Microbiologia Degli Alimenti (Testo)

Prof. E.
Neviani, Appunti di Microbiologia degli Alimenti
Microrganismi e analisi dei microrganismi

Introduzione
Gli alimenti sono prodotti molto particolari caratterizzati dallessere, nel loro insieme,
indispensabili alla vita e dallavere un impatto diretto sulla salute e sul benessere delluomo.
Nel 2003 lindustria alimentare italiana divenuta il secondo settore produttivo nazionale. La
produzione di alimenti non , da tempo, pertanto un settore marginale di intervento ma coinvolge
risorse, lavoro e investimenti importanti che sono parte essenziale delleconomia nazionale. Inoltre
lindustria alimentare coinvolge un numero di utenti enorme se comparato a quello di altri settori. Il
termine consumatori, in questo caso tende per numero a sovrapporsi a quello degli esseri viventi.
Si pu scegliere la tipologia di alimento da consumare ma non di evitare in toto il consumo.
In termini generali garantire la sicurezza degli alimenti e, quindi, la qualit della vita del
consumatore un compito prioritario di chi produce o comunque di tutti gli operatori che
partecipano alla filiera di produzione degli alimenti.
La sicurezza deve essere considerata una conditio sine qua non della qualit di un alimento. Anzi
parte integrante della qualit stessa, senza la quale, questultima non pu esistere. Allo stesso
tempo la necessit e la volont di sicurezza devono fare i conti con la possibile realizzazione
tecnologica. E ben noto che la pur auspicabile sicurezza assoluta (rischio zero) nella filiera di
produzione agro-alimentare , purtroppo, quasi sempre tecnicamente irrealizzabile; la presenza di
pericoli di differente natura (presenza, sopravvivenza o contaminazione delle materie prime, dei
semilavorati o dei prodotti finiti da parte di agenti biologici, chimici o fisici) ed il rischio che
questi si concretizzino riscontrabile sia alla produzione e trasformazione della materia prima, che
nel corso della commercializzazione e conservazione del prodotto finito.
Il rischio pu essere ridotto ai minimi termini, ma esiste sempre una probabilit, anche minima,
che un evento negativo possa accadere. La frequenza con cui particolari eventi negativi, con
conseguente rischio per la salute del consumatore, possono avvenire, varia da prodotto a prodotto,
in relazione a molti fattori di ordine biologico e tecnologico che saranno pi approfonditamente
discussi in seguito.
La certezza assoluta dellassenza di pericolo per alcuni prodotti potrebbe comportare limpiego di
trattamenti tecnologici di intensit tale da danneggiare e rendere inappetibile lalimento stesso; ad
esempio possibile impiegare trattamenti termici di intensit e durata che rendano impensabile la
sopravvivenza di qualsiasi forma di contaminazione biologica ma, al contempo, gli stessi
trattamenti indurrebbero modificazioni profonde delle caratteristiche nutrizionali ed organolettiche
dellalimento tali da renderlo non edibile.
Nel determinare la realizzabilit, o meglio la possibilit di raggiungere, livelli di elevatissima
sicurezza anche laspetto economico ha un rilievo essenziale; garantire la sicurezza comporta infatti
dei costi che devono essere proporzionati al valore intrinseco del prodotto. La sicurezza non
dovrebbe pertanto diventare un valore aggiunto dellalimento, da tradurre in costo aggiuntivo come
per altri fattori di pregio, ma deve essere condizione preliminare alla commercializzazione del
prodotto. Il prodotto sicuro non pu essere considerato una specialit per nicchie di consumo. La
salubrit deve essere garantita quindi per tutti i consumatori dai banchi delle migliori botteghe
specializzate in prodotti di alta gamma agli scaffali degli hard discount. Ci nonostante la
sicurezza, come detto, impone dei costi di produzione e questi costi devono essere compatibili, allo
stesso tempo, con la garanzia della salute del consumatore e con la sopravvivenza delle produzioni.
Deve esistere un livello soglia di sicurezza, il pi elevato possibile, che deve essere
obbligatoriamente raggiunto, al di sotto del quale la commercializzazione deve essere evitata ed il
consumatore allertato.
Sia nei paesi in via di sviluppo che in quelli industrializzati, anche se con differenti motivazioni e
cause, le malattie indotte dalla presenza di microrganismi patogeni negli alimenti rimane una delle
maggiori cause di malattia per gli uomini. Secondo i dati forniti dalla World Health Organization
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(WHO) le morti conseguenti alle tossinfezioni alimentari, considerando anche quelle imputabili al
consumo di acqua non potabile, superano ampiamente i venti milioni lanno. Ovviamente, i casi di
malattie ad esito non letale indotte dal consumo di alimenti si possono misurare in un ordine di
fattori molto superiore.
Conseguentemente tutto il comparto alimentare deve considerare la valutazione dei rischi di
origine microbiologica associati alla produzione, il loro monitoraggio e la loro costante riduzione,
uno dei settori di intervento prioritari.
Il mondo dei microrganismi
La cellula
Tutti gli esseri viventi sono costituiti da cellule. Si tratta di strutture biologiche che contengono
linformazione di quanto necessario alla sopravvivenza della cellula ed il sistema biochimico di
realizzazione di questa informazione. La cellula di fatto un contenitore che trattiene
selettivamente al suo interno il necessario per lo sviluppo, la moltiplicazione e leventuale
differenziazione. Questo particolare contenitore biologico attraverso una serie di differenti barriere
definisce il suo rapporto con lambiente esterno, sia che questo sia rappresentato da materia
inanimata o, piuttosto, da altre cellule viventi ad esso correlate o estranee.
Il numero di cellule che contribuisce alla morfologia ed al funzionamento degli organismi
appartenenti al mondo vivente oscilla dalla singola cellula ai miliardi di unit. In particolare il regno
animale e vegetale sono spesso caratterizzati da organismi costituiti da un numero di cellule
differenziate e specializzate che si organizzano in tessuti ed organi con differenti funzioni
fisiologiche, variabile da individuo a individuo ma, comunque, sempre molto elevato.
I microrganismi, che sono una parte essenziale del mondo vivente, al contrario, sono per lo pi
unicellulari. In questo senso si tratta di strutture viventi singolari, se comparate alla complessit ed
allorganizzazione degli organismi superiori.
I microrganismi sono infatti forme di vita microscopiche, anche molto differenti le une dalle altre
per morfologia, fisiologia e metabolismo. Nel caso dei batteri le loro dimensioni possono variare
da poche frazioni decimali di micron ad alcune unit, come nel caso dei bacilli; i lieviti presentano
cellule pi grandi rispetto ai batteri con dimensioni di norma comprese tra i due e i dieci micron;
le muffe, che invece presentano strutture pluricellulari ad ife, possono raggiungere dimensioni
maggiori.
Se confrontata con levoluzione delle conoscenze scientifiche in genere, la presa di conoscenza da
parte delluomo di queste semplici forme di vita stata molto tardiva. La conferma dellesistenza di
un mondo vivente invisibile, o troppo piccolo per essere notato ad occhio nudo, risale infatti al
1600, quando fu scoperto il microscopio. Da quel momento i dubbi e le ipotesi si trasformarono in
evidenze sperimentali e si svilupp la microbiologia. Negli anni successivi le ricerche dei primi
pionieri di questa scienza trovarono concrete connessioni tra la presenza dei microrganismi e la vita
delluomo: si compresero, ad esempio, i collegamenti tra alcuni microrganismi e la comparsa di
malattie o le cause della modificazione degradativa di differenti prodotti. La produzione di alimenti
fermentati come lo yogurt o il formaggio considerata fino a quel momento come magica trova in
questo modo una sua iniziale giustificazione scientifica.
I microrganismi, allo stato attuale, sono compagni di viaggio, coinquilini del nostro mondo con i
quali necessario trovare forme di coesistenza efficaci, sicure ed anzi possibilmente vantaggiose.
Come anticipato, in genere col termine di microrganismi si definiscono gli esseri viventi
unicellulari, come i batteri e i lieviti, oppure capaci di formare strutture pluricellulari, come nel caso
delle ife del micelio delle muffe, caratterizzate da strutture pi articolate costituite tuttavia da
cellule tutte simili tra loro.

Si tratta comunque di organismi viventi molto semplici, se commensurati a forme di vita superiore
come quelle presenti nel regno vegetale ed animale, che al contrario comprendono forme di vita
pluricellulari ed in particolare un elevato grado di differenziazione, organizzazione e
specializzazione.
Le cellule degli eucarioti superiori, essendo solo parte di organismi pi complessi, pur contenendo
nel loro genoma tutte le informazioni necessarie allo sviluppo dellindividuo, grazie a complessi
sistemi di regolazione, ne esprimono solo la parte funzionale, in relazione ai compiti della cellula in
quella parte dellorganismo ed alla fisiologia dellessere vivente.
Nel mondo microbico, al contrario, lunit fondamentale della vita, la cellula, non differenziata e
contiene ed esprime tutte le potenzialit fisiologiche e metaboliche che le permettono di
sopravvivere e moltiplicarsi anche singolarmente; cellula e organismo in questo caso sono entit
che si sovrappongono e di fatto ogni cellula lorganismo stesso.
In verit altre forme di vita ancora pi semplici, i virus, sono assimilabili al mondo microbico. I
virus possiedono una struttura sub-cellulare, composta solo da un singolo o doppio filamento di
DNA o RNA, e necessitano per moltiplicarsi di cellule ospiti rispetto alle quali si comportano come
veri parassiti.
I principali componenti del mondo microbico noti fino ad oggi sono i batteri, i lieviti e le muffe;
distinguibili in differenti famiglie, generi, specie e biotipi che meglio tratteremo in seguito.
I batteri sono singole cellule procariote, pi semplici rispetto alla cellula eucariote, che si
moltiplicano per duplicazione binaria del singolo individuo (Figg. 1 e 2). I lieviti sono eucarioti
unicellulari dotati di riproduzione sessuata o asessuata (Fig. 3). Le muffe sono invece eucarioti
pluricellulari e possono creare strutture ramificate in ife che le rendono visibili senza lausilio del
microscopio; a differenza di quanto osservabile negli eucarioti superiori, tutte le singole cellule
sono uguali e totipotenti ed ognuna di loro in grado di moltiplicarsi indipendentemente dalle altre.
Alcuni batteri, gli sporigeni, sono in grado di dare origine a forme di resistenza, le spore, che
lasciano la cellula in uno stato di letargo metabolico e le permettono di sopravvivere per lungo
tempo, in condizioni ostili ed in assenza di sostanze nutritive. In condizioni ottimali la spora
germina e d nuovamente origine alla cellula batterica vitale (Fig. 4).
Nel caso delle muffe le spore sono delle forme cellulari utili alla moltiplicazione; si formano sulla
superficie delle ife del micelio e quindi trasportate nellambiente da vettori come aria, acqua, insetti
o altro, contaminano nuovi substrati e permettono a nuove ife di formarsi ed invadere il prodotto.
La cellula microbica la pi piccola unit dotata di vita autonoma; i virus sono infatti strutture di
dimensioni minori ma incapaci di riprodursi in assenza di organismi ospiti che supportino la
replicazione della loro matrice costituita da sequenze di DNA o RNA.
La dimensione e la forma della cellula sono definite dalla parete cellulare che rappresenta non solo
unimpalcatura che dona rigidit e resistenza meccanica al microrganismo, ma anche il suo
confine.
La parete cellulare la barriera che separa linterno della cellula dallambiente, definisce lin e lout
cellulare; anche il distretto cellulare, che essendo a diretto contatto con lesterno, agisce come
elemento sia di tutela e difesa della cellula che di comunicazione e rapporto con lhabitat e con le
sue modificazioni.
La struttura parietale impedisce lesplosione o limplosione della cellula in ragione del differenziale
di pressione rispetto lesterno e, pi in generale, permette che le sollecitazioni esterne e gli urti
cellulari non abbiano effetti drammatici per il microrganismo.
La parete della cellula procariotica costituta principalmente da peptidoglicano, acidi teicoici,
lipidi e proteine. Il peptidoglicano una struttura polimerica costituita da acido acetilmuramico e
N-acetilglucosamina cui sono legate altre catene peptidiche che conferisce la rigidit alla cellula, .
In base alla minore o maggiore presenza di lipidi nella parete, i batteri si differenziano
rispettivamente in Gram + e Gram . La differente composizione, utilizzata a fini tassonomici,
conferisce caratteristiche funzionali e di capacit di trasporto, di resistenza o sensibilit ad enzimi
(muramidasi) e sostanze antibatteriche e pi in generale di interazione con lambiente.
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Nella parte esterna della parete possono essere presenti strutture flagellari, che facilitano la mobilit
della cellula e i fenomeni di chemiotassi, ed i pili e le fimbrie, che invece sembrano favorire
ladesione a differenti superfici. La parete pu essere ricoperta da capsule polisaccaridiche e da
strutture proteiche extraparietali, dette S-layer il cui ruolo ancora in discussione.
La parete anche coinvolta nei fenomeni di aggregazione cellulare, adesione alle superfici,
resistenza e/o recepimento di particelle virali ed in altre funzioni fisiologiche che travalicano la
semplice resistenza strutturale.
La parete di alcuni microrganismi sede di enzimi necessari per lidrolisi di macromolecole
presenti nel substrato, le cui dimensioni sono incompatibili con lingresso nella cellula. Lattivit
enzimatica favorisce la produzione di composti di minor taglia molecolare che possono penetrare
allinterno del microrganismo, dove vengono utilizzati a fini plastici o per il metabolismo
energetico. Per esemplificare questo tipo di funzionamento si pu prendere ad esempio il sistema
proteolisi di alcuni batteri che dispongono di proteasi, peptidasi ed enzimi ad attivit degradativi
o di trasformazione degli aminoacidi. Si tratta di sistemi complessi differentemente collocati nella
cellula il cui complesso di attivit permette una scissione delle macromolecole proteiche allesterno
della cellula, lingresso e la completa demolizione ed il riutilizzo nel citoplasma.
In contatto con la parete troviamo la membrana citoplasmatica; si tratta di un distretto cellulare a
carattere lipofilo costituito in gran parte da una variet di molecole lipidiche complesse, in
particolare fosfolipidi, organizzate in modo da rivolgere verso lesterno le componenti idrofile. La
funzione principale di questa struttura riconducibile a quella di un filtro che discrimina ci che
pu entrare ed uscire dalla cellula. Trattiene il citoplasma e attraverso dei sistemi di trasporto, attivi
o passivi, seleziona lingresso dei nutriliti e lo smaltimento dei residui metabolici di scarto. Si tratta
di unazione selettiva che per alcune molecole comporta una diffusione facilitata e per altre dei
sistemi di trasporto attivo che coinvolgono specifiche proteine di trasporto e carriers.
In realt il confine tra parete e membrana non sempre semplice da definire, in particolare in alcune
cellule procariote. Alcuni strutture di trasporto appartengono ad entrambi i distretti cellulari o si
trovano alla loro interfaccia. Alcune proteine ad attivit enzimatica appartengono alla parete per la
loro parte idrofila mentre le zone idrofobiche della molecola penetrano nella membrana e si
intrecciano con le sue componenti strutturali. Nei batteri Gram- i rapporti tra parete cellulare e
membrana sono pi intrecciati: la membrana costituita da due strati, uno esterno ed uno interno,
avvolge la parete cellulare. In alcuni enterobatteri nella membrana esterna si ritrovano componenti
lipopolisaccaridiche essenziali allattivit di specifiche endotossine.
Alla membrana sono associate differenti attivit enzimatiche necessarie per lulteriore demolizione
di specifici substrati, nel trasporto selettivo di zuccheri, peptidi e sali minerali e nel mantenimento
delle condizioni chimico-fisiche ottimali del citoplasma. La membrana una barriera osmotica
selettiva, deputata a mantenere un ambiente intracellulare il pi favorevole possibile rispetto alle
condizioni esterne. Il mantenimento di condizioni citoplasmatiche di acidit o di concentrazione
ionica, compatibili con la corretta conformazione delle proteine citoplasmatiche e con lattivit
enzimatica intracellulare, affidato a sistemi di trasporto attivo presenti nella membrana che creano
e mantengono un differenziale di concentrazione con lesterno di composti potenzialmente tossici o
comunque dannosi alla cellula. Queste attivit costano energia alla cellula e variano a seconda della
specie.
Nel citoplasma della cellula avvengono i biochimismi essenziali alla vita del microrganismo. Il
citoplasma contiene tutti gli elementi che permettono il funzionamento della cellula. Semplificando,
il funzionamento del microrganismo dal punto di vista biochimico garantito dal flusso di
informazioni DNA-RNA-Proteine; il potenziale della cellula contenuto nel DNA, in relazione alla
fase di crescita cellulare e degli stimoli che provengono dallambiente, viene prima trascritto in
RNA e quindi tradotto in proteine a differente funzionalit metabolica e fisiologica. Lespressione
del genotipo in fenotipo soggetta a regolazioni rigorose e flessibili, che da un lato non consentono
la produzione di ci che non utile alla cellula e dallaltro garantiscono la capacit del
microrganismo di rispondere, reagire, alle sollecitazioni dellambiente.
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Nel citoplasma oltre il cromosoma batterico possiamo trovare i plasmidi, ovvero filamenti di DNA
extracromosomali dotati di autonoma capacit di replicazione. I plasmidi possono codificare per
fenotipi di grande importanza per la cellula, come attivit enzimatiche determinanti per la
fermentazione di alcuni zuccheri, la capacit di produrre alcune sostanze ad attivit antibiotica, la
resistenza ad antibiotici, la sensibilit o la resistenza a batteriofagi, la produzione di enzimi
proteolitici e di composti aromatici. I plasmidi possono integrarsi nel cromosoma batterico oppure
rimanere in forma libera nel citoplasma. Per loro natura i plasmidi non si replicano stabilmente
come il DNA cromosomale e i caratteri fenotipici codificati da plasmidi possono essere non stabili.
La frequenza con cui possono essere persi i plasmidi nel corso della riproduzione cellulare
variabile da specie a specie e rappresenta uno degli elementi che giustificano le modificazioni che
insorgono nel potenziale del microrganismo. Alcune specie batteriche hanno un elevata capacit
di trasferire in altri microrganismi alcuni plasmidi, detti coniugativi. Questo fenomeno di grande
rilievo nellinsorgere di nuovi biotipi con differenti potenzialit metaboliche; nel caso dei germi
patogeni lacquisizione di plasmidi che inducano vantaggi competitivi o resistenze ambientali
maggiori pu rappresentare un pericolo per linsorgenza di nuovi germi a maggiore efficacia
patogena.
Nel citoplasma sono inoltre presenti i ribosomi, organelli che rappresentano il distretto cellulare
dedicato alla traduzione del RNA messaggero ed alla sintesi delle proteine. Sempre nel citoplasma
dei procarioti possono essere presenti inclusioni di materiale nutritivo di riserva.
Lattivit enzimatica oltre che dalla presenza di specifici substrati e dalla concentrazione dei
prodotti condizionata da differenti parametri chimico-fisici quali lacidit, la disponibilit di acqua
libera, la forza ionica e la temperatura. Come gi sottolineato, per il funzionamento della cellula
microbica risulta essenziale mantenere il citoplasma nelle condizioni che garantiscano la stabilit e
delle attivit enzimatiche essenziali alla vita cellulare (Tab.1.1).
La capacit di adeguarsi a differenti condizioni di acidit, concentrazione salina e temperatura sono
parametri impiegati per il riconoscimento delle diverse specie microbiche ed hanno un evidente
significato tecnologico in relazione della capacit della cellula di adattarsi al substrato ed alle
condizioni di processo.
Alcune specie bacillari Gram + sono caratterizzate dalla possibilit di formare endospore, forme di
resistenza elaborate nel citoplasma la cui sintesi viene indotta in differenti momenti della vita
cellulare. I fenomeni che determinano la sporificazione in determinati momenti non sono ancora
completamente compresi anche se assodato che la sporificazione coinvolge le cellule in fase di
difficolt metabolica conseguenti a carenza di nutriliti o a fenomeni ambientali ostili alla forma
vegetativa.
Ogni cellula pu generare una sola spora. La formazione di endospore regolata da un numero
molto elevato di geni e da fattori sigma che in risposta a stimoli ambientali inducono la produzione
di profonde modificazione nella composizione, nella morfologia e nella fisiologia del batterio. Tali
modificazioni iniziano con una introflessione della membrana citoplasmatica, che quindi ingloba il
cromosoma batterico e poi sviluppa un sistema articolato di membrane che circondano e
definiscono lendospora.
La spora, di forma sferica od ovoidale, una forma di resistenza cellulare fortemente disidratata,
ricca di dipicolinato di calcio (circa il 10% del peso della spora), una sostanza che favorisce la
resistenza termica e alle sostanze chimiche, ed dotata di una complessa struttura di parete e
membrane. Grazie a queste caratteristiche le spore batteriche possono sopravvivere a lungo in
condizioni di quiescenza e possiedono capacit di resistenza incompatibili con la forma vegetativa
e superiori di numerosi ordini di fattori.
Il fenomeno speculare alla sporificazione la germinazione, processo nel corso del quale a partire
dalla spora si ricrea la forma vegetativa della cellula batterica (Fig. 4). Normalmente questo
fenomeno molto pi veloce rispetto alla sporificazione e viene favorito da trattamenti di stress
subletali, quali trattamenti termici a 70-80 C per alcuni minuti. La germinazione si articola in
differenti fasi che si comportano con lesione della tunica sporale e la formazione e lesocrescita
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della forma vegetativa. Sia la sporificazione che la germinazione comportano lattivazione di geni
specifici, che inducono la profonda modificazione della cellula, e sono quindi soggetti a fattori di
regolazione rigorosi.
Gli eumiceti sono eucarioti, quindi microrganismi dotati di una struttura cellulare pi organizzata,
che si differenziano dai batteri per le maggiori dimensioni e, come detto, per la struttura cellulare
pi complessa. Morfologicamente gli eumiceti si presentano sotto due forme: quella unicellulare,
tipica dei lieviti, che solo in rari casi si organizza in strutture pseudomiceliari, e quella
multicellulare con strutture filamentose, dette ife, tipica delle muffe. In questultimo caso linsieme
delle ife costituisce il micelio che pu raggiungere dimensioni anche molto grandi; si pu
distinguere il micelio vegetativo che aderisce al substrato, assorbe i nutriliti e si propaga sulla
superficie, ed uno aereo, pi superficiale, dove si formano le spore. Queste spore hanno
principalmente una funzione riproduttiva ma, essendo maggiormente resistenti agli stress ambientali
rispetto alle cellule miceliari rappresentano anche una forma di resistenza per la muffa, sebbene tale
resistenza sia sicuramente inferiore e non paragonabile a quella osservabile nelle spore batteriche.
Le cellule dei miceti si differenziano dai batteri in quanto presentano un nucleo organizzato, che
contiene il cromosoma, circondato da una membrana; esternamente le cellule sono dotate di una
capsula extra-parietale, una parete ed una membrana citoplasmatica. Nel citoplasma si riconoscono
il reticolo endoplasmatico, i mitocondri ed i ribosomi.
Cellula procariota i batteri
I batteri sono cellule microbiche procariote; tra i batteri numerose sono le specie utili nel settore
alimentare, ma tra questi microrganismi troviamo anche la maggior parte delle specie direttamente
patogene per luomo. Le cellule procariote sono morfologicamente riconducibili fondamentalmente
a 4 morfologie principali
1. Forma coccica o sferica (fig.1)
2. Forma bacillare o a bastoncino (fig.2)
3. Forma a vibrio o bastoncino ricurvo
4. Forma a spirale
La parete della cellula procariote costituta principalmente da peptidoglicano, ovvero da una
struttura polimerica costituita da acido acetilmuramico e N-acetilglucosamina che conferisce la
rigidit alla cellula, cui sono legate altre catene peptidiche. In base alla minore o maggiore presenza
di lipidi nella parete, i batteri si differenziano rispettivamente in Gram + e Gram . La differente
composizione non implica solo laspetto tassonomico, ma anche funzionale e di capacit di
trasporto, di resistenza o sensibilit ad enzimi (muramidasi), sostanze antibatteriche e pi in
generale di interazione con lambiente.
Nella parte esterna della parete possono essere presenti strutture flagellari, che facilitano la mobilit
della cellula facilitando i fenomeni di chemiotassi, i pili e le fimbrie, che sembrano favorire
ladesione a differenti superfici. La parete pu essere ricoperta da capsule polisaccaridiche e da
strutture proteiche extraparietali, dette S-layer il cui ruolo ancora in discussione. Si tratta di
strutture i cui monomeri sono sintetizzati allinterno della cellula e quindi trasportati alla superficie.
Nei batteri Gram+ a ridosso della parete, allinterno della cellula, si trova la membrana
citoplasmatica nella quale sono presenti i mesosomi, caratteristiche invaginazioni che svolgono un
ruolo nellambito della replicazione cellulare.
Nei batteri Gram- i distretti della parete cellulare e della membrana sono pi intrecciati. La
membrana cellulare costituita da due strati , uno esterno ed uno interno, che avvolgono la parete
cellulare. Nei batteri Gram - , di norma , lo strato di pepticoglicano che costituisce la parete molto
pi sottile rispetto a quello caratteristico della cellula Gram +. Tra la sottile parete e la membrana
interna si trova lo spazio periplasmico che un distretto cellulare dove si concentrano particolari
attivit enzimatiche. La membrana esterna presenta dei canali di ingresso preferenziali e selettivi
per alcune molecole, detti porine, che permettono la permeazione delle sostanze idrofile nella
matrice liofila. In alcuni batteri patogeni (enterobatteri) nella membrana esterna si ritrovano
componenti liposaccaridiche essenziali allattivit di specifiche endotossine. Per esempio nella
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membrana esterna di Salmonella sono presenti unit polisaccaridiche, che costituiscono un sito
antigenico, utilizzato anche per la classificazione della specie.
Come detto nel citoplasma troviamo il cromosoma batterico. Sempre nel citoplasma possiamo
trovare i plasmidi; si tratta di filamenti di DNA extracromosomali dotati di autonoma capacit di
replicazione. I plasmidi possono codificare per fenotipi di grande importanza per la cellula, come
attivit enzimatiche determinanti per la fermentazione di alcuni zuccheri, la capacit di produrre
alcune sostanze ad attivit antibiotica, la resistenza ad antibiotici, la sensibilit o la resistenza a
batteriofagi, la produzione di enzimi proteolitici e di composti aromatici. I plasmidi possono
integrarsi nel cromosoma batterico oppure rimanere in forma libera, autonoma, nel citoplasma. Per
loro natura i plasmidi non si replicano stabilmente come il DNA cromosomale e i caratteri
fenotipici portati da plasmidi possono essere instabili. La frequenza con cui possono essere persi i
plasmidi nel corso della riproduzione cellulare variabile da specie a specie e rappresenta uno
degli elementi che giustificano le modificazioni che insorgono nel potenziale del microrganismo.
Alcune specie batteriche hanno una elevata capacit di trasferire in altri microrganismi alcuni
plasmidi, detti coniugativi. Questo fenomeno di grande rilievo nellinsorgere di nuovi biotipi con
differenti potenzialit metaboliche; nel caso dei germi patogeni lacquisizione di plasmidi che
inducano vantaggi competitivi o resistenze ambientali maggiori pu rappresentare un pericolo per
linsorgenza di nuovi germi a maggiore efficacia patogena.
Nel citoplasma sono inoltre presenti i ribosomi, organelli che rappresentano il distretto cellulare
dedicato alla traduzione del RNA messaggero ed alla sintesi delle proteine. Sempre nel citoplasma
dei procarioti possono essere presente inclusioni di materiale nutritivo di riserva.
Alcune specie bacillari Gram + sono caratterizzate dalla possibilit di formare endospore. Si tratta
di forme di resistenza elaborate nel citoplasma la cui formazione viene indotta in differenti
momenti della vita cellulare, solitamente collegati a fattori stress per la cellula. Si forma una sola
spora che quindi si libera della forma vegetativa che si lisa. Questa capacit, che offre grandi
vantaggi per la sopravvivenza della specie batterica, regolata da un numero molto elevato di geni
(alcune centinaia) e da fattori sigma che in risposta a stimoli ambientali inducono la produzione di
profonde modificazione nella composizione, nella morfologia e nella fisiologia del batterio. Tali
modificazioni iniziano con una introflessione della membrana citoplasmatica, che quindi ingloba il
cromosoma batterico e poi sviluppa un sistema articolato di membrane che circondano e
definiscono lendospora.
La spora, di forma sferica od ovoidale, una forma di resistenza cellulare fortemente disidratata,
ricca di dipicolinato di calcio (circa il 10% del peso della spora), una sostanza che favorisce la
resistenza termica e alle sostanze chimiche, ed dotata di una complessa struttura di parete e
membrane. Grazie a queste caratteristiche le spore batteriche possono sopravvivere a lungo in
condizioni di quiescenza e possiedono capacit di resistenza incompatibili con la forma vegetativa
e superiori di numerosi ordini di fattori.
I fenomeni che determinano la sporificazione in determinati momenti non sono ancora
completamente compresi anche se assodato che la sporificazione coinvolge le cellule in fase di
difficolt metabolica conseguenti alla carenza di nutriliti o a fenomeni ambientali ostili alla forma
vegetativa.
Il fenomeno speculare alla sporificazione la germinazione, processo nel corso del quale a partire
dalla spora si ricrea la forma vegetativa della cellula batterica (fig 4). Normalmente questo
fenomeno molto pi veloce rispetto alla sporificazione e viene indotto da trattamenti di stress
subletali. Si articola in differenti fasi che si comportano con lesione della tunica sporale e la
formazione e lesocrescita della forma vegetativa. Sia la sporificazione che la germinazione
comportano lattivazione di geni specifici, che inducono la profonda modificazione della cellula, e
sono quindi soggetti a fattori di regolazione rigorosi.

