso di strumenti adatti.

4 CHRISTEYNS
Le fasi della formazione
di un biofilm
La formazione di biofilm sulle superfici segue un processo sequenziale
che inizia con l’adesione delle cellule microbiche alla superficie. Ciò
si traduce nella formazione di microcolonie, che inducono le cellule
raggruppate tra loro a cambiamenti fenotipici grazie ai quali queste
cellule si adattano al nuovo ambiente e iniziano a produrre EPS per
formare la matrice del biofilm e consentirne la crescita. Il biofilm
maturo ha una struttura che si estende perpendicolarmente alla
superficie, spesso a forma di fungo, e dotata di canali attraverso i
quali possono circolare acqua e sostanze nutritive.

Figura 1. Struttura della matrice polimerica del biofilm.

La matrice del biofilm trattiene le cellule e le mantiene vicine tra

loro, consentendo un elevato grado di interazione, compresa la
comunicazione intercellulare e la formazione di micro-consorzi
sinergici. La matrice protegge anche gli organismi dalla perdita
di umidità e dall’azione di ossidanti, disinfettanti, cationi metallici,
radiazioni ultraviolette e di alcuni antibiotici. Comunque le cellule
del biofilm non sono completamente immobili e possono sia
spostarsi all’interno del biofilm che staccarsi da esso.

5 CHRISTEYNS
 Esiste una grande varietà di EPS che possono formare la matrice del
biofilm, a seconda dei microrganismi presenti, delle forze di taglio in
fase di formazione, della temperatura e della disponibilità di nutrienti.
Come illustrato nella Figura 2, la formazione di un biofilm inizia con
l’adesione dei microrganismi a una superficie, seguita dalla loro
crescita e colonizzazione. Successivamente, si formano la matrice
extracellulare e i canali interstiziali, fenomeno influenzato da un
meccanismo di comunicazione tra i microrganismi chiamato quorum
sensing. Una volta che il biofilm è maturo, inizia la fase di dispersione,
in cui piccoli frammenti di esso si staccano e colonizzano altre
superfici, dove possono sviluppare un nuovo biofilm. In questo modo,
la formazione iniziale di un biofilm su una superficie in un punto
specifico del processo produttivo può portare alla sua espansione
in diversi punti dell’industria alimentare.

1. Adesione 2. Colonizzazione 3. Formazione 4. Crescita 5. Dispersione

Figura 2. Sequenza della formazione di un biofilm.

6 CHRISTEYNS
Di cosa sono fatti
i biofilm?
I biofilm sono di solito formati contemporaneamente da più specie
microbiche: batteri, muffe, alghe, ecc. e si insediano su superfici che
ne favoriscono l’adesione (porose, graffiate o ruvide) o che sono state
sottoposte a un inadeguato programma di lavaggio e disinfezione.
In generale, i componenti principali della matrice del biofilm sono
acqua, polisaccaridi, proteine, acidi nucleici, lipidi e altri biopolimeri.
La struttura del biofilm è influenzata dall’EPS nonché da molti altri
fattori, come le condizioni idrodinamiche, la concentrazione dei
nutrienti, la mobilità batterica, la comunicazione intercellulare e gli
ioni metallici che possono trovarsi nell’ambiente.

7 CHRISTEYNS
Raccomandazioni per
controllare i biofilm
La presenza di biofilm sugli impianti rappresenta un rischio
elevato per la sicurezza alimentare e può anche causare problemi
di funzionamento delle apparecchiature. I biofilm svolgono una
funzione protettiva nei confronti dei microrganismi che ospitano,
riducendo l’efficacia dei trattamenti di disinfezione.

Per controllare la presenza di biofilm in una industria alimentare si

consiglia di seguire le seguenti indicazioni:

• Valutare dove i biofilm possono svilupparsi più facilmente e i

fattori che possono favorirne la formazione.

• Mettere in atto le misure necessarie per rimuovere i biofilm rilevati.

• Definire una serie di strategie per evitare la formazione di biofilm.

• Verificare periodicamente l’efficacia delle suddette attività.

8 CHRISTEYNS
Biofilm multispecie e
l’industria alimentare
La coesistenza di diversi tipi di microrganismi nello stesso ambiente
favorisce la formazione di biofilm multispecie. Infatti, sebbene la
formazione di biofilm mono-specie sia possibile in laboratorio, i
biofilm trovati nell’industria alimentare sono per lo più costituiti da più
specie batteriche o anche da una combinazione di specie batteriche
e fungine. Ad esempio, biofilm di Bacillus cereus, E. coli, Shigella spp.
e S. aureus sono stati rilevati negli impianti di lavorazione delle uova
o del latte (Jan et al., 2011; Sharma e Anand.2002) o biofilm di Listeria
spp., Staphylococcus spp. e Vibrio spp. sono stati isolati in macchinari
industriali nelle industrie di lavorazione del pesce (Gutiérrez et al.,
2012; Shi & Zhu, 2009).
All’interno dei biofilm multispecie, possiamo trovare un’ampia varietà
di microrganismi che crescono molto vicini gli uni agli altri. Ciò
promuove la creazione di interazioni interspecie, che possono dare
origine a nuove funzioni o sviluppare differenti capacità. Questi tipi
di interazioni possono giocare un ruolo chiave, sia nel mantenimento
della struttura del biofilm che nello sviluppo di funzioni specifiche.

9 CHRISTEYNS
Ad esempio, è stato osservato che possono aumentare la resistenza
agli agenti antimicrobici, aumentare la virulenza nei processi infettivi
o migliorare la degradazione dei composti organici (Roder et al.,
2016). L’organizzazione spaziale delle specie all’interno del biofilm
e la possibilità di condividere i polimeri che formano la matrice
determina il loro grado di persistenza nei biofilm multispecie, nonché
la loro resistenza ai trattamenti di lavaggio e disinfezione.
Molti dei microrganismi patogeni di origine alimentare possono
aderire a un gran numero di superfici e formare biofilm nella maggior
parte delle condizioni ambientali che si possono trovarde all’interno
di un impianto di produzione alimentare. In ogni caso, un batterio che
si trova in forma planctonica in un’industria alimentare e si deposita
su una superficie che contiene un biofilm, tenderà ad unirsi ad esso,
potenziando la diversità microbica al suo interno. Per questo, la
presenza di un biofilm nell’industria alimentare, anche se si tratta di
un microrganismo non patogeno, è un problema perché può favorire
ad eventuali microrganismi patogeni di potersi unire ad esso.
All’interno di un biofilm multi-specie si possono trovare gradienti
di ossigeno e nutrienti che ne favoriscono l’eterogeneità. Pertanto,
i batteri incorporati all’interno si possono trovare in un gran numero
di microambienti specifici. (Bidrier et al., 2015). Ciò favorisce che
questi biofilm possano ospitare anche microrganismi con condizioni
di crescita specifiche. In questo senso, è stato dimostrato che i biofilm
di Pseudomonas spp. facilitano l’adesione di Campylobacter jejuni, un
microrganismo che necessita di condizioni microaerofile per crescere
(Ica et al., 2012). Inoltre, è stato osservato che specie batteriche
come E. coli, P. aeruginosa, L. monocytogenes, S. aureus o S. enterica,
sono in grado di adattarsi a questa eterogeneità mediante lievi
cambiamenti nella loro espressione genica. I batteri quindi si adattano
al microambiente circostante, dando origine a diversi fenotipi, che
contribuiscono all’eterogeneità batterica all’interno del biofilm.

10 CHRISTEYNS
Biofilm e agenti
patogeni
La persistenza di L. monocytogenes, Salmonella spp. e altri
microrganismi patogeni sugli impianti di lavorazione alimentare è
strettamente correlata alla presenza di biofilm.

Listeria monocytogenes

Il rilevamento di L. monocytogenes nei locali e sulle linee produttive

è una premessa imprescindibile per l’eliminazione dei ceppi batterici
resistenti. Se non si sa dove si trovano questi ceppi, è difficile
adottare adeguate misure per rimuoverli. In questo senso, lo sviluppo
di tecnologie innovative consente di identificare rapidamente e
facilmente la presenza di un biofilm.
I biofilm limitano l’attività dei disinfettanti e, inoltre, la loro eliminazione,
compresa la disgregazione della matrice, non si può ottenere in modo
completo usando solo prodotti disinfettanti. Sebbene un disinfettante
possa uccidere tutte le cellule microbiche, la matrice extracellulare
formata dal materiale polimerico persisterebbe e in breve tempo
verrebbe colonizzata da altri microrganismi.

11 CHRISTEYNS
Salmonella

La persistenza di Salmonella spp. negli ambienti di lavorazione degli

alimenti d opo il lavaggio e la d isinfezione può essere collegata a
processi effettuati in modo improprio. Tuttavia, anche nel contesto di
trattamenti di sanificazione effettuati in modo corretto, è opportuno
considerare la possibilità dell’insorgenza di una resistenza acquisita
ai disinfettanti. Per effetto di un periodo prolungato di esposizione
allo stesso principio attivo microbicida oppure di una ripetuta
esposizione a concentrazioni subletali del disinfettante, Salmonella
spp può sviluppare una resistenza acquisita, soprattutto quand o si
trova sotto forma di biofilm. Salmonella spp forma facilmente biofilm
sulle superfici a contatto con gli alimenti, sia in ambienti industriali
che domestici. Per cui la formazione d i un biofilm si rivela essere un
fattore determinante per spiegare la lunga persistenza di Salmonella
sulle superfici. Spesso poi i biofilm di Salmonella possono fungere da
serbatoi di contaminazione batterica e dare luogo a focolai di origine
alimentare.

Campylobacter

Oggi il microrganismo più importante nelle lavorazioni con carne

fresca di pollame è il Campylobacter spp. che è riconosciuto come
la principale causa a livello mondiale di gastroenterite batterica e
ne fa una delle malattie gastrointestinali con il maggiore impatto
economico in molti paesi. Si trova principalmente nel pollame, ma
anche nella carne rossa bovina, nel latte non pastorizzato e nell’acqua
non trattata. Sebbene normalmente non cresca negli alimenti, si
diffonde facilmente, con l’aggravante che solo pochi batteri possono
causare la malattia.
Studi di M. Reuter, A. Mallett, A. van Vliet e Bruce M. Pearson, pubblicati
sulla rivista Applied and Environmental Microbiology, hanno dimostrato
che Campylobacter jejuni in condizioni di stress ambientale ha
risposto formando immediatamente un biofilm, sviluppandosi più
rapidamente sotto condizioni ambientali aerobiche con concentrazioni
di ossigeno del 20%, rispetto a condizioni microaerofile (ossigeno 5%).

12 CHRISTEYNS
Successivamente, quando si trova in condizioni ambientali idonee
al suo sviluppo, questo biofilm rilascia i batteri in esso contenuti,
facilitando così il loro ingresso nella catena alimentare e provocando
la contaminazione degli alimenti.
Questo stud io conclud e che Campylobacter spp può facilmente
percepire un ambiente ostile e cercare di proteggersi formando un
biofilm per rilasciare successivamente batteri che possono entrare
nella catena alimentare. Occorre quind i valutare come prevenire
questo fenomeno, sia a livello della alterazione della matrice del
biofilm per poter agire sui batteri, che a livello della prevenzione
della sua formazione.

Pseudomonas spp.

Pseudomonas spp. forma molto facilmente biofilm nelle condizioni

ambientali che normalmente si trovano nell’industria alimentare, non
solo sulle superfici di produzione, pavimenti, pareti, o scarichi, ma
anche nei prodotti alimentari stessi, come cavoli, spinaci o lattuga.
Pseudomonas spp. è uno dei più importanti agenti patogeni
alterativi nei latticini pastorizzati perché produce enzimi lipolitici e
proteolitici che vengono secreti nel latte durante la conservazione
prima della pastorizzazione, anche alle temperature di raffreddamento.
Molti di questi enzimi possono sopravvivere al trattamento di
pastorizzazione, alterando le caratteristiche organolettiche e
riducendo la shelf life del prodotto. Inoltre, Pseudomonas spp. può
agire come un microrganismo alterativo nel latte pastorizzato
durante la conservazione in frigorifero.
In ogni caso, la capacità di Pseudomonas spp. di formare biofilm
spiega il fatto che in molti casi è il microrganismo che da vita al
biofilm, a cui si uniranno altre specie microbiche, fino a formare un
biofilm multispecie, che tipicamente si trova nell’industria alimentare.

13 CHRISTEYNS
Staphylococcus spp.

Staphylococcus aureus è uno dei patogeni di origine alimentare

capace di formare biofilm. Nell’industria alimentare, i biofilm di S.
aureus si trovano principalmente nelle materie prime, in particolare
nei prodotti congelati e nei mangimi per animali, negli ambienti,
soprattutto nei macelli, e negli impianti produttivi, ad esempio
all’interno delle tubazioni. La presenza di biofilm di S. aureus
nell’industria alimentare è preoccupante perché le tossine prodotte
da questo batterio possono finire negli alimenti e provocare la
cosiddetta intossicazione alimentare da stafilococco.
È una malattia gastrointestinale causata dall’assunzione di tossine
prodotte da S. aureus, che sono resistenti al calore e non vengono
distrutte durante la cottura dei cibi. Alcuni esempi di alimenti che
hanno causato intossicazioni alimentari da Staphylococcus spp. sono
affettati, panini e torte.

14 CHRISTEYNS
Strumenti rapidi per
controllare ed eliminare i
biofilm
Nelle industrie alimentari, la validazione dei processi igienici è
fondamentale per garantire che le superfici a contatto con gli alimenti
siano nelle adatte condizioni igieniche prima di iniziare la produzione.
Questa validazione include il controllo della presenza di residui fisici
o chimici e di microrganismi indesiderati.

Rilevamento dei biofilm

CHRISTEYNS ha sviluppato uno strumento per rilevare tutti i tipi di

biofilm, il kit TBF® 300. Questo prodotto consente l’identificazione
visiva dei punti di crescita di un biofilm colorando la loro matrice
esopolimerica.

Figura 3. Kit per il rilevamento visivo di biofilm TBF® 300.

15 CHRISTEYNS
Il prodotto viene applicato a spruzzo, sotto forma di schiuma, sulle
superfici da campionare; con il successivo risciacquo viene rimosso
il prodotto e la presenza del biofilm è segnalata dalla persistenza
della colorazione. TBF® 300 è un grande aiuto per il controllo di
contaminanti microbici sulle superfici mentre altri sistemi alternativi,
che identificano solo i microrganismi catalasi positivi, non sono in
grado di rilevare la loro presenza quando sono inglobati in un biofilm.
D’altra parte, esistono altri sistemi per verificare la presenza di un
biofilm che sono costosi e complessi e generalmente richiedono
l’uso di specifiche apparecchiature.

Rimozione dei biofilm

La presenza di biofilm in un ambiente alimentare e il loro rapporto di

causa-effetto con la presenza di agenti patogeni, rende fondamentale
stabilire procedure per rilevarli ed eliminarli. A tal fine, CHRISTEYNS
dispone di due prodotti specificatamente sviluppati per eliminare i
biofilm su superfici aperte e in impianti chiusi: MIDA® SAN 327 BF e
MIDA® SAN 328 EC.

Figura 4. Prodotti ad elevata capacità di rimuovere i biofilm.

Una alternativa per la rimozione dei biofilm si basa sull’utilizzo di un

prodotto enzimatico come MIDA® ADD 409 AG, additivo contenente
una miscela di diversi enzimi che, utilizzato in combinazione con un
idoneo detergente, consente la rimozione dei biofilm.

Guardate il video sui prodotti per il controllo

dei biofilm sviluppati da BETELGEUX-CHRISTEYNS.

16 CHRISTEYNS
Storie di successo sulla
rimozione dei biofilm

In occasione di molti interventi effettuati nelle industrie alimentari, il

personale tecnico di CHRISTEYNS è stato in grado di individuare la
presenza di un biofilm nei punti critici e mettere a punto procedure
che riuscissero a rimuoverli, controllando in questo modo la presenza
di contaminazioni microbiche che potevano mettere a rischio la
sicurezza dei prodotti alimentari.

Di seguito vengono descritti due esempi di attività di assistenza

tecnica, uno in un impianto chiuso e l’altro su una superficie aperta.

17 CHRISTEYNS
Controllo del biofilm in un impianto di imbottigliamento
Era stata segnalata la presenza di una contaminazione microbica
nelle confezioni di bevande analcoliche. Non tutte le confezioni
o lotti produttivi risultavano contaminati, ma la contaminazione
si manifestava in modo discontinuo. Questa è una indicazione
indiretta della possibile presenza di biofilm, che vengono portati via
(microrganismi presenti nelle porzioni che si staccano dal biofilm) dal
flusso della bevanda in circolazione e depositati nei contenitori. Parti
del circuito sono state smontate per l’ispezione visiva e per applicare
il kit di rilevamento del biofilm TBF® 300. In alcune giunzioni e
curve del circuito è stata osservata una persistente colorazione rosa
che ha dimostrato la presenza della matrice esopolimerica del biofilm
(Figura 5).

Figura 5. Presenza di biofilm rilevati dal colore rosa prodotto dal kit TBF® 300.
La presenza di biofilm è stata rilevata sulle valvole e nelle filettature di collega-
mento tra le tubazioni dell’impianto.
È stata messa a punto una procedura per il controllo dei biofilm, con-
sistente nel ricircolo, dopo una fase iniziale di risciacquo e lavaggio
alcalino, del prodotto MIDA® SAN 328 EC alla dose del 3% per 3 ore.
Successivamente è stato effettuato un risciacquo con acqua fino alla
completa rimozione di ogni residuo. Dopo questi trattamenti non è
stata rilevata la presenza di alcun biofilm ed i risultati microbiologici
effettuati dall’azienda hanno verificato l’assenza di contaminazione
microbica. È stato stabilito un protocollo preventivo che prevede
il trattamento periodico degli impianti con MIDA® SAN 328 EC in ag-
giunta alla normale procedura di sanificazione.

18 CHRISTEYNS
Controllo del biofilm su superfici aperte
La presenza di una inaccettabile contaminazione microbica nel prodo-
tto finito, inclusa la presenza di L. monocytogenes, è stata segnalata da
diverse industrie alimentari. Nell’affrontare il problema, la prima fase
dello studio consiste nel determinare le cause, in gran parte legate alla
presenza di biofilm sulle superfici che entrano in contatto diretto con
gli alimenti in lavorazione. L’utilizzo del kit TBF® 300 si è dimostrato
uno strumento fondamentale per rilevare la presenza di biofilm, che
agiscono come nicchie di contaminazione e ostacolano l’azione dei di-
sinfettanti, favorendo la persistenza delle cellule microbiche.
Le seguenti fotografie (Figure 6, 7 e 8) mostrano i risultati posi-
tivi della presenza di biofilm, rilevati con il kit TBF® 300, su diverse
superfici di industrie alimentari che si sono poi dimostrate, dopo i
relativi test microbiologici, essere la causa di contaminazioni del
prodotto finito da parte di microrganismi alterativi e patogeni.

Figura 6. Applicazione di TBF® 300 su un sistema di taglio. La residua colora-

zione rosa indica la presenza di biofilm.

19 CHRISTEYNS
 Figura 7. Presenza di biofilm in dosatori a tramoggia.

Figura 8. Presenza di biofilm nel sistema di scarico di una sala di lavo-

razione della carne.

La rilevazione dei biofilm ha consentito di dare vita a specifiche

procedure per il loro controllo nei punti osservati, integrando la
sanificazione con un trattamento con MIDA® SAN 327 BF, un prodotto
attivo nei confronti dei biofilm che elimina la matrice esopolimerica
e consente la successiva eliminazione delle cellule microbiche. Una
volta risolto il problema, è stato definito un programma di utilizzo
periodico del prodotto con l’obiettivo di prevenire la formazione del
biofilm e la conseguente comparsa di nuovi problemi microbiologici
nel prodotto finito.

20 CHRISTEYNS
Conclusioni
La presenza di microrganismi alterativi e patogeni nelle industrie
alimentari è relativamente frequente, in quanto possono venire veicolati
negli impianti di produzione in molteplici modi. Una volta presenti nelle
strutture produttive, una combinazione di vari fattori determina la loro
capacità di sopravvivere, diventando così un potenziale pericolo per
l’alimento in lavorazione.

Uno degli aspetti più determinanti è la capacità dei microrganismi di

formare biofilm, pertanto è fondamentale utilizzare adeguate tecniche
di rilevazione e diagnostica che permettano di attuare e validare
strategie e programmi di controllo al fine di garantire la sicurezza
alimentare e la salute dei consumatori.

21 CHRISTEYNS
Soluzioni specifiche per controllare tutti i
tipi di biofilm nell’industria alimentare