I BIOFILM

Per biofilm si intende una comunità di cellule microbiche adese ad una superficie, inglobate in una matrice
polisaccaridica secreta dalle cellule stesse. I biofilm si formano su substrati umidi, solidi, naturali, su tessuti
molli e duri di organismi viventi e piante. Sono ubiquitari. L’unità strutturale del biofilm è la microcolonia.
Essi sono costituiti da una:
• componente biotica → microbi (batteriovirus, protozoi, muffe, lieviti, alghe unicellulari)
• componente abiotica → rappresentata dalla sostanza organica e inorganica che rimangono
intrappolate nel liquido.
Nei biofilm i microbi compiono il loro ciclo vitale, quando poi muoiono rilasciano DNA che contribuisce alla
viscosità del mezzo.
Pe quanto riguarda la componente biotica distinguiamo:
➢ BIOFILM POLIMICROBICI → si formano in ambiente non sterile
➢ BIOFILM MONOMICROBICI → si formano in distretti dell’organismo che dovrebbero essere sterili o
nelle superfici di strumenti medici invasivi come protesi, cannule e catetere.

Le cannule sono sottili tubicini di materiale plastico o di acciaio (aghi) che vengono somministrati per via
endovenosa per somministrare farmaci o sostanze nutritive. La formazione del biofilm può avvenire per:
asepsi cutanea, assenza di pulizia del catetere o per persistenza catetere venoso in situ.
I cateteri urinari vengono utilizzati per favorire l’eliminazione di urina contenuta nella cavità vescicale. La
cateterizzazione uretrale, può essere usata per 1-2 gg al fine di sopperire ad una temporanea incapacità del
paziente di eliminare l’urina.
In alcune circostanze la cateterizzazione può essere permanente per lunghi periodi di tempo con maggior
possibilità di infezioni a carico del tratto urinario.

STADI DI FORMAZIONE DEL BIOFILM

Il processo di formazione del biofilm non è un evento casuale ma è caratterizzato da una serie di
cambiamenti morfologici che possono essere riassunti in quattro fasi principali.
1) Adesione reversibile
2) Adesione irreversibile
3) Maturazione del biofilm
4) Distacco del biofilm
Questa fase prevede l’instaurarsi di due tipologie di adesione che si susseguono tra di loro, ed è
caratterizzata dalla formazione del legame tra i microrganismi e la superficie che fungerà da
sostegno. Nel momento in cui il microrganismo capta, attraverso il sistema chemiotattico, un ambiente
favorevole, esso si avvicina e l’associazione è governata da interazioni deboli, dipendenti dalle cariche della
superficie e del microrganismo. In questo caso si parla di adesione reversibile.
Le forze che intervengono in questo tipo di adesione, sono le forze di v. d. Walls.
Sappiamo che sia i microrganismi, sia le superfici hanno una carica negativa. Inoltre, sappiamo che due
cariche uguali si respingono tra di loro. Tale problema viene risolto con la produzione, da parte del
microrganismo, di molecole che hanno carica netta positiva o neutra. La produzione di tali molecole
crea delle zone della membrana che presentano una carica negativa attenuata.
La fase di adesione reversibile è anche caratterizzata dalla repressione dei geni che codificano per il
flagello e, quando il microrganismo inizia a replicarsi e quindi aumenta il numero di individui, si
attivano i processi che sono governati dal quorum sensing. Uno dei processi che viene attivato
dal quorum sensing è la produzione della matrice esopolisaccaridica.
L’adesione reversibile è seguita dall’adesione irreversibile, che è permessa dalla produzione dei fattori di
adesione che rafforzano il legame con la superficie.
Nel caso in cui ci sono a disposizione quantità sufficienti di nutrienti, i continui cicli di replicazione
porteranno alla formazione di una microcolonia, alla quale possono aggregarsi anche microrganismi di
diversa specie.
Dopodichè si ha la maturazione del biofilm che assume una ben definita conformazione spaziale e che
permette, tramite la presenza di piccoli canali all’interno, l’equa distribuzione di acqua e di nutrienti.
Nonostante ciò si può comunque avere la formazione di un gradiente sia di nutrienti sia di ossigeno,
tra gli strati interni ed esterni. Tali gradienti portano ad una differenza di velocità di crescita tra gli
strati interno (crescono lentamente) e gli strati esterno (crescono velocemente).
Nell’ultima fase si ha il distacco del biofilm; questo avviene per esaurimento della quantità di nutrienti.
Ciò permette ai microrganismi di ritornare ad una vita di tipo plantonica.
La degradazione del bioflim avviene per azione di enzimi che vengono prodotti dai microrganismi stessi.
All’interno del biofilm molto è evidente il fenomeno della co-aggregazione. Un fenomeno tipico
dell'ecosistema orale dove i batteri traggono vantaggio nell’aderire ad altri microrganismi già adesi al
substrato sfruttando le diverse strutture o molecole ponte.
I vantaggi della co-aggregazione sono:
✓ adesione
✓ nutrimento
✓ variazione potenziale Eh ambientale
✓ protezione