Cellula Eucariote eumiceti
Gli eumiceti sono microrganismi dotati di cellula eucariota, quindi con una struttura cellulare pi
organizzata. Si tratta di microrganismi largamente diffusi in natura che si differenziano dai batteri
per le maggiori dimensioni e, come detto, per la struttura cellulare pi complessa.
Morfologicamente gli eumiceti si presentano sotto due forme: quella unicellulare, tipica dei lieviti,
che solo in rari casi si organizza in strutture pseudomiceliari, e quella multicellulare con strutture
filamentose, dette ife, tipica delle muffe. In questultimo caso linsieme delle ife costituisce il
micelio che pu raggiungere dimensioni anche molto grandi; si pu distinguere il micelio
vegetativo che aderisce al substrato,assorbe i nutriliti e si propaga sulla superficie, ed uno aereo, pi
superficiale, dove si formano le spore. Queste spore hanno principalmente una funzione riproduttiva
ma, essendo maggiormente resistenti agli stress ambientali rispetto alle cellule miceliari
rappresentano anche una forma di resistenza per la muffa, sebbene tale resistenza sia sicuramente
inferiore e non paragonabile a quella osservabile nelle spore batteriche.
Gli eumiceti, oltre al meccanismo di fissione binaria mitotica, tipico dei batteri, possiedono sia
sistemi di riproduzione sessuata attraverso le spore che asessuata con formazione di conidi o
sporangiospore. Per la riproduzione sessuata necessario che due cellule specializzate, chiamate
gameti, si fondano assieme. Le spore sessuate possono essere prodotte entro aschi, cio conitori a
forma di sacchi, o allesterno nei basidiomiceti.
Le cellule dei miceti si differenziano da quelle procariote dei batteri in quanto presentano un nucleo
organizzato, che contiene il cromosoma, circondato da una membrana cellulare; esternamente le
cellule sono dotate di una capsula extra-parietale, una parete ed una membrana citoplasmatica. Nel
citoplasma si riconoscono il reticolo endoplasmatico, i mitocondri ed i ribosomi.
Metabolismo microbico
Le cellule microbiche, come ogni forma di vita, necessitano per crescere e moltiplicarsi di energia
e di materiale per costruire o sostituire i componenti cellulari.
Lenergia pu essere recuperata dalla luce, da parte degli organismi fotosintetici, o dallossidazione
di composti chimici, organici od inorganici, mentre il carbonio necessario per la costruzione del
materiale biologico della cellula pu essere recuperato alternativamente dalla materia organica
(eterotrofi) o dalla CO2 (autotrofi). I principi della termodinamica definiscono che la materia evolve
spontaneamente verso stati di massima entropia. La vita cellulare al contrario un sistema
organizzato e regolato che funziona solo grazie allapporto di energia che contrasta la naturale
tendenza della materia verso lentropia.
In questo senso la vita della cellula corrisponde ad un flusso di energia e di elettroni creato
attraverso reazioni biochimiche specifiche. Questa energia viene creata attraverso reazioni di
ossidoriduzione.
Il trasporto di energia avviene attraverso la sintesi di molecole che contengono legami ad elevato
livello energetico e che vengono accumulate e quindi rese disponibili per le reazioni di sintesi o
comunque per le trasformazioni energeticamente sfavorevoli. Si tratta di molecole molto reattive
(AMP, ADP, ATP) costituite di adenosina mono- , di- o tri-fosforilate. Il flusso di energia nella
cellula avviene grazie alla formazione o scissione di legami fosforilati con la materia organica e le
differenti forme di adenosina fosforilata costituiscono sistemi di accumulo, riserva, trasporto o
cessione di energia nei diversi processi metabolici.
A fianco del flusso di energia si crea un parallelo flusso di elettroni che permette lalternarsi delle
reazioni di ossido-riduzione coinvolte nei pathway metabolici della cellula. Il flusso di elettroni che
accompagna i processi metabolici nella cellula garantito da altre molecole (NAD-NADH2,
NADP-NADPH2) in grado di acquisire e cedere elettroni e quindi di trasferirli alle reazioni di
ossidoriduzione trasportandoli allinterno dei pathway metabolici della cellula.
I processi di ossidazione che avvengono nella cellula microbica prevedono differenti biochimismi
in relazione al sistema previsto per i processi di ossidoriduzione ed in particolare alla molecola
utilizzata come accettore finale degli elettroni prodotti dallossidazione dei substrati:
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respirazione aerobia, con O2 come accettore finale di elettroni che viene ridotto ad acqua.
respirazione anaerobia, con composti inorganici come accettori finali di elettroni
fermentazione, con composti organici come accettori finali di elettroni
Nella gran parte dei casi i microrganismi di interesse alimentare sono eterotrofi e quindi richiedono
per il loro sviluppo la presenza di sostanza organica.
Nei microrganismi aerobi la materia organica pu essere trasformata completamente ad acqua ed
anidride carbonica. Il rendimento energetico dellossidazione di un monosaccaride con 6 atomi di
carbonio porta alla formazione di 38 molecole di ATP. La respirazione comporta, comunque, in un
primo tempo la produzione di acido piruvico (fase nota come glicolisi) che poi viene trasformato e
completamente ossidato attraverso il ciclo degli acidi tricarbossilici.
I microrganismi anaerobi, che non dispongono di una completa catena enzimatica per il trasporto
degli elettroni allossigeno, devono ridurre altre componenti che si generano nel corso del processo
di fermentazione o che trovano nel substrato. In questo caso il rendimento energetico della
demolizione della sostanza organica molto inferiore rispetto alla respirazione aerobia; da una
molecola di glucosio si possono ottenere al massimo due molecole di ATP.
In entrambi i casi si tratta di rendimenti teorici che come vedremo meglio in seguito risultano
fortemente condizionati e modificati dalle condizioni di crescita e dalla tipologia di substrato.
Lossidazione dei composti organici in acido piruvico comporta la contemporanea riduzione di un
altro composto. Nella cellula questo composto il NAD che viene ridotto a NADH2. In altre fasi
del metabolismo, a sua volta, il NAD viene prodotto per ossidazione del NADH2 e contemporanea
riduzione di altre molecole che funzionano da accettori di elettroni.
Come detto i microrganismi aerobi attraverso una articolata catena di trasporto di elettroni
utilizzano lossigeno come accettore terminale di elettroni. Altri composti come i solfuri e i nitriti
possono fungere da accettori di elettroni nella respirazione anaerobia.
Nel caso della fermentazione laccettore finale di elettroni spesso una molecola organica prodotta
nel corso della degradazione del carboidrato. Di norma lo stesso acido piruvico che pu essere
ridotto ad acido lattico (fermentazione lattica), alcool etilico (fermentazione alcolica) e/o in altre
numerose sostanze in relazione alla metabolismo della specie microbica (Tab. 1.2).
Alri substrati di crescita per i microrganismi possono essere carboidrati a minor peso molecolare
rispetto agli esomonosaccaridi, come zuccheri pentosi oppure acidi organici e alcoli. Anche altre
molecole organiche, come ad esempio peptidi e amminoacidi, possono essere degradate dai
microrganismi con recupero di energia per la cellula.
La capacit di utilizzare le diverse sostanze organiche presenti in natura come risorsa energetica o
in funzione plastica ed il tipo di trasformazione-ossidazione delle stesse, con produzione di nuove e
pi semplici molecole, varia in funzione delle differenti specie microbiche e del potenziale
enzimatico e biochimico delle cellule di quella specie.
Non tutti i microrganismi si adattano a tutti i substrati e le differenti famiglie microbiche presentano
esigenze nutrizionali molto varie e riconducibili alla minore o maggiore capacit della specie di
sintetizzare autonomamente o di recuperare dallambiente le sostanze essenziali per la crescita.
Microrganismi poco esigenti necessitano di forme semplici di carbonio e azoto, mentre i
microrganismi pi esigenti per svilupparsi devono trovare nel substrato specifici carboidrati, forme
azotate pi complesse, vitamine e sali minerali.
Lenergia quindi non di per s sufficiente alla crescita microbica e i differenti microrganismi
presentano diverse esigenze nutrizionali in sostanze essenziali alla crescita ed al funzionamento
della cellula perch non sintetizzabili dai microrganismi.
La presenza nel substrato di quantit sufficienti e nel corretto rapporto di composti essenziali risulta
discriminante nel permettere la crescita batterica delle differenti specie.
Tra i componenti necessari alla crescita microbica alcuni amminoacidi risultano essenziali per la
sintesi delle proteine cellulari e devono essere recuperati dal substrato di crescita. Le proteine e i
peptidi possono essere idrolizzati ad amminoacidi da complessi sistemi enzimatici presenti nelle
differenti specie microbiche. Si tratta di proteasi e peptidasi che idrolizzano con differente livello di
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specificit particolari legami peptidici, sia in relazione al tipo di aminoacido che alla sua posizione
nella catena peptidica. Lattivit enzimatica pu riguardare legami allinterno della sequenza
proteica (endoproteasi) o essere limitata agli amminoacidi disponibili allN-terminale
(aminopeptidasi) o al C-terminale della proteina (carbossipeptidasi). Sono poi note attivit
specifiche su di e tripeptidi. La sequenza di queste attivit enzimatiche permette la degradazione
delle proteine e dei peptidi di maggior taglia permettendo lingresso nella cellula di peptidi a basso
peso molecolare e, quindi, il recupero degli amminoacidi necessari alluptake cellulare. Gli
amminoacidi possono a loro volta essere decarbossilati o deamminati ed ulteriormente trasformati
(Tab. 1.3).
La sostanza organica utilizzata e trasformata dalla cellula viene per la maggior parte, ad esclusione
delle componenti utili in senso plastico, riversata allesterno della cellula. Si tratta a tutti gli effetti
di un sistema di gestione dei rifiuti metabolici; leconomia cellulare prevede lingresso di ci che
utile, la trasformazione e la permanenza di ci che necessario, mentre i residui dannosi od inutili
alla cellula, dopo eventuale trasformazione, vengono espulsi.
Come detto il potenziale metabolico della cellula microbica pu essere anche molto differente da
specie a specie. La capacit di utilizzare differenti fonti energetiche e le esigenze nutrizionali sono
determinate dalla presenza nel genoma cellulare di specifici segmenti di DNA in grado di codificare
la trascrizione-traduzione di proteine ad attivit enzimatica essenziali allutilizzo dei differenti
substrati o alla sintesi di componenti cellulari specifiche.
Lassenza o la presenza nel genoma di una cellula batterica di alcune di queste sequenze geniche
determina il potenziale metabolico della cellula e di conseguenza la capacit di utilizzare e
trasformare differenti substrati e la necessit di procurarsi o meno dei precursori, non sintetizzabili,
preformati dallambiente.
Si deve inoltre ricordare che le attivit enzimatiche che esplicano questo potenziale metabolico
sono fortemente regolate sia da fattori intriseci alla cellula che ambientali. Non tutto il messaggio
presente nel genoma cellulare viene necessariamente espresso dalla cellula e si traduce in attivit
biochimica. La cellula microbica nella sua semplicit ed essenzialit di funzionamento prevede dei
sistemi di regolazione che economizzano la sua attivit e allo stesso tempo ottimizzano il suo
rapporto con il mondo extra-cellulare.
Solo il necessario alla sopravvivenza viene espresso. La definizione di questo necessario
deriva dal sovrapporsi delle esigenze metaboliche della cellula, dalla sua capacit di adattarsi alle
condizioni ambientali (temperatura, disponibilit di acqua, acidit, disponibilit di ossigeno, etc.) e,
quindi, dalla sua possibilit di trovare risorse energetiche idonee da dedicare al mantenimento di un
ambiente favorevole alla crescita.
La regolazione dellespressione genica favorisce la capacit di adattamento di una forma di vita
unicellulare a differenti ambienti; resta il fatto che solo ci che presente nel DNA della cellula pu
essere espresso e, quindi, specie che possiedono genomi diversi possono adattarsi preferenzialmente
o selettivamente a nicchie ecologiche differenti.
I microrganismi meno esigenti saranno i pi diffusi nellambiente, mentre i pi esigenti li
ritroveremo solo in specifiche matrici complesse. Alla variet di potenziale metabolico delle varie
specie microbiche corrispondono specularmene differenti modificazioni del substrato; la sostanza
organica trasformata in tappe successive in composti sempre pi semplici, in alcuni casi giunge
fino alla sua completa mineralizzazione.
In conclusione fenomeni biochimici associati alla moltiplicazione dei microrganismi possono
differire in modo significativo sia qualitativamente che quantitativamente in relazione al tipo di
microrganismo, alle caratteristiche della matrici ed alle condizioni ambientali al contorno.
La modificazione della sostanza organica che avviene nel corso dello sviluppo microbico pu
quindi indurre variazioni anche molto importanti nella composizione del substrato. La produzione
di acidi organici o di alcool etilico dovuta ai processi di fermentazione ha come conseguenza
immediata linibizione, parziale o totale, di altri microrganismi, in particolare dei batteri putrefattivi
e di buona parte dei patogeni, favorendo lincrementata conservabilit degli alimenti. Anche la
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salubrit dellalimento entra in gioco come risultato del metabolismo cellulare nel caso di
produzione di cataboliti tossici per luomo.
Ne consegue che la valutazione dellutilit o della pericolosit dei microrganismi viene definita dai
vantaggi che luomo pu ottenere dalle trasformazione che questi sono in grado di indurre in alcune
matrici; questo il punto di vista delluomo, ma in realt, sempre semplificando, per la cellula
batterica si tratta semplicemente di ottenere energia per sopravvivere.
Versatilit e capacit di adattamento
In tutti gli ambienti dove luomo riesce a sopravvivere anche i microrganismi, essendo forme di vita
pi semplice, possono trovare le condizioni per svilupparsi. La semplicit dellorganizzazione della
vita di questi organismi microscopici ne favorisce la proliferazione e la diffusione. I microrganismi,
infatti essendo molto meno evoluti e complicati rispetto agli organismi superiori, risultano molto
resistenti ed in grado di popolare ambienti anche molto ostili. Ancora in anni recenti sono state
evidenziate delle famiglie di batteri estremofili rinvenuti sui bordi di vulcani o nelle solfatare e
quindi adattati a condizioni ritenute inconcepibili per ogni forma di vita superiore.
Uno degli elementi chiave nella comprensione del mondo microbico la capacita della cellula
microbica di replicarsi e riprodursi in tempi molto inferiori a quelli degli altri esseri viventi. Questa
replicazione permette che a partire da una singola cellula si producano miliardi di microrganismi
copia del progenitore comune.
Lelevato ritmo di riproduzione favorisce il fatto che qualora intervengano eventi, esterni o
intrinseci alla cellula, che inducono mutazioni nelle sue caratteristiche, queste, se favorevoli alla
cellula stessa, prendano il sopravvento favorendo le cellule in grado di meglio adattarsi
allambiente.
Si tratta di modificazioni di popolazione che possono avvenire in tempi relativamente brevi rispetto
a quanto avviene nel resto del mondo vivente e che, a volte, permettono alla cellula di sopravvivere
ad eventi per essa drammatici come, ad esempio, la presenza di una sostanza ad azione
antibatterica, una temperatura elevata, un pH troppo acido. In questi casi, se anche una sola delle
cellule batteriche della specie, tra le migliaia che possono essere presenti in un dato ambiente,
presenta delle mutazioni occasionali del suo patrimonio genetico che le permettono di sopravvivere
allevento ostile, questa che prender il sopravvento. In questo modo si selezioner una
discendenza di cellule simili alla progenitrice caratterizzate da una specifica resistenza.
Ovviamente, come in ogni altro aspetto del metabolismo e della vita della cellula microbica, la
selezione e linsorgere di resistenza ed adattamento non sono solo fenomeni qualitativi ma anche
laspetto quantitativo rimane determinante per alcune espressioni.
Unitamente alla naturale capacit di reagire alle sollecitazioni dellambiente la capacit di mutare e
di adattarsi possono essere considerati i fenomeni di maggior importanza nel determinare la
capacit delle cellule microbiche di adattarsi e svilupparsi in ambienti estremi o in condizioni
sfavorevoli.
Anche la presenza di organismi della stessa specie ma con caratteri metabolici e fisiologici
differenti (biodiversit) pu essere ricondotta a fattori di selezione ed adattamento che hanno
favorito lo sviluppo elettivo, in alcune specifiche nicchie ecologiche, di varianti microbiche
portatrici di caratteri che nel contesto della nicchia li rendevano pi idonei a sopravvivere e
prendere il sopravvento su altri biotipi. La biodiversit pu essere intesa in questo senso come
maggiore capacit di sopravvivere e adattarsi da parte di organismi di una specie.
Rispetto alle condizioni ambientali le differenti specie microbiche presentano degli intervalli di
resistenza/sensibilit o degli optimum di attivit caratteristici ma comunque variabili tra gli
individui della stessa specie.
In questo contesto lo studio della biodiversit microbica, e quindi della capacit di un determinato
microrganismo di crescere, colonizzare e modificare un dato prodotto, risulta fondamentale per
interpretare la funzione ecologica di popolazioni microbiche in ecosistemi complessi quali quelli
agro-alimentari.
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La struttura microbica di una popolazione in continua evoluzione, risultando determinata sia da
fattori esterni tecnologici e di modificazione dellecosistema che da fattori interni di natura
biologica. In questo senso la crescita, la sopravvivenza e lattivit di una data specie risultano, nella
maggior parte dei casi, definite dalla presenza di altre specie (microbiche, vegetali o animali).
Complessit del mondo microbico ed interazioni
Il mondo microbico estremamente variegato e la suddivisione in famiglie, generi, specie e biotipi
attualmente in uso probabilmente non copre che una parte di una realt non ancora completamente
nota.
La microbiologia, e quindi la conoscenza dei microrganismi, in verit ancora una scienza
giovane, o comunque, ancora lontano dallaver compreso la complessit di tutti gli aspetti legati alle
caratteristiche di queste forme di vita microscopica.
Si ritiene che i primi batteri siano comparsi sul globo terrestre almeno 3 miliardi di anni fa, quindi
un tempo enormemente precedente agli uomini. Tutto questo tempo ha favorito lo sviluppo
diversificato di queste forme di vita che si sono adattate ad ambienti molto eterogenei.
Ne consegue che, nonostante le loro dimensioni, il mondo dei microrganismi molto vasto sia in
variet che famiglie, generi e biotipi.
I primi studi sistematici che possono essere ritenuti gli inizi della scienza dei microrganismi
risalgono solo alla met del 800; gli studi di Pasteur, basandosi sulle osservazioni ed elaborando
lopera di altri precedenti illustri studiosi e pionieri della materia, quali Spallanzani e Van
Leeuwenhoek, hanno infatti dato il via alla comprensione del ruolo dei microrganismi nei processi
fermentativi ed alle basi della conservazione degli alimenti.
In conseguenza si deve ritenere che, anche grazie allenorme sviluppo delle tecniche diagnostiche
indotto in particolare dallevoluzione tecnologica e biotecnologica, nel prossimo futuro saranno
ancora molte le scoperte e le innovazioni in grado di modificare radicalmente il modo di
interpretare questa complessa e variegata materia.
La dimensione delle cellule microbiche le rende difficilmente individuabili e riconoscibili. I metodi
per il loro studio sono per la maggior parte dei casi ancora basati sulla capacit di indurre la loro
proliferazione e quindi ottenere un numero di cellule copia dello stesso microrganismo molto
elevato. In seguito alla moltiplicazione si formano delle colonie batteriche, costituite da un elavato
numero di copie della cellula progenitrice, che possono essere riconosciute ad occhio nudo e che
servono anche per lidentificazione. Questo fenomeno, in alcuni casi, pu risultare evidente anche
negli alimenti; si pensi alle muffe che si sviluppano in differenti prodotti od allintorbidamento di
alcune bevande.
Sono stati messi a punto negli anni differenti sistemi per coltivare i microrganismi e quindi
studiarli: si tratta perlopi di supporti colturali liquidi o solidi i cui costituenti sono in grado di far
crescere con differenti livelli di selettivit le diverse forme microbiche.
Gli sviluppi delle tecniche genetiche e biochimiche degli ultimi 50 anni hanno enormemente
migliorato la capacit di riconoscere e studiare i microrganismi. Secondo alcuni studiosi,
comunque, ancora oggi abbiamo probabilmente evidenziato solo una parte delle possibili forme di
vita microscopiche.
Inoltre, a fini interpretativi, si inteso semplificare il mondo microbico nella sua dimensione
unicellulare studiando e trattando i differenti microrganismi singolarmente e quindi esasperandone
le potenzialit individuali. In natura sono molto rari i sistemi monospecie o caratterizzati dalla
presenza di poche specie. Nella grande maggioranza dei casi differenti microrganismi sono presenti
in ecosistema ed interagiscono modificando anche profondamente le loro attitudini metaboliche e
di crescita. Le relazioni inter e/o intraspecie divengono determinanti nel definire lo sviluppo di un
microrganismo in un sistema biologico. La presenza e lo sviluppo simultaneo di altre specie
microbiche possono esaltare lattivit di un microrganismo ma anche risultare fortemente inibitorie
ed in alcuni casi letali in conseguenza della produzione di metabolici tossici sia specifici che
12

aspecifici. Tra i primi ricordiamo le batteriocine mentre tra i secondi possono trovarsi differenti
molecole organiche come metaboliti secondari o acqua ossigenata.
Microrganismi e habitat
Essendo organismi unicellulari le interazioni della cellula microbica con lesterno sono determinanti
al fine della sopravvivenza della cellula stessa. La parete e la membrane cellulare divengono dei
filtri di informazione e dei sistemi di difesa attraverso i quali lorganismo comunica con lesterno (il
mondo); agli impulsi esterni la cellula risponde in base al suo potenziale cellulare. Tale potenziale
corrisponde allespressione di quanto compreso nel DNA della cellula batterica; la capacit di un
microrganismo di modificarsi o adattarsi sotto la spinta della pressione ambientale infatti,
generalmente, ampia ma rimane comunque compresa in limiti che la cellula non pu superare e
che sono definiti da quanto racchiuso nel suo cromosoma.
La gran parte dellenergia che la cellula ricava dal metabolismo e dalla trasformazione dei substrati
di crescita viene devoluta alla moltiplicazione cellulare ed alla proliferazione nellambiente.
Quando le condizioni esterne non sono ottimali, buona parte dellenergia che la cellula ricava dal
metabolismo viene invece dedicata alla difesa della cellula ed alla limitazione dei danni che
interverrebbero sulla stessa struttura cellulare se non si tamponassero gli effetti di un ambiente che
divenuto ostile. Questo fenomeno induce il depotenziamento di tutte le altre attivit cellulari che
richiedono energia; quando gli effetti indotti dallesterno sottraggono anche la quota di energia da
dedicare ai metabolismi essenziali per la sopravvivenza la cellula collassa e smette di funzionare o,
se pu sporifica.
Le cellule microbiche interagiscono tra loro e con il resto delle forme viventi presenti nel loro
ecosistema, si adattano alle condizioni di sviluppo imposte dallambiente, non necessariamente a
loro ottimali, e di conseguenza modificano i loro comportamenti.
Lo stesso ecosistema viene modificato pi o meno profondamente dallattivit dei microrganismi e,
a sua volta, induce nuovi comportamenti nel biota che si adatta. Il potenziale metabolico di un
microrganismo in un dato ecosistema, e quindi anche in un alimento, pu essere interpretato solo
considerando le interazioni metaboliche positive o negative che si instaurano con le altre forme di
vita presenti ed in particolare con gli altri microrganismi presenti e con il substrato.
Gli alimenti fermentati, come ampliamente ricordato, sono ecosistemi complessi composti dalla
matrice e dalla popolazione batterica che in essa risiede. Questo sistema inoltre caratterizzato da
fattori chimico-fisici intrinsechi (pH, Aw, presenza di nutriliti) e esogeni al substrato ma dipendenti
dalla tecnologia di trasformazione e, quindi, in ultima analisi dalluomo (temperatura, presenza di
batteri aggiunti, trattamenti di bonifica microflora endogena, ambiente gassoso, presenza di O2).
Sia i fattori estrinseci che intrinseci alla matrice inducono modificazioni dellattivit cellulare che
ne condizionano lomeostasi, la capacit di crescita ed il metabolismo.
Lecologia microbica di un dato sistema comprende pertanto le interazioni che intercorrono tra le
caratteristiche strutturali della nicchia ecologica e la sua popolazione microbica; i fattori estrinseci
alla nicchia possono essere manipolati dalluomo sia per favorire specifiche crescite microbiche che
al fine di inibire la moltiplicazione batterica.
La complessit di questi fenomeni al momento non ancora facile da simulare se non ricorrendo a
modelli predittivi, sempre necessariamente riduttivi e, per loro natura, estremamente semplificati.
La modellazione matematica di sistemi complessi, come gli alimenti, una disciplina che si pone il
compito di prevedere il comportamento dei microrganismi in relazione a variazioni delle
condizioni ambientali e, per ottenere questo scopo, devere ricorrere a semplificazioni che pur
mantenendo il potenziale descrittivo siano di facile gestione.
Come discusso in precedenza, i rapporti e gli equilibri tra microrganismi di differente genere e
specie appartenenti ad un dato ecosistema, e quindi anche un alimento non sterilizzato, sono
influenzati da molteplici fattori abiotici o biotici; il numero e le caratteristiche del microrganismo,
la presenza di altri microrganismi e la loro interazione, le caratteristiche del substrato, le condizioni
ambientali e, nel caso di prodotti trasformati, i parametri di processo.
13

I trattamenti tecnologici possono concretizzarsi rispetto ai microrganismi in effetti di rimozione
dalla matrice (centrifugazione, microfiltrazione), uccisione (trattamenti termici o disinfettanti),
inibizione o attivazione della crescita in relazione alle caratteristiche del microrganismo ed allentit
del parametro di processo. La tecnologia di trasformazione pu, inoltre, indurre selezione e/o
elezione di particolari specie e/o biotipi.
Di fatto si crea uninterazione tra parametri di processo (es: temperatura/tempi trattamento,
aggiunta coadiuvanti e/o additivi, umidit ambienti), le caratteristiche del substrato di crescita (es:
concentrazione differenti nutriliti, acidit, disponibilit di ossigeno, attivit dellacqua) e
lecosistema microbico (presenza differenti generi, specie e biotipi).
Queste interazioni
determinano il sopravvento di alcuni microrganismi rispetto ad altri ed allo stesso tempo le
modificazioni di composizione e struttura del substrato. Luomo attraverso i trattamenti
tecnologici indirizza gli eventi metabolici che derivano dalla selezione.
Le variazioni di habitat (substrato/parametri tecnologici) modificano sia le caratteristiche della
singola cellula che le sue capacit di interagire con altre cellule, della stessa o di differente specie,
presenti nel sistema (Tabb. 1.1., 1.4).
Indipendentemente dalla difficolt di riprodurre in laboratorio le condizioni ottimali per interpretare
le interazioni tra microrganismi in sistemi naturali, come in precedenza anticipato, negli ultimi anni
sono sempre frequenti gli studi che utilizzando metodi di indagine molecolari hanno evidenziato la
presenza di cellule vitali ma non coltivabili. Cellule microbiche quindi in grado di interagire con il
substrato ma che allo stato attuale delle conoscenze non sono isolabili dal substrato e quindi
studiabili. In alcuni casi si tratta di biotipi di specie altrimenti coltivabili con metodi classici.
Tutto ci lascia supporre non solo che alcuni microrganismi siano in grado di crescere in un solo
specifico ecosistema ma, anche, la possibilit che in alcuni casi la loro capacit di moltiplicarsi sia
stimolata dalla presenza di altri microrganismi in grado di supplire a carenze metaboliche con
interazioni positive. Alternativamente la non coltivabilit pu essere il risultato di modificazioni
della potenzialit metabolica della cellula conseguenti a trattamenti che inducano stress nel
microrganismo; questo fenomeno stato osservato, ad esempio, dopo pastorizzazione del latte.
Queste evidenze ci inducono a credere che molto ci sia ancora da comprendere in merito alla
fisiologia ed alla biochimica cellulare dei microrganismi e come sia possibile che queste materie
di studio presentino aspetti del tutto inattesi.
A questi fenomeni si aggiunga che in particolari ecosistemi sono state evidenziate forme di
organizzazione complesse, che oltrepassano laspetto unicellulare, della popolazione microbica che
pare organizzarsi in forme differenziate, anche se molto primitive rispetto alle cellule degli eucarioti
superiori, come i bio-film. In queste strutture particolari, si sono distinte cellule pi propense
alladesione alla superficie ed altre, pi esterne, pi propense a rapportarsi con lesterno. Queste
forme di organizzazione modificano il metabolismo della singola cellula ed instaurano una sorta di
differenziazione nei compiti dei componenti di una popolazione microbica introducendo,
probabilmente come conseguenza delladattamento a condizioni differenti, elementi di
organizzazione sopracellulari non compatibili con lunicellularit nota per queste forme di vita.
Ogni approccio al mondo dei microrganismi deve pertanto prevedere la certezza delle grandi
conoscenze acquisite dalluomo in questo settore ma anche la consapevolezza che siamo ancora
lontani dalla piena comprensione di questa forma di vita.
Metodi per lanalisi della presenza dei microrganismi e la loro caratterizzazione
Lanalisi microbiologica
Disporre di metodi per valutare la salubrit dei cibi diviene un problema sempre pi sentito fin dalla
seconda met dellottocento. Se la microbiologia nasce come scienza studiabile nel momento in
cui si concretizza la possibilit di osservare i microrganismi al microscopio, lanalisi microbiologica
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degli alimenti si sviluppa con lintento di comprendere le origini della putrefazione e del
deterioramento delle derrate alimentari e degli effetti sulla salute pubblica collegati al loro
consumo. Da allora con lo sviluppo di differenti terreni colturali e la messa a punto di metodi di
crescita ed identificazione sempre pi selettivi diviene possibile una valutazione maggiormente
approfondita della presenza di differenti gruppi microbici e del loro significato.
Lanalisi microbiologica di un alimento si pu porre differenti scopi ed assume un differente
significato in relazione al campione da analizzare. Per i test di sterilit pu, ad esempio, essere
sufficiente la valutazione dellassenza (non crescita) di microrganismi in una data aliquota di
campione e dopo incubazione per un tempo determinato in condizioni definite. In altri casi si deve
quantificare la presenza delle cellule microbiche; alternativamente si ricercano solo microrganismi
con determinate caratteristiche (psicrofili, termofili) o appartenenti ad un genere o ad una specie.
Nel caso di alcuni patogeni pu essere sufficiente valutarne la presenza o lassenza, mentre per i
batteri alterativi o per la microflora lattica caratteristica sono di maggiore interesse le valutazioni
della presenza numerica. La ricerca di specifici biotipi pu assumere un rilievo di natura
tecnologica o di legame con lisolamento da particolari prodotti. Allo stesso tempo le
problematiche coinvolte nellanalisi di un latte sterile, dove i microrganismi devono essere assenti,
e quella di uno yogurt dove deve essere presente unabbondante microflora lattica sono molto
differenti.
In tutti i casi il primo momento dellanalisi la preparazione del campione. Solitamente il prelievo
deve essere rappresentativo di tutto il prodotto da analizzare, in alternativa, se lanalisi si indirizza
ad una sua specifica parte (es. la crosta), questa deve essere rappresentativa della porzione che si
intende indagare.
Tutte le operazioni di prelievo e preparazione del campione allanalisi devono essere eseguite
preservandolo dalla contaminazione da parte di microflora esogena. Lanalisi di crescita in terreni di
conta comporta la necessit di diluire il campione, in particolare quando esso non liquido.
La tipologia di prodotto e la flora microbica che si intende individuare (lo scopo dellanalisi)
indirizzano le modalit di analisi.
In pratica, cos come differisce il significato della presenza di diversi microrganismi in differenti
prodotti, anche lorganizzazione dellanalisi microbiologica pu e deve essere modificata in
relazione al campione in analisi.
Lesigenza di poter confrontare i risultati ottenuti nellanalisi microbiologica dai differenti operatori
del settore ha indotto a formare commissioni ed enti preposti a normare le procedure di analisi e a
validare i nuovi metodi proposti. In tabella 1.5 riportiamo la lista delle analisi per il settore
lattierocaseario riconosciute dalla FIL-IDF (Fdration Internationale de Laiterie - International
Dairy Federation, www.fil-idf.org).
La complessit della risoluzione analitica delle problematiche di ordine microbiologico ed
igienico, in particolare nel settore alimentare, rimane tuttora elevata. La riuscita dellanalisi
microbiologica di un alimento, in particolare per quello che concerne la ricerca dei germi patogeni,
deve infatti confrontarsi con differenti fattori sfavorevoli tra i quali:
leterogeneit fisico-chimica della matrice costituita da sostanze che possono interferire con
la crescita batterica o la selettivit dei terreni colturali,
la distribuzione non uniforme dei batteri nelle differenti parti o porzioni del campione e
quindi la necessit di un prelievo sufficiente e rappresentativo,
la presenza contemporanea di altri microrganismi nel campione che, ad esempio nel caso dei
batteri patogeni, possono essere in numero enormemente superiore alla specie da ricercare
ed interferire con la riuscita dellanalisi,
la presenza cellule danneggiate dai processi tecnologici di produzione ma ancora in grado di
sopravvivere (injured o stressed cell; cellule vitali ma non coltivabili).
Alcuni di questi fenomeni risultano sfavorire la sensibilit dellanalisi microbiologica e se
generalmente questa evidenza tollerata e considerata intrinseca allanalisi stessa, assume un
rilievo preoccupante nel caso della ricerca di patogeni caratterizzati da un livello di infettivit
15

elevata. Lo sviluppo di terreni di arricchimento sempre maggiormente efficaci ha favorito il
recupero e lo sviluppo selettivo della maggior parte dei batteri, ma il problema rimane ancora aperto
Si consideri, inoltre, che oggi la produzione di alimenti sempre meno facilmente conciliabile con
i tempi necessari allindagine microbiologica tradizionale; i protocolli HACCP necessitano di
risposte veloci in modo da poter intervenire in caso di eventi negativi per correggere i parametri di
processo possibilmente on-line e non molte ore dopo il prelievo per lanalisi e quindi quando
levento negativo non pi correggibile ed ha gi avuto la possibilit di mettere a rischio la salute
del consumatore.
Metodiche tradizionali o classiche
Con questo termine non corretto si intende definire i metodi di indagine in uso nei laboratori di
microbiologia fino almeno al decennio a cavallo degli anni 80. Si tratta di metodiche di
identificazione e conta dei microrganismi che rimangono la base dellanalisi microbiologica e,
quindi, con il termine tradizionale non si deve intendere superate o desuete. Lo sviluppo di nuove
tecniche di indagine caratterizzate da maggiore sensibilit e, a volte, facilit di impiego rimane
piuttosto un complemento alle indagini microbiologiche tradizionali, che ne permette
unapprofondimento analitico ed unapproccio pi sistematico.
Analisi al Microscopio
Gli esordi dellanalisi microbiologica si possono sovrapporre in un certo senso con limpiego del
microscopio. Ancora oggi il microscopio rappresenta uno strumento fondamentale per il lavoro dei
microbiologi alimentari in quanto permette lo studio della morfologia delle cellule batteriche
presenti in un campione e, dopo diluizione se solido o torbido, anche una valutazione numerica
tramite conta visiva delle cellule presenti in volumi definiti e determinati dallo spessore e dallarea
di particolari vetrini con griglie di volume noto (camere di conta).
Il primo limite dellanalisi quantitativa consiste nella necessit di avere concentrazioni microbiche
elevate nel preparato in osservazione; ad esempio la misurazione con camera di Thoma richiede la
presenza di almeno un milione di cellule per millitro. Ulteriore limite dellanalisi risiede nel fatto
che, ovviamente, al di l di una pur importante preliminare classificazione morfologica (forma,
mobilit, reazione alla colorazione di gram, presenza di spore, formazione di catene o strutture a
palizzata, etc.), losservazione al microscopio dice poco in relazione alla presenza di batteri
appartenenti a specie differenti, alla vitalit delle cellule osservabili ed alle loro caratteristiche. Ad
esclusione dei controlli di purezza di alcune colture di laboratorio o di equilibrio in starter costituiti
da colture miste di lattobacilli e streptococchi, anche agli occhi dei microbiologi pi esperti
lanalisi visiva del preparato al microscopio non risulta risolutiva, ma solo di indirizzo e di
introduzione allanalisi in terreni colturali.
La metodica tradizionale: identificazione e conta dopo crescita in terreni nutritivi
Nel 1881 Koch nel suo testo "Agar-based method for isolating bacteria" pone le basi dello sviluppo
dei metodi di conta in piastra in terreni agarizzati, successivamente elaborate dal suo assistente
Petri. A partire da queste osservazioni sono stati messi a punto la gran parte dei sistemi di conta,
selezione, isolamento ed identificazione dei microrganismi.
Tra la fine del 1800 e linizio del secolo scorso cominciano a formarsi i primi comitati per la
valutazione della salubrit degli alimenti e dellacqua, prima attraverso la definizione della loro
analisi chimica e quindi anche batteriologica. The American Pubblic Health Association nel 1905
pubblic la prima edizione di Standard Methods of Water Analysis. Sempre, nello stesso anno
Prescott del Massachusetts Institute of Technology propose di impiegare terreni colturali differenti e
condizioni di incubazioni specifiche nellanalisi del latte; la commissione che si form in seguito
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alla proposta produsse la prima versione degli Standard Methods for Examination of Dairy
Products, successivamente si svilupparono organizzazioni ad hoc per sviluppare, confrontare e
standardizzare le metodiche di analisi.
La metodica di Koch e Petri, che si basa sulla capacit dei microrganismi di moltiplicarsi e formare
colonie una volta incubati in condizioni e per tempi definiti in appositi substrati, ha permesso,
attraverso lo sviluppo di terreni selettivi e di arricchimento, di poter indagare praticamente sulla
presenza di tutte le specie microbiche oggi note.
La tassonomia microbica stessa, si sviluppata attraverso la crescita preliminare in opportuni
terreni colturali. Lisolamento delle colonie da classificare, limpiego di test di crescita in
particolari condizioni o di specifiche attivit metaboliche, per molti delle quali il segnale di
positivit rimaneva la crescita microbica stessa, lanalisi al microscopio delle colture pure
permettevano quindi, nellinsieme, di assegnare il microrganismo ad una specie.
Per quanto riguarda lanalisi di presenza o assenza di determinate specie microbiche, dopo
opportuno prelievo e preparazione del campione (Tab. 1.5) possibile ricorrere a terreni di
arricchimento con la principale funzione di recupero di tutte le cellule batteriche presenti (anche
parte di quelle maggiormente stressate). Si procede quindi alla deposizione del campione in
terreni di crescita, liquidi o agarizzati, caratterizzati da specifica selettivit. Lintorbidamento del
terreno liquido o la comparsa di colonie batteriche nel terreno agarizzato indicano positivit della
presenza.
La metodica della conta in piastra, che divenuta metodo ufficiale e di riferimento per tutte le
analisi microbiologiche, rimane basata sulla corretta preparazione e diluizione del campione e
sulla successiva deposizione, per spatolamento od inclusione, in opportuni terreni di crescita
agarizzati caratterizzati da differenti livelli di selettivit. La crescita in terreni agarizzati offre il
vantaggio di discriminare i batteri vivi da quelli che non sono pi in grado di moltiplicarsi (il
numero viene infatti espresso come unit formanti colonia = ufc). In particolare nel caso delle
analisi ufficiali sono previste ripetizioni delle prove di analisi e limpiego di procedure specifiche
relative a tutte le operazioni di analisi (dal campionamento alla lettura del dato analitico). Anche
lelaborazione del valore numerico del risultato deve seguire idonee procedure normate e codificate
(Tab. 1.5)
Ricorrendo alla tecnica del MPN (Most Probable Number) invece possibile utilizzare terreni
liquidi per la conta di microrganismi. Si tratta di preparare diluizioni successive del campione e
deporle in ripetizioni di brodi di crescita selettivi o elettivi. Il valore numerico della presenza
microbica viene valutato in base al numero di ripetizioni della diluizione alla quale si evidenzia
intorbidimento e quindi crescita batterica. Alternativamente la positivit di crescita pu essere
evidenziata dalla manifestazione di un particolare carattere metabolico, quale ad esempio la
produzione di CO2 che induce il galleggiamento nel terreno colturale di campanelle di vetro. Si
utilizzano opportune tabelle numeriche elaborate, in base alla probabilit statistica, in modo da
tradurre in un numero le differenti possibilit di combinazioni di ripetizioni positive alle diverse
diluizioni. In questo caso i risultati di analisi sono costituiti da valori discreti e non coprono tutto
linsieme numerico continuo come nel caso della conta in piastra.
Il livello di selettivit dellanalisi in terreni liquidi o agarizzati completato dalladozione di
specifici tempi e condizioni di incubazione che risultano determinanti nel discriminare la crescita
di alcune specie. Le condizioni di incubazione sono parte integrante delle differenti procedure
analitiche.
Tra i limiti maggiori della metodiche di conta tradizionale in primo luogo si devono sottolineare i
lunghi tempi di attesa per disporre del risultato; a seconda del tipo di microrganismo ricercato i
tempi di incubazione variano infatti dalle 24 ore alla settimana. Inoltre riconosciuta una non
sempre soddisfacente precisione di analisi. Limprecisione insita nel metodo aggravata dalla
difficile ripetibilit della componente manuale dell'
operatore. Quando si confrontano risultati
ottenuti in laboratori differenti, il cui livello di professionalit sia accertato, non raro osservare
differenze dei risultati analitici anche importanti. Infine la metodica non offre alcuna indicazione
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sullo stato fisiologico e metabolico dei microrganismi, si evidenziano infatti solo le cellule vive, o
coltivabili, ma non si ottiene alcuna informazione sul loro stato di attivit.
Metodiche innovative
Unitamente allo sviluppo dellindustria alimentare, in particolare in relazione allampliamento ed
alla globalizzazione delle reti di distribuzione e commercializzazione, si imposta la necessit di
disporre di tecniche di valutazione della qualit microbiologica degli alimenti, sempre pi sensibili,
veloci, automatizzate ed economiche.
Mentre grandi progressi sono stati fatti nella messa a punto di terreni e condizioni di incubazioni
selettivi, i limiti nella precisione e la necessit di tempi di incubazione prolungati sono
sostanzialmente rimasti inalterati fin dai tempi della messa a punto della metodica di conta in
piastra e, allo stato attuale delle conoscenze, non pare possibile modificare significativamente le
procedure delle tecniche tradizionali.
In questo senso lo sviluppo scientifico, sia biologico che di altri settori della scienza, ha favorito la
messa a punto di nuove tecniche di indagine; in particolare, lavvento delle biotecnologie ha
permesso lo sviluppo di metodi sempre maggiormente conoscitivi e discriminanti. In questo
contesto levoluzione delle tecniche basate sullindagine di porzioni del genoma batterico hanno
rappresentato una vera rivoluzione nel campo dellanalisi microbiologica degli alimenti.
La sensibilit delle metodiche basate sul riconoscimento di sequenze geniche o di epitopi antigenici
da parte di specifici anticorpi, attualmente a disposizione del microbiologo alimentare, non erano
immaginabili nei decenni scorsi. In particolare, lincremento di sensibilit offerto da queste
metodiche nella ricerca dei batteri patogeni negli alimenti ha permesso di identificare e monitorare
nuove problematiche relative alla qualit della materia prima e/o alleffetto dei parametri di
processo sulla sopravvivenza batterica e sulla conservabilit del prodotto.
Levoluzione dei sistemi di identificazione che derivano dallo sviluppo di queste tecniche
talmente veloce al punto da renderne molto difficile una rassegna esaustiva.
Allo stesso tempo l'
avvento dell'
automazione e dellinformatizzazione che ha coinvolto numerose
aree della scienza e della tecnologia ha indotto ripercussioni anche nel campo delle discipline
microbiologiche. Il settore della microbiologia stato sicuramente uno degli ultimi a sentirne gli
effetti e questo ritardo rispetto ad altri settori, quali quello chimico e quello fisico, ha differenti
ragioni. La principale insita nella natura stessa della microbiologia, una scienza che lavora con
organismi viventi dalla natura articolata e complessa, soggetta a mutazioni comportamentali
coerenti al sistema di crescita o, a volte, intrinseche al microrganismo stesso; tale variabilit
difficilmente assimilabile a sistemi di indagine semplificati che, come previsto dalle metodiche
analitiche automatizzate, monitorizzano poche singole variabili di natura chimica o fisica. La
difficolt di validare con le metodiche ufficiali di conta microbica in terreni agarizzati i risultati
ottenuti con metodiche alternative ha rappresentato e continua a rappresentare unulteriore
problema: poich i metodi di conta in piastra prevedono livelli di ripetibilit e riproducibilit che
poco si addicono alla correlazione con le precise rilevazioni, almeno nel contesto della specifica
variabile considerata, determinate dalle metodiche innovative. In particolare, quando non si
considerino solo i microrganismi patogeni, la valutazione della qualit microbiologica di un
alimento prevede la necessit di esprimere una valutazione quantitativa della carica microbica,
generica o differenziata in specie, e non solo la presenza o assenza di specifiche microflore; questo
aspetto, vista la difficolt di tradurre il risultato strumentale in un valore numerico assimilabile alle
ufc previste dai metodi tradizionali e riconosciuti, ha complicato la possibilit di impiego di
metodiche alternative. Infine, anche se non di minore importanza, la naturale recalcitranza da parte
dei microbiologi ad abbandonare od innovare le metodiche consolidate non ha favorito
lavvento di nuovi sistemi di indagine. In merito a questa discussione Sharpe ha avuto modo di
sottolineare come i microbiologi siano ossessionati dalla capacit dei batteri di moltiplicarsi nei
terreni agarizzati e come questo fatto, conseguenza dell'
abitudine a prendere come riferimento la
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metodica tradizionale, abbia sicuramente ritardato lo sviluppo di metodiche alternative di
valutazione della contaminazione batterica.
In questi ultimi decenni l'
automazione concernente l'
analisi microbiologica andata comunque
sempre pi affermandosi sotto la spinta del continuo perfezionamento delle tecniche di misura
chimico-fisiche e, come detto, della sempre pi pressante esigenza di disporre di tecniche versatili,
in modo da poter analizzare un numero elevato di campioni e di meglio ammortizzare i costi di
investimento, e possibilmente strutturate in modo da permettere l'
elaborazione ed il controllo
computerizzato dei risultati.
Si deve sottolineare come lautomazione delle analisi, mentre quasi sempre coincide con una
maggiore potenzialit riferita al numero di campioni da analizzare, non necessariamente comporti
maggiore sensibilit e velocit di ottenimento del risultato. Peraltro la definizione di metodi rapidi
in microbiologia appare ancora indefinita. La rapidit infatti interpretabile in modo soggettivo in
relazione alle specifiche esigenze; si potrebbe considerare rapido un metodo che offre una risposta
istantanea e, in questo senso, il metodo ideale non esiste ancora. Per rapido quindi si usa intendere
un metodo semplice che abbrevia i tempi e le procedure di analisi caratteristiche dei metodi
tradizionali.
Volendo sintetizzare in commercio si possono ritrovare metodi rapidi basati sostanzialmente su
alcune tipologie di organizzazione dellanalisi:
1. test biochimici di identificazione miniaturizzati
2. test di derivazione dei metodi colturali classici modificati
3. test immunologici
4. test a DNA o RNA
5. test basati sullimpiego di marcatori fluorescenti
Tutti questi tipi di test possono essere differentemente organizzati, automatizzati, gestiti ed
archiviati da specifici software e possono risultare utili alla detezione ed identificazione di
differenti microrganismi.
Anche la disponibilit e lutilit nel settore della microbiologia degli alimenti di questi metodi si
deve confrontare con le problematiche poste dagli scopi dellanalisi (identificazione o conta) e le
difficolt imposte dal substrato (effetto matrice e presenza di altri batteri) caratteristici delle
metodiche tradizionali.
I problemi rimangono simili a quelli osservati per le metodiche tradizionali ma la necessit di
rapidit incrementa le difficolt di mantenere sensibilit e precisione.
Sotto la spinta dellevoluzione della biologia e della tecnologia differenti livelli di innovazione e di
automazione
sono andati, comunque, col tempo affermandosi nei laboratori di analisi
microbiologica.
Allo stato attuale sono disponibili test di riconoscimento per la maggior parte dei patogeni
rinvenibili negli alimenti; buona parte sono ancora basati sulla metodica di conta ed isolamento
tradizionale, altri su nuove tecniche che in alcuni casi risultano pi veloci, specifiche e pi
sensibili. Si pu sostenere che i livelli di innovazione dellanalisi microbiologica che si sono
affermati in questi utimi due-tre decenni, nel loro insieme, hanno profondamente cambiato
lapproccio allanalisi microbiologica di un alimento offrendo al microbiologo nuove soluzioni per
studiare la popolazione batterica di un campione e comprenderne il significato.
Nuovi metodi di identificazione dei microrganismi
Messa a punto di nuovi terreni selettivi e kit diagnostici
Il primo aspetto coinvolto nellevoluzione delle metodologie di analisi di identificazione dei
microrganismi stata la messa a punto di nuovi terreni di crescita selettivi e/o substrati che
permettessero di discriminare le cellule batteriche in grado di esprimere attivit metaboliche
definite.
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In particolare sono stati prodotti differenti sistemi miniaturizzati per evidenziare specifiche attivit
enzimatiche utili allidentificazione dei ceppi. La miniaturizzazione dei kit biochimici per la
diagnostica e la classificazione dei microrganismi ha favorito lo sviluppo di strumentazioni con
differente livello di automazione e di rilevazione oggettiva dei risultati in modo da sottrarre la
valutazione del risultato alla soggettivit dellocchio umano. Linterfaccia con computer e
limpiego di software elaborati ad hoc ha permesso di ridurre limprecisione dovuta allanalista e di
aumentare la ripetibilit e la riproducibilit dei risultati, nonch la loro archiviazione. In questo
settore sistemi come il Vitek o il Biolog Identification System hanno trovato una importante
diffusione per lidentificazione di microrganismi isolati da campioni alimentari.
Da considerare innovativi sono stati i sistemi Petri-Film; si tratta di film agarizzati che in realt
riproducono completamente il sistema di conta in piastra ma che essendo gi pronti all'
uso e di
dimensioni molto ridotte facilitano l'
analisi di un numero elevato di campioni, eliminando la
preparazione del terreno colturale e la sua distribuzione in piastra, riducendo gli spazi necessari per
la preparazione, incubazione e valutazione delle piastre ed, in particolare, limitando i costi del loro
smaltimento.
Anche lintroduzione di substrati fluorogenici e cromogeni ha facilitato lo sviluppo di terreni
colturali selettivi e specifici per alcune specie batteriche ed in particolare per microrganismi
patogeni.
In questi ultimi due casi si tratta di sistemi non solo utili allidentificazione microbica ma anche alla
numerazione selettiva di alcune specie microbiche.
Metodi immuno-enzimatici
Per il riconoscimento selettivo di particolari microrganismi negli ultimi anni si sono notevolmente
sviluppati kit diagnostici basati su metodi immunoenzimatici.
Lo sviluppo delle tecniche immunologiche ha favorito la produzione di anticorpi di epitopi
antigenici caratteristici di metaboliti o componenti cellulari specifici di differenti microrganismi.
Questo si rivelato di grande utilit in particolare per il riconoscimento di alcune specie patogene
presenti in differenti substrati. Lelevata sensibilit della reazione antigene-anticorpo e la facilit di
adattare il sistema a differenti supporti e a differenti sistemi di rilevazione ha favorito lo svilippo di
molteplici test caratterizzati dal differente design. I sistemi proposti sono sempre basati sulla
specificit di riconoscimento antigene-anticorpo, ma nel tempo si sono sviluppati sistemi pi
sofisticati e sensibili. Si tratta di test estremamente specifici caratterizzati dalla semplicit di
impiego. Alcuni di questi metodi permettono anche una valutazione semi- quantitativa del numero
di microrganismi presenti ma, in genere, trovano impiego in analisi di riconoscimento qualitativo
specifico. Sono stati proposti test di agglutinazione con gli anticorpi legati a piccole sfere di lattice
(lattex-agglutination test, LA); la presenza dellantigene induce lagglutinazione in seguito alla
formazione di una rete di legami ponte antigene-anticorpo-lattice. Il test LA molto semplice e
veloce ma poco sensibile e quindi pi adatto per la conferma tassonomica o serologica dopo
isolamento dei ceppi dallalimento e coltura o arricchimento. Per Salmonella sono stati proposti test
di immunodiffusione organizzati in modo da comprendere una parte di arricchimento allinterno del
kit di reazione. I test ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) che sono probabilmente i pi
utilizzati per la rilevazione di batteri patogeni negli alimenti sono basati sullaccoppiamento di
unattivit enzimatica alla reazione anticorpale. Solitamente i test ELISA prevedono limpiego di
pi anticorpi: il primo legato ad un supporto cattura lantigene quindi, il secondo, che di norma
collegato ad una attivit enzimatica, viene aggiunto in successione e si lega, a sua volta, con
lantigene catturato dal primo. In base alla rilevazione dellattivit enzimatica possibile stabilire la
positivit della prova. I sistemi di rilevazione sono solitamente molto semplici e quasi sempre legati
a reazioni colorimetriche di facile detezione. I metodi ELISA disponibili si sono differenziati in
ragione dei molteplici supporti proposti e dellorganizzazione della tempistica di successione dei
differenti eventi coinvolti nel riconoscimento dellantigene; la loro sensibilit solitamente oscilla tra
le diecimila e le centomila ufc/ml e nellordine delle unit di ng/ml per le proteine e/o le tossine
batteriche. Per la ricerca dei batteri patogeni sono quindi solitamente previste colture di
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arricchimento preventive per raggiungere le soglie di sensibilit necessarie. In commercio sono stati
proposti sistemi automatizzati basati sul metodo ELISA.
Al fine ridurre i tempi dedicati alla coltura di arricchimento ed aumentare la sensibilit del metodo
sono stati proposti dei sistemi immunomagnetici (Immunomagnetic Separation, IMS); in questo
caso previsto limpiego di supporti magnetici grazie ai quali, dopo la reazione di riconoscimento,
possibile recuperare, concentrare e separare lanticorpo e quindi anche leventuale antigene
riconosciuto.
Pi recentemente sono stati messi a punto sistemi basati sullimmunoprecipitazione o
immunocromatografia. Si tratta di kit derivati dalla diagnostica medicale che come nel caso degli
ELISA prevedono un primo anticorpo legato al supporto ed un secondo che, invece che allenzima,
legato a sferette di lattice colorate. La positivit del test evidenzia dalla comparsa della
colorazione.
Impiego di batteriofagi
Lelevata specificit di interazione tra batteriofago e cellula batterica ospite stata impiegata per la
messa a punto sperimentale di test per valutare la presenza di alcuni batteri patogeni negli alimenti.
In questi sistemi la presenza del microrganismo viene evidenziata in conseguenza della lisi cellulare
indotta dallinfezione
fagica. La rottura della cellula comporta il rilascio di materiale
citoplasmatico (ATP, proteine) che viene evidenziato mediante particolari attivit biochimiche. Il
rilascio di ATP viene riconosciuto attraverso la produzione di bioluminescenza mentre la presenza
di particolari proteine citoplasmatiche, caratteristiche in alcune specie, pu essere rilevata in
conseguenza della modificazione del punto di congelamento di soluzioni acquose.
Questo tipo di test dunque basato sullelevata specificit di interazione fago-ospite, il limite
risiede nel fatto che nellambito di tutte le specie sono stati evidenziati biotipi resistenti al
batteriofago, e che anzi la stessa presenza del batteriofago pu indurre la selezione di varianti
resistenti e quindi non pi rilevabili dal metodo.
Metodi di identificazione basati sul riconoscimento di sequenze DNA
Come discuteremo meglio in seguito negli ultimi anni si sono sviluppati e affermati differenti
metodi basati sul riconoscimento e/o lamplificazione di determinate sequenze del DNA. Si tratta
di tecniche di grandissima utilit per lidentificazione e la biotipizzazione degli isolati, basate
sullindividuazione di sequenze specifiche che possono essere riconosciute da sonde molecolari a
differente livello di specificit o, alternativamente, una volta individuati gli opportuni primer,
amplificate un elevatissimo numero di volte (PCR) e quindi riconosciute tramite tecniche
elettroforetiche. Lelevata specificit, la sensibilit e la semplicit duso di questo tipo di analisi ne
ha fatto uno strumento essenziale nella diagnostica microbica.
Le sonde DNA sono state utilizzate per il riconoscimento dei patogeni negli alimenti allinizio
degli anni 80 e da allora numerosissimi sono le tecniche messe a punto per il riconoscimento di
differenti microrganismi sulla base di questa tecnica. La possibilit di accoppiare il riconoscimento
genico da parte della sonda DNA con lespressione di attivit enzimatica (GENE-TRAK) o con
marcatori chemioluminescenti (GEN-PROBE) ha favorito lo sviluppo di sistemi diagnostici di pi
semplice e veloce impiego.
Recentemente sono stati impiegati come sonde gli Acidi Peptido Nucleici (PNA), molecole
sintetiche che simulano la struttura del DNA, dove lo scheletro zucchero fosfato carico
negativamente sostituito da monomeri a base di N-aminoetilglicina. Per le loro caratteristiche i
PNA permettono una specificit di riconoscimento di sequenza complementari di DNA, maggiore
rispetto ad analoghe sequenze di DNA.
Le tecniche che prevedono lamplificazione si basano anchesse sul riconoscimento-appaiamento di
specifiche zone del genoma da parte di segmenti DNA (primers), solitamente brevi, e successiva
amplificazione della sequenza genica laterale ai primers per intervento dellenzima Taq polimerasi.
La Polymerase Chain Reaction (PCR) risultato un sistema di grande efficacia in conseguenza
della possibilit di amplificare un numero esponenziale di volte una sequenza specifica in breve
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tempo. Si tratta quindi di una tecnica sensibile che permette lindivuazione della presenza di
microrganismi in una matrice anche quando presenti in numero limitato.
Limpiego della PCR per la valutazione quantitativa della microflora presente in un campione pare
molto promettente.
Automazione e metodi rapidi per la valutazione della presenza e la numerazione dei microrganismi
L'
automazione nel controllo microbiologico si diffusa inizialmente nel settore medico
diagnostico e solo pi recentemente ha trovato importanti applicazioni nel settore del controllo degli
alimenti. Questo ulteriore ritardo, specifico per il comparto alimentare, trova giustificazione nella
difficolt di adattare le metodiche di indagine automatizzate agli alimenti in conseguenza della
maggiore variabilit e complessit di composizione chimica delle matrici da analizzare.
Senza la presunzione di essere esaustivi ma nel tentativo di evidenziare le problematiche generali di
un settore in continua evoluzione come quello che si propone la valutazione della crescita
microbica utilizzando metodiche alternative, si propone una breve rassegna dei principali metodi
automatizzati, o innovativi e rapidi, esistenti. Al fine di comprenderne meglio le possibilit e
lutilit dimpiego, oppure gli eventuali limiti duso, dobbligo il costante confronto con i principi
base della metodica tradizionale di conta in piastra, che rimane il metodo di riferimento per
lanalisi microbiologica.
Automazione delle procedure di routine
Il primo settore dove l'
automazione ha trovato impiego nei laboratori di microbiologia stato quello
dell'
automazione delle procedure di routine. In questa categoria si possono inglobare differenti
proposte che vanno dai diluitori automatici, ai contatori di colonie, ai microdosatori automatici, fino
alla miniaturizzazione dei kit biochimici per la diagnostica e la classificazione dei microrganismi.
In questo caso pi che di metodi automatizzati si tratta di innovazioni nelle procedure di analisi che
in alcuni casi hanno introdotto parziali principi di automazione e che, comunque, hanno
sostanzialmente modificato il modo di lavorare nei laboratori di microbiologia.
Sistemi che prevedono l'
automazione delle metodiche tradizionali
Alcuni sistemi prevedono l'
automazione parziale o totale delle procedure previste dalle metodiche
tradizionali di conta in piastra; tra questi si possono ricordare lo Spiral System ed il Thomson Buri.
Il primo sistema prevede la deposizione, attraverso un beccuccio dispensatore, di quantit
decrescenti di una diluizione del campione sulla superficie di una piastra agarizzata. Il particolare
tipo di inoculo, col dispensatore che si muove dal centro della piastra alla sua periferia, favorisce
una disposizione a spirale delle colonie. Il sistema deve prevedere la corretta pulizia del beccuccio
dosatore prima di ripetere l'
analisi al fine di evitare fenomeni di trascinamento.
Il secondo metodo prevede l'
inoculo del campione con anse calibrate da 0,1 a 10 microlitri, in modo
da poter procedere evitando la diluizione dello stesso. La diluizione iniziale rimane necessaria solo
per campioni solidi. Punto chiave del sistema la calibrazione delle anse dosatrici; non sempre
infatti risulta facile ottenere linearit di risposta confrontando dati ottenuti utilizzando anse calibrate
di differente capacit, probabilmente anche in relazione ai molteplici fenomeni che regolano
l'
organizzazione di un liquido in anse di diverso diametro (es. tensione superficiale).
In generale i sistemi di conta di questo tipo, grazie all'
automazione, permettono l'
analisi
contemporanea, o comunque pi veloce, di un numero elevato di campioni e consentono di
utilizzare terreni selettivi per la valutazione di particolari contaminazioni microbiche. Il limite
rimane, come nel caso del metodo tradizionale, la necessita dei medesimi lunghi periodi di
incubazione prima di ottenere il risultato e quindi nella mancata possibilit di interventi tempestivi
sul processo produttivo.
Metodi alternativi di conta diretta dei microrganismi
Sono sistemi automatizzati che pur prevedendo la conta diretta dei microrganismi presenti non
ricorrono alla loro moltiplicazione in terreni agarizzati. Si tratta in genere di sistemi rapidi, non
sempre selettivi, non sempre in grado di differenziare i batteri coltivabili da quelli non coltivabili o
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morti ed alcuni dei quali, presentando un alto livello di automazione, permettono l'
analisi di
un'
elevato numero di campioni.
Ad esempio, il sistema Coulter Counter tra i primi proposti in questo settore, prevede il passaggio
del campione in un campo elettrico che in funzione del diametro delle particelle che lo attraversano
in grado di discriminare i microrganismi dalle cellule animali e da eventuali particelle non
batteriche.
Il sistema HGMF (Hydrophobic Grid Membrane Filters) ha proposto limpiego di membrane di
filtrazione idrofobiche che permettessero una maggiore ritenzione dei microrganismi facilitandone
la conta. Si tratta di membrane sulle quali vengono applicate griglie idrofobiche che ne permettono
la divisione in un considerevole numero di singoli comparti di crescita. La conta viene determinata
attraverso la valutazione del MPN. La necessit di filtrare il campione comporta tuttavia lo
svantaggio di possibili interferenze da parte di particelle di origine non microbica, ad esempio nel
caso del latte e dei suoi derivati bisogna prevedere, preliminarmente alla filtrazione, una tappa di
digestione enzimatica .
Tra le metodiche di conta od identificazione che non prevedono la crescita in terreni colturali
grande sviluppo e notevoli applicazioni anche nel settore alimentare hanno trovato i metodi basati
sullepifluorescenza. La microscopia in epifluorescenza sfrutta limpiego di fluorofori che si
possono legare specificamente a determinate strutture cellulari dei microrganismi. Si tratta di una
tecnica che ha trovato largo utilizzo, in particolare nello studio di miscele di microrganismi
attraverso limpiego di fluorofori che si legano selettivamente a componenti cellulari. Limpiego dei
differenti fluorofori permette tramite losservazione al microscopio, con lausilio di opportuni filtri
ed in base alla tipologia di molecole fluorescenti utilizzate, di ottenere differenti informazioni in
merito alla composizione microbiologica del campione. E di particolare interesse la possibilit di
valutare, tramite la microscopia in epifluorescenza, lo stato di vitalit del microrganismo in base
alla reattivit di precipui componenti cellulari. La microscopia in epifluorescenza prevede
comunque la necessaria preparazione di campioni danalisi ad elevata concentrazione cellulare.
Alternativamente la citofluorimetria a flusso permette la rilevazione di poche unit cellulari.
Lelevato livello di selettivit nella differenziazione-discriminazione ottenibile attraverso la
tecniche in epifluorescenza ne ha favorito in particolare limpiego negli studi di ecologia
microbica, con lo scopo di comprendere le cinetiche di sviluppo di popolazioni microbiche di
ecosistemi ambientali. La risposta differenziale alla permeabilit da parte delle membrane cellulari
a differenti fluorofori ha permesso di valutare lo stato di integrit cellulare delle cellule e quindi di
differenziare quelle non coltivabili con metodi tradizionali. Limpiego abbinato della microscopia e
della citofluorimetria, oggi, pare offrire le migliori possibilit di valutare parte delle cellule
microbiche considerate non coltivabili, o comunque non in grado di formare colonia e quindi non
valutabili con le tecniche tradizionali di coltura.
Tra i sistemi che prevedono la conta diretta dei batteri, dopo marcatura con fluorofori, il Bactoscan
System ha trovato ampia diffusione, in particolare nel settore lattiero caseario dove impiegato
nella valutazione della carica batterica totale per il pagamento del latte a qualit85).
Metodi indiretti di conta dei microrganismi
Numerosi sono i sistemi di valutazione della carica microbica che non prevedono la conta diretta
dei microrganismi presenti in un campione ma che, dopo un'
opportuna taratura del metodo, ne
permettono la stima in relazione alla presenza di componenti o metaboliti microbici. Si tratta in
genere di strumenti analitici di elevata sensibilit che, nella gran parte dei casi, si sono sviluppati in
conseguenza all'
evoluzione dei sistemi di indagine chimica e fisica.
Questi sistemi sono generalmente da ritenersi tra i pi rapidi fra quelli proposti. La rapidit di
risposta in alcuni casi tale da permettere una veloce valutazione della qualit igienica del prodotto
in modo da poter intervenire direttamente sul ciclo di produzione. Non solo, alcuni di questi
strumenti sono organizzati in modo da permettere un numero molto elevato di analisi
23

contemporanee. Il limite pi evidente che accomuna queste metodiche rimane la difficolt di
tradurre i risultati strumentali in ufc; infatti la produzione di componenti cellulari o di metaboliti
non sempre correlabile al numero di microrganismi presenti ma dipende in modo significativo dal
loro stato di crescita e dalle loro condizioni fisiologiche (es. cellule eventualmente stressate da
trattamenti tecnologici precedenti). Questo limite diviene maggiormente importante quando si
analizzano, per la valutazione della carica batterica totale, campioni che presentano una flora
microbica composta da differenti specie microbiche; non tutte le specie presentano infatti uguali
"pathways" metabolici e questo fatto, unitamente ai differenti possibili livelli di contaminazione,
rende molto arbitraria la diretta traduzione del dato strumentale in un valore di carica batterica
totale.
Tale limitazione diviene meno sensibile quando si utilizzino terreni selettivi per la ricerca di
specifiche microflore. Tra i differenti sistemi proposti, alcuni in via ancora del tutto sperimentale,
si possono segnalare:
a) Microcalorimetria; questo sistema, che necessita di un calorimetro ad elevata sensibilit,
misura il calore prodotto dalle cellule batteriche in fase di crescita.
b) Radiometria; incorporando nel mezzo di coltura carbonio radioattivo possibile studiare il
metabolismo batterico seguendo lo sviluppo dell'anidride carbonica radioattiva prodotta. La
metodica ha permesso lo sviluppo di un sistema automatizzato che ha trovato applicazioni in
campo medico. Essendo la produzione di anidride carbonica legata alle caratteristiche
metaboliche del microrganismo il metodo rimane limitato solo allindividuazione di
particolari specie.
c) Bioluminescenza; per stimare la carica microbica questo sistema utilizza la rilevazione dell'
ATP contenuto nelle cellule. Il metodo sfrutta il sistema enzima-substrato luciferinaluciferasi che venendo in contatto con ATP produce emissione di luce. L'
emissione di luce
risulta proporzionale alla quantit di ATP presente ed pertanto correlabile alla carica
batterica. Interferenze con la determinazione vengono prodotte dall'
eventuale presenza di
ATP non batterico che caratteristico anche di altre cellule (es. cellule somatiche nel latte) e
che dovrebbe essere eliminato da preliminari trattamenti enzimatici. Anche la
concentrazione di ATP nella cellula microbica pu variare sia in relazione alla specie
microbica che in funzione della fase di crescita e quindi, anche in questo caso, il metodo
rileva "attivit" cellulare, collegata al metabolismo energetico delle cellule, piuttosto che il
reale numero di microrganismi presenti nel campione. Il sistema ha comunque trovato
differenti applicazioni, alcune ad elevata automazione e semplicit, in particolare nel
controllo igienico delle superfici.
d) Produzione di metabolici rilevabili con analisi gascromatografiche; alcuni ricercatori hanno
utilizzato lanalisi gascromatografica dello spazio di testa per seguire il metabolismo
microbico e valutarne la presenza e lattivit in campioni alimentari.
e) Conduttanza-Impedenza; questi metodi utilizzano le variazioni delle caratteristiche
elettriche del substrato colturale conseguenti alla crescita ed al metabolismo microbico. I
microrganismi in fase di crescita producono metaboliti che modificano la carica elettrica del
substrato e che, a loro volta, possono interferire con altri componenti presenti nel mezzo
modificandoli. Questo fenomeno produce variazioni nella conduttanza (conduttanza ed
impedenza sono parametri strettamente correlati) del mezzo che possono essere utilizzate
per stimare la carica microbica di un campione. I differenti sistemi messi a punto sulla base
di questo metodo sono risultati molto sensibili e possono presentare un elevato livello di
automazione. Lo sviluppo di particolari terreni di crescita selettivi permette la ricerca
specifica di specie microbiche. Anche in questo caso il risultato ottenuto rappresenta
maggiormente l'
"attivit" batterica piuttosto che la carica presente nel campione. Questo tipo
di analisi risente delle caratteristiche del substrato e rende quindi necessarie specifiche
tarature per ogni terreno colturale utilizzato. I differenti strumenti che si basano su questa
24

metodica di analisi hanno trovato impiego in particolare nei test di sterilit e nel controllo di
qualit di prodotti alimentari.
Problematiche relative alle analisi indirette di conta
Se si pu affermare che nella maggior parte dei casi sia semplice tradurre in numero di cellule il
risultato offerto da sistemi di analisi innovativi, altres evidente che rimane complicato il tentativo
di interpretare il risultato nella logica tradizionale della conta in piastra. Anzi, soprattutto nel caso
delle metodiche indirette di valutazione della crescita microbica basate sulla rilevazione del
metabolismo microbico, non sempre possibile trovare una correlazione tra numero di cellule
presenti nel campione e loro attivit metabolica. In realt ci si deve chiedere se a volte, in
particolare nel settore alimentare quando non si tratta di batteri patogeni, la misura dell'
"attivit" dei
microrganismi presenti non sia un'
informazione pi utile rispetto a quella offerta dal numero di
batteri presenti in grado di moltiplicarsi e formare colonie in terreno agarizzato in condizioni
ottimali. La capacit dei microrganismi presenti negli alimenti di provocare inconvenienti, sia di
natura igienico-sanitaria sia tecnologici, dipende da differenti fattori tra i quali di sicura importanza
risultano: il loro numero, la loro capacit di moltiplicarsi nell'
alimento, i fenomeni connessi alla
presenza di differenti microrganismi in associazione (simbiosi, antibiosi, etc.). La metodica
tradizionale di conta microbica in terreni agarizzati permette di analizzare solo il primo di questi
fattori, oltretutto limitatamente alla presenza di cellule vitali e coltivabili e trascurando quelle
metabolicamente attive ma non coltivabili. Si pu quindi speculare che in alcuni casi le metodiche
alternative possano offrire una valutazione pi realistica della qualit igienica di un prodotto.
In molti casi la carica microbica soggetta a regolamentazioni che si basano sulla precisa
valutazione delle ufc presenti e la sovrastima o la sottostima dei valori di carica pu comportare per
i produttori l'
intervento di sanzioni economiche od anche legali. Quindi, indipendentemente delle
valutazioni teoriche sui metodi pi idonei alla valutazione della qualit igienica degli alimenti, per
gli operatori l'
espressione dei risultati di analisi in ufc, come previsto dalla metodica tradizionale ed
ufficiale, si trasforma in una necessit. Per le metodiche alternative al metodo tradizionale si pone
quindi il problema di correlare i risultati ottenuti con la conta in terreni agarizzati e, mediante
opportuna taratura, convertire i dati in ufc.
Non sempre i dati analitici ottenuti in questo modo risultano accettabili sia perch, in particolare
tutte le metodiche indirette, la misura valutata in alcuni casi di fatto non corrisponde alla reale
carica microbica (rapporto attivit/ufc), sia perch, pi in generale, esiste indubbiamente una
difficolt di base connessa anche all'
imprecisione dello stesso metodo di riferimento. Infatti spesso
le metodiche alternative offrono risultati di gran lunga pi precisi e ripetibili rispetto al metodo
diretto di conta in piastra ed molto problematico costruire correlazioni significative utilizzando un
metodo di riferimento con soglie di approssimazione cos importanti.
Frequentemente si portati a chiedere ai metodi alternativi di conta limiti di precisione superiori a
quelli dello stesso metodo di riferimento e questo, oltre che concettualmente sbagliato, risulta
evidentemente impossibile.
Come visto in questa sommaria rassegna, sono disponibili differenti sistemi automatizzati di
valutazione della carica microbica che, in relazione ai diversi livelli di automazione e di rapidit di
risposta offerti permettono di soddisfare le esigenze sia di laboratori preposti al controllo della
qualit igienica dei prodotti alimentari, per alcuni dei quali l'
analisi tradizionale era improponibile
visto l'
elevato numero di campioni da analizzare quotidianamente (es. pagamento del latte a
qualit), sia di industrie alimentari che vogliano mettere in atto un monitoraggio completo del ciclo
di produzione (materie prime, intermedi di lavorazione, prodotti finiti, etc.) che permetta tempi di
risposta compatibili con un possibile intervento durante le fasi di processo.
L'
automazione delle analisi microbiologiche, che gi ora offre una serie di innegabili vantaggi, si
deve comunque considerare come un settore con ulteriori grandi margini di sviluppo ed probabile
25

che in un prossimo futuro potremo disporre di sistemi sempre pi funzionali anche all'
analisi degli
alimenti.
Allo stato attuale delle cose l'
automazione dell'
indagine microbiologica comporta la necessit di
adattare ai nuovi sistemi sia le strutture sia, in un certo senso, lo stesso modo di lavorare in un
laboratorio di microbiologia. Infatti se necessario che per l'
evoluzione delle nuove strumentazioni
si tenga conto del tipo di analisi da effettuare, altrettanto innegabile che il passaggio
all'
automazione comporti variazioni dell'
organizzazione del laboratorio ed un cambiamento di
mentalit da parte dell'
analista stesso.
Sviluppi dei metodi di identificazione, caratterizzazione e biotipizzazione dei microrganismi
Lintroduzione di metodiche molecolari di identificazione e caratterizzazione dei microrganismi
basate su conoscenze fenotipiche e genotipiche in questi anni ha assunto una importanza rilevante
anche nel settore alimentare. La contemporanea evoluzione e automazione dei sistemi di
identificazione e classificazione, in particolare di quelli che fanno ricorso allamplificazione
genomica, gli sviluppi delle scienze statistiche e delle tecnologie informatiche applicate alla
microbiologia alimentare allo stato attuale permettono indagini sempre pi mirate e sensibili dei
microrganismi. I risultati ottenibili con queste metodiche possono essere utili sia a fini tassonomici
che per studiare e porre in evidenza le loro potenzialit metaboliche di differenti biotipi.
Lo sviluppo esponenziale di tecniche di identificazione e biotipizzazione molecolari, la conoscenza
e la diffusione nel World Wide Web di un sempre pi ampio numero di sequenze geniche e
limpatto delle tecnologie informatiche nella diagnostica microbiologica, hanno permesso di
incrementare le conoscenze sulla diversit microbica nei batteri. Limpiego di queste tecniche ha
rivoluzionato la diagnostica microbica ed ha permesso una migliore comprensione dei rapporti
filogenetici fra batteri. I metodi basate sulle tecniche conoscitive di sequenze del genoma batterico
possono fornire differenti tipologie di informazione in relazione alla zona di DNA che si intende
valutare. Lanalisi delle zone pi conservate del DNA batterico sicuramente utile a fini
identificativi (specie, subspecie) mentre lindagine della variabilit di sequenza del genoma in zone
che codificano per attivit metaboliche particolari (fermentazioni, resistenza fagica, attitudine alla
proteolisi, produzione di batteriocine) risulta di maggiore interesse per lo studio della biodiversit
allinterno della specie e, quindi una volta valutata la regolazione dellespressione fenotipica
collegata alla sequenza genica, anche per comprendere possibili utilizzi mirati in tecnologia della
microflora utile o, alternativamente, nel caso di batteri patogeni elaborare protocolli di difesa della
salute pubblica che tengano in considerazione la variabilit di comportamento allinterno delle
differenti specie.
Come sottolineato nei precedenti paragrafi, nellanalisi degli alimenti la conta microbica totale
rappresenta uninformazione non sempre sufficiente a comprenderne il significato igienico o
tecnologico.
In particolare nel caso delle flore patogene, ma anche di quelle utili o probiotiche, il numero di
microrganismi appartenenti ad un genere, una specie o addirittura ad un particolare biotipo pu
risultare di fondamentale importanza per lesito del processo di trasformazione.
Per il settore dellanalisi degli alimenti le molteplici applicazioni dei metodi di identificazione
batterica possono essere sommariamente sintetizzate come segue:
Identificazione di flore patogene in prodotti sospetti ed individuazione delle fonti di
contaminazione. La caratterizzazione molecolare degli isolati presenti nel campione al
consumo ed il confronto con campioni prelevati sulla filiera di produzione facilita il
controllo delle possibili sorgenti di contaminazione, la valutazione del pericolo e la gestione
del rischio ad essa connesso. Simili indicazioni possono valere non solo nel caso dei germi
patogeni, ma anche di flore alterative o per la ricerca della presenza di microrganismi non
desiderati perch portatori di caratteri sfavorevoli alle rese di trasformazione.
26
Identificazione della flora batterica caratteristica di alcuni prodotti. In molti alimenti

fermentati la microflora caratteristica della materia prima cruda, o quella residuale dopo i
trattamenti di risanamento viene arricchita dallimpiego di colture starter (naturali o
selezionati) con il risultato della formazione di popolazioni microbiche complesse, a volte
caratteristiche, i cui singoli componenti (generi, specie e biotipi) non sono di facile
identificazione e il cui ruolo tecnologico rimane da interpretare.
Determinazione del numero totale di una specifica tipologia di batteri appartenenti alla
stessa specie. Questo aspetto di particolare rilevanza soprattutto per quanto riguarda i
prodotti fortemente caratterizzati dalla presenza di differenti biotipi batterici che possono
svolgere ruoli funzionali allalimento, anche in questo caso non sempre di facile
comprensione.
I metodi di identificazione microbica pi utilizzati si possono schematicamente raggruppare in
alcune principali categorie, corrispondenti a differenti livelli di informazione tassonomica:
1. riconoscimento immunologico
2. riconoscimento sequenze geniche caratteristiche e profili genotipici degli isolati
3. analisi proteine cellulari
4. marcatori chemotassonomici
5. profili fenotipici
Il primo gruppo di identificazione si basa sul riconoscimento anticorpale di specifici siti antigenici
caratteristici della specie; come delineato in precedenza nellambito della discussione dei metodi di
analisi, sono stati sviluppati numerosi kit immuno-enzimatici, basati sul riconoscimento anticorpoantigene, utili a rendere pi praticabile lidentificazione.
Del secondo gruppo fanno parte tutti i metodi di analisi del DNA (o RNA), sia totale (% Guanina +
Citosina; polimorfismi di restrizione), sia di sue parti (profilo plasmidico) o frammenti (DNA
fingerprinting, metodi PCR, uso di sonde, sequenziamento di particolari regioni del cromosoma).
Nel terzo gruppo ritroviamo profili elettroforetici delle proteine (sia totali che di parete), profili
elettroforetici di enzimi, o zimogrammi e sequenze aminoacidiche.
Fra i marcatori chemotassonomici ascrivibili al gruppo quarto si possono annoverare i profili degli
acidi grassi cellulari o i componenti della parete cellulare (tipi di peptidoglicano).
Infine, nel quinto gruppo, che definisce i fenotipi espressi, si ritrovano i metodi sia classici che
innovativi di tipizzazione fenotipica (morfologia, fisiologia, propriet biochimiche, resistenza agli
antibiotici, resistenza ai fagi etc.).
Volendo approfondire le possibilit offerte dai metodi di identificazione e biotipizzazione genetica,
tra i maggiormente utilizzati si possono annoverare quelli che fanno ricorso a:
polimorfismi di restrizione del DNA ribosomico (ribotyping) o totale (elettroforesi in campo
pulsato, o PFGE) recentemente applicate nella caratterizzazione di numerose specie lattiche
sonde geniche e basate nella maggior parte dei casi sulle sequenze delle porzioni variabili
del 16S rRNA o su molecole che mimano il DNA e lRNA come gli Acidi Peptido Nucleici
(PNA);
amplificazione genica mediante PCR, che ha permesso lo sviluppo di numerosissime
tecniche sia di identificazione (Species-specific PCR) che di tipizzazione (PCR
fingerprinting). Alcuni esempi delle pi comuni metodiche basate sulla PCR e applicate ai
batteri lattici sono ARDRA, o Amplification of Ribosomal DNA Restriction Analysis;
polimorfismo di amplificazione dello spaziatore 16S-23S rRNA; RAPD, o Random
Amplification of Polymorphic DNA. Questultima
la tecnica
probabilmente
maggiormente utilizzata, in particolare per la biotipizzazione dei ceppi, si basa sullimpiego
di un unico primer di poche paia di basi che in condizioni di bassa astringenza ibridizza con
sufficiente affinit sequenze di DNA cromosomale. La separazione elettroforetica dei
prodotti di amplificazione risulta caratteristica del ceppo.
sequenziamento del DNA, in particolare del gene 16S rRNA (o di suoi frammenti) ma anche
di altri geni meno conservati come quelli metabolici. Questa tecnica, consentendo di
27

stabilire i rapporti filogenetici fra microrganismi, ha permesso lo sviluppo della moderna
tassonomia molecolare e trova anche impiego negli studi sulla biodiversit.
Fra i metodi fenotipici, accanto allapproccio classico basato sulla morfologia, su caratteristiche
metaboliche o profili fermentativi, ancora oggi di valido ausilio per identificazioni routinarie, si
sono affermate metodiche di screening pi efficaci quali:
profili elettroforetici in SDS delle proteine cellulari totali o di quelle extraparietali,
applicate in particolare per i batteri lattici;
determinazione sierologica, basata sulla presenza e la variabilit di alcuni determinanti
antigenici di parete come polisaccaridi o acidi teicoici
Lutilizzo di markers chemotassonomici, come la composizione in acidi grassi e lipidi polari
cellulari o lanalisi qualitativa della presenza di alcuni componenti della parete cellulare, non ha
ancora avuto un deciso sviluppo. La distribuzione di composti della parete cellulare, come i tipi di
mureina, che pu risultare genere o ceppo-dipendente, stata proposta come metodo rapido di
screening per identificare i lattobacilli (Hammes, et al., 1995). La determinazione della
composizione del peptidoglicano, per esempio, risultato uno dei metodi pi rapidi per
differenziare L. reuteri da L. fermentum.
La tassonomia microbica generalmente sinonimo di sistematica microbica e si pone
tradizionalmente tre differenti scopi: (i) classificazione, ovvero larrangiamento ordinato dei
microrganismi in gruppi tassonomici; (ii) nomenclatura, cio la denominazione delle unit (o
gruppi) definite in (i); (iii) identificazione, definita come il processo che porta alla determinazione
di appartenenza di un organismo sconosciuto in una delle classi definite in (i) e denominate in (ii).
La classificazione ha portato allintroduzione del concetto di gruppi tassonomici omogenei
(famiglie, generi, specie, sottospecie) composti da oggetti, i ceppi, che a loro volta sono
distinguibili a seconda della capacit di risoluzione di una singola metodica identificativa.
Analizzando le diverse tipologie di metodi identificativi attualmente a disposizione, si rileva come
al di l della risoluzione tassonomica richiesta, ogni singola tecnica presenti vantaggi e limitazioni
duso a seconda delle esigenze analitiche. Nel caso per esempio dellanalisi fenotipica, le
informazioni ottenute risultano spesso variabili e poco riproducibili e in molti casi non garantiscono
un risultato affidabile e costante nel tempo. Daltra parte il livello di automazione, che garantisce
una notevole rapidit di risposta e una praticit di applicazione, ha permesso una sempre pi ampia
diffusione di kit diagnostici applicati ai batteri lattici, molto efficaci per analisi di routine su un
numero elevato di ceppi. Anche nel caso dellanalisi elettroforetica delle proteine totali (SDSPAGE) lautomazione della tecnica, unitamente allevoluzione delle tecnologie informatiche, hanno
permesso di ottenere informazioni sulle relazioni filogenetiche a livello di genere, specie, ceppo,
pleomorfismi di colonia, presenza di contaminanti etc. Gli svantaggi dellSDS-PAGE risiedono
soprattutto nella necessit di disporre di colture pure e di realizzare complessi database per le
gestione delle informazioni.
I metodi chemotassonomici hanno avuto un ruolo importante nella tassonomia batterica; oggi sono
disponibili kit commerciali per lanalisi dei componenti di parete e opportuni database per una
corretta interpretazione del risultato.
Fra i metodi genotipici, i vantaggi della PFGE sono sicuramente legati allestrema affidabilit e
riproducibilit della tecnica, che consente di ottenere fingerprints esclusivi del singolo ceppo.
Purtroppo, i costi eccessivi e i lunghi tempi di preparazione del DNA e di esecuzione dellanalisi,
uniti alla laboriosit del metodo e allesigenza di disporre di colture pure, ne hanno limitato finora
lapplicazione per screening su vasta scala. Spesso si suggerisce di condurre una genotipizzazione
preliminare con metodi rapidi, anche se meno sensibili (come RAPD o ARDRA) al fine di ridurre
in modo consistente, raggruppandoli, il numero di isolati da analizzare per poi passare allanalisi
mediante PFGE degli individui pi rappresentativi dellintera popolazione microbica.
I metodi basati sulla PCR (come la RAPD) condividono una serie di vantaggi che ne giustificano
lampio uso, fra cui lestrema semplicit di realizzazione, i costi contenuti e la rapidit dei tempi di
esecuzione. Oggi sono inoltre disponibili kit di estrazione di DNA PCR grade basati su particolari
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resine (come il chelex) che consentono di estrarre in pochi minuti la molecola da matrici anche
complesse, come quelle alimentari, e che hanno ulteriormente velocizzato tutta la procedura. Nel
caso della RAPD i profili di amplificazione ottenuti, inseriti in opportuni database mediante ricorso
a particolari pacchetti informatici, consentono la creazione di gruppi o clusters e una rapida
identificazione, almeno preliminare, di isolati ignoti.
La RAPD per non una tecnica molto riproducibile e, analogamente alla PFGE, non permette
lanalisi di colture miste; inoltre, per la migliore identificazione di una data specie, richiede una fase
preliminare di ottimizzazione per individuare il set di primer pi adatto, in termini sia di capacit
discriminante che di tipologia di oligonucleotidi (numero, lunghezza, sequenza).
Pertanto, la risoluzione tassonomica di una singola tecnica di identificazione altro non riflette che la
sua capacit di catalogare un ceppo allinterno di gruppi tassonomici. A tal riguardo, spesso i ceppi
isolati da habitat naturali, a causa delle pressioni selettive ambientali e tecnologiche cui sono
sottoposti, mostrano marcate differenze fenotipiche rispetto al ceppo tipo della specie o spiccata
variabilit intra-specifica. Ci significa che possibile ritrovare, con elevata frequenza, diversi
biotipi o biovarianti adattatisi a particolari nicchie, che hanno subito unevoluzione tale da
determinare piccoli o grandi cambiamenti sia nel fenotipo che nel genotipo. Pertanto, il ricorso a un
singolo criterio identificativo non sempre sufficiente a catalogare in modo corretto e univoco un
organismo allinterno di un insieme, per la cui identificazione necessaria una caratterizzazione che
tenga conto di tutte le informazioni possibili (fenotipiche, genotipiche, filogenetiche, biochimiche
ed ecologiche), che sono alla base della tassonomia polifasica.
Una sintesi delle principali applicazioni di tecniche di caratterizzazione molecolare utilizzabili per i
batteri lattici riportata in tabella 1.6 .
Il termine tassonomia polifasica, coniato da Colwell, individua una filosofia tassonomica che mira a
integrare diversi tipi di dati e informazioni (fenotipiche, genotipiche, filogenetiche) al fine di
delineare i differenti taxa a tutti i livelli. E pertanto un tipo di tassonomia consenso, ovvero una
caratterizzazione microbica approfondita, che tiene conto del contributo di svariate discipline:
biologia molecolare, biochimica, morfologia, fisiologia, genetica, ecologia microbica e statistica.
Negli ultimi ventanni lavvento della tassonomia polifasica ha sicuramente rivoluzionato la
sistematica batterica; il concetto stesso di specie, definibile come un gruppo di ceppi (incluso il
ceppo tipo) che condividono caratteristiche in comune, acquista contorni meno definiti secondo la
tassonomia polifasica. Daltra parte, in mancanza di criteri univoci di identificazione microbica,
lidentificazione polifasica potrebbe risultare pi valida, sebbene ci si potrebbe chiedere quale
elemento debba incidere in misura pi significativa sulla valutazione. A tal riguardo ogni possibile
metodo che informi sulla natura biologica dei ceppi merita, in linea di principio, la stessa attenzione
e importanza; la scelta spesso deriva da altre considerazioni (costo, praticit, numero di ceppi da
analizzare, consuetudine).
La tassonomia polifasica una disciplina che, affermatasi soprattutto in virt del confronto fra
diverse tecniche di identificazione e caratterizzazione microbiche, impiega differenti tecniche di
identificazione e, quindi, elabora i dati ottenuti con tecniche statistiche. Tali tecniche si basano sulla
valutazione del grado di dissomiglianza rispetto ad un insieme di variabili. A tal riguardo
importante sottolineare che in statistica multivariata le analisi di raggruppamento sinteticamente si
suddividono in gerarchiche e non gerarchiche che rappresentano due approcci di studio totalmente
differenti. In unanalisi gerarchica dei gruppi ogni classe fa parte di una classe pi ampia, la quale
contenuta a sua volta in una classe di ampiezza superiore e cos in progressione fino alla classe che
contiene lintero insieme di ceppi analizzati: tale concatenamento di classi viene in genere
rappresentato mediante diagramma ad albero (o dendrogramma). La soluzione che si ottiene con le
tecniche gerarchiche piuttosto rigida, nel senso che unaggregazione effettuata nei primi stadi
dellanalisi si pu trascinare fino alla fine e pu rendere i risultati artificiosi. Le tecniche non
gerarchiche prevedono che si debba decidere, o conoscere sulla base di precedente esperienza, a
priori il numero di gruppi. Lobbiettivo quello di stabilire un criterio per assegnare correttamente
ulteriori unit allo studio al rispettivo gruppo di appartenenza.
29

Lanalisi dei componenti principali (o PCA) un tipo di analisi non gerarchica che genera
partizioni, ossia classi mutuamente esclusive e tali che, per un numero di gruppi prefissato,
possibile inserire unentit in una e una sola classe.
Una soluzione statisticamente utile di far precedere lanalisi non gerarchica da una gerarchica:
questo dovrebbe permettere di ottenere raggruppamenti alquanto concordanti, nonostante i due
approcci siano concettualmente molto differenti.
Lo sviluppo delle tecnologie informatiche ha sicuramente dato un contributo indispensabile al
miglioramento della capacit di interpretazione ed elaborazione dei dati microbiologici.
Naturalmente, lacquisizione di un software di elaborazione, che in genere presenta costi elevati e
necessita di competenze specifiche per un efficace utilizzo, diviene insostituibile per la gestione di
dati polifasici relativi a ceppoteche, collezioni microbiche, per confrontare nuovi isolati con ceppi
di collezione, per mantenere la memoria biologica di gruppi microbici o per valutare levoluzione
di popolazioni in ecosistemi.
Levoluzione di alcune discipline, come la biologia molecolare e linformatica, ha permesso di
migliorare le possibilit diagnostiche in microbiologia, consentendo inoltre di fare significativi passi
avanti nello studio della biodiversit dei batteri lattici in ecosistemi anche complessi (come le
matrici alimentari). In questo specifico settore, al fine di non incorrere in semplificazioni errate che
possono risultare fuorvianti nellinterpretazione del confronto e nel raggruppamento dei cluster
ottenibili dallanalisi del DNA batterico, obbligo ricordare che nonostante il rigoroso impiego di
tecniche statistiche di raggruppamento, lindagine a monte spesso rappresentativa di zone di DNA
molto parziali se comparate allintero genoma batterico. I risultati che si ottengono sottolineano la
differenza o la similitudine dei ceppi solo per alcune specifiche sequenze di DNA; sono pertanto
certe solo le differenze, quando queste compaiono, mentre le similitudini potrebbero essere
controvertite da analisi di altre zone del DNA.
Nella maggior parte dei casi si analizzano zone conservate del DNA che sono molto utili per lo
studio di appartenenza alla specie mentre sono meno efficaci per evidenziare la biodiversit
intraspecie. In questo senso lo studio della biodiversit dovrebbe riquardare le zone del DNA
maggiormente variabili.
La crescente disponibilit di tecniche quali DGGE/TGGE (Denaturing Gel Gradient
Electrophoresis/Thermal Gel Gradient Electrophoresis), SSCP (Single Strand Conformation
Polymorphism), T-RFLP (Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism) e LHPCR
(Length Heterogeneity Polymerase Chain Reaction), unitamente allo sviluppo della statistica
predittiva, gi applicate nella microbiologia ambientale e alimentare, consentir inoltre lo studio
delle dinamiche di popolazione di batteri lattici in matrici alimentari e la valutazione della effettiva
biodiversit microbica, in virt della possibilit di individuare ceppi vitali ma non coltivabili perch
stressati dai trattamenti tecnologici anche intensi cui vengono sottoposti durante i processi
tecnologici di trasformazione.
In questo senso, risultano di notevole interesse i, cosiddetti, metodi culture-indipendent. Il principio
analitico comune a questi sistemi di analisi la possibilit di rilevare la composizione della
popolazione microbica di un ecosistema evitando le fasi di isolamento e coltura dei suoi singoli
componenti, tramite lanalisi del DNA totale presente nel campione. Si tratta di tecniche molecolari
che sono gi da tempo utilizzate a scopo tassonomico ma che vengono applicate per valutare,
almeno qualitativamente, la presenza di diversi microrganismi (desiderati o indesiderati) negli
ecosistemi naturali. Le tecniche pi comunemente utilizzate sono TGGE (elettroforesi in gradiente
denaturante di temperatura degli amplificati di zone variabile di DNA); DGGE (elettroforesi in
gradiente denaturante di forza ionica degli amplificati di zone variabile di DNA); LH-PCR
(eterogeneit di lunghezza di frammenti amplificati); T-RFLP (polimorfismo di lunghezza dei
frammenti terminali di restrizione); FISH (ibridazione fluorescente in situ); citofluorimetria ISH;
DEFT (conta diretta in epifluorescenza). I risultati fino ad oggi ottenuti sono riferiti a diversi
ecosistemi alimentari e sembrano essere promettenti.
30
Famiglie e generi microbici di interesse alimentare

I batteri
Il mondo dei microrganismi estremamente vasto e non sarebbe possibile in un paragrafo inserire
approfondimenti relativi a tutte le specie. Quindi, senza alcuna ambizione di esaustivit e
sintetizzando quanto riportato da testi specializzati in tassonomia batterica, si cercato di
evidenziare le principali famiglie e generi batterici enfatizzando le specie che svolgono ruoli
maggiore rilevanza per il settore alimentare:
1. Gruppo Batteri lattici:
fam. Lactobacillaceae; gen. Lactobacillus, gen. Pediococcus
fam. Streptococcaceae; gen. Streptococcus, gen. Lactococcus,
fam Leuconostaceae; gen. Leuconostoc, gen. Oenococccus, gen. Weissella
fam. Enterococcaceae; gen. Enterococcus
2. fam. Micrococcaceae: gen. Micrococcus e gen. Arthrobacter
3. fam. Staphylococcaceae: gen. Staphylococcus.
4. fam. Planococcaceae: gen. Planococcus e gen. Kurtia
5. fam. Bacillaceae: gen. Bacillus
6. fam. Clostridaceae: gen. Clostridium
7. fam. Mycobacteriaceae: gen. Mycobacterium
8. fam. Microbacteriaceae: gen. Microbacterium
9. fam. Propionibacteriaceae: gen Propionibacterium
10. fam. Corynebacteriaceae: gen. Corynebacterium
11. fam. Brevibacteriaceae: gen. Brevibacterium
12. fam. Listeriaceae: gen. Listeria
13. fam. Bifidobacteriaceae: gen. Bifidobacterium
14. fam. Pseudomonaceae: gen. Pseudomonas
15. fam. Xanthomonaceae: gen. Xanthomonas
16. fam. Acetobacteriaceae: gen. Acetobacter e gen. Gluconobacter
17. fam. Enterobacteriaceae:
gen. Escherichia Coli
gen. Salmonella
gen. Shigella
gen. Yersinia
gen. Klebsiella
gen. Enterobacter
gen. Serratia
gen. Edwarsiella
gen. Citrobacter
gen. Proteus
gen. Plesiomonas
18. fam. Vibrionaceae: gen. Vibrio
19. fam. Aeromonodaceae: gen. Aeromonas
20. fam. Campylobacteriaceae: gen. Campylobacter
21. fam. Moraxellaceae: gen. Acinetobacter e gen. Moraxella
22. fam. Brucellaceae: gen. Brucella
Batteri Lattici
31

I batteri lattici sono un gruppo molto eterogeneo di microrganismi, caratterizzati dallessere
ampiamente diffusi in natura, di estrema importanza nella trasformazione e conservazione di molti
alimenti. I batteri lattici svolgono un ruolo centrale in buona parte delle biotecnologie
agroalimentari, in virt soprattutto della capacit di inibire microflora indesiderata o patogena negli
alimenti fermentati, delle loro propriet acidificanti, aromatizzanti e probiotiche.
Si suddividono in differenti Famiglie ed in particolare le Lactobacillaceae, coi generi Lactobacillus
e Pediococcus, le Streptococcaceae, con i generi Streptococcus e Lactococcus, le Leuconostaceae,
coi generi Leuconostoc, Oenococccus, Weissella, le Enterococcaceae e le Carnobacteriaceae.
Sono batteri Gram + , eterotrofi, non mobili, non sporigeni, anaerobi obbligati o facoltativi, acido
tolleranti e talvolta acidofili, catalasi negativi, molto esigenti nutrizionalmente. Si riconoscono
differenti generi anche se la tassonomia in continua evoluzione. Come detto si tratta di un gruppo
microbico molto variegato sia per morfologia (Lactobacillus e Carnobacterium di forma
bastoncellare, Streptococcus, Leuconostoc, Lattococcus, Enterococcus, Oenococccus e Pediococcus
di forma coccica) che in relazione alle attitudini metaboliche dei differenti ceppi. La temperatura
ottimale di crescita variabile da specie a specie e si caratterizzano sia forme mesofile che
termofile.
I batteri lattici utilizzano gli zuccheri secondo la via fermentativa lattica, omo o eterofermentante a
seconda della specie, producendo prevalentemente acido lattico nel primo caso mentre nel secondo
anche alcool etilico, acetaldeide e CO2 sono metaboliti primari della fermentazione.
Le differenti specie sono in grado di utilizzare per via fermentativa diversi tipi di glucidi;
preferenzialmente monosaccaridi, esosi o pentosi (questi ultimi in particolare nelle fermentazioni
dei vegetali e nei mosti duva) e, previa idrolisi, anche disaccaridi come lattosio, saccarosio,
maltosio, trealosio, cellobiosio e melibiosio. Alcune specie possono utilizzare per via fermentativa
anche acidi organici quali citrico, malico e tartarico.
Si tratta comunque di microrganismi con elevate esigenze nutrizionali che attecchiscono e trovano
substrato di crescita in molte matrici alimentari in relazione alla ricchezza della composizione di
queste ultime in zuccheri, composti azotati semplici, vitamine, sali minerali ed altri fattori di
crescita. I metabolismi associati alla moltiplicazione dei batteri lattici sono la base dei processi
fermentativi associati alla produzione ed alla maturazione di differenti alimenti fermentati quali:
derivati del latte (formaggi, creme e yogurt), salami e salsicce, vegetali fermentati (crauti), impasti
acidi per prodotti da forno e che possono svolgere un ruolo importante nella maturazione di alcuni
vini (fermentazione malolattica; Oenococcus oenii).
La produzione di acido lattico e di altri metaboliti primari funzionale alle caratteristiche
strutturali e alla conservabilit degli alimenti fermentati. Lacidificazione pu indurre modificazioni
della struttura delle proteine funzionali alla reologia dellalimento e inibisce le microflore alterative
e patogene. Linibizione, oltre che alla produzione di acidit, pu essere collegata alla competizione
nutrizionale e/o alla produzione di sostanze antimicrobiche a differente spettro di attivit
caratteristica per alcuni ceppi. Lattivit metabolica dei batteri lattici (fermentazioni secondarie,
proteolisi e attivit esterasica nei confronti di mono e digliceridi) induce profonde modificazioni
della matrice e la produzione di differenti sostanze aromatiche. Ad alcune specie sono state inoltre
attribuite virt probiotiche.
In virt del secolare consumo da parte delluomo di alimenti da essi fermentati, i batteri lattici sono
generalmente considerati sicuri. Tuttavia, si ritiene che non tutti i batteri lattici siano utili, anzi,
alcune specie possono risultare patogene o comunque dannose.
In particolare nellambito del genere Streptococcus, alcune specie -emolitiche differenziabili in 4
sierotipi (A, B, C, E) sono risultate essere patogene Nel gruppo A si trovano in particolare gli
streptococchi patogeni per luomo, tra questi di rilievo S. pyogenes, agente della scarlattina, che
stato ritrovato anche in alimenti come il latte in seguito a contaminazione da parte di personale
infetto.
Secondo differenti Autori, in alcuni casi particolari, anche altre specie ritenute di norma sicure e di
frequente rinvenimento negli alimenti, possono essere riconosciute come patogene opportuniste.
32

Alcuni batteri lattici sono stati infatti occasionalmente implicati in infezioni umane (endocarditi,
bacteremia); lepidemiologia non offre ancora dati sicuri ma certamente in questi ultimi anni
incrementato il riconoscimento dei casi clinici di questo tipo anche se nellambito delle infezioni da
batteri patogeni opportunisti i batteri lattici risultano meno implicati rispetto a numerose altre
microflore commensali. In generale i casi di infezione hanno coinvolto individui debilitati o
comunque caratterizzati da condizioni di salute predisponenti linfezione. Allo stato attuale delle
conoscenze si pu ritenere che il rischio associabile anche alla presenza di alcune particolari specie
di batteri lattici, coinvolte occasionalmente in episodi di infezioni oportuniste, sia al momento poco
significativo.
In considerazione delleterogeneit genotipica e fenotipica, il gruppo dei batteri lattici
caratterizzato dalla presenza di numerosi generi, specie e biotipi. Le recenti metodiche di studio
basate su omologia di zone conservate del DNA o RNA hanno profondamente modificato la
classificazione proposta allinizio del secolo scorso da Orla Jensen in uso fino agli anni 80-90
(tabb. 2.7, 2.8, 2.9). Allo stato attuale sono note pi di cento specie di batteri lattici.
Allinterno di ognuna delle specie possono essere evidenziati particolari biotipi caratterizzati da
fenotipi di rilievo tecnologico e ecologico quali:
presenza di differenti livelli di esigenze nutrizionali e capacit di adattarsi ad un substrato,
adattamento alla temperatura (temperatura ottimale di crescita e capacit metabolizzare a
temperature non ottimali),
capacit di utilizzare differenti fonti glucidiche,
capacit di utilizzare substrati alternativi agli zuccheri a fini energetici,
utilizzazione dei citrati,
attitudine alla proteolisi,
produzione di molecole ad impatto aromatico,
resistenza allacidit (capacit di tollerare valori di acidit elevata),
capacit acidificante (velocit e/o intensit di acidificazione),
resistenza a differenti concentrazioni di sale,
attitudine allautolisi,
resistenza/sensibilit infezione fagica,
produzione e/o sensibilit alle batteriocine,
sensibilit a differenti sostanze ad attivit battericida o batteriostatica,
produzione sostanze addensanti o ispessenti,
capacit di adesione.
In relazione a tali attitudini, specie e biotipi differenti possono prendere il sopravvento in diverse
nicchie ambientali e di produzione che a volte possono risultare caratteristiche. La presenza di
differenti biotipi giustifica la grande versatilit dei batteri lattici e la loro ubiquitariet e, allo stesso
tempo, rappresenta per il settore alimentare unopportunit per limpiego mirato di ceppi a migliore
funzionalit tecnologica.
Alla famiglia Enterococcaceae, secondo il Bergeys Manual appartengono i generi Enterococcus,
Melissococcus, Tetragonococcus e Vagococcus che in precedenza, nellambito dei batteri lattici,
erano compresi nella famiglia delle Streptococcaceae.
Fra le specie di maggiore interesse per il settore alimentare sicuramente troviamo gli appartenenti al
genere Enterococcus. Alcune specie di questo genere sono ampiamente diffuse nel settore alimenti.
Il loro significato igienico e tecnologico stato sovente discusso. Lidentificazione degli
enterococchi spesso problematica; numerosi isolati ambientali rimangono di difficile assegnazione
tassonomica. Si tratta comunque di un gruppo di microrganismi molto eterogeneo con molte
similitudini con i generi Streptococcus e Lactococcus.
A testimonianza di ci, si ricordi che solo negli anni 80, sulla base di analisi del 16S rRNA
vennero differenziati i tre generi Enterococcus, Lactococcus, and Streptococcus. Da allora il
numero di specie riconosciute appartenenti al genere Enterococcus sono salite ad almeno 19. Questa
33

situazione non pare comunque definitiva ed probabile che in futuro, in base alle risultanze delle
sempre pi sofisticate e specifiche indagini molecolari, il genere Enterococcus venga ridiscusso e
sia soggetto a nuove evoluzioni e collocazioni tassonomiche.
Dal punto di vista metabolico si tratta di microrganismi molto simili a Streptococcus spp. ma con
caratteristiche fisiologiche aggiuntive che ne facilitano la resistenza e la capacit di adattamento a
differenti condizioni ambientali (TC, pH, concentrazione salina). In genere si tratta di
microrganismi molto resistenti e versatili, isolabili da differenti matrici e difficili da eradicare in
conseguenza delle capacit di adattamento e resistenza a differenti fattori. Sono stati considerati
microflora tipica di produzioni casearie artigianali e a latte crudo. Da sottolineare, tuttavia, la
capacit di alcune specie di produrre ammine biogene ed emolisi. Di notevole rilievo, in relazione
agli equilibri ecologici che si creano in colture microbiche miste, come quelle caratteristiche di
molti alimenti fermentati, la capacit di produrre batteriocine a differente spettro di attivit . Desta
preoccupazione, o comunque richiede maggiori approfondimenti lattitudine di alcuni ceppi del
genere ad acquisire e trasferire ad altri batteri caratteri di resistenza agli antibiotici.
Famiglia Micrococcaceae
Si tratta di una famiglia di batteri di forma coccica non mobili, Gram-positivi, con la caratteristica
tendenza di disporsi in ammassi (tetradi, grappoli o cubi). Sono catalasi e citocromo positivi e
nitrato riduttori. Tollerano alte pressioni osmotiche derivanti da alte concentrazioni di sale o
zuccheri. Crescono tra i 10C e i 45C, con un optimum compreso tra 30C e 37C, e in un
intervallo di pH variabile da 5 a 9. Il loro habitat naturale la pelle e le mucose animali, ma
vengono riscontrati anche in diversi altri ambienti.
Limportanza di alcune specie di questi microrganismi negli alimenti da correlare in particolare
alle attivit enzimatiche (proteolitiche, lipolitiche e saccarolitiche), alle loro relativamente contenute
esigenze nutrizionali e alla osmo- e alotolleranza.
Tra le specie che appartengono alla famiglia si ritrova Micrococcus, Nesterenkonia, Kytococcus,
Kocuria e Arthrobacter.
Genere Micrococcus
Nella Famiglia il genere Micrococcus quello di maggiore interesse per il settore alimentare. Tale
genere caratterizzato da microrganismi saprofiti tutti aerobi obbligati, che fermentano il glucosio
per ossidazione. Alcuni di essi resistono ai normali trattamenti termici, quindi possono essere
ritrovati in alimenti pastorizzati.
Alcuni ceppi di Micrococcus vengono riscontrati sulla superficie di formaggi con crosta lavata e/o
morchiosa (stagionatura del Taleggio) e sono considerati tra i microrganismi responsabili delle
caratteristiche colorazioni e/o pigmentazioni arancio-rosa dei formaggi a crosta lavata. Sono in
particolare microflora caratteristica degli insaccati fermentati (Kocuria varians e K. Kristinae)
Genere Arthrobacter
Microrganismi a forma bastoncellare irregolare la cui morfologia pu variare nel corso della
crescita fino a risultare sferoidale. Gram positivi non sporigeni. Solitamente non mobili ed aerobi
obbligati. Chemorganotrofi con metabolismo respiratorio. Mesofili, anche se alcuni ceppi risultano
in grado di ben tollerare le basse temperature, non termodurici.
Sono batteri comunque molto diffusi nel terreno e negli ambienti acquatici, in particolare possono
contaminare i pesci di mare. Sono tutti alotolleranti o alofili, crescono a concentrazioni di sale
variabili dal 5 al 15%, questa caratteristica pu favorirne lo sviluppo sulla superficie dei formaggi a
crosta lavata come il Taleggio che nel corso della stagionatura vengono ripetutamente spazzolati e
lavati con soluzioni saline. Formano spesso colonie cremose di colore arancio.
Famiglia Staphylococcaceae
Genere Staphylococcus
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Costituito pi di 20 specie e subspecie; sono tutte forme batteriche anaerobie facoltative che
fermentano il glucosio e che sono caratterizzate da attivit enzimatiche lipolitiche e proteolitiche di
rilievo. Il genere comprende sia specie saprofite, alcune delle quali di grande interesse alimentare,
come Staphylococcus xylosus molto importante nella produzione e maturazione dei salami, ed altre
invece patogene.
Le specie patogene sono coagulasi+, fosfatasi+, DNAsi+ e producono due tipi di tossine: le
emolisine alfa o beta, la prima caratteristica degli stipiti umani e la seconda di quelli di provenienza
bovina; un enterotossina termostabile, della quale attualmente sono stati identificati almeno 4 tipi
(A, B, C, D) con differente reattivit antigenica.
Anche se differenti specie sono responsabili di gastroenteriti, la specie patogena pi nota ed
importante dal punto di vista alimentare Staphylococcus aureus responsabile di un grande numero
di intossicazioni alimentari con sintomatologia caratteristica, con esito solitamente breve e benigno,
i cui costi sociali diretti ed indiretti negli USA sono stati per considerati di grande rilievo.
La tipizzazione di S. aureus ha permesso di evidenziare differenti serotipi che risultano in grado di
produrre enterotossine differenti anche se simili per caratteristiche biochimiche e biologiche. Allo
stato attuale differenti ceppi della specie sono stati caratterizzati geneticamente in particolare
riguardo i fattori che determinano la regolazione della produzione di tossina.
La contaminazione degli alimenti origina principalmente dalluomo, ma anche dagli animali e
dallambiente. La maggioranza degli S. aureus coinvolti in casi di intossicazione sono di
provenienza umana e quindi derivano da contaminazioni che avvengono nel corso della produzione
e manipolazione degli alimenti.
S. aureus caratterizzato dalla capacit di insediarsi in particolari distretti umani o animali ove
persiste per lunghi periodi e da dove difficile da eradicare. Anche gli animali sono una fonte
importante di contaminazione; di particolare rilievo per il settore caseario sono le mastiti bovine
causate dal microrganismo.
Vista la notevole resistenza di S. aureus a fattori ambientali avversi e la notevole diffusione non
sempre possibile risalire alla fonte di contaminazione. Si tratta comunque di uno dei microrganismi
maggiormente studiati e conosciuti, del quale sono stati approfonditi la capacit di acquisire
resistenza agli antibiotici, il numero di microrganismi richiesti per produrre la tossina in quantit
rilevabili e la dose di tossina necessaria per lindurre intossicazione.
Desta particolare preoccupazione la diffusione ambientale di ceppi appartenenti alla specie che
manifestano resistenza agli antibiotici.
Famiglia Planococcaceae
Genere Planococcus
Cellule sferiche gram positive (a volte gram variabile) a volte mobili per cilia peritriche, aerobie,
non sporigene e catalasi positive. Questi batteri, particolarmente resistenti al sale, sono stati isolati
da ambienti marini o collegabili allecosistema marino, come lepidermide di alcuni pesci.
Per lungo tempo i microrganismi appartenenti al genere sono stati inseriti nella famiglia delle
micrococcaceae ma allo stato attuale, sia sulla base dei risultati di esami serologici che di analisi
di sequenza della zona 16S rRNA, non pare possibile trovare relazioni con gli altri generi della
famiglia.
Genere Kurtia
Questo genere appartenente alla famiglia delle Planoccocacee costituito da bastoncini Gram
positivi, non sporigeni, corti e mobili e aerobi stretti. La visione al microscopio spesso evidenzia
catenelle di bastoncini parallele.
Famiglia Bacillaceae
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Appartengono a questa famiglia microrganismi Gram-positivi, di forma bacillare in grado di
formare endospore come forma di resistenza. Si tratta pertanto di microrganismi notevolmente
resistenti a condizioni avverse ed in particolare termoresistenti. Alcune delle specie appartenenti
alla famiglia sono patogene ed altre semplici contaminanti, anche se spesso in grado di provocare
importanti alterazioni degli alimenti.
Genere Bacillus
Si tratta di microrganismi mobili per ciglia peritriche, aerobi o anaerobi facoltativi, mesofili o
termofili, catalisi positivi con attivit proteolitica spiccata (coagulano il latte). Fermentano i
carboidrati con produzione di acido, che di norma viene neutralizzato dalle sostanze azotate alcaline
liberate per proteolisi.
I batteri appartenenti al genere hanno una vasta diffusione ambientale, sono di fatto ubiquitari, e si
trovano allo stato saprofitico nel terreno, nella polvere, nei fieni e nelle feci.
Alcuni ceppi sono impiegati industrialmente per la fermentazione aceton-butilica; altri in campo
farmaceutico per la produzione di sostanze antibiotiche e di enzimi proteolitici.
Il Bergeys Manual of Determinative Bacteriology propone che il genere Bacillus in base a
caratteristiche morfologiche e biochimiche venga suddiviso in 3 gruppi:
1.
forme con sporangio non deformante e spore di forma ovale o cilindrica;
2.
forme con sporangio deformante e spore di forma sempre ovale;
3.
forme con sporangio non deformante e spore di forma sferica (ma nessuna specie
appartenente a questo terzo gruppo interessa il settore alimentare)
Recentemente, grazie allimpiego delle tecniche molecolari di identificazione e tipizzazione sono
state proposti numerose modificazioni alla classificazione con il riconoscimento di almeno 16
differenti specie.
Le specie B.anthracis, B.cereus, B. mycoides, B. thuringiensis, B.
pseudomycoides e B. weihstephanensis sono state raggruppate nel gruppo B. cereus. Sulle basi delle
similitudine delle sequenze conservate dell RNA ribosomale (16S e 23S) stato definito che
queste specie sono molto simili e che le divergenze da una comune linea evolutiva siano avvenute
recentemente.
B. cereus un microrganismo patogeno rinvenibile negli alimenti; ubiquitario come buona parte
dei batteri appartenenti al genere, flora che transita nell intestino umano, maggiormente diffuso
nella polvere, nel terreno, si riscontra quindi spesso in cereali e vegetali. Da questi ambienti naturali
facilmente trova veicoli per contaminare gli alimenti, in particolare quelli di origine vegetale. Sono
possibili e note differenti contaminazioni crociate con altri alimenti, quali quelli di origine carnea o
latte e i suoi derivati. Nel caso del latte le spore, presenti nel latte crudo come contaminazione
dallambiente di allevamento, possono sopravvivere al processo di pastorizzazione.
B. cereus cresce in terreni con un intervallo di pH compreso tra 5.0-8.8 (optimum 6-7) e ad un
valore di attivit dellacqua maggiore di 0.93. Si sviluppa in un intervallo di temperatura ampio,
compreso tra 4 e 55C anche se trova condizioni migliori di sviluppo tra i 30 e i 40C; di norma la
temperatura di 10C dovrebbe inibire lo sviluppo, ma sono state isolate varianti in grado di
moltiplicarsi tra 4 e 6 C.
Produce due diverse tossine, che vengono liberate in seguito alla lisi del batterio sia nellalimento
che direttamente nellintestino umano. La soglia di pericolosit riportata in letteratura ampia e
varia tra 105 e 108 cellule vitali o spore ingerite; la variabilit imputabile alla differente
attitudine dei singoli ceppi di produrre quantit di tossine differenti.
Esistono due tipi di intossicazione: la sindrome enterica e sindrome emetica.
La sindrome enterica causata da una tossina termolabile (56C per 5min) che prodotta dal
microrganismo nella fase esponenziale di crescita a 18-43C e pH di 6,0-8,5.
La sindrome emetica causata da una enterotossina termostabile (126C per 90min), resistente a pH
estremi e prodotta nella fase stazionaria di crescita. I sintomi compaiono dopo 1-6h, durano per 1224h e sono caratterizzati da nausea e vomito violenti.
Allo steso gruppo di B. cereus appartiene B. anthracis, agente eziologico del carbonchio che
attacca polli, ovini, equini e uomo. Nei bovini la forma pi comune quella ematica (con edema
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emorragico, ingrossamento della milza e convulsioni); nelluomo invece si pu avere un carbonchio
cutaneo (con formazione di una pustola cutanea maligna) o un carbonchio ematico polmonare.
B. subtilis come le altre specie del genere molto diffuso in natura, a differenza di Bacillus cereus
non patogeno, anzi utilizzato in alcuni preparati farmaceutici come riequilibratore della flora
intestinale.
Bacillus coagulans un forte produttore di acido e pu essere impiegato per la produzione
industriale in fermentatori di acido lattico. Pu modificare il sapore anche dei cibi in scatola, senza
produrre bombaggio (flat sour). B. thermophilus e B. stearothermophilus sono termofili con un
optimum di temperatura che varia da 50C ai 70C anche queste specie acidificano il mezzo di
crescita e possono produrre flat sour. B. polimixa e B. macerans sono preferibilmente anaerobi
produttori di gas, e quindi possibili responsabili di bombaggio biologico di alimenti in scatola.
Famiglia Clostridiaceae
Genere Clostridium
Sulla base di recenti studi filogenetici sono state riconosciute almeno 15 specie appartenenti al
genere. Sono microrganismi bastoncellari, anaerobi obbligati, immobili o mobili per cilia peritriche,
sporigeni citocromo negativi e di solito anche catalasi negativi (anche se tracce di catalasi possono
essere riscontrate in alcuni ceppi). Possono essere mesofili o termofili a seconda delle specie. Le
forme vegetative sono sensibili allossigeno. Questi microrganismi sono riscontrati frequentemente
nel terreno, nella polvere, nellintestino di uomo e animali e nelle feci. Si tratta di microrganismi
dalla grande versatilit metabolica; possono metabolizzare carboidrati, alcool, aminoacidi, purine,
steroidi e altri composti organici con produzione di diverse sostanze organiche e gas (CO2, H2, H2S,
CH4) accompagnati da odori e sapori sgradevoli (tali trasformazioni vengono comunemente
denominate putrefazioni). La produzione di gas in alcuni casi tale da danneggiare seriamente il
prodotto, modificandone oltre che il sapore la struttura, o provocando bombatura e deformazione
dei contenitori.
Molte specie sono dannose nella conservazione dei prodotti alimentari: Cl. butyricum, Cl.
tyrobutyricum, Cl. butylicum, Cl. nigrificans, Cl. thermosaccharolyticum e Cl. sporogenes.
Cl. butyricum e Cl. tyrobutyricum assumono importanza nei difetti di gonfiore tardivo dei formaggi
a lunga stagionatura.
Di notevole rilievo assume il fatto che recentemente sono stati individuati microrganismi
appartenenti alla specie Cl. butyricum in grado di produrre una neurotossina analoga a quella
botulinica di tipo E.
Clostridium botulinum, Clostridium perfringens e Clostridium tetani sono specie patogene; i primi
due possono essere responsabili di tossinfezioni alimentari.
Cl. botulinum un microrganismo tristemente noto per la gravit dellintossicazione che deriva
dallassunzione di alimenti che contengano la potente esotossina che in grado di produrre. E
normale saprofita del terreno, pu essere rinvenuto nel tratto intestinale di uomo ed animali ed
normale contaminante di numerosi ambienti. E pressoch ubiquitario e ampiamente diffuso nel
suolo, nei sedimenti marini, nelle acque stagnanti e nei residui vegetali, pertanto possibile che sia
presente nel contenuto intestinale e nelle carcasse di mammiferi, uccelli e pesci.
Non in grado di moltiplicarsi negli organismi viventi ma, in condizioni di anaerobiosi, pu
moltiplicarsi negli alimenti contaminati dallambiente. Cl. botulinum stato ritrovato
principalmente nelle carni e nei vegetali ma, anche se in basse concentrazioni di spore, in molti altri
alimenti ed anche nel latte.
La specie fondamentalmente caratterizzata dalla produzione di neurotossine. Tutti gli organismi
che producono tossine botuliniche sono infatti assegnati al genere Cl. botulinum, anche se nota la
grande eterogeneit che li caratterizza.
Sulla base della specificit antigenica dellesotossina prodotta vengono distinti 7 varianti: A, B, C
(C, C), D, E, F, G (tutte neurotossine, tranne la C, ma solo A, B, E, ed F al momento sono
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conosciute causare malattia nelluomo). Solitamente ogni ceppo di Cl. botulinum produce una sola
tossina e sono rari i casi di ceppi in grado di produrne due tipi contemporaneamente. Sulla base di
caratteristiche fisiologiche e metaboliche si possono distinguere, invece, 4 gruppi colturali
allinterno dei quali sono inclusi ceppi che possono produrre differente tipo di tossina (varianti
differenti):
I gruppo (proteolitico); contiene tutte le varianti tipo A e i ceppi proteolitici delle varianti tipo B
e F. I ceppi appartenenti a questo gruppo possono ottenere energia dallidrolisi delle proteine e
sono in grado di utilizzare il glucosio per via fermentativa, crescono in unintervallo di temperatura
compreso tra i 10 e i 48C con optimum a 37C. Valori di pH inferiori a 4.6, concentrazioni di
NaCl superiori al 10% e valori di Aw inferiori a 0.94 ne inibiscono la crescita.
II gruppo (non proteolitico); contiene tutte le varianti tipo E ed i ceppi non proteolitici delle
varianti tipo B e F . I ceppi appartenenti al gruppo ottengono energia principalmente dalla
fermentazione degli zuccheri, hanno temperatura ottimale di crescita a 30C ma possono
moltiplicarsi anche a temperatura di refrigerazione. Valori di pH inferiori a 5.0, concentrazioni di
NaCl superiori al 5 % e valori di Aw inferiori a 0.97 ne inibiscono la crescita.
III gruppo (debolmente proteolitico o non proteolitico); contiene varianti dei tipi C, C e D che al
momento non sono risultate coinvolte in casi intossicazione botulinica nelluomo.
IV gruppo (proteolitico ma non saccarolitico); contiene varianti tipo G, anchesse fino ad oggi non
ritenute responsabili di casi di intossicazione botulinica nelluomo.
Le tossine botuliniche sono molecole molto simili tra di loro. Si tratta di proteine neurotossiche ad
elevato peso molecolare (PM 150 Kda), costituite da una catena peptidica pesante (PM 100 Kda),
e da una catena peptidica leggera (PM 50 Kda), unite da ponti disolfuro. La tossina viene prodotta
durante la crescita vegetativa, ma rilasciata solamente in concomitanza con la lisi delle cellule, che
avviene durante la sporulazione.
Le tossine botuliniche sono termolabili (inattivate completamente a 100C per 10 min.), sensibili
agli alcali e allalcol, ma acidoresistenti. La tossina libera, se ingerita con gli alimenti, non viene
quindi inattivata dallacidit dello stomaco, dove anzi subisce un processo di attivazione
conseguente allazione della tripsina gastrica, e viene assorbita dallapparato gastrointestinale per
essere trasportata per via ematica fino alle cellule nervose, dove la catena pesante si lega in modo
specifico alla placca motrice nervosa. La tossina viene internalizzata e successivamente trasportata
a livello delle giunzioni neuromuscolari, dove la catena leggera blocca la penetrazione degli ioni
Ca++ e quindi il rilascio dellacetilcolina.
Ancora poco si conosce riguardo la dose minima tollerabile di presenza di spore di Cl. botulinum e
della neurotossina botulinica negli alimenti. Per garantire la sicurezza degli alimenti comunque
necessaria lassenza della tossina e quindi si devono garantire o lassenza delle spore del
microrganismo o condizioni inibitorie per la loro germinazione.
La presenza di spore di Cl. botulinum non infrequente nelle materie prime alimentari e quindi i
processi tecnologici di trasformazione devono utilizzare processi di sterilizzazione idonei
alleliminazione delle spore o, alternativamente, sfruttare il potenziale di inibizione alla crescita
esercitato della presenza di ossigeno, dalla refrigerazione, dallacidit del mezzo, dalla
concentrazione salina e la sensibilit termica della tossina preformata.
La sensibilit delle spore di Cl. botulinum a differenti trattamenti di sterilizzazione non pu essere
disgiunta dalle caratteristiche del mezzo. Trattamenti termici equivalenti a 121C per tre minuti
garantiscono dodici riduzioni decimali (12D) delle spore presenti e sono considerati idonei per
garantire la salubrit anche degli alimenti poco acidi, prodotti in contenitori ermetici e non
refrigerati.
Grazie allo sviluppo di opportune tecnologie di produzione delle conserve i casi di botulismo nei
paesi industrializzati sono andati diminuendo negli anni e, attualmente, sono nella maggior parte dei
casi riconducibili alla produzione artigianale (domestica) di conserve.
Nel botulismo alimentare lesordio pu essere caratterizzato da disturbi gastroenterici
(addominalgia, nausea, vomito, diarrea), cui seguono segni di coinvolgimento neurologico.
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Il botulismo infantile causato dallingestione di spore che riescono germinare e sintetizzano la
tossina nellintestino. Si pensa che ci sia possibile nei bambini tra i 6 e i 24 mesi, nei quali la flora
intestinale non ancora stabilizzata e quindi incapace di contrastare la colonizzazione da parte del
clostridio. Il botulismo infantile stato messo in relazione con lassunzione di miele. Una
suscettibilit simile a quella dei neonati pu essere osservata in adulti con perturbazioni della flora
intestinale conseguenti ad altre sintomatologie.
Nel botulismo da ferite si ha uno sviluppo del microrganismo in lesioni traumatiche infette (spesso
imbrattate da terriccio), con conseguente produzione e assorbimento di tossine in vivo.
Il botulismo per inalazione un evento accidentale nelluomo e derivante dallinalazione della
tossina botulinica mediante areosol.
Clostridium perfringens un bacillo microaerofilo, non mobile, mesofilo che presenta spore ovali e
centrali nella forma vegetativa, largamente distribuito in natura. Sono state riconosciute almeno 14
tipi differenti di tossine di questo microrganismo che possono essere prodotte dai diversi biotipi.
raggruppato in 6 gruppi (A, B, C, D, E, F) in base alle tossine prodotte (tra cui le pi note e
patogene sono le tossine , , , e , responsabili di gangrene gassose, coliti necrotizzanti e
setticemie).
Cl. perfringens stato riconosciuto come causa di tossinfezioni alimentari solo verso la met del
secolo scorso. E parte della normale flora del suolo ed molto diffuso nella polvere, ma anche
parte costitutiva della normale flora intestinale degli animali e dell uomo.
Lampia distribuzione in natura di Cl.perfringens il motivo del suo frequente coinvolgimento in
tossinfezioni alimentari. Il microrganismo pu causare due differenti malattie enteriche veicolate
dagli alimenti: tossinfezioni da Cl.perfringens tipo A e enteriti necrotiche; la prima la pi
frequente, mentre la seconda molto rara perlomeno nelle societ industrializzate.
I ceppi appartenenti al gruppo A, ma anche C e D sono patogeni per luomo. A e C producono
anche unenterotossina, la cui formazione avviene durante la sporulazione del germe (che pu
avvenire non solo nellalimento ma anche nellintestino delluomo) e il rilascio in seguito alla lisi
cellulare. Tale tossina, che causa delle gastroenteriti alimentari, termolabile; a 60C per 5min
perde la sua attivit biologica, ma a 4C pu permanere attiva per settimane.
La dose infettante elevata e deve raggiungere valori superiori a 106 cellule vegetative/g di
alimento contaminato. Anche in questo caso si osservata una maggiore suscettibilit in organismi
debilitati.
Gli alimenti che pi frequentemente sono veicolo di tale microrganismo, sono i prodotti carnei o a
base di carne, la cui caratteristica comune di essere stati sottoposti a trattamenti termici e
raffreddati a temperatura ambiente. Viste le caratteristiche del microrganismo e della tossina si
tratta in genere di ricontaminazioni dopo la cottura.
Famiglia Mycobacteriaceae
Si tratta di bastoncini gram positivi, asporigeni acido ed alcool resistenti: ne fanno parte sia forme
patogene che saprofite.
Per quanto riguarda le specie patogene, il risanamento degli allevamenti dalla tubercolosi bovina ha
ridotto la diffusione di Mycobacterium bovis e Mycobacterium hominis. Mentre il consumo di latte
crudo stato responsabile di trasmissione di tubercolosi, non sono invece descritti casi di
trasmissione per consumo di formaggi o altri prodotti. Al momento negli USA sono in corso
approfondimenti per valutarne la reale presenza nel latte e sopravvivenza dopo pastorizzazione.
La paratubercolosi (Malattia di Johne) invece una malattia infettiva a decorso cronico con esito
letale che colpisce principalmente i bovini in et adulta. L'
agente il Mycobacterium
paratuberculosis che resistente nell'
ambiente e si trova comunemente nelle feci.
Questo microrganismo stato recentemente preso in considerazione anche per il possibile ruolo
svolto nella trasmissione del morbo di Crohn (malattia intestinale cronica delluomo). Unalta
percentuale di pazienti con il morbo di Crohn sembrano presentare anche linfezione da M.
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paratuberculosis. L'
ipotesi di un coinvolgimento del microrganismo nel determininare linsorgere
del morbo di Crohn dell'
uomo comunque in attesa di una risposta definitiva.
Sono state recentemente condotti studi sulla termoresistenza di Mycobacterium paratubercolosis al
fine di comprendere lefficacia della pastorizzazione del latte per assicurare la distruzione del
microrganismo.
Ceppi saprofiti appartenenti a differenti generi di questa famiglia sono stati riscontrati in formaggi
a crosta lavata ai quali stato anche associato un effetto antagonista alla crescita della Listeria.
Famiglia Microbacteriaceae
Genere Microbacterium
Bastoncini morfologicamente irregolari e molto piccoli, gram positivi non sporigeni e
frequentemente saprofiti. Allinterno del genere sono riconosciute sia specie mobili che non mobili.
Si tratta di batteri aerobi ma capaci di crescere anche in condizioni di microaerofilia. Il
metabolismo primario fondamentalmente respiratorio ma in alcune occasioni anche fermentativo.
La condizione ottimale di crescita in ambito mesofilo. In conseguenza dellelevata
termoresistenza alcune specie si possono ritrovare nel latte anche dopo pastorizzazione. Alcune
specie appartenenti a questo genere sono state isolate anche sulla crosta di formaggi a crosta lavata.
Famiglia Propionibacteriaceae
Genere Propionibacterium
Sono microrganismi bastoncellari irregolari estremamente pleomorfi, con forma difteroide o a V
(angolata a coppie), non mobili, Gram-positivi, asporigeni, mesofili, anaerobi (o meglio
microaerofili, perch la loro crescita facilitata da piccole quantit di ossigeno) e sensibili al sale.
La temperatura ottimale di crescita prossima ai 30C. Hanno esigenze nutrizionali complesse e per
fermentazione di zuccheri, di lattati e di altri idrati di carbonio formano prevalentemente acido
propionico unitamente a acido acetico e CO2; i rendimenti teorici della fermentazione propionica
ed i rapporti tra i differenti prodotti metabolici possono variare sia in funzione del ceppo che delle
condizioni ambientali e della caratteristica del substrato di crescita. Sono in grado di utilizzare i
lattati e sono.
Si tratta di microrganismi piuttosto omogenei dal punto di vista filogenetico; appartengono alla
sezione degli attinomiceti e nel Genere sono attualmente riconosciute almeno 11 specie suddivise in
due gruppi in base allhabitat di isolamento; ambiente caseario-alimentare e ambiente cutaneo o
mucose di uomo ed animali.
La fermentazione propionica nel settore caseario caratteristica per formaggi come lEmmenthal
dove sia il sapore che laroma e la caratteristica occhiature della pasta sono conseguenti allo
sviluppo dei batteri propionici nel corso della stagionatura. Propionibacterium freudenreichii con
le due subspecie freudenreichii e shermanii, P.acidpropionici e P.jenseniii vengono utilizzati come
starter nei formaggi tipo svizzero con caratteristica occhiature e sapore. Allo stesso tempo per altre
produzioni casearie a lunga stagionatura, come il Grana, la fermentazione propionica pu essere
responsabile di difetti di gonfiore.
Batteri propionici si possono rinvenire anche in prodotti vegetali.
I batteri propionici cutanei possono essere origine, o comunque essere coinvolti, in alcune affezioni
infiammatorie di differente importanza e gravit quali lacne.
I batteri propionici sono comunque un gruppo di microrganismi le cui caratteristiche sono state
relativamente poco approfondite. Indipendentemente dal ruolo storico ed essenziale nelle
produzioni di formaggi con i buchi, questi microrganismi possiedono altre caratteristiche
metaboliche di potenziale interesse industriale; la capacit di produrre vitamina B12, acido folico,
trealosio, la sintesi di batteriocine a spettro di azione molto ampio (con attivit antagonista rispetto a
batteri Gram positivi e Gram negativi, lieviti e muffe), la presenza nella cellula di un complesso di
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enzimi lipolitici e proteolitici ad anche levidenza di caratteristiche probiotiche quali la capacit di
adesione alla mucosa intestinale umana della quale risultano normali colonizzatori.
Famiglia Corynebacteriaceae
Genere Corynebacterium
Microrganismi Gram-positivi, bastoncellari non sporigeni, non mobili, generalmente curvi con
estremit arrotondate e dilatate a forma di clava. Allosservazione al microscopio possono assumere
organizzazione raggruppata a palizzata o angolare a coppie. Sono batteri anaerobi facoltativi anche
se si rinvengono alcune specie aerobie. Sono caratterizzati dallessere molto sensibili alla
temperatura tanto da non resistere a trattamenti a 55C per pochi minuti.
Al genere afferiscono sia forme patogene come C. dyphteryae, in grado di produrre esotossine che
provocano degenerazione necrosi di differenti tessuti (reni, fegato, muscolo cardiaco) e forme
saprofitiche dette difteroidi. Alcune di queste ultime possono essere ritrovate in formaggi differenti
nel corso della stagionatura e possono avere un ruolo importante per colorazione giallo-arancione in
formaggi a crosta lavata.
Famiglia Brevibacteriaceae
Genere Brevibacterium
Batteri a forma bastoncellare, Gram positivi non sporigeni, non mobili ed aerobi obbligati.
Chemorganotrofi con metabolismo respiratorio. Generalmente mesofili. Alcune specie come
Brevibacterium linens producono pigmentazioni di colore variabile dal giallo allarancione e sono
impiegate industrialmente nella produzione di formaggi come starter secondari (non acidificanti).
Si ritrovano sulla superfice di alcuni formaggi e sono corresponsabili, unitamente ad altre specie,
delle colorazioni di crosta. Contribuiscono alla stagionatura dei formaggi producendo, grazie alla
loro azione proteolitici, differenti molecole ad impatto aromatico e modificando la struttura della
parte pi esterna del prodotto, il sottocrosta. Recentemente stata identificata una nuova
batteriocina prodotta dal Brevibacterium linens che risulta attiva contro Listeria.
Famiglia Listeriaceae
Genere Listeria
Questo genere, composto da 7 specie (Listeria ivanovii, L. monocytogenes, L. seeligeri, L .murrayi,
L.grayi, L.innocua e L.welshimeri). Solo due specie sono patogene; L. monocytogenes per luomo e
L. ivanovii per gli animali. I microrganismi appartenenti al genere sono morfologicamente dei
piccoli bastoncini, Gram-positivi, asporigeni, aerobi o microaerofili, che presentano una certa
mobilit (grazie a pochi flagelli peritrichi) disordinata e rotatoria soprattutto. Lidentificazione delle
specie ed in particolare la differenziazione di L.monocytogenes basata sulla rilevazione della
capacit emolitica del batterio.
L.monocytogenes responsabile di una malattia dalla sintomatologia abbastanza complessa ed
eterogenea denominata listeriosi. I ceppi della specie possono essere differenziati in base ad
antigeni somatici O o flagellari H.
Il batterio ritenuto un sicuro agente patogeno per l'
uomo, per diverse specie di animali domestici,
uccelli, pesci e perfino insetti. L.monocytogenes ha capacit di sopravvivere in condizioni avverse
anche per lunghi periodi, sensibile alla pastorizzazione, ma sopravvive bene nei prodotti
refrigerati ed essiccati, cresce a temperature comprese tra 0 e 45C, resiste a concentrazioni saline
elevate e si moltiplica in condizioni di aerobiosi o microaerofilia, tollera pH elevati, ma la crescita
viene inibita a pH inferiori a 5.6.
41

La listeriosi divenuta una delle infezioni alimentari pi studiate negli ultimi trentanni, anche se
la scoperta del microrganismo che la causa molto precedente e risale a pi di settanta anni
addietro.
La natura, la struttura e le modalit di trasmissione dei fattori responsabili della virulenza di L.
monocytogenes sono ancora oggi scarsamente conosciuti e la listeriosi pertanto definita come una
patologia complessa e multifattoriale. Sembrerebbe ormai consolidato che il potere patogeno di
L.monocytogenes sia fondamentalmente dovuto alla capacit invasiva, nonch alla produzione di
diversi fattori tossici.
Nell'
ambito clinico la sorgente di infezione viene identificata difficilmente e la malattia quasi
sempre sporadica. E noto che la listeriosi tende a colpire preferenzialmente soggetti
immunocompromessi, bambini, donne gravide ed individui anziani. In circostanze adatte ogni
individuo comunque potenzialmente suscettibile all'
infezione. Per quanto riguarda la dose
infettante bisogna ricordare che non si hanno dati certi a riguardo, mancando ancora oggi evidenti
correlazioni tra livello di alimento contaminato ingerito e rischio di contrarre l'
infezione. Ci
nonostante sembrerebbe ormai accertato che la dose infettante sia variabile anche in funzione
della suscettibilit dell'
ospite.
Le caratteristiche fisiologiche e la sua resistenza a fattori ambientali avversi ne favoriscono la
sopravvivenza e lo sviluppo in differenti matrici. L'
ubiquit e la comune presenza di Listeria
nell'
ambiente deve essere considerata la pi probabile ed importante fonte di contaminazione degli
alimenti nel corso della loro produzione ed a valle del processo tecnologico.
Per quanto riguarda la trasmissione di Listeria attraverso gli alimenti, si ritiene che la listeriosi
alimentare sia l'
espressione di una contaminazione ambientale trasmessa durante la produzione, la
trasformazione e la manipolazione degli stessi; la diffusione nelle materie prime e negli ambienti di
produzione sembra favorire la ricontaminazione dei prodotti finiti in assenza di opportune
procedure di difesa. I casi pi frequentemente riconosciuti riguardano in particolare carne,
formaggi, prodotti della pesca, vegetali ed in generali prodotti alimentari elaborati pronti al
consumo senza cottura.
Numerose ricerche hanno evidenziato come L.monocytogenes possa essere isolata da un ampio
numero di fonti ambientali e di alimenti, compreso il latte crudo. Le caratteristiche fisiologiche di
L.monocytogenes, quali l'
acidotolleranza, l'
alotolleranza e la psicrotrofia, consentono a questo
microrganismo di insediarsi, di adattarsi ed eventualmente di svilupparsi in differenti derivati
del latte.
In conseguenza dellelevata percentuale di letalit che accompagna la malattia
(approssimativamente compresa tra il 20 ed il 30% dei casi) e della possibilit di gravi complicanze,
a differente carattere, ad essa collegate, oggi la listeriosi riconosciuta come una delle pi gravi
infezioni alimentari.
Famiglia Bifidobacteriaceae
Genere Bifidobacterium
Si tratta di bastoncini Gram positivi polimorfi, non mobili, anaerobi stretti, catalasi negativi.
Fermentano gli zuccheri producendo acido lattico e acido acetico, sono molto esigenti dal punto di
vista nutrizionale.
Hanno habitat intestinale e si ritiene che possano svolgere un ruolo probiotico. Per questo motivo
vengono aggiunti a differenti preparazioni alimentari, in particolare a latti fermentati e yogurt, al
fine di mantenere o ripristinare la flora batterica intestinale. Allo stato attuale sono state
riconosciute 31 specie di Bifidobacterium, 11 delle quali isolate direttamente dalle feci umane.
Famiglia Pseudomonadaceae
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Questa famiglia composta da bastoncini Gram negativi, aerobi obbligati tranne per alcune specie
in grado di utilizzare i nitrati come accettori finali di elettroni (Ps.fluorescens), chemoorganotrofi,
con metabolismo respiratorio e non fermentativi. Sono batteri mobili per flagelli, catalasi positivi e,
solitamente, ossidasi positivi.
Nella famiglia presente genere Pseudomonas di grande interesse per il settore alimentare.
Genere Pseudomonas
Bastoncini sottili e mobili, molto diffusi ed in particolare nellacqua e nel suolo. Negli alimenti
sono presenti in particolare nelle carni, nei prodotti ittici, nel latte e negli ortaggi di superficie. Il
loro sviluppo solitamente inibito a valori di Aw vicini a 0.95, pertanto possono contaminare e
colonizzare ambienti e prodotti ricchi di acqua. Molte specie risultano patogene per i vegetali,
mentre solo la specie Ps. aeuruginosa, microrganismo frequentemente presente nelle acque,
patogena per luomo e viene ritenuto responsabile di infezioni dellapparato uro-genitale. Si tratta di
microrganismi psicrotrofi in grado di produrre enzimi lipolitici e proteolitici molto attivi e
termoresistenti che possono produrre degradazioni dei prodotti anche nel corso della loro
conservazione.
Famiglia Xanthomonaceae
Genere Xanthomonas
I microrganismi del genere sono molto simili a Pseudomonas tranne per la produzione di
caratteristiche pigmentazioni gialle. Sono aerobi e hanno temperatura ottimale di crescita a 35C,
non si moltiplicano a 4C ma alcuni ceppi possono farlo in campo termofilo (40C). A differenza
di Pseudomonas richiedono metionina come fattore di crescita presenti in particolare sui vegetali
ma possono essere isolati anche da acqua, latte e cibi congelati.
Alcuni microrganismi della specie sono stati utilizzati per la produzione di xantani a partire da siero
di latte.
Famiglia Acetobacteriaceae
Generi Acetobacter e Gluconobacter
I microrganismi appartenenti alle specie comprese in questi generi sono caratteristici dei processi
ossidativi che inducono acetificazione a carico del vino. Si tratta di cellule ellittiche o
bastoncellari, Gram negative aerobie. Possono essere sia mobili per flagelli che immobili
Le specie appartenenti al Genere Acetobacter sono i principali responsabili dellossidazione acetica
e per questo ceppi selezionati o colture naturali a base di microrganismi appartenenti ad alcune di
queste specie vengono utilizzati nelle produzioni industriali di aceto alimentare. Tra le specie
appartenenti al Genere si ritrovano: A.aceti, A.peroxydans, A.malorum, A.cerevisiae, A.
pasteurianus e A.lovaniensis.
Le specie appartenenti al Genere Gluconobacter (G. oxydans, G. frateurii, G.cerinus) non ossidano
lattati e acetati a CO2 e acqua, non si sviluppano a temperature maggiori di 37C e sono catalasi
positive.
Famiglia Enterobacteriaceae
Costituita da microrganismi di forma bastoncellare, Gram-negativi, generalmente piccoli,
asporigeni, anaerobi facoltativi e con esigenze nutrizionali ridotte. Alcuni generi possono essere
capsulati. Fatta eccezione per i generi Klebsiella e Shigella, le Enterobacteriaceae sono mobili
grazie a flagelli peritrichi. Circa 40 generi differenti sono riconosciuti allinterno della famiglia
delle Enterobacteriaceae.
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I batteri appartenenti alla famiglia delle Enterobacteriaceae ricavano energia dalla fermentazione
degli zuccheri secondo due vie metaboliche principali: la fermentazione acido mista e la
fermentazione butilenglicolica. In entrambi i casi vengono prodotti acidi organici e CO2. La
temperatura ottimale di crescita, pur tenendo in considerazione la variabilit osservabile tra le
differenti specie appartenenti alla famiglia, prossima ai 37C. Nessuna specie presenta
resistenza termica elevata e le Enterobacteriaceae sono facilmente eliminate da trattamenti di
pastorizzazione o da trattamenti di risanamento equivalenti.
Lhabitat preferenziale delle Enterobacteriaceae lintestino dei vertebrati, dove si possono
ritrovare sia come normale microflora residente che come eventuali patogeni, ma sono di comune
rinvenimento anche nel suolo e negli ambienti acquatici. Alcune specie si possono comportare
come patogeni opportunisti ed altre sono semplici saprofiti. Possono essere rinvenuti in differenti
alimenti e la loro presenza comunque indice di contaminazione fecale e pu avvenire in differenti
momenti della filiera di produzione.
I dati forniti da differenti programmi di sorveglianza internazionali relativi alle tossinfezioni
alimentari evidenziano come le Enterobacteriaceae siano frequenti agenti responsabili di
gastroenteriti umane (Salmonella, Shigella, Escherichia coli), in particolare per i settori delle
produzioni carnee, ma anche per altre filiere di produzione.
Allinterno della famiglia Enterobacteriaceae i generi in grado di fermentare il lattosio vengono
raggruppati nei coliformi.
Da sempre i coliformi sono presi come indice della corretta gestione delligiene di produzione; le
normative comunitarie per il settore caseario, ad esempio, ne stabiliscono i limiti di presenza nei
criteri microbiologici. Vista la sensibilit termica, la loro presenza nel latte viene considerata, se
abbinata a test positivo della fosfatasi, indice di non corretto trattamento di pastorizzazione, o,
alternativamente, in presenza di fosfatasi negativa indice di ricontaminazione a valle del trattamento
termico.
Tra i coliformi si riconoscono i Generi: Escherichia, Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter.
Escherichia coli si ritrova quasi esclusivamente nellintestino e quindi viene considerato testimone
diretto di contaminazione fecale mentre gli altri generi, pur presenti nelle feci, sono comuni
residenti di altri ambienti come il terreno o i vegetali.
I coliformi, vista la loro diffusione in natura, in considerazione delle loro relativamente scarse
esigenze nutrizionali, della loro capacit di sopravvivere alle basse temperature e della loro capacit
di adattarsi anche a valori di pH prossimi a 4, possono contaminare differenti alimenti ed indurre
degradazioni indesiderate con comparsa di sapori e odori indesiderati e produzione di CO2. Alcuni
di questi hanno attivit decarbossilasica nei confronti di aminoacidi del formaggio con produzione
di ammine biogene.
Le Enterobatteriaceae che, di norma, non fermentano il lattosio comprendono i Generi: Proteus,
Salmonella, Shigella, Yersinia e Edwarsiella.
Genere Escherichia
Il Genere contiene almeno 7 specie: E.coli, E.blattae, E. albertii, E. fergusonii, E. hermannii, E.
senegalensis, E. vulneris. E.coli lunica specie di grande interesse per il settore alimentare.
E.coli un microrganismo anaerobio facoltativo, catalasi +, ossidasi , mesofilo e normale residente
dellintestino delluomo e di animali a sangue caldo. Molti ceppi di E.coli non sono quindi dannosi
alla salute umana e possono essere considerati commensali. Al contrario, alcuni ceppi e biotipi
presentano caratteristiche di virulenza che li rendono patogeni per luomo e provocano
principalmente infezioni intestinali.
I diversi ceppi vengono distinti sierologicamente in base a 3 antigeni di superficie: O (somatici), H
(flagellari), K (capsulari) (al 2001 erano stati identificati 174 antigeni O, 56 antigeni H e 80 antigeni
K)
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I ceppi di E. coli responsabili di infezioni enteriche sono stati suddivisi in 6 classi secondo le
caratteristiche di virulenza, dellinterazione con la mucosa intestinale, della sintomatologia indotta e
delle differenze sierologiche ed epidemiologiche.
Sulla base di tali caratteristiche si riconoscono: ceppi enteropatogeni (EPEC),
ceppi
enterotossinogeni (ETEC), ceppi enteroinvasivi (EIEC), ceppi entero-aderenti a pattern diffuso
(DAEC) e a pattern aggregativo (EAEC), ceppi enteroemorragici (EHEC) (Nataro e Kaper, 1998).
- E. coli enteropatogeni (EPEC)
Sono riconosciuti come responsabili di gravi sindromi di diarree infantili, frequenti in particolare
nei paesi in via di sviluppo.
La patogenicit di tali ceppi legata ad un fattore di aderenza (EAF): una proteina di membrana in
grado di indurre lesioni istopatologiche a livello della mucosa dei villi intestinali.
- E. coli enteroemorragici (EHEC)
Questa forma morbosa stata descritta per la prima volta nel 1975 e lagente eziologico stato
identificato con il sierotipo O157:H7, successivamente sono stati identificati altri sierotipi
enteroemorragici ma E. coli O157:H7 rimane il serotino pi frequentemente riconosciuto come
causa della patologia tipica.
Caratteristica di questi batteri lacidotolleranza, si possono sviluppare a pH prossimi a 4.0 ma
sopravvivono anche a valori di acidit pi elevata. Non presentano particolare termoresistenza,
sono capaci di moltiplicarsi anche a temperature di 7- 10C e possono sopravvivere bene allo stato
congelato. In generale riconosciuta per questi batteri la capacit di sopravvivere molto meglio di
altri batteri nelle condizioni di stress ritrovabili in ambienti come gli alimenti fermentati conservati.
La patogenicit dei ceppi EHEC dovuta a un meccanismo multifattoriale non ancora
completamente compreso. Due elementi determinanti lattivit patogena sono stati evidenziati: la
produzione di potenti tossine (verocitotossine- VT) e la capacit di aderire alla membrana cellulare
delle cellule della mucosa intestinale, che viene colonizzata e danneggiata a livello endoteliale. La
tossina rilasciata dopo colonizzazione della mucosa intestinale e distruzione dei microvilli,
raggiunge il circolo sanguigno e quindi differenti siti bersaglio (intestino, reni). Queste tossine dal
punto di vista chimico e biologico risultano molto simili alle Shiga-toxin (Stx) prodotte da Shigella
dysenteriae. I ceppi produttori di queste tossine sono denominati VTEC o STEC.
Non tutti i ceppi produttori di verocitotossine possiedono anche i fattori di adesione caratteristici e
determinanti nel definire il tipo e la gravit della patologia, dei ceppi EHEC.
E. coli O157:H7 oggi da considerare la causa di molti tra i pi severi casi di tossinfezione
alimentare registrati in differenti paesi del mondo. I dati relativi alla dose infettante per E. coli
O157:H7, ricavati dalla presenza numerica in alimenti causa di malattia, indicano come questa sia
veramente molto bassa, compresa tra 10 e 100 cfu. Preoccupante anche il rinvenimento di ceppi
che presentano caratteri di antibiotico resistenza.
Una ampia gamma di alimenti risulta essere stata fonte di infezione per luomo, fra i quali il latte e i
formaggi, anche se maggiormente coinvolti rimangono quelli a base di carne, in particolare se
macinata e poco cotta (tale sindrome stata anche rinominata malattia da hamburger).
- E. coli enteroinvasivi (EIEC)
I ceppi di E. coli enteroinvasivi provocano dissenteria non emorragica simili a quelli caratteristici
delle infezioni causate da Shigella; in realt questi sierotipi di E. coli sono molto somiglianti sia
per la patogenicit che per lattivit biologica a Shigella con la quale vengono spesso confusi.
La malattia conseguente alla penetrazione delle cellule nella mucosa del colon, dove prolificano e
ne determinano la lisi. La dose infettante pari a 107 109 e lincubazione in media di 11h (8-24h).
I sintomi sono caratterizzati da: brividi, febbre, cefalea, sindrome dissenterica con muco e sangue,
infiltrazioni granulomatose della lamina propria (parete enterica).
- E. coli enterotossigeni (ETEC)
Gli E. coli enterotossinogeni sono gli agenti eziologici maggiormente coinvolti nella cos detta
diarrea del viaggiatore e nei paesi in via di sviluppo sono tra le pi importanti cause di diarrea
infantile, con gravi stati di disidratazione.
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Dopo lingestione, E. coli supera indenne lambiente acido dello stomaco e raggiunge il piccolo
intestino dove, grazie a fattori di colonizzazione (presenti nelle fimbrie), aderisce alla mucosa e
inizia a produrre tossine.
Questi ceppi sono in grado di produrre una o pi tossine acidoresistenti sia termostabili (STa e STb)
che termolabili (LT1 e LT2). Le pi importanti nel determinare la malattia nelluomo sono la STa
(stabile a 100C x 30min) e la LT1 (inattivata a 60C x 15min). Affinch si sviluppi la malattia,
per indispensabile lingestione di 108-1010 E. coli ETEC vitali.
Il periodo di incubazione di 8-36 ore con una media di 1g e la sintomatologia scompare
generalmente in 2-3 giorni. Nella forma leggera i sintomi sono costituiti da febbre e modica diarrea;
nella forma grave similcolerica da febbre, diarrea acquosa, dolori gastrici e vomito.
- E.coli entero-aderenti a pattern diffuso (DAEC)
I ceppi di questo tipo sono stati riconosciuti responsabili di episodi di diarrea in bambini con et
compresa tra uno e cinque anni. Non sono ancora note le basi di questa relazione.
- E.coli ceppi entero-aderenti a pattern aggregativo (EAEC)
Questi ceppi di E.coli sono stati associati a casi di diarrea persistente in neonati e bambini avvenuti
in differenti zone del mondo. Anche in questo caso si conoscono ancora poco le caratteristiche di
questo tipo di infezione intestinale.
Genere Salmonella
Salmonella spp. sono microrganismi anaerobi facoltativi, mobili (ad eccezione di S. enterica
serovar gallinarum e S. enterica serovar pullorum), chemorganotrofi con capacit di utilizzare sia
metabolismo respiratorio che fermentativo. Come in genere le Enterobacteriaceae, Salmonella spp.
ha 37C come temperatura ottimale di crescita, ossidasi e catalasi negativa, utilizza il glucosio ed
altri carboidrati con produzione di acidi inorganici e CO2 , mentre la fermentazione del lattosio e del
saccarosio pu essere presente in alcuni biotipi se codificata da plasmidi. In assenza di altri
glucidi, Salmonella spp. pu utilizzare il citrato come unica fonte di carbonio.
La nomenclatura del genere si sviluppata nel tempo, parallelamente alle tecniche di indagine,
sulla base di caratteristiche biochimiche e sierologiche.
Allo stato attuale il genere annovera due specie: Salmonella enterica e Salmonella bongori. La
prima la specie principale allinterno della quale sono state riconosciute 6 subspecie: enterica,
salamae, arizonae, diarizonae, houtenae, indica. Le due specie e le rispettive subspecie sono a
loro volta suddivise in molteplici sierovarianti (pi di 2400) in base a tre antigeni: antigene
somatico O (lipopolisaccaride presente sulla membrana esterna del batterio); antigene flagellare H
(associato ad un flagello peritrico); antigene capsulare Vi che si ritrova solo nelle sierovarianti
Typhi, Paratyphi C e Dublin.
I microrganismi del Genere Salmonella in genere sono in grado di adattarsi facilmente anche ad
ambienti di norma non ottimali, alcuni ceppi possono crescere a temperature prossime ai 54C o
alternativamente presentare caratteri di psicotrofia e moltiplicarsi in cibi conservati a 2-4C.
Salmonella spp. possono crescere a pH compresi tra 4.5 e 9.5 anche se le condizioni ottimali sono
prossime alla neutralit. La capacit di adattarsi ad ambienti acidi ne pu permettere la
sopravvivenza anche in prodotti alimentari fermentati. E stato osservato che Salmonella spp.
sottoposte a processi di adattatamento ad ambienti acidi manifestano una incrementata capacit di
sopravvivere in prodotti caseari fermentati. La capacit di adattarsi allacidit pu diminuire
lefficacia antibatterica del pH dello stomaco e quindi favorire la maggiore sopravvivenza di alcuni
ceppi allinterno dellapparato digerente e rendere minore la dose necessaria per produrre
infezione. Alimenti con valori di Aw prossimi a 0.93 non supportano la crescita del
microrganismo.
Salmonella risulta molto diffusa nellambiente e viene rinvenuta maggiormente nellintestino di
uccelli, rettili e mammiferi, ma anche in acque reflue e nei mangimi. Le tecniche di allevamento
intensivo, impiegate per gli animali da carne e i pesci, e le pratiche di riutilizzo degli avanzi di
macellazione in mangimistica hanno sicuramente favorito la diffusione del microrganismo nella
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filiera di produzione degli alimenti. Gli alimenti a base di carne, i pesci, i molluschi, il pollame e le
uova risultano solitamente i prodotti a maggiore rischio ma anche i prodotti vegetali possono
risultare inquinati in relazione alla tipologia di coltivazione, allo stato igienico delle acque di
irrigazione e, pi in generale,
allimpiego di non idonee tecniche di produzione e
commercializzazione dei prodotti. Anche per questo microrganismo il rinvenimento di biotipi
antibioticoresistenti appare preoccupante.
La salmonellosi diffusa in tutto il mondo e i casi di malattia risultano in crescita negli ultimi
decenni; sono sempre pi numerose le tipologie di alimenti coinvolti come veicolo dellinfezione e
il numero di sierovarianti rinvenute nelle infezioni di origine alimentare. Tale fenomeno non pare
solamente collegabile al miglioramento delle tecniche diagnostiche o al miglioramento del
rilevamento epidemiologico, ma piuttosto si ha la sensazione di una maggiore diffusione
dellinfezione dovuta alla modificazione delle tecniche di produzione e commercializzazione degli
alimenti.
Linfezione da Salmonella spp. pu comportare differenti evoluzioni cliniche tra le quali la febbre
tifoide, enterocoliti e infezioni sistemiche.
La febbre tifoide una grave forma infettiva sostenuta dai ceppi tifoidi (S. typhi) che ingeriti con il
cibo raggiungono la parte terminale del piccolo intestino, invadono la lamina propria e arrivano al
sistema linfatico. I germi a questo punto vengono fagocitati e raggiungono il sistema circolatorio e
quindi fegato, cistifellea, milza e altri organi parenchimatosi. I sintomi, che perdurano per 1-8
settimane, sono setticemia, febbre elevata, cefalea, costipazione, vomito e diarrea, che compare per
dopo circa 7-10 giorni dalla comparsa degli altri sintomi. Le infezioni sostenute da Salmonella spp.
non tifoidi si risolvono in casi di enterocolite a differente gravit.
Genere Shigella
Al genere Shigella appartengono microrganismi non mobili, che non idrolizzano il lattosio e
fermentano il glucosio senza produzione di gas. I batteri del genere sono responsabili di una
dissenteria batterica accompagnata da necrosi ed ulcerazioni della mucosa intestinale; si tratta di
una tossinfezione alimentare molto diffusa sia nei paesi in via di sviluppo che in quelli
industrializzati. La World Helth Organisation nel 1999 stimava che Shigella spp. potesse essere
responsabile di 164.7 milioni di casi di infezione nei paesi in via di sviluppo e di 1.5 milioni di casi
nei paesi industrializzati; la mortalit rara e solitamente riguarda le persone pi deboli (bambini
malnutriti, malati, anziani).
Nel genere Shigella si riconoscono quattro specie differenziate in pi di 40 serotipi in base
allantigene somatico O: Sh. dysenteriae (gruppo A), Sh. flexneri (gruppo B), Sh. boydii(gruppo
c), Sh. sonnei (gruppo D). Non si tratta di microrganismi particolarmente esigenti dal punto di
vista nutrizionale e, come membri della famiglia delle Enterobacteriaceae, questi microrganismi
sono molto simili e geneticamente correlati sia a Escherichia che a Salmonellae.
Solo luomo, sano o malato, e i primati ne sono gli ospiti naturali. Lorigine dellinfezione
alimentare pertanto risiede nella contaminazione fecale di alimenti o dellacqua. Shigella pu
permanere per mesi nellintestino di alcuni soggetti (portatori sani) che costituiscono la fonte
principale di contaminazione. La scarsa igiene personale riveste un ruolo fondamentale nella
trasmissione della shigellosi, che appare maggiormente diffusa in ambienti socio-economici
degradati o in comunit di persone a stretto contatto (asili, caserme, campeggi).
La dose infettante specie-dipendente, ma in genere bastano poche cellule (10-200 ufc) per
contrarre la malattia. La shigellosi provoca dissenteria emorragica e si caratterizza per la
bassissima dose di infezione. Come nel caso di E.coli enteroinvasivi (EIEC) Shigella spp. invade la
mucosa del colon e si moltiplica allinterno delle cellule dellepitelio dove in grado di produrre
enterotossine.
Shigella spp. sopravvive molto a lungo in condizioni di neutralit e per alcuni giorni in ambienti
acidi, tollera sia temperature di congelamento che ambientali. Questa capacit di adattarsi a
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differenti sistemi ne favorisce la sopravvivenza in alcuni alimenti. La shigellosi non comunque
collegabile a specifici prodotti; infatti tutti gli alimenti che vengono manipolati dalluomo possono
rappresentare un veicolo di contaminazione.
Genere Yersinia
Si tratta di bacilli corti (coccobacilli) immobili a 37C, ma mobili per cilia peritriche a temperature
inferiori ai 30C. Anaerobi facoltativi, catalasi positivi, ossidasi negativi, fermentano il glucosio e
altri carboidrati con produzione di acidi organici e debole produzione di gas. Sono psicrofili e
patogeni per luomo. Il Genere comprende 11 specie, ma i sierotipi patogeni appartengono tutti alle
4 specie: Y. pestis (agente della peste bubbonica), Y. pseudotubercolosis (patogeno dei roditori,
raramente causa di malattie umane), Y. ruckeri (patogeno dei salmonidi e di altri pesci di acqua
dolce) e Y. enterocolitica che lunica specie riconosciuta come versatile patogeno intestinale
nelluomo, la cui infezione dovuta al consumo di alimenti.
Y. enterocolitica una specie eterogenea, assegnata alla famiglia delle Enterobactericeae
nonostante il non elevato livello di omologia genetica con le altre specie della famiglia. Allinterno
della specie sono differenziabili un elevato numero di sottogruppi sia in relazione alle caratteristiche
biochimiche e allantigene O (lipopolisaccaride di superficie). Sono stati inoltre identificati
differenti antigeni flagellari H.
Y. enterocolitica caratterizzato dalla capacit di moltiplicarsi a 4C e questo ne favorisce la
sopravvivenza in molti alimenti crudi o cucinati.
Le infezioni da Yersinia spp. sono zoonosi; la specie Y. enterocolitica presente in un ampio
numero di ambienti, si pu considerare un microrganismo ubiquitario, spesso ritrovato nello sporco
e nelle acque, ma rinvenuto anche nellintestino degli animali a sangue caldo.
Gli alimenti coinvolti nella yersiniosi sono le carni di differenti animali (maiale, manzo, pollo),
latte crudo, creme, gelati e in genere gli alimenti refrigerati e quelli manipolati dalluomo.
Non tutti i sierotipi sono patogeni. La patogenit legata alladesione e invasione delle cellule
epiteliali del lume intestinale, alla proliferazione del batterio e secondariamente allinterazione con
il sistema immunitario ospite. La dose di microrganismi necessaria per indurre linfezione non
ancora ben chiarita, ma sicuramente superiore alle 1000 cfu. Lacidit gastrica esercita infatti
unimportante effetto barriera nei confronti del microrganismo.
Il periodo di incubazione varia da 1 a 11 giorni e i sintomi tipici di gastroenterite si manifestano per
5-14 giorni (anche se occasionalmente possono perdurare per alcuni mesi). I sintomi pi comuni
sono: dolori addominali, febbre, diarrea (80% dei casi), nausea, vomito, mal di testa. Esistono
alcune complicanze dovute alla virulenza di alcuni biotipi e/o alla predisposizione d alcuni soggetti
colpiti (et, sistema immunitario compromesso).
Genere Klebsiella
A differenza di E.coli che attua una fermentazione acido-mista; questo genere esegue la
fermentazione butilen-glicolica.
Anche se Klebsiella stata isolata da casi di diarrea acuta di bambini, la sua enteropatogenicit
stata messa in dubbio.
K. pneumoniae la specie pi patogena per luomo. Questo microrganismo causa il 3% di tutte le
polmoniti batteriche acute ed il secondo patogeno che pi frequentemente causa infezioni urinarie.
La polmonite prodotta da K. pneumoniae caratterizzata da un denso escreto gelatinoso e
dallazione distruttiva svolta dai microrganismi non fagocitati sul tessuto polmonare, che spesso
porta alla formazione di ascessi polmonari.
Genere Enterobacter
Anche il genere Enterobacter attua la fermentazione butilen-glicolica. I microrganismi appartenenti
a questo genere sono diffusi nel suolo, nei latticini, nei liquami, nelle acque e nellintestino di
uomini e animali. La specie pi comune alluomo E. cloacae, seguito da E. aerogenes e E.
48

sakazakii. Sono generalmente considerati patogeni secondari, opportunisti o commensali. Di rilievo
alcuni casi di tossinfezioni causate da ceppi appartenenti al genere conseguenti a contaminazione
di latti per linfanzia.
Genere Serratia
La specie pi riscontrata in ambiente clinico Serratia marcescens (della quale sono stati
riconosciuti 15 antigeni O e 16 antigeni H). Serratia sono microrganismi mobili e a differenza di
quasi tutti gli altri coliformi non fermentano il lattosio, o se la fermentazione avviene, molto lenta.
Serratia pu causare endocarditi, osteomieliti, setticemie ed infezioni delle ferite, delle vie urinarie
e quelle respiratorie. Serratia marcescens ha la capacit di produrre lipasi extracellulari in latte che
portano ad alterazione delle caratteristiche organoelettiche.
Genere Edwarsiella
In questo genere sono annoverati microrganismi mobili, produttori di H2S, lattosio negativi, molto
simili per caratteristiche biochimiche ed in alcuni casi anche per la patogenicit a Salmonella.
E. tarda stata isolata da svariati mammiferi e rettili e viene riscontrata occasionalmente anche
nellintestino delluomo, specialmente in casi di gastroenterite acuta ed stata associata a meningiti,
setticemie ed infezioni delle ferite.
Genere Citrobacter
Le specie appartenenti al genere Citrobacter, originariamente inserito nella trib Salmonella, sono
bacilli Gram-, anaerobi facoltativi, mobili per flagelli che ulizzano il glucosio e numerosi altri
carboidrati con produzione di acidi e gas. Sono abitanti occasionali dellintestino animale ed
umano, dellacqua e di alimenti.
Genere Proteus
Comunemente presenti nel terreno, nei liquami e nei concimi. La maggior parte dei ceppi di Proteus
attuano una fermentazione acido-mista e, ad esclusione di P. rettgeri e P. morganii, producono
quantit importanti di H2S.
I membri di questo genere sono frequentemente agenti eziologici di differenti infezioni, in
particolare a carico delle vie urinarie.
Genere Plesiomonas
Plesiomonas un patogeno trasmesso con gli alimenti in grado di provocare sindromi
gastrointestinali. I batteri del Genere Plesiomonas risultano molto omogenei dal punto di vista
genetico e vengono raggruppati nellunica specie P. shigelloides, della quale sono state descritte
numerose sierovarianti in base agli antigeni somatici O e flagellari H.
La temperatura ottimale di crescita prossima ai 38-39C e Plesiomonas quindi rinvenibile in
particolare negli ambienti acquatici dei paesi caldi. Alcuni ceppi resistono comunque alle basse
temperature.
Il ruolo di tale microrganismo come patogeno enterico non ancora stato pienamente compreso ed
ancora discusso.
Famiglia Vibrionaceae
La famiglia fino un tempo comprendeva i generi Vibrio, Aeromonas e Pseudomonas. Con la
trasformazione degli ultimi due generi in famiglia, la famiglia mantiene solo il genere Vibrio pi
altri generi meno importanti nella microbiologia degli alimenti. Allo stesso tempo il genere Vibrio
stato soggetto ad una importante evoluzione tassonomica ed ora comprende pi di 40 specie, una
parte delle quali patogene e coinvolte in infezioni alimentari.
Genere Vibrio
Il genere comprende bacilli, Gram negativi, talvolta leggermente incurvati, non sporigeni, non
termoresistenti, mobili per un flagello polare. Questi microrganismi dispongono sia di metabolismo
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respiratorio che fermentativo, hanno carattere alotollerante o debolmente alofilo e sopravvivono in
un ampio intervallo di temperatura (10-42C). Sono sensibili ai pH acidi e lo sviluppo risulta inibito
sia per valori inferiori a 5.0 che superiori a 8.0. La crescita della maggioranza dei Vibrio spp.
stimolata dalla presenza dello ione sodio.
Molte specie sono caratteristiche della flora batterica acquatica di differenti zone nelle quali si
rinvengono ceppi dalle caratteristiche ottimali (TC, NaCl, pH ) per ladattamento allecosistema ed
anche alle condizioni stagionali.
Le infezioni umane possono essere causate dal contatto diretto con lambiente acquatico o per
consumo di alimenti e acqua contaminata. I principali alimenti coinvolti nellinfezione sono i
prodotti della pesca ed in particolare i molluschi, che per la loro natura di filtratori di acqua,
possono concentrare i vibrioni. Ceppi di differente specie vengono comunemente isolati da pesce
fresco, conservato refrigerato e congelato. Le specie maggiormente presenti risultano V.
paraemoliticus, V. vulnificus, V. fluvialis, V. colerae non-O1, V. metschinkovii.
Anche il consumo di acqua contaminata o vegetali irrigati con acque reflue di contaminazione
possono indurre linfezione.
La dose di cellule batteriche da ingerire per contrarre linfezione risulta piuttosto elevata,
nellordine di un milione di cfu, ma pu essere inferiore nei casi di ipoacidit gastrica. La
patogenicit collegata alla liberazione di fattori tossici liberati nellintestino in seguito alla lisi
del microrganismo.
Famiglia Aeromonodaceae
Genere Aeromonas
Questo genere costituito da microrganismi Gram-negativi aerobi facoltativi, a forma bastoncellare

con estremit arrotondate, non capsulati e sporigeni, ossidasi positivi e generalmente mobili grazie
ad un flagello polare. Fermentano i carboidrati producendo idrogeno, anidride carbonica e 2,3butandiolo. Sono batteri pressoch ubiquitari, anche se vengono riscontrati con in particolare negli
ambienti acquatici: acque dolci, debolmente salate, clorate (alcuni ceppi sono cloro resistenti) e di
scarico. La termoresistenza dei ceppi del genere risulta paragonabile a quella degli altri
microrganismi Gram negativi.
La tassonomia in questi ultimi anni ha particolarmente modificato lorganizzazione delle specie nel
genere ed ancora in fase di evoluzione.
In passato le specie del genere erano considerate patogene solo per gli animali, ma in base alle
evidenze epidemiologiche ormai accertato che alcuni ceppi possano procurare serie infezioni
extraintestinali ed in alcuni casi anche gastroenteriti. Semplificando il genere Aeromonas
comprende, allo stato attuale, sia specie patogene per animali a sangue freddo (A. salmonicida, A.
punctata, A. putrefaciens) che per luomo (A. hydrophila, A. caviae, A. sobria).
Lattivit patogena nei confronti delluomo pare confinata ad alcuni ceppi e limitarsi in particolare
ad individui immunocompromessi. Il fenomeno pu essere ritenuto simile a quanto osservato in
E.coli e Y. enterocolitica, per i quali una combinazione di differenti fattori di virulenza determinano
la patogenit di alcuni stipiti. In generale si pu ritenere che sia corretto considerare quanto riferito
in passato per la specie A. hydrophila come caratteristico di Aeromonas spp.
La maggior parte dei microrganismi del genere hanno temperatura di crescita ottimale a 28C;
anche in questo caso la temperatura di crescita pare variabile in relazione al ceppo e pu variare da
temperature di refrigerazione a temperature termofile. La maggior parte dei ceppi risulta comunque
mesofila. Aeromonas spp. non tollera valori di pH inferiori al 5.5 e non sembra poter crescere
negli alimenti refrigerati caratterizzati da pH inferiore a 6.0 e concentrazioni saline superiori al 3%
Aeromonas spp. sono microrganismi presenti nellacqua e in generale negli habitat acquatici. In
genere non sono parte della normale flora intestinale umana mentre possono essere riconosciuti
50

come popolazione minoritaria della flora fecale di differenti animali anche domestici. La maggior
parte di casi di infezioni ricondotte ad Aeromonas spp. stata ricondotta al consumo di acqua.
Famiglia Campylobacteriaceae
La famiglia comprende bastoncini variamente incurvati, Gram negativi e non sporigeni. La
tassonomia di questa famiglia e stata modificata notevolmente negli ultimi anni. Un tempo molte
delle specie appartenenti ora alla famiglia venivano attribuite alla famiglia delle Spirillaceae in
ragione della forma morfologica dei tipici spirilli ricurvi. Attualmente la famiglia comprende tre
Generi distinti: Campylobacter, Arcobacter, Sulfurospirillum.
Genere Campylobacter
Il Genere Campylobacter il Genere tipo allinterno della famiglia costituito da bastoncini,
ricurvi a forma di S, che in colture stressate per contatto prolungato con aria e non fresche possono
assumere una forma coccoide. Sono batteri mobili per flagelli polari ad una o ad entrambe le
estremit, microaerofili; alcuni ceppi si moltiplicano sia in aerobiosi che in condizioni di
anaerobiosi. Presentano metabolismo respiratorio, sono ossidasi positivi, non fermentano o
ossidano gli zuccheri, ricavano energia da aminoacidi o da intermedi del ciclo degli acidi
tricarbossilici. La presenza di H2 pu essere necessaria per la crescita di alcune specie
microaerofile. Sono microrganismi termolabili e, frequentemente, sensibili al congelamento.
Le specie in grado di provocare sindromi gastroenteriche nelluomo sono fondamentalmente due:
C. jejuni e C. coli. Quella di maggiore interesse come patogeno alimentare sicuramente C.jejuni,
(suddiviso in 2 sottospecie: C. jejuni jejuni e C. jejuni doylei).
Il principale serbatoio dei Campylobacter spp. patogeni il tratto gastrointestinale di differenti
animali a sangue caldo, soprattutto volatili (polli, tacchini), ma anche bovini, suini e ovini. Viene
anche riscontrato come commensale nellintestino di molte altre specie animali come roditori, cani e
gatti. Lacqua rappresenta un habitat importante per Campylobacter spp. che pu essere isolato da
acque di superficie, laghi, fiumi e sabbia di spiaggie. Lorigine della presenza nelle acque, dove il
microrganismo pu sopravvivere a lungo in particolare alle basse temperature, da ricondurre alla
contaminazione fecale. Dal momento che Campylobacter spp. comune
contaminante
dellintestino di animali da carne, nel corso della macellazione ed eviscerazioni sono molteplici le
possibilit di contaminazione.
I campylobatteri derivanti dalla carne cruda possono contaminare sia la zona di lavoro in cui
vengono manipolati che le mani delloperatore, trasferendosi cos anche in altri cibi. Gli alimenti
coinvolti sono principalmente carni di pollame, che si infettano principalmente durante
leviscerazione delle carcasse, carne macinata (salsicce, hamburger), carni di ovino, uova, latte
crudo, acqua non trattata, alimenti vari manipolati o da portatori sani o in locali dove vengono
lavorate carni crude. La presenza del Campylobacter jejuni stata riscontrata anche in latte crudo.
Tutti i ceppi del Genere crescono a 37C; C.jejuni e C.coli hanno 42-45C come intervallo di
temperatura ottimale di crescita, ma non resistono ai trattamenti di cottura.
C.jejeni risulta sensibile a pH acidi e quindi lacidit gastrica costituisce unimportante barriera di
difesa rispetto la tossinfezione, anche se non sufficiente ad eliminarne completamente il rischio. In
conseguenza allelevata mobilit e invasivit intestinale del microrganismo ed alla produzione di
tossine le forme enteriche da Campylobatter spp. possono essere causate dallingestione di poche
centinaia di cellule (500-1000 cfu).
La prima fase dellinfezione prevede un legame con le cellule della mucosa intestinale,
linternalizzazione; in questo contesto vengono prodotte dal batterio differenti proteine che
modificano e riarrangiano la struttura della cellula della mucosa e favoriscono la colonizzazione da
parte del microrganismo. Quindi C. jejuni e C. coli producono unenterotossina citotonica
termolabile (con peso molecolare di circa 70.000 Da ); il 70% di questi ceppi producono anche una
citotossina, responsabile della forma diarroica sanguinolenta. Nei casi lievi la sintomatologia
51

indistinguibile dalle normali gastroenteriti virali, mentre in quelli pi severi assume aspetti simili a
coliti ulcerose ed al morbo di Crohn.
Genere Arcobacter
Sono bastoncini ricurvi a forma di arco o di elica. Sono mobili per presenza di un singolo flagello
polare. La temperatura ottimale di crescita varia tra i 15 ed i 30C ma per alcuni ceppi si osserva
crescita anche a 37 e 42C. Si tratta di microrganismi microaerofili che non richedono H2 per la
crescita . Molti ceppi non sono emolitici.
Arcobacter spp. sono alotolleranti e ceppi simili alle Corynobacteriaceae sono frequentemente
isolati da enteriti od in caso di aborti in bovini e suini. Due specie del Genere sono state associate
con infezioni umane: A.butzleri e A.cryoaerophylus. La prima stata isolata in pazienti con
bacteremia, endocarditi, diarrea e peritoniti, la seconda da pazienti con bacteremia e diarrea .
Famiglia Moraxellaceae
Genere Acinetobacter
Coccobacilli Gram negativi, aerobi stretti, ossidasi negativi e catalasi positivi, psicrotrofi. Sono
microrganismi mobili grazie a fimbrie. Vengono isolati da varie specie animali e prodotti refrigerati
quali carni, pesce, latte, formaggi e vegetali.
Genere Moraxella
Coccobacilli mobili, Gram negativi, aerobi anche se alcuni ceppi crescono in condizioni di debole
anaerobiosi, ossidasi e catalasi-positivi e psicrotrofi. Si tratta di batteri largamente diffusi in natura,
presenti anche in acqua ed alcuni alimenti carnei e pesce.
Famiglia Brucellaceae
Genere Brucella
In passato la brucellosi stata uninfezione di origine alimentare molto diffusa. Allo stato attuale le
brucelle trovano trasmissione alluomo attraverso gli alimenti solo in casi particolari e saltuari.
Linfezione alimentare non si manifesta con una gastroenterite, ma provoca stati di febbre (febbre
ondulante) accompagnati da stati di debolezza. Br. Melitensis, la specie pi pericolosa per luomo,
induce uninfezione sistemica a decorso molto lento.
Lattuazione decennale di piani di profilassi obbligatoria ha contribuito a prevenire ed eradicare la
malattia da molti allevamenti tanto che la grande maggioranza delle regioni italiane pu a tutti gli
effetti considerarsi indenne. Nonostante ci, si osserva la comparsa saltuaria di tale patologia umana
quasi sempre associato al riemergere di casi di allevamenti ove si segnali la presenza di capi di
bestiame infetto. In Europa lincidenza della malattia nellanno 1997 risultava di un caso ogni
centomila abitanti. Malgrado i successi raggiunti nelleradicazione della malattia questa costituisce
ancora un serio problema di sanit pubblica in molti paesi in via di sviluppo e riemergente in quelli
industrializzati. Le ragioni di tale situazione sono fondamente da ricondurre allincremento
dellimportazione-esportazione di animali, e quindi a un pi difficile controllo del loro stato
sanitario, ed allo sviluppo di allevamenti su scala industriale non sempre idonei al mantenimento
delle corrette condizione di igiene.
Secondo il Bergeys Manual gli appartenenti al genere
Brucellae sono microrganismi
coccobacillari, Gram-negativi, non mobili e asporigeni. Hanno elevate esigenze nutrizionali, sono
aerobi, anche se per la crescita nei terreni colturali richiedono unatmosfera arricchita in CO2.
Crescono in un intervallo di temperatura compreso tra i 6C e i 42C, con un optimum di 37C. Per
quanto riguarda il pH, la crescita avviene tra 4.0 e 8.8, con un valore ottimale di 7.4. Di norma non
sopportano concentrazioni saline superiori al 4%.
52

In passato sono state riconosciute 6 specie, di cui 3 di interesse alimentare: Brucella abortus,
agente di infezioni subacute e croniche nei bovini e causa aborto nelle vaccine; Br. suis, causa
infezione nei suini e causa di aborto nelle scrofe; Br. melitensis che provoca affezioni di carattere
cronico in capre e pecore, anche se talvolta colpisce sia i suini che i bovini, inducendo gli elementi
gravidi allaborto.
Recenti studi di omologia basati sullibridizzazione DNA-DNA hanno dimostrato che il genere
Brucellae costituito da una sola specie, Br. melitensis, divisa in sei biovarianti. Sono in corso,
tuttavia, approfondimenti e discussioni a riguardo.
La trasmissione della brucellosi pu seguire differenti vie: orale, la pi comune; per contatto di
abrasioni della pelle con animali infetti; congenita attraverso lesposizione del feto allinfezione in
utero nel corso dellultimo periodo di gestazione
Gli alimenti, veicolo di questa infezione, sono prevalentemente il latte crudo e suoi derivati non
pastorizzati e freschi quali il burro e i formaggi molli. Nei formaggi stagionati, oltre 3-6 mesi,
Brucella spp. non sopravvive. Per quanto riguarda gli alimenti carnei, considerando che quasi tutti i
casi di brucellosi riguardano solo maestranze addette alla lavorazione delle carni, non ancora stato
chiarito se il contagio sia dovuto ad origini alimentari o se, pi probabilmente, sia dovuto ad una
trasmissione cutanea.
Gli eumiceti
Gli eumiceti sono organismi dotati di cellula eucariota, eterotrofi, privi di clorofilla, generalmente
saprofiti e pi raramente parassiti. Si tratta di organismi non mobili, chemiosintetici ed eterotrofi.
Gli eumiceti si riproducono mediante spore di tipo agamico o mediante spore di tipo sessuale
prodotte allinterno di aschi (ascomiceti) o organizzate nei basidi (basidiomiceti).
Lutilizzazione dei funghi, o miceti, nel settore della produzione di alimenti, parimenti a quanto
osservato per i batteri, ha origini antiche e si sviluppa parallelamente al progredire delle
conoscenze. Prodotti come il pane, la birra e il vino sono parte della cultura di molte popolazione,
ma anche prodotti fermentati a base di riso e soia, meno utilizzati nel mondo occidentale ma diffusi
nellarea asiatica, sono ottenuti con limpiego di eumiceti. Nel settore caseario gli eumiceti sono
microrganismi diffusi e, a volte caratteristici, di prodotti quali alcuni latti fermentati, i formaggi
erborinati e i formaggi a crosta fiorita.
Allo stesso tempo, noto, che lo sviluppo di eumiceti in alcune derrate alimentari ne pu causare
il deterioramento ed il deprezzamento. I processi metabolici che inducono lo sviluppo di parte degli
eumiceti (le muffe) sono accompagnati in alcuni casi dalla produzione di metaboliti secondari
tossici per luomo e quindi di grande importanza nellambito di una valutazione complessiva della
salubrit degli alimenti.
Da un punto di vista tassonomico gli eumiceti possono essere divisi in due grandi raggruppamenti: i
lieviti e le muffe.
I Lieviti
I lieviti sono eucarioti unicellulari, eterotrofi, privi di clorofilla ed in genere saprofiti. Si presentano
come cellule rotonde o ellittiche, dalle dimensioni generalmente variabili tra 2 e pi di 10 micron,
di norma isolate, anche se in alcuni casi possono dare origine a pseudomiceli.
Si possono riprodurre per scissione o gemmazione.
Alcune specie, quali Saccharomices, Hansenula e Kluyveromyces, rientrano negli Ascomiceti; si
tratta in questo caso delle cellule che si possono riprodurre per via sessuata attraverso ascospore.
Altre specie sono raggruppate nei Deuteromiceti, come le Criptococcaceae, per i quali non nota la
possibile riproduzione sessuata. La riproduzione asessuata dei lieviti avviene tramite un processo di
gemmazione che prevede lestrusione dalla cellula madre, dopo mitosi, di una nuova cellula di
lievito che si staccher e proceder per vita propria come organismo unicellulare.
53

Sotto laspetto morfologico allesterno riconosciamo la parete cellulare, divisa in strati intimamente
connessi tra loro. Semplificando, si tratta di unorganizzazione di polimeri complessi,
eterogeneamente costituita da glucani, chitina e proteine. La parete dei lieviti sede di differenti
attivit enzimatiche extacellulari. La membrana svolge una funzione di filtro similare a quella gi
descritta per i batteri. Nel citoplasma presente il reticolo endoplasmatico con funzioni di raccolta
e esporto delle sostanze, i mitocondri, i ribosomi, i vacuoli, i granuli di glicogeno come riserva di
carboidrati per la cellula, il nucleo ed in alcuni casi i plasmidi.
Dal punto di vista fisiologico si tratta di microrganismi in grado di svilupparsi in un ampio
intervallo di temperature, generalmente mesofili e psicotrofi anche se sono state evidenziate forme
psicrofile. Non resistono ai trattamenti termici di pastorizzazione, si sviluppano preferibilmente in
substrati acidi e, in particolare, alcune specie sono in grado di resistere e svilupparsi a basse Aw
(inferiori a 0.93 e nel caso di alcune specie di Saccharomyces prossime allo 0.60), minori di quelle
sopportate comunemente dai batteri ma generalmente superiori a quelle che inibiscono la crescita
delle muffe.
Si tratta di microrganismi aerobi, anche se molte specie oltre alla respirazione possiedono
metabolismi fermentativi. Fermentano gli idrati di carbonio con produzione di alcol etilico e
anidride carbonica. Questa possibilit rende molto versatili le cellule di alcuni lieviti ed in grado di
adattarsi a differenti condizioni ambientali.
Pur essendo un gruppo microbico piuttosto omogeneo, sulla base di protocolli di identificazione
genotipica (RFLP del DNA mitocondriale, analisi di restrizione e RAPD del DNA totale o
ribosomale) e fenotipica (temperatura di crescita, fermentazione carboidrati, esigenza in vitamine e
fonti azotate, resistenza al sale ed alle elevate concentrazioni di zuccheri, resistenza agli antibiotici,
presenza di proteine e di acidi grassi cellulari), sono state differenziate tassonomicamente circa 700
specie di lieviti.
I lieviti che interessano il settore alimentare sono solo una parte di quelli noti e, grossomodo,
corrispondono alle specie che per produrre energia possono utilizzare gli zuccheri attraverso la
fermentazione alcolica. Nel settore caseario assumono interesse anche le specie in grado di
utilizzare i lattati producendo CO2 e che, conseguentemente, inducono una parziale
disacidificazione del prodotto. Sovente negli alimenti fermentati i lieviti si trovano in caratteristica
associazione con alcune specie di batteri lattici; le interazione metaboliche che intercorrono tra
questi microrganismi molte volte risultano essenziali e determinanti per la corretta riuscita del
prodotto.
La contaminazione da parte di cellule di lievito, tuttavia, pu anche indurre alterazioni gravi in
differenti tipi di alimenti (es: vegetali freschi, salumi affettati e confezionati, prodotti a base di
carne, formaggi, yogurt, burro, creme, maionese) e bevande (soft drink, vino, succhi di frutta)
quali il bombaggio dei contenitori, conseguente a produzione di gas per rifermentazione del
prodotto o, pi semplicemente, alterazioni di gusto, sapore e struttura.
La presenza non caratteristica di lieviti nelle derrate alimentari, anche qualora non induca difetti,
vista la loro ubiquitariet, pu essere interpretata come un indice di errata gestione del processo di
produzione e di presenza di punti deboli nella gestione della protezione da possibili contaminazioni
e nel confinamento degli ambienti di trasformazione.
Nellambito alimentare, di norma, non si riconoscono specie di lieviti patogene e, in particolare, non
risulta che alcun ceppo di lievito sia in grado di produrre tossine attive sulluomo. In realt, gi da
diversi anni, alcuni lavori, prendendo spunto da occasionali eventi di gastroenterite riconducibili al
consumo di alimenti dove si sospettava che gli agenti eziologici fossero lieviti, propongono una pi
attenta rivalutazione del ruolo dei lieviti in alcune infezioni di origine alimentare. In particolare
alcuni Autori sottolineano come siano molteplici le osservazioni a sostegno di potenziali effetti
allergizzanti da parte dei lieviti e del loro possibile coinvolgimento nel favorire linsorgere di
differenti stati infiammatori dellintestino.
Allo stesso tempo, nel settore medicale, si osservato un incremento delle infezioni causate da
lieviti non alimentari, che stato messo in relazione a fattori di differente ordine, ivi compresi
54

quelli sociali collegati allemergere di categorie di popolazione pi sensibili, ed il coinvolgimento
di ceppi di lieviti un tempo ritenuti sicuri in alcuni casi di malattia (Hazen, 1995).
In considerazione di queste ultime osservazioni e nonostante loccasionalit e leccezionalit dei
casi riportati che inducono il sospetto, si deve prendere in considerazione che anche i lieviti
veicolati con gli alimenti, come molti altri microrganismi ritenuti safe, in particolari occasioni
possano produrre effetti negativi alla salute delluomo.
Le specie che pi comunemente si rinvengono nei prodotti alimentari sono riconducibili ad alcuni
generi tra i quali il pi noto il Genere Saccharomyces, che comprende le specie utilizzate per le
fermentazioni del pane, del vino e della birra. Saccharomyces sono le specie che di norma vengono
prodotte industrialmente per limpiego nel settore alimentare.
Altre specie di rilevanza per il settore alimentare appartengono ai Generi Zygosaccaromyces,
Torulopsis, Schizosaccaromyces, Hansemula, Yarrovia, Pichia, Dekkera, Kluyveromyces e
Debaryomyces. Molte specie dei Generi Hansemula, Picchia e Torulopsis possono creare
inconvenienti ma, come evidenziato nel caso dei batteri non patogeni, il significato della presenza di
ceppi di lieviti in differenti alimenti non pu essere valutato indipendentemente dalle caratteristiche
del prodotto e, spesso, anche in funzione del numero di cellule presenti.
Le Muffe
Le muffe, o funghi filamentosi, sono invece caratterizzate da strutture pluricellulari, composte da
cellule allungate dette ife che formano il micelio.
Nel micelio fungino si differenziano una parte delle cellule deputate alla colonizzazione del
substrato, che si ancora alla matrice, (micelio vegetativo) ed una parte con strutture cellulari
deputate alla produzione di spore (micelio aereo) e che rappresentano la struttura contaminante
della muffa dalla quale le spore si staccano e trasportate dallaria, acqua, uomo od altro si
propagano nellambiente circostante e lo colonizzano. La germinazione delle spore da origine alle
nuove ife.
Questa organizzazione morfologica risulta efficace sia per la crescita superficiale che per penetrare
strutture solide porose o fessurate. Il micelio rappresenta anche una struttura molto efficace dal
punto di vista fisiologico per il trasporto dei nutriliti dalla sua parte ancorata al substrato a quella
deputata alla riproduzione.
Le spore sono organismi unicellulari che contengono al loro interno tutte le informazioni genetiche
ed i componenti base per organizzare lo sviluppo di un nuovo micelio. Visto il numero elevato di
spore presenti nel micelio aereo di una muffa, il potenziale inquinante di questi microrganismi
molto elevato. Rispetto alle cellule del micelio le spore presentano maggiore resistenza
allambiente. Anche se non tollerano trattamenti termici elevati e gli effetti di trattamenti chimici o
fisici drastici, linerzia metabolica delle spore fungine ne fa a tutti gli effetti delle forme di
resistenza e di conservazione della specie rispetto a fenomeni di stress ambientale. Si tratta pertanto
di forme di riproduzione e resistenza. Si riconoscono spore asessuali, che si formano per divisione
mitotica da cellule specializzate, o spore sessuali la cui formazione comporta ricombinazione del
materiale genico di cellule madri e divisione meiotica. Si distinguono muffe per le quali noto solo
un ciclo di riproduzione asessuale ed altre, al contrario, per le quali noto solo una forma di
moltiplicazione e sviluppo tramite spore sessuali.
La classificazione delle muffe unargomento di grande complessit e, come del resto osservato
per gli altri microrganismi, in continua evoluzione. La tassonomia si basata principalmente sulla
natura della riproduzione, sessuale o asessuale, e sulla morfologia del micelio e delle strutture
riproduttive.
Caratteristica comune di questi eumiceti il metabolismo strettamente aerobio. In fase di sviluppo
avanzato il micelio si riconosce ad occhio nudo come un feltro caratteristico che invade la
superficie del prodotto e penetra nelle fessure dove anche lossigeno pu permeare. Le temperature
di sviluppo, come nel caso dei lieviti, sono particolarmente varie, anche se principalmente si situano
55

in ambito mesofilo e psicrofilo e quindi ben si possono adattare anche alle temperature di
refrigerazione. Le muffe non gradiscono
le temperature elevate e sono distrutte dalla
pastorizzazione; si sviluppano in condizioni di Aw inferiori anche a quelle dei lieviti e quindi non
trovano nelle elevate concentrazioni di sale e zucchero condizioni limitanti ed inibitorie. Il pH acido
ben tollerato se non addirittura preferenziale. Le muffe possono caratterizzate in particolare dalla
produzione di enzimi lipolitici, proteolitici e amilolitici.
Differenti generi sono in grado di produrre sostanze ad attivit antimicrobica pi o meno specifica,
gli antibiotici. Questa caratteristica, di grande interesse per il settore medico, nellambito degli
alimenti interviene nei fenomeni di interazione tra microrganismi presenti in ecosistemi complessi.
Dallinsieme di queste caratteristiche, peraltro come detto molto variabili nelle differenti specie, si
pu comprendere come le muffe rivestano un ruolo di notevole interesse nel settore alimentare ed in
particolare nella contaminazione degli alimenti. La grande capacit invasiva delle muffe,
unitamente alla capacit di produrre differenti enzimi idrolitici, unaspetto essenziale nel
determinare la capacit di deterioramento degli alimenti di questi organismi.
Nellambito delle produzioni alimentari, in particolare, assumono un rilievo fondamentale i
Deuteromiceti o funghi imperfetti. Si tratta di una classe di funghi filamentosi che coprendono
differenti specie tossinogene ascrivibili ai Generi Aspergillus, Penicillium e Fusarium.
Le muffe sono in grado di elaborare metaboliti secondari tossici, non essenziali per la loro crescita,
detti micotossine. Questi prodotti metabolici sono molto stabili e negli alimenti, una volta avvenuta
la contaminazione, non vengono denaturati e inattivati; allo stato attuale non si conoscono processi
di sanificazione a valle della contaminazione compatibili con la salvaguardia delle caratteristiche
del prodotto e quindi lunico intervento efficace resta per il momento la prevenzione dello sviluppo
fungino nelle materie prime e nei prodotti finiti. Lingestione di micotossine provoca nelluomo
linsorgere di manifestazioni cliniche, acute o croniche, che possono interessare differenti organi
vitali o modificazioni cellulari.
E noto come molte specie di muffe siano in grado di produrre composti tossici per luomo ma,
fortunatamente, queste attitudini sono variabili in relazione al genotipo del ceppo e si esprimono
solo in definite condizioni di sviluppo.
La produzione di micotossine subordinata alle condizioni colturali ed alla necessit da parte della
muffa di utilizzare vie metaboliche secondarie, non essenziali di norma al suo sviluppo, che
inducono alla produzione ed al rilascio nel mezzo di questi prodotti metabolici di scarto. Alcune
delle micotossine prodotte dalle muffe, in particolare dai ceppi delle tre specie citate in precedenza,
sono ben note ma permane il sospetto che il numero di questi organismi in grado di produrre
sostanze tossiche per luomo e la tipologia di queste sostanze tossiche possa essere maggiore di
quanto noto allo stato attuale. E anzi probabile che lattuale stato delle conoscenze in materia di
micotossine, o pi in generale di tossine microbiche, negli alimenti sia solo parziale, la punta di un
iceberg, che in futuro sar meglio compresa e pi facilmente gestita.
Genere Aspergillus
Il Genere contiene pi di cento specie riconosciute. Almeno cinquanta di queste sono state
riconosciute in grado di produrre micotossine.
Quelle di maggiore interesse e pericolosit per il settore alimentare e zootecnico sono le aflatossine
B1, B2, G1, G2 prodotte da ceppi delle specie Aspergillus flavus (B1 e B2), Aspergillus parasiticusus
(B1, B2, G1, G2) e Aspergillus nomius (G1, G2).
Le aflatossine sono sostanze estremamente tossiche a bassissime concentrazioni, anche se la
sensibilit pu variare da soggetto a soggetto in relazione a differenti fattori quali, il sesso, lo stato
di salute e le abitudini alimentari. Si tratta di molecole che possiedono attivit carcinogeniche,
mutageniche e teratogeniche. Inoltre presentano effetti immunosoppressivi che possono facilitare
linsorgere di altri processi infettivi in particolare in popolazioni ove lassunzione di aflatossine con
la dieta sia frequente.
56

Gli effetti tossici conseguenti allingestione di aflatossine si manifestano solo dopo attivazione ad
opera del sistema microsomiale. Il fegato lorgano bersaglio preferenziale, ma anche i reni ed il
colon possono essere colpiti.
Particolare importanza assume la presenza di aflatossine in componenti dellalimentazione di
animali da latte quali insilati ed integratori. Le aflatossine M1 e M2 sono prodotti di trasformazione
per idrossilazione dalle aflatossine B1 e B2, rispettivamente, che i mammiferi secernono nel latte
in un rapporto pari a circa 1.5% rispetto alle aflatossine introdotte con la razione alimentare. In
questo modo lerrata conservazione e lo sviluppo di muffe in componenti della razione della dieta
degli animali si pu tradurre in presenza di micotossine in alimenti qualitativamente idonei ed
allapparenza salubri.
La corretta gestione di tutta la filiera di produzione lunico sistema di prevenzione efficace.
Genere Penicillium
Numerose specie di muffe impiegate nella produzione di formaggi appartengono a questo Genere.
La scoperta della penicillina nel 1929 diede grande impeto della ricerca e caratterizzazione dei
metaboliti prodotti dalle muffe appartenenti al Genere ed stata il principale motore della
conoscenza delle differenti molecole a sospetta tossicit per luomo che possono essere rinvenute
negli alimenti come conseguenza del loro sviluppo.
Penicillium un Genere molto vasto che comprende circa 150 specie, diverse delle quali, in
determinate condizioni, sono in grado di produrre sostanze tossiche per luomo e gli animali
domestici.
In realt gli effetti negativi per luomo, conseguenti allassunzione con la dieta di queste
micotossine, nella maggior parte dei casi sono solo supposte e sospette (non ancora dimostrate con
dati sperimentali inequivocabili e supportate da dati epidemiologici incontrovertibili), ma rimane
la certezza che differenti specie di Penicillium sono in grado di elaborare una gamma di metaboliti
tossici, o potenzialmente tali.
La tipologia di micotossine prodotte da specie di Penicillium vasta e diversificata sia dal punto di
vista chimico che tenendo conto del loro modo dazione. Volendo semplificare si possono
raggruppare le micotossine prodotte dal Genere Penicillium in due sottogruppi; quelle attive nei
confronti di fegato e reni e le neurotossine. Al primo gruppo appartengono molecole il cui effetto
asintomatico e che possono agire debilitando il fisico nel tempo. Leffetto delle seconde induce
sintomi pi evidenti, quali il tremore, che sono stati osservati per solo in animali domestici.
L Ocratossina A certamente la micotossina pi importante prodotta da Penicillium
(P.verrucosum); si tratta di una sostanza liposolubile che in base ai test di laboratorio risultata
carcinogenica sugli animali, mentre leffetto sugli umani non ancora confermato. Gli alimenti a
maggiore rischio sono il pane o i derivati del frumento sui quali si sia sviluppata la muffa.
LOcratossina A si accumula nel corpo degli animali, o quantomeno non ne viene facilmente
escreta, e di conseguenza la sua presenza diffusa in un ampia gamma di prodotti carnei.
La Citrina una nefrotossina prodotta in particolare da P.citrinum, ma anche da molte altre specie
del Genere, che risultata attiva nei confronto di animali domestici monogastrici. Gli effetti della
Citrina nei confronti della salute umana non sono ancora noti.
La Patulina un lattone prodotto da P.expansum, ma anche da altre specie e ceppi appartenenti al
Genere, che induce disturbi neurologici e gastrointestinali sul topo. Anche in questo caso gli effetti
sulluomo non sono stati ancora dimostrati.
Lacido ciclo-piazonico invece un composto ad elevata tossicit prodotto da differenti specie di
Penicillium che esplica la sua azione nei confronti di fegato e reni di animali domestici. Di
particolare interesse il fatto che alcuni ceppi di P.camemberti, muffa di largo impiego caseario,
risultino in grado di produrre lacido piazonico. Le condizioni di caseificazione e stagionatura del
formaggio non sembrano per favorire la produzione della tossina.
La Citreoviridina una micotossina che stata associata alla comparsa di crisi cardiache acute
avvenute in Giappone. E prodotta in particolare da P.citreonigrum, una specie che di norma si
moltiplica sul riso, ma che potrebbe contaminare occasionalmente anche altri differenti cereali.
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Numerosi altri composti tossici, a differente tipologia dazione, sono stati rilevati come prodotti
metabolici di una parte importante delle specie del Genere, quali; PR toxin e Roquefortina, tossine
prodotte da P.roqueforti, Penitrm A (neurotossine), Rubratossina, Islandicina e Acidi Secalonici.
Come premesso la tossicit per luomo di buona parte dei questi composti rimane solamente
sospetta; la diffusione delle sostanze in un ampia gamma di cibi, la possibilit di effetti sinergici
dovuti alla presenza di pi componenti tossiche in un solo prodotto e i possibili rischi di accumulo
e sovrapposizione sono per fattori che impongono di prendere in considerazione la produzione di
micotossine da Penicillium come un potenziale pericolo per la salute umana e sicuramente inducono
a considerare la necessit di impiegare norme di produzione e di conservazione degli alimenti
idonee ad inibire la moltiplicazione di queste muffe. Allo stesso tempo, quando questi
microrganismi vengono utilizzati in modo mirato in tecnologia di produzione, come nel settore
caseario, necessario impiegare per linnesto ceppi selezionati non produttori di sostanze
tossiche.
Genere Fusarium
Il Genere Fusarium comprende comprende numerosi funghi talvolta saprofiti ma quasi sempre
parassiti delle piante.
Per quello che riguarda il settore alimentare Fusarium pu contaminare in particolare cereali, semi
oleosi e fagioli. Anche i derivati di queste materie prime possono risultare quindi contaminati da
micotossine eventualmente prodotte.
Le muffe del Genere possono infatti produrre differenti metaboliti tossici, alla presenza di alcuni
dei quali sono stati associati casi di intossicazione umana anche gravi avvenuti sporadicamente ed
in differenti zone del mondo. E stata anche osservata una maggiore frequenza nellinsorgenza di
tumore allesofago in alcune popolazioni con abitudini alimentari che favoriscono lassunzione
con la dieta di prodotti con sospetta presenza di micotossine prodotte da questo tipo di muffe.
In particolare, i tricoteceni sono composti tossici prodotti da muffe appartenenti al Genere
Fusarium. Includono molti composti chimicamente e strutturalmente similari che vengono
differenziati in tre grandi gruppi: il tipo A tricoteceni, che comprende il diacetossiscirpenolo, la
tossina T-2, la tossina HT-2 e il neosolaniolo; il tipo B tricoteceni, che comprende il
deossinivalenolo, il 3-acetidesossinivalenolo, il 15-acetidesossinivalenolo, il nivalenolo e il
fusarenon-X; il tipo C che comprende tricoteceni macrociclici, noti come satratossine.
Tra questi la sostanza tossica pi spesso rinvenuta nei cereali e pi frequentemente associata ad
episodi di intossicazione umana il deossinivalenolo. Altre tossine che sono state collegate ad
episodi di intossicazione sono lo zearalenone e il fumonisin. La tossina T-2 allo stato attuale risulta
rinvenuta solo raramente nei grani di cereali e quindi non desta preoccupazione anche se stata
associata a casi di intossicazione umana collegata al consumo di cereali ammuffiti che risalgono alla
prima met del secolo scorso.
Alcune delle tossine prodotte dalle muffe appartenenti al Genere Fusarium vengono frequentemente
ritrovate in cereali o derivati destinati allalimentazione del bestiame mentre, per quello che
riguarda la loro presenza negli alimenti, sono rinvenute in tracce in pasta, pane e birra.
Altre specie di muffe, potenziali contaminanti di alimenti, che risultano produrre micotossine
appartengono ai Generi Acremonium, Alternaria, Chaetomium, Cladosporium, Claviceps,
Myrothecium, Phomopis, Rhizoctonia e Rhizopus. Gran parte di queste muffe sono facilmente
rinvenibili in prodotti per alimentazione animale ma, allo stato attuale delle conoscenze la loro
potenziale ricaduta nel settore alimentare sembra minima.
I Virus
I virus sono organismi viventi che non sono in grado di replicarsi autonomamente ma solo dopo
aver infettato una cellula ospite ed essersi integrati nel suo genoma. Questo fenomeno comporta la
lisi, e quindi la morte, della cellula ospite. In questo aspetto consiste il danno conseguente
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allinfezione virale per lorganismo ospite. Un singolo virus in grado di infettare una cellula,
mentre la lisi della cellula accompagnata dal rilascio di molti (centinaia) di nuovi virus copie di
quello originario.
Si tratta perlopi di brevi filamenti di DNA o RNA a singola o a doppia elica racchiusi in una
guaina proteica; la morfologia delle particelle virali pu essere molto varia in relazione alla struttura
della guaina proteica di rivestimento. Tali proteine sono coinvolte anche nel riconoscimento della
cellula da infettare e nella penetrazione della parete o membrana cellulare. Solo il DNA o RNA
virale penetrano nella cellula e si inseriscono nel genoma cellulare. In questo stato il virus pu
rimanere in una forma quiescente, innocua per la cellula, oppure divenire infettivo e dare inizio ad
una repentina moltiplicazione. Questo fenomeno connesso sia alle caratteristiche del virus stesso,
che alla tipologia e allo stato fisiologico ed energetico della cellula ospite.
In conseguenza dellelevata capacit riproduttiva e del rapporto cellule infettate e virus rilasciati,
anche in presenza di dosi infettanti di virus molto basse, linfezione pu determinare effetti
dirompenti per lospite.
Gli alimenti possono essere veicolo di trasmissione di infezioni virali alluomo; recenti dati
epidemiologici evidenziano come siano sempre pi frequenti i casi di infezioni virali riconosciute.
Allo stesso tempo il sospetto che in molti casi lorigine virale dellinfezione non venga riconosciuta
consistente. Tra virus noti per la trasmissione attraverso gli alimenti i pi diffusi sono il
Calicivirus ed il Virus dellepatite A.
In conseguenza della specificit dellospite, i virus in grado di infettare gli uomini si moltiplicano
solo nelle cellule umane e quindi non possono moltiplicarsi negli alimenti, ma li utilizzano solo
come vettore di trasporto. La quasi totalit dei virus trasmissibili alluomo dagli alimenti sono virus
enterici, prodotti dal corpo umano e rilasciati con le feci. In base alle caratteristiche morfologiche,
antigeniche e fisico-chimiche se ne riconoscono pi di 100 differenti tipi, la maggior parte dei quali
caratterizzati da una singola catena di RNA.
Generalmente si ritiene che i virus enterici manifestino rispetto agli enterobatteri una maggiore
resistenza allacidit ma una minore resistenza termica. Di norma i virus sono inattivati dalle alte
temperature (cottura) mentre si preservano al freddo. Per questultimo motivo fonte di infezione
virale possono essere in particolare gli alimenti crudi o non pastorizzati.
Lacqua la principale fonte di infezioni virali di origine alimentare. Altri veicoli importanti
possono essere i vegetali ed i prodotti della pesca, ma anche carne, latte e frutta sono stati coinvolti
in episodi di infezioni virali. La contaminazione pu riguardare la materia prima ma anche le sue
manipolazioni in tutte le fasi di preparazione dellalimento. Le potenziali fonti di contaminazioni
possono essere molteplici (insetti, animali) ma la pi importante resta il contatto con le secrezioni
fecali umane.
Particolari virus invece possono attaccare le cellule batteriche e sono definiti batteriofagi. Queste
particelle virali sono in grado di inattivare le colture starter utilizzate per la produzione di alimenti
fermentati e quindi di bloccare i processi produttivi e perci comportano danni economici anche
molto gravi. La selezione di colture innesto studiate in base alla resistenza di biotipi batterici a
differenti particelle virali ed il loro impiego in rotazione allo stato attuale il rimedio maggiormente
impiegato per produzioni industriali che utilizzano colture starter selezionate.
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Microrganismi ed alimenti
Significato dei microrganismi negli alimenti
Le implicazioni dei microrganismi negli alimenti possono essere di diversa natura, in funzione del
tipo di alimento, della concentrazione e del tipo di microrganismi presenti nelle materie prime e nel
prodotto finito.
La concentrazione!e il tipo di microrganismi presenti in un prodotto alimentare dipendono da fattori
diversi: i) materia prima da cui l'
alimento stato originariamente ottenuto; ii) qualit
microbiologica dellalimento prima del processo di trasformazione; iii) condizioni igienico sanitarie
in cui lalimento stato manipolato e processato; iv) adeguatezza delle condizioni di
confezionamento e conservazione del prodotto; v) uso deliberato e appropriato di microrganismi
selezionati (starter), che sono i principali responsabili del processo di trasformazione degli alimenti
fermentati.
La contaminazione di tali alimenti da parte di microrganismi patogeni e deterioranti causa,
rispettivamente, di implicazioni igienico-sanitarie e deprezzamento della qualit organolettica. Al
contrario, le caratteristiche organolettiche e la conservabilit degli alimenti fermentati sono il
risultato, diretto o indiretto dell'
attivit di microrganismi starter deliberatamente usati nei processi di
trasformazione degli alimenti.
Microbiologia degli alimenti
La microbiologia degli alimenti un area di studio molto vasta e diversificata:
coinvolge infatti un vasto numero di microrganismi, muffe, lieviti, batteri e virus di
differenti specie;
implica lapprofondimento dei differenti effetti indotti dei batteri veicolati dagli alimenti
sulla vita delluomo, quali la probiosi, la possibilit di indurre malattie, lutilit per la
produzione di specifici prodotti;
si occupa dello studio del metabolismo microbico in relazione alla matrice di crescita, ai
parametri tecnologici del processo di trasformazione ed alle condizioni di conservazione;
studia le basi biochimiche della grande diversificazione dei prodotti alimentari e degli
effetti del metabolismo batterico su una vasta gamma di substrati, siano essi materie prime
o alimenti finiti pronti al consumo.
Lo sviluppo delle prime ricerche microbiologiche nel settore medicale e il grande impatto
mediatico che alcune tossinfezioni hanno avuto in differenti periodi storici ha favorito, in
particolare tra i non esperti in materia, lassociazione mentale immediata tra batteri e malattie.
Ancora oggi i microrganismi, o germi, suscitano diffidenza e paura nella maggior parte delle
persone.
In verit, la grande maggioranza dei microrganismi a noi noti sono utili, se non addirittura
necessari, alla vita degli uomini. I germi patogeni sono solo una minoranza dei microrganismi,
anche se il loro potenziale negativo ha indotto ad una maggiore attenzione al loro studio e li ha resi
pi famosi.
Microrganismi utili alla salute colonizzano differenti distretti del corpo umano e di altre specie
animali, altri sono essenziali alle trasformazioni del suolo ed allo sviluppo dei vegetali ed altri
ancora hanno consentito la produzione degli alimenti fermentati come i formaggi, i salami, il vino,
la birra e i prodotti da forno lievitati. In termini generali lutilit o il danno associabile alla presenza
di microrganismi negli alimenti sono valutabili solo in relazione alle caratteristiche del prodotto,
alle condizioni di conservazione ed alle abitudini di consumo.
Sovente la materia prima presenta una sua microflora caratteristica dovuta agli ambienti di
produzione ed alle sue caratteristiche compositive che selettivamente possono favorire le differenti
60

specie. Quindi luomo con le sue attivit produce nuove contaminazioni, specifiche o generiche,
occasionali o volute, utili o dannose. La presenza del microrganismo pu implicare anche la
produzione di metaboliti con differente significato biologico e igienico: alcuni di questi, come ad
esempio le tossine, possono permanere nellalimento anche dopo la scomparsa del microrganismo e
possono produrre gravi inconvenienti alla salute del consumatore.
Le fonti di contaminazione pi comuni sono riconducibili a:
Esseri umani gli esseri umani sono degli importanti dispensatori dei microrganismi che
risiedono sullepidermide, sugli epiteli ed in numerosi apparati. Si tratta di una
microflora molto variegata che comprende Micrococcaceae, Corynebacteriaceae,
Lactobacillaceae, Bifidobacterium, Enterobacteriaceae, Streptococchi fecali, etc. Parte
di questa microflora, in particolare quella anaerobia o ossigeno intollerante residente
dellultima parte del tratto gastrointestinale non ancora completamente nota. Luomo
rilascia nel corso delle sue attivit nellambiente un grande numero di microrganismi;
lentit ed il tipo della contaminazione dipendono da molteplici fattori quali lo stato di
salute, ligiene individuale, lattivit fisica, il tipo di dieta e pi in generale le abitudini
di vita.
Animali come gli esseri umani gli animali sono vettori di un grande numero di
microrganismi. Si aggiunga inoltre che le condizioni di vita degli animali sono dal punto
di vista igienico molto meno protette rispetto a quelle caratteristiche per gli uomini, ne
deriva che il conseguente rilascio di microrganismi, alcuni dei quali patogeni,
nellambiente sia sicuramente maggiore. Molti animali quali pesci, uccelli, roditori sono
caratterizzati dalla presenza sulla superficie e nel tratto gastrointestinale da popolazioni
microbiche caratteristiche dellecosistema dellanimale. Alcuni di questi animali sono
infestanti delle derrate alimentari e con le loro spoglie e le loro feci possono essere
veicolo di importanti contaminazioni. In questo senso anche gli insetti e gli acari
possono essere di grande pericolo; si deve ricordare che nelle feci di alcuni di questi
piccoli esseri viventi certi microrganismi patogeni possono sopravvivere per lunghi
periodi di tempo.
Piante anche in questo caso la microflora presente sulle superfici molto variegata e
dipende da fattori morfologici e fisiologici della pianta. Lampiezza della superficie
esposta allaria o interrata e la sua rugosit risultano determinanti. Anche fattori
ambientali e legati alla stagione possono modificare la popolazione microbica delle
piante anche se di norma i microrganismi pi rappresentati sono Lieviti, Muffe,
Pseudomonadaceae,
Bacillaceae,
Enterobatteriaceae,
Micrococcaceae
e
Lactobacillaceae. Lirrigazione e la presenza di animali da allevamento nellambiente
possono inoltre arricchire e modificare la popolazione microbica dei vegetali e dei frutti
coltivati. Nel caso dei foraggi la popolazione microbica diviene rilevante anche per il
suo carico inquinante sullanimale e di conseguenza sugli alimenti che ne originano,
come il latte.
Suolo il terreno probabilmente risulta la pi grossa fonte di contaminazione microbica;
tutti i microrganismi noti sono rinvenibili nel suolo anche se non tutti sono in grado di
moltiplicarvisi. La definizione stessa di suolo talmente vaga e varia che prevede che
territori o terreni differenti permettano la presenza maggioritaria di popolazioni
microbiche differenti. La presenza di nuclei abitativi di essere umani, allevamenti
animali o colture vegetali influisce in maniera determinante sulle caratteristiche
microbiologiche dei terreni.
Acqua anche le acque come il suolo rappresentano un notevole reservoir di virus e
batteri. Parte di questa microflora solo ospite transiente mentre alcune specie sono
caratteristiche. La presenza di altri esseri viventi come pesci, protozoi, larve, insetti e
alghe arricchisce ulteriormente la popolazione microbica dal punto di vista qualitativo.
Come nel caso del suolo anche per il carico microbico ed il potenziale contaminante
61

delle acque risultano determinanti la presenza di nuclei abitativi e pi in generali di
attivit umana nelle vicinanze.
Aria laria non possiede una popolazione microbica caratteristica, non essendo un
substrato di crescita, ma molti microrganismi vi persistono a lungo e quindi, anche in
considerazione del suo essere fluida e mobile, diviene un vettore per i microrganismi,
che vengono trascinati dal suo fluire, ed la principale fonte di veicolazione della
contaminazione per tutte le superfici.
In relazione al tipo di prodotto la presenza di un determinato carico quantitativo di differenti specie
microbiche pu essere definita funzionale, dannosa o ininfluente in relazione a differenti aspetti
quali:
lorigine della contaminazione (dallambiente o aggiunti dalluomo con specifico fine
tecnologico)
la capacit dei differenti microrganismi di moltiplicarsi nellalimento
la capacit di alcune specie di inibire la crescita di altre forme microbiche tramite la
produzione di differenti metaboliti
gli effetti del metabolismo microbico sulla trasformabilit della materia prima, sulle
caratteristiche organolettiche e merceologiche dellalimento, sulla deperibilit
dellalimento e sulle condizioni necessarie per la sua conservazione
la possibilit di indurre malattie nei consumatori (in questo caso, come gi sottolineato,
diviene determinante la conoscenza della dose minima infettante)
In base al ruolo della microflora gli alimenti possono essere divisi in tre grandi categorie:
la prima comprende i prodotti ottenuti da materie prime pi o meno modificate in
conseguenza allintervento di microrganismi fermentanti, in particolare lieviti e batteri
lattici. Per questi alimenti (formaggi, yogurt, burro, salami, vino, etc) lesito tecnologico
dipendente dallo sviluppo della corretta microflora e quindi i microrganismi sono
essenziali alla produzione. In questi casi, di norma, lo sviluppo dei batteri funzionali al
processo dovrebbe inibire lattecchimento di batteri patogeni o alterativi; pi
verosimilmente la riuscita della produzione dipende dallimpiego di tecnologie corrette
che favoriscono lo sviluppo della microflora necessaria e, grazie anche al contributo
inibitorio di questultima, rendano impossibile, o perlomeno poco probabile, lo sviluppo
di quella indesiderata. Si tratta attraverso la tecnologia di gestire lo sviluppo di
microrganismi nel prodotto.
la seconda categoria raggruppa gli alimenti per la cui produzione non sono necessarie
modificazioni della materia prima indotte dal metabolismo microbico. Si tratta della
maggioranza degli alimenti (latte alimentare, verdura, frutta, etc.), per i quali lesito
tecnologico della trasformazione dipende dal fatto che nel corso della vita commerciale
del prodotto, dalla produzione al consumo, non si creino delle falle che favoriscano la
contaminazione da parte di germi patogeni, o di microrganismi in grado di depauperare
il valore nutrizionale e le caratteristiche organolettiche del prodotto. Per una parte di
questi alimenti, le semi-conserve, accettabile la presenza di una microflora saprofita
non patogena la cui possibile moltiplicazione limita la conservabilit del prodotto. Il
latte fresco pastorizzato, ad esempio, fa parte di questa gamma di prodotti. Per le
conserve, come il latte sterilizzato, prevista invece lassenza di microrganismi nel
prodotto e di conseguenza la vita commerciale dellalimento molto superiore e la
refrigerazione non necessaria. In questo caso si tratta, sempre con lausilio della
tecnologia, non di gestire ma di annullare il carico di microrganismi presenti nella
materia prima e, quindi, di impedire la ricontaminazione del prodotto nelle differenti fasi
della trasformazione e della conservazione.
un terzo gruppo di alimenti prevede laggiunta di microrganismi utili alla salute umana.
Si tratta dei prodotti probiotici. In questo caso la presenza di una determinata quantit di
specifici microrganismi non necessariamente utile allesito tecnologico, ma
62

funzionale ad incrementare il valore salutistico dellalimento attraverso la presenza di
microrganismi la cui assunzione con la dieta pu indurre beneficio alla vita.
In sintesi, la contaminazione e la colonizzazione degli alimenti un processo competitivo,
allinterno del quale le specie pi veloci ad adattarsi e che dispongono di un metabolismo pi
vantaggioso prendono il sopravvento. La produzione di alimenti e la loro conservazione implica
dunque la capacit di imporre condizioni alla materia prima tali da sfavorire lo sviluppo dei
microrganismi patogeni o di quelli alterativi. Infatti, ad esclusione dei germi patogeni la definizione
di microflora caratteristica, alterativa o ininfluente non pu essere data a prescindere dal sistema
prodotto nel suo insieme. Mentre la classificazione dei patogeni, anche se in continua evoluzione ed
aggiornamento, comunque ben definita, il termine microrganismi alterativi coinvolge
necessariamente le caratteristiche dellalimento stesso. Microrganismi che rappresentano fonte di
difetti ed alterazioni di un prodotto possono essere caratteristici di un altro, ove anzi possono essere
necessari per raggiungere le caratteristiche che lo rendono particolare. Inoltre erroneo ritenere che
qualsiasi microrganismo debba necessariamente presentare aspetti negativi o funzionali alla
produzione; una buona parte di microrganismi sono semplici contaminanti banali e possono
sopravvivere nel prodotto senza necessariamente moltiplicarsi o modificarlo e senza indurre effetto
alcuno sulla salute del consumatore.
La presenza di differenti quantit e tipi di microrganismi negli alimenti ha quindi implicazioni di
carattere igienico e nutrizionale che risultano sostanziali per definirne la qualit.
La capacit di qualsiasi specie vivente di colonizzare un ecosistema comprende anche la sua
attitudine ad interagire con le altre specie viventi presenti nellecosistema e, quindi nel caso
delluomo, anche con i microrganismi. Gli alimenti fermentati, in particolare, sono da sempre uno
dei principali canali di interazione tra cellule microbiche e uomo. In particolare la possibilit da
parte dei microrganismi presenti negli alimenti di colonizzare il tratto gastrointestinale umano
uno dei principali elementi che motivano il rapporto alimentazione-salute.
La storia dello sviluppo delluomo sul pianeta coinvolge perci, la sua presa di contatto e la sua
capacit di adattarsi ed integrarsi con il mondo microbico. Gli esseri umani nel corso della storia
hanno trovato differenti forme di coesistenza e di vita in equilibrio con i microrganismi presenti
nellambiente e quindi anche nei loro alimenti. Queste pragmatiche forme di coesistenza si sono col
tempo modificate parallelamente allevoluzione dei sistemi di vita delluomo ed ai progressi della
tecnologia industriale.
Inizialmente con osservazioni empiriche luomo ha imparato a produrre alimenti maggiormente
conservabili e che non influissero negativamente sul suo benessere. Si pensi, ad esempio, alla
scoperta dellutilit del sale, del grasso o del ghiaccio per conservare pi a lungo i prodotti. Quindi
le osservazioni empiriche hanno trovato riscontri tecnici e col tempo si evoluta la produzione di
alimenti su larga scala e si resa possibile la loro conservazione e commercializzazione a largo
raggio. Questi ultimi decenni, in particolare, sono stati caratterizzati da progressi tecnologici di
notevole portata che hanno positivamente coinvolto anche lindustria alimentare.
Allo stesso tempo limpatto dellevoluzione tecnologica ha imposto a tutto lambiente
unevoluzione accelerata; questo fatto ha comportato la necessit di interpretare con maggiore
rapidit le modificazioni degli ecosistemi microbici, con i quali quotidianamente si in contatto, al
fine di individuare, mantenere e gestire forme adeguate di prevenzione che consentano il corretto
rapporto con i microrganismi presenti nellambiente per preservare la nostra salute.
Si pensi al differente effetto di una contaminazione dello stesso alimento prodotto ad inizio secolo
ed oggi. Nel primo caso la produzione artigianale comportava una commercializzazione locale ed
una breve conservazione, quindi uneventuale tossinfezione poteva coinvolgere, anche se molto
seriamente, un numero limitato di persone. Un prodotto industriale, invece, viene preparato in
grandi quantitativi, commercializzato anche molto lontano dalla sede di produzione e conservato il
pi a lungo possibile; questi fattori amplificano esponenzialmente gli effetti della contaminazione
batterica e determinano un rischio molto pi elevato rispetto al passato.
63

Solo la corretta gestione dei parametri di processo, sia della materia prima che del prodotto finito,
possono produrre leliminazione dei microrganismi dannosi e la selezione di quelli utili
mantenendo nel contempo inalterate, o meno deteriorate possibili, le qualit intrinseche al prodotto.
Ogni modificazione del processo produttivo o delle caratteristiche del prodotto finito deve
prevedere una preliminare analisi approfondita di quali e quanti microrganismi possano esserne
favoriti. Si tratta di individuare le possibili fonti di contaminazione, gli effetti inibitori dei
trattamenti tecnologici sulla microflora starter, se aggiunta, il potenziale di contenimento di
eventuali coadiuvanti tecnologici o additivi, le condizioni di commercializzazione e conservazione.
In pratica si devono stabilire la cinetica di sviluppo della microflora caratteristica, quindi
funzionale al prodotto, e la possibile presenza di pericoli microbici che si possano trasformare in
rischi per il consumatore in considerazione delle variazioni indotte con le modificazioni di processo
e laumento della durata della conservazione.
Allo stato attuale le malattie trasmesse attraverso gli alimenti sono un problema di sanit pubblica
importante sia nei paesi industrializzati che in quelli in fase di sviluppo. Le problematiche
igieniche sono differenti in relazione ai modelli di sviluppo sociale e di organizzazione della vita
nelle diverse regioni del mondo. In questo caso non sempre semplice disgiungerle da altri fattori
ambientali o relativi alla salute delluomo.
In Europa le tossinfezioni alimentari sono seconde per morbilit solo alle affezioni respiratorie e
quasi una persona ogni tre tutti gli anni viene colpita da malattie trasmesse dagli alimenti. Nel 1992
il rapporto del Comitato di esperti della sicurezza alimentare della FAO sottolineava come
probabilmente le malattie dovute al consumo di alimenti contaminati fosse il problema sanitario pi
vasto a livello mondiale e come questo avesse, in seconda istanza, anche gravi ripercussioni sulla
produttivit economica globale. Allo stato attuale si pu ipotizzare che dal 10 al 15 % delle morti
nei paesi in via di sviluppo siano conseguenti a malattie diarroiche dovute al consumo di acqua o
alimenti contaminati.
Nelle differenti regioni del mondo in rapporto alle condizioni igieniche di vita ed allo stato di salute
e nutrizione delle popolazioni si va sviluppando una differente incidenza delle diverse forme
morbose.
Nei paesi industriali a fianco di una riduzione delle malattie caratteristiche dellinizio del secolo
scorso si osserva laumento di tossinfezioni riconducibili alla manipolazione e conservazione degli
alimenti (Listeria spp., Escherichia coli, Campylobacter jejeuni, Yersinia enterocolitica).
I dati ufficiali, provenienti dai differenti paesi e raccolti in base ai vigenti sistemi di sorveglianza
epidemiologica e di notifica delle malattie, rappresentano comunque una stima per difetto della
reale incidenza. In realt infatti, il numero attendibile dei casi pu variare in funzione dellagente
eziologico e della gravit della sindrome. Le malattie a trasmissione alimentare rapportabili ad
eziologia batterica sono quelle di relativamente pi facile identificazione e pi frequentemente
rapportabili al fattore alimentare.
Una recente indagine condotta negli USA ha evidenziato che un valore accettabile sulla reale
frequenza delle malattie a trasmissione alimentare possa essere ottenuto moltiplicando i dati di base
per fattori di correzione che tengono conto della gravit della sindrome. La frequenza di forme
clinicamente severe, e quindi pi frequentemente notificate ed identificate, sono stimate con un
fattore di correzione poco elevato (es: 2 volte per botulismo e listeriosi); patologie di media gravit
possono essere corrette con un fattore pari a 15-20 volte (brucellosi, shigellosi, gastroenterite da
Escherichia coli enteroemorragico); le forme cliniche lievi vengono aggiustate con un fattore di
moltiplicazione pari a 38 (campilobatteriosi, yersiniosi, tossinfezione da Bacillus cereus).
Definire il significato igienico della presenza delle differenti specie di microrganismi nei prodotti
alimentari rimane da sempre fonte di grandi discussioni tra gli esperti del settore. In particolare
linterpretazione del significato igienico della presenza di microrganismi nei prodotti alimentari si
molto modificata in conseguenza allo sviluppo di tecniche analitiche sempre pi selettive e
precise.
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Non tutti i microbiologi si sono sempre espressi in modo concorde, in particolare, in merito al
rapporto danno/beneficio imputabile al possibile contatto uomo/microrganismi potenzialmente
pericolosi attraverso gli alimenti. Alcuni esperti hanno, ad esempio, collegato lindebolimento del
sistema immunitario umano, osservato in particolare nei paesi occidentali, alla diminuzione del
contatto con i microrganismi conseguente alla maggior igiene che si affermata in differenti settori
della vita, e tra questi anche la produzione di alimenti. Questo filone di pensiero avversato da
coloro che sostengono che il miglioramento delligiene di vita delluomo ha portato ad una
diminuzione di molte patologie infettive o di intossicazioni con esiti gravi ed in alcuni casi letali. In
particolare il maggior tasso di sopravvivenza alle malattie conseguente allo sviluppo della medicina
comporta inevitabilmente la presenza di parte della popolazione pi debole dal punto di vista
immunitario, che non si naturalmente selezionata per la resistenza alle intossicazioni o alle
infezioni. Questo evento, se valutato solo in termini statistici, pu essere letto come diminuzione
delle nostre capacit immunitarie ma anche, alternativamente, come diminuzione della mortalit
dovuta a malattie conseguenti al contatto con germi patogeni.
Ad esempio la diffusione dellimpiego degli antibiotici, sia a livello umano che zootecnico, da un
lato ha permesso di debellare alcune cause di mortalit molto diffuse allinizio del secolo scorso, ma
inevitabilmente ha indotto modificazione delle flore microbiche enteriche. Queste modificazioni
possono in alcuni casi aver ridotto leffetto barriera della microflora normalmente residente
nellintestino rispetto alla colonizzazione da parte di batteri patogeni. Prescindendo dalle differenti
teorie proposte, che indipendentemente dalle estremizzazioni contengono elementi veritieri e sono
comunque basate su validi supporti scientifici, siamo pi propensi a privilegiare la diminuzione del
rischio alimentare e delle patologie conseguenti, anche a dispetto della possibile selezione di
individui pi resistenti. Detto questo si deve accettare come utile ed indispensabile il contatto con il
mondo dei microrganismi. Si tratta pertanto di non enfatizzare lassenza generica o la presenza in
basso numero dei microrganismi negli alimenti quanto, piuttosto, garantire che in particolare quelli
potenzialmente pericolosi non siano presenti. Come in altri aspetti della vita anche il senso del
rapporto uomo/microrganismo deve essere contestualizzato ed aggiornato in relazione ai modificati
sistemi di vita.
Muovendosi in questa direzione agli inizi degli anni 90 la CEE, nell'
ambito delle misure previste
per la realizzazione del mercato unico, ha delineato delle Direttive, generali e settoriali, che hanno
definito le norme di igiene che devono essere rispettate nell'
intera catena alimentare. Nella
prospettiva di produrre cibi sani per tutti la CEE ha voluto garantire ad un qualsiasi cittadino
europeo di godere delle stesse norme di tutela, non solo nel proprio Paese, ma in tutto il territorio
della Comunit; tali direttive definiscono criteri microbiologici minimi per garantire la salubrit dei
prodotti ed i sistemi aziendali per ottenere questi obbiettivi, lautocontrollo (tab. 2.10).
Questa strategia si posta il duplice compito di tutelare la salute del consumatore e di facilitare lo
scambio dei prodotti evitando la presenza di barriere commerciali inutili. Quindi la formulazione di
regole comuni ha perseguito lo scopo di garantire a tutti i consumatori ed i produttori comunitari
eguaglianza di diritti e doveri.
Il pericolo e le sue fonti
Il pericolo viene definito come la presenza di agenti microbiologici, chimici o biologici; la
probabilit che questo pericolo si traduca in danno per il consumatore consiste nel rischio. Per
rischio si intende la possibilit che il pericolo si concretizzi tenendo conto delle caratteristiche
dellagente, della dose infettante, delle caratteristiche dellalimento, della tecnologia di produzione
e commercializzazione e pi in generale delle abitudini del consumatore che definiscono le porzioni
di consumo abituale. I pericoli sono comuni a differenti classi di alimento, ma il rischio differente
in relazione alle caratteristiche del singolo prodotto e di chi lo consuma.
Tra i differenti pericoli biologici noti, la presenza di batteri patogeni rimane il pericolo pi
frequente, anche se recentemente si osservato un incremento delle malattie provocate da virus e da
65

protozoi.
I microrganismi, essendo ubiquitari in natura, facilmente possono contaminare sia le materie prime
che i prodotti finiti. La presenza nellambiente anche di microrganismi patogeni determina quindi
la necessit di attuare idonei piani di sorveglianza e controllo al fine di impedire che, unitamente
alla microflora utile ed alla microflora saprofita, dallambiente si trasferiscano al prodotto anche
microrganismi potenzialmente dannosi alla nostra salute.
Indipendentemente dal principio generale la messa in pratica di sistemi di prevenzione totale
comunque complicata. Infatti si deve ricordare che potenzialmente qualunque intervento umano
nella catena alimentare, dalla produzione al consumo, pu condizionare la salvaguardia della
salubrit.
Ad esempio gli addetti alla produzione, attraverso interventi non corretti operati in fase di
trasformazione, conservazione e distribuzione dei prodotti, possono essere veicolo di
contaminazione o favorire la sopravvivenza e lo sviluppo di germi patogeni nel prodotto. In questo
senso la messa in pratica di procedure standardizzate di prevenzione e controllo ha favorito la
riduzione dei rischi di contaminazione nel corso della fase di produzione.
Pi complessa appare la gestione delle problematiche connesse alla commercializzazione e
conservazione dei prodotti non sterili; questi ultimi sono infatti legati ad usi e pratiche da parte di
grossisti, dettaglianti e consumatori non sempre dotati della corretta conoscenza delle problematiche
igieniche. Recentemente stato in particolare evidenziato come una parte delle tossinfezioni
alimentari possa essere associata alla cattiva gestione dei prodotti da parte dello stesso consumatore,
la cosiddetta contamination in the home.
Le nuove emergenze
In questi ultimi anni si notato un incremento di infezioni e tossinfezioni causate da
microrganismi la cui trasmissione pu essere imputata anche agli alimenti.
Questa nuova situazione il risultato di
una sovrapposizione e combinazione
di
problematiche di ordine biologico, industriale e sociale che hanno modificato e condizioneranno in
futuro i concetti di pericolo e di "rischio" per i prodotti alimentari.
Le statistiche provenienti dai Paesi che effettuano una sorveglianza epidemiologica efficace e
rigorosa suggeriscono, infatti, che la lotta contro le infezioni di origine alimentare lungi
dallessere vinta. La frequenza degli episodi in aumento e, nella maggior parte dei casi, le
infezioni derivano da una trasmissione di patogeni da animali a uomo. Inoltre, lemergere di un
numero considerevole di nuovi patogeni ha avuto e continua ad avere un notevole impatto nella
casistica epidemiologica pi recente. Gli esempi pi eclatanti che coinvolgono pi direttamente
anche i prodotti lattiero caseari riguardano ceppi di Escherichia coli enteroemorragici, Listeria
monocytogenes e Clostridium botulinum.
In realt almeno una parte di queste novit erano attese e temute dagli esperti; da un lato gli studi
epidemiologici avevano evidenziato questa tendenza ed alcune elaborazioni teoriche e ricerche
sperimentali ne avevano confermato la possibilit e lasciavano intravedere gli effetti del
modificato rapporto uomo/microrganismo tramite gli alimenti.
Quali sono le ragioni che possono spiegare questi cambiamenti?
Cambiamenti delle caratteristiche dei microrganismi - per alcuni patogeni, come ad
esempio Salmonella, si evidenziato che il numero minimo di cellule batteriche
necessarie per causare malattia oggi risulta molto inferiore a quanto noto in passato e
riportato in bibliografia. In questo caso si osserva una diminuzione della dose minima
infettante che incide drammaticamente sullentit del rischio salmonellosi e che a parit di
carica risulta determinante nel causare percentuali di eventi infettanti superiori. In questo
caso solo la riduzione dei limiti di tolleranza e quindi limpiego di strategie di protezione pi
drastiche pu risultare efficace. Gli effetti ambientali, ad esempio la diffusione della
conservazione refrigerata, possono avere indotto una selezione di batteri con maggiore
66
resistenza, favorendo alcuni germi patogeni (es: Listeria monocytogenes, Campylobacter

spp. o Yersinia spp.) in grado di adattarsi, crescere e/o produrre tossine anche a temperature
molto basse. Limpiego spesso indiscriminato di farmaci nellalimentazione animale a fini di
ottenere un incremento ponderale della produzione di carne e di latte ed il rilascio di
sostanze ad attivit antibiotica nellambiente ha modificato gli equilibri di ecosistema,
favorendo il sopravvento di biotipi resistenti. La comparsa sempre pi diffusa di germi
patogeni multiresistenti e con soglie di sensibilit elevata agli antibiotici sta ponendo nuovi
e pressanti problemi in terapia clinica. L'
antibiotico resistenza nei microrganismi sta
divenendo un problema a carattere mondiale.
Miglioramento delle informazioni epidemiologiche e delle tecniche diagnostiche

non deve sfuggire che il deciso incremento dei casi riportati di alcune infezioni alimentari
a cui si assistito negli ultimi anni dipende dal miglioramento del livello di monitoraggio
da parte degli organismi di controllo. Il perfezionamento delle tecniche diagnostiche e del
livello di informazione epidemiologica ha per esempio dimostrato che, nella maggior parte
dei casi, i cosiddetti nuovi patogeni spesso altro non sono che microrganismi da sempre
esistenti e che da sempre hanno causato problemi, magari con patologie poco frequenti, la
cui origine era semplicemente ignota. Sono differenti i microrganismi conosciuti da decenni
ma che solo recentemente sono stati riconosciuti come possibili responsabili di tossinfezioni
alimentari; si pensi al Cryptosporidium noto dallinizio del secolo scorso, ma che solo
negli anni novanta stato individuato come microrganismo responsabile di un grave
episodio di infezione intestinale che ha coinvolto migliaia di persone a Milwaukee, oppure
al recente Campylobacter jejeuni, noto sempre allinizio del 1900 come Vibrio fetus. I
biotipi enteroemorragici di Escherichia coli sono stati individuati solo recentemente, circa
nel 1980, ed ad oggi vengono riconosciuti come uno dei maggiori pericoli. Allo stesso modo
Listeria monocytogenes, poco considerata fino alla met degli anni ottanta, divenuto in
breve tempo uno dei pericoli principali e maggiormente considerati per i prodotti caseari.
Recentemente viene proposto di approfondire leventuale pericolosit di Aeromonas
hydrophila. Rimane comunque complicato discriminare tra la comparsa di nuovi biotipi di
microrganismi modificati o la scoperta di ceppi di difficile identificazione. Non si tratta solo
di un esercizio accademico, ma anche di acquisizioni scientifiche utili al fine di modificare
eventuali comportamenti umani che possano favorire la comparsa di nuovi pericoli. Si deve
comunque ritenere molto probabile che al miglioramento della nostra capacit di indagine
microbiologica corrisponder la contemporanea scoperta o riscoperta di nuovi
microrganismi.
Nonostante il miglioramento delle tecniche diagnostiche, resta evidente che, in particolare
nei paesi poveri, una buona parte delle tossinfezioni rimane ancora oggi non compresa e
censita. In futuro possiamo sperare che vengano riconosciute e risolte le cause di numerose
di queste patologie tossinfettive; questo, pur implicando un miglioramento della vita,
delluomo, dal punto di vista epidemiologico sar paradossalmente riconosciuto come un
incremento di patologie dovute ad alimenti contaminati.
Cambiamenti nella produzione, trasformazione, distribuzione e preparazione degli
alimenti - modificazioni nelle pratiche intensive di allevamento zootecnico ed innovazioni
tecnologiche volte a migliorare e diversificare i prodotti e ad estenderne la shelf-life, hanno
certamente modificato i rischi legati alla proliferazione di germi patogeni anche in alcuni
prodotti lattiero-caseari.
I cambiamenti tecnologici avvenuti in tutte le fasi della produzione e della distribuzione
degli alimenti hanno determinato linstaurarsi di nuove opportunit di sviluppo dei patogeni
e stanno favorendo levoluzione di varianti virali in grado di portare allo sviluppo di nuove
infezioni di origine alimentare, dimostrando limportanza di elevare e migliorare la
sorveglianza ed il controllo a vari livelli della catena alimentare.
Limpiego di nuovi sistemi di packaging, di film a differente permeabilit e di atmosfere
67
modificate nel confezionamento dei prodotti, per quanto abbia migliorato la conservabilit
degli alimenti, pu indurre lo sviluppo di