La matrice è costituita da esopolisaccaridi (EPS). Quest’ultimi forniscono alla comunità microbica moltissimi
vantaggi tra cui:

• la capacità di adsorbire e concentrare i nutrienti essenziali disciolti nel fluido

• la capacità di prevenire la diffusione o l’accesso fisico dall’ambiente circostante di alcuni agenti
antimicrobici, degli anticorpi e di tossine
• la capacità di legare metalli e cationi tossici
• la capacità di fornire protezione da diversi stress ambientali, come radiazioni U.V., variazioni di pH,
shock osmotico e disidratazione
• l’EPS determina sia le strutture sia le forze coesive del biofilm

I vantaggi di crescere in biofilm sono molteplici. In ambito medico si ha:

✓ la protezione delle difese immunitarie
✓ la riduzione della sensibilità agli agenti antimicrobici.
Infatti, i batteri che formano biofilm non sono sensibili ad anticorpi, fagociti e antibiotici. Nel momento in
cui i fagociti raggiungono il biofilm; la fagocitosi è poco attiva per cui si ha la liberazione degli enzimi
fagocitari che danneggiano il tessuto intorno al biofilm. I batteri planctonici liberati dal biofilm possono
diffondere l’infezione ad altri tessuti. (infezioni ricorrenti)

Per quanto riguarda la formazione del biofilm, esiste un sistema di comunicazione tra cellule batteriche
della stessa specie detto quorum sensing: un sistema di regolazione trascrizionale che utilizza molecole
segnale (solitamente omoserina lattone nei Gram- e peptidi nei Gram+).
Il quorum sensing dipende dalla densità cellulare: le molecole segnale non hanno effetto fino a che la
densità della popolazione è bassa. Nel momento in cui la popolazione batterica raggiunge una
concentrazione critica, si accumula una quantità adeguata di molecola segnale che attiva la popolazione
cellulare a svilupparsi in biofilm.
Una volta formato il biofilm, i batteri continuano a comunicare tra loro per controllare l’equilibrio del
biofilm e la produzione di fattori di virulenza come il rilascio di enzimi e tossine.
RESISTENZA DEI BIOFILM BATTERICI AGLI AGENTI ANTIMICROBICI
La resistenza antimicrobica dei biofilm non è genotipica cioè portata da plasmidi, trasposoni o
legata ad eventi mutazionali) ma è dovuta a strategie multicellulari e o alla capacità delle singole cellule,
interne al biofilm, di differenziarsi in uno stato fenotipico tollerante l’azione degli antimicrobici.
I meccanismi responsabili della resistenza possono essere diversi:
• ritardata penetrazione dell'agente antimicrobico attraverso la matrice del biofilm
• un alterato tasso di accrescimento dei microrganismi all’interno del biofilm
• cambiamenti fisiologici dei microrganismi inclusi nel biofilm in risposta alle condizioni ambientali
• formazione di cellule persister

Nel biofilm c’è un gradiente di ossigeno e di nutrienti, infatti nella parte più profonda si trovano gli anaerobi
e solitamente sono forme quiescenti necessitano di meno nutrienti per cui si trasformano in forme a basso
metabolismo e per tale motivo sono dette anche persistenti; in quanto resistano anche agli antibiotici che
agiscono solo su vie metaboliche attive. Più precisamente si ritiene che una sottopopolazione di
microrganismi del biofilm acquisisca un particolare fenotipo (PERSISTERS), altamente protettivo.
L’agente antimicrobico pur riuscendo a penetrare attraverso la superficie del biofilm non è in grado di
eliminare tutti i microrganismi poiché parte di questi si trovano in uno stato persistente che conferisce loro
una ridotta sensibilità agli antibiotici. Tale fenomeno è indotto dall’adesione a superfici oppure dal quorum
sensing.

PLACCA DENTALE
La placca dentale rappresenta una complessa comunità microbica che si riscontra sulla superficie del dente.
Occasionalmente la placca può accumularsi al di sopra dei livelli compatibili con lo stato di salute della
cavità orale, portando ad una variazione delle specie microbiche della placca ed a predisporre la bocca
all’insorgenza di malattie. La sua calcificazione porta alla formazione del tartaro.
Le zone maggiormente colonizzate sono: le facce approssimali, le aree delle superfici lisce vicino al margine
gengivale e il solco gengivale.

Lo sviluppo del biofilm nella placca può essere distinto in diverse fasi.
1) Nel momento in cui la superficie del dente viene ripulita le molecole dell’ospite si depositano sulla
superficie del dente per formare la pellicola acquisita
2) Successivamente si ha l’adsorbimento dei microrganismi con le molecole della pellicola acquisita
sulla superficie del dente, si instaurano quindi interazioni fisico-chimiche tipo forza di Wan der
walls e interazioni specifiche tra adesine batteriche e recettori della pellicola acquisita → (adesione
irreversibile).
3) Dopo circa 24 h della formazione della placca prevalenza streptococchi (95%) quasi assenti batteri
anaerobi obbligati. I pionieri si moltiplicano formando microcolonie.
4) Si verifica poi il fenomeno di co-aggregazione di microrganismi a batteri già adesi e questo
comporta una diversificazione della popolazione microbica della placca. Dopo 1-3 giorni, i
colonizzatori secondari (Gram- anaerobi) aderiscono ai Gram+ (batteri/batteri, co-aggregazioni
specifiche) e si moltiplicano. Qui si assiste ad una diminuzione del potenziale redox
5) Successivamente si ha la crescita e la maturazione di biofilm quindi la comunità diventa più
complessa con presenza di diversi strati microbici di cocchi, bacilli e fusobatteri. In secondo luogo si
assiste anche alla colonizzazione da parte di microrganismi icroaerofili e anaerobi aerotolleranti
(Prevotella, Actinobacillus e Capnoctophaga)
6) Poi si ha l’adesione, microrganismi anaerobi stretti quali Porphyromonas, Tanneralla,
Fusobacterium, Aggregatibacter, Treponema, detti anche colonizzatori tardivi che aderiranno a
microrganismi già presenti formando la placca stabilizzata. In questa placca si riconoscono
disposizioni microbiche stratificate particolari a «panocchia di granturco»
 7) Infine, si ha il distacco delle cellule dal biofilm ad una fase planctonica (di solito nella saliva) che
faciliterà la colonizzazione di nuovi siti. Nella placca matura la pellicola acquisita è da tempo
degenerata e i microrganismi si ritrovano a contatto diretto con lo smalto dei denti

La progressione nello sviluppo della placca

• predominanza precoce di Gram+ aerobi/anaerobi facoltativi,
• predominanza tardiva di Gram- anaerobi
Essa riflette il cambiamento della flora nella transizione dallo stato di salute a quello di malattia.

Lo sviluppo della placca dentale sulla superficie pulita dello smalto

I batteri cocciformi si attaccano alla pellicola dello smalto come specie pioniere e si moltiplicano per
formare microcolonie. Si assiste quindi alla crescita del biofilm. Nel corso del tempo la biodiversità della
popolazione microbica aumenta ed è favorita la colonizzazione di batteri bacilliformi e filamentosi
Nella comunità apicale si possono realizzare molte associazioni microbiche insolite tra differenti specie
batteriche comprese formazioni a spighe di grano o a scovolino, a pannocchia o a spazzola (cocchi collocati
lungo microrganismi filamentosi ad esempio associazione Streptococchi - Fusobacterium oppure
Streptococchi legati a Veillonella).

La placca dentale è caratterizzata da processi di adesione altamente specifici:

✓ batteri/pellicola dello smalto (contatto adesine-recettore)
✓ batteri/batteri (contatto adesine-adesine)
Il fenomeno della coo-aggregazione è un processo altamente specifico e porta alla formazione di biofilm
complessi, in cui microrganismi diversi si aggregano per mezzo di interazioni specifiche.
Tali interazioni possono sfruttando le diverse strutture o molecole ponte:
1) unione mediata da molecole come glucano e glicoproteine
2) unione diretta tra i batteri mediante molecole della superficie esterna come lectine che sono delle
proteine in grado di legare carboidrati tipico di streptococchi; e le fimbrie tipiche degli actinomiceti

Anche nella placca dentale i batteri nel biofilm hanno un’aumentata resistenza ai farmaci antiobiotici.
Fusobacterium agisce da ponte fra i colonizzatori tardivi (Eubacterium spp.) e colonizzatori primari
(streptococchi)
Le condizioni ambientali su un dente non sono uniformi, le differenti superfici variano come fonte di
materiali nutritizi e nel grado di protezione. Queste differenze si riflettono sulla composizione della
popolazione microbica per cui potremmo osservare due tipi di placca:
✓ Placca sottogengivale
✓ Placca sopragengivale (placca delle superfici lisce, placca interprossimale, placca dei solchi)
La placca subgengivale → a livello del margine è simile a quella delle superfici lisce; nella profondità del
solco invece è caratterizzata da una minore quantità di matrice intercellulare, infatti troviamo cocchi o a
volte anche spirochete
La placca dei solchi delle facce occlusali → ha una composizione più semplice, qui si ha una carenza di
nutrienti e troviamo per lo più Gram+. Anche la sua organizzazione è semplice senza formazioni a palizzata
e a pannocchia.
La placca interprossimale → ha una massiccia presenza di placca tra gli spazi interprossimali. Troviamo
sempre gram+ tra cui streptococchi e Actinomyces

Tra le varie attività biochimiche della placca ricordiamo:

✓ Fermentazione e produzione di acidi
✓ Sintesi di polisaccaridi intracellulari
✓ Mineralizzazione
Acquisizione di nutrienti da parte dei batteri orali

1) Si ha prima la demolizione di macromolecole in molecole più piccole capaci di essere acquisite più
facilmente
2) Dopodichè le molecole vengono acquisite mediante vari trasportatori. Il trasportatore di zuccheri
più noto è il sistema di trasporto delle fosfotrasferasi (PTS)
Il sistema PTS ha un ruolo cruciale nei batteri orali quando la carenza dei fattori nutritivi diventa un fattore
limitante e la specie batterica deve cercare di reclutare gli zuccheri, anche se presenti in tracce, come
succede ad esempio fra un pasto e l’altro.

METABOLISMO BATTERI ORALI

Il più grande interesse è rivolto al metabolismo dei carboidrati in relazione alla stretta associazione tra
zuccheri presenti nella dieta pH acido e carie dentale
❑ Gli amidi possono essere degradati nei loro zuccheri costitutivi da parte di amilasi salivari e
batteriche
❑ Glucani (prodotto da glicosil-transferasi - GTF) insolubili sono utili per la formazione
strutturale della placca e per l’adesione
❑ Fruttano (prodotto da fruttosil-transferasi - FTF) viene utilizzato da altri microrganismi
costituenti la placca dentale e spesso porta alla sintesi di acido lattico e quindi alla formazione
di carie

FERMENTAZIONE E PRODUZIONE DI ACIDI

Gli zuccheri trasportati all’interno della cellula batterica possono essere utilizzati per via anabolica per la
produzione di biomassa oppure essere degradati per via catabolica ad acidi organici che verranno secreti
per generare energia.
Inizialmente gli zuccheri sono catabolizzati per via glicolitica a piruvato il cui utilizzo dipenderà dal
particolare microrganismo e dalla disponibilità di ossigeno.
La maggioranza dei batteri orali metabolizzano in anaerobiosi il piruvato ad acidi organici
In carenza di zuccheri avviene ETEROFERMENTAZIONE
✓ è la condizione più comune
✓ viene prodotto il 50% di acido lattico e formato, acetato, etanolo
✓ il pH non cambia
✓ non si ha un’azione cariogena della placca
In eccesso di zuccheri avviene l’OMOFERMENTAZIONE:
✓ viene prodotto solo acido lattico
✓ si ha un forte abbassamento del pH
✓ Si ha un’azione cariogena della placca

METABOLISMO DELL’OSSIGENO DA PARTE DEI BATTERI ORALI

I microrganismi pionieri sono più tolleranti nei confronti degli effetti tossici dei metaboliti dell’ossigeno
rispetto ai colonizzatori tardivi. Questi ultimi possono dipendere da interazioni metaboliche interspecifiche
all’interno del biofilm della placca al fine di resistere all’ossigeno e ai radicali tossici (ROS).
I metaboliti dell’ossigeno possono essere tossici per cui i batteri orali possiedono meccanismi di difesa per
prevenire o ridurre il danno ossidativo: catalasi, superossido dismutasi (SOD), perossidasi.
• Streptococchi del gruppo mutans producono SOD e NADH-perossidasi
• Neisseria (aerobio) utilizza catene di trasporto degli elettroni per la riduzione dell’ossigeno e la
sintesi di ATP
 • Batteri anaerobi stretti come T. denticola utilizzano NADH-ossidasi (con flavina) e NADH-perossidasi
per rimuovere piccole quantità di ossigeno e perossido d’idrogneo nell’ambiente sub-gengivale
→non producono SOD

I ROS possono reagire con i lipidi, DNA e proteine.

La perossidazione lipidica è dannosa per gli eucarioti ricchi di acidi grassi polinsaturi rari nei batteri.
Nei batteri i ROS possono causare un danno significativo al DNA dando origine a mutazioni o rotture delle
eliche; oppure danneggiano le proteine enzimatiche per cui si ha un’alterazione metabolismo microbico.

Rapporti di simbiosi tra i batteri della placca omeostasi della placca

SIMBIOSI MUTUALISTICA
✓ Aerobi utilizzano O2 favorendo anaerobi
✓ Acido lattico prodotto da una varietà di specie microbiche orali favorisce la crescita di Veillonella
parvula che, utilizzandolo (sintetizza acidi più deboli), alza il pH e riduce il potenziale cariogeno
✓ Streptococchi e lattobacilli utilizzano polisaccaridi extracellulari prodotti da altri batteri
prolungando la produzione di acido in assenza di carboidrati esogeni della dieta
✓ Streptococcus sanguis produce acido p-amino-benzoico (PABA, sintesi acido folico) essenziale per
Streptococcus mutans
✓ Poliamine e isobutirrato prodotte da Fusobacterium nucleatum e bastoncini Gram+ favoriscono la
crescita delle spirochete (Treponema microdentium)
✓ Co-aggregazione favorisce la colonizzazione delle superfici e le interazioni metaboliche fra
microrganismi
Rapporti di simbiosi tra i batteri della placca
✓ Singole specie microbiche orali sono caratterizzate da attività glucosidasica e proteasica differente
ma sovrapponibile così che si ha un’azione concertata di diverse specie e sono necessarie per la
completa degradazione delle macromolecole dell’ospite
✓ La crescita di alcuni microrganismi potrà dipendere da quella di altri per la rimozione di carboidrati
terminali dalle catene laterali oligosaccaridiche di glicoproteine con la conseguente esposizione di
zuccheri adiacenti
✓ Varie specie microbiche evitano di competere direttamente per specifici nutrienti e sono quindi in
grado di COESISTERE all’interno del biofilm
SIMBIOSI ANTAGONISTA
✓ Competizione per costituenti nutritivi essenziali
✓ Competizione per i recettori necessari alla colonizzazione
✓ Il pH acido generato dal metabolismo dei carboidrati, di batteri acidogeni ed acidofili, inibisce la
crescita di molte specie microbiche acido-sensibili
✓ Produzione di sostanze antimicrobiche: (membri del gruppo Streptococcus mitis producono H2O2 ;
riduzione dei batteri parodontopatogeni nella placca; alcuni streptococchi producono batteriocine
(proteine ad elevato PM): S. mutans (mutacine) S. sanguis, S. mitior, S. salivarius (streptocine) S.
salivarius produce salivaricina attiva nei confronti di Streptococcus pyogenes
Una elevata concentrazione di ioni Ca++ nella saliva è una condizione predisponente per la formazione del
tartaro. Infatti, la calcificazione della placca porta al tartaro. Il fosfato di calcio si ritrova all’interno dei
batteri e della matrice extracellulare. La mineralizzazione è una conseguenza dell’azione batterica ma anche
dei leucociti della placca subgengivale.
TARTARO SOPRAGENGIVALE, si forma in meno di due settimane. Si presenta sotto forma di piccole
incrostazioni bianche o giallognole che ricoprono la superficie del dente intorno all’orlo gengivale. Le
gradazioni di colore vanno dal bianco al nero.
E’ costituito da:
✓ La componente inorganica è costituita prevalentemente dal 75,9 % di fosfato tricalcico Ca3(PO4)2 e
da altri sali. Almeno due terzi della componente inorganica si presenta sotto forma cristallina: il
prevalente è lidrossiapatite Ca5(PO4)3(OH) (58%)
✓ La componente organica è costituita da una miscela di proteine, polisaccaridi, cellule epiteliali,
leucociti e alcuni tipi di microrganismi ed è presente nella glicoproteina salivare. Una percentuale
variabile tra l’1.9% e il 9.1% della componente organica è costituita da carboidrati.

TARTARO SOTTOGENGIVALE ha un colore rossiccio per la presenza di piccole emorragie gengivali. E’ più
consistente e si deposita nelle profondità del solco gengivale. Trovandosi al di sotto della gengiva non è
immediatamente visibile e contribuisce alla formazione della tasca parodontale collegata alla parodontite.
Il tartaro sottogengivale provoca spesso alitosi.
L’igiene orale quotidiana non è sufficiente a rimuovere placca e batteri in particolar modo negli spazi
interdentali e in eventuali sacche presenti all’interno delle pareti gengivali.
Il tartaro provoca l’infiammazione permanente delle gengive e il più spesso è il responsabile delle malattie
parodontali
Al fine di evitare l’insorgere di carie e il propagarsi di patologie come piorrea e gengivite è necessario la
rimozione meccanica del tartaro.
I prodotti che si usano per prevenire la formazione del tartaro contengono zinco o polifosfati in grado di
inibire la mineralizzazione rallentando così l’accrescimento dei cristalli e riducendo la coalescenza.
Questi composti possono inoltre esercitare un’attività antimicrobica inibendo l’ATP sintetasi un enzima
importante per il controllo del pH intracellulare dei batteri orali.
Nel tartaro sono state individuate 22 specie, ma predominano per lo più Streptococchi e Actinomiceti.
Tra i vari batteri ricordiamo B. matruchotii che è in grado di incorporare calcio e fosfato per formare
depositi intracellulari di fosfato di calcio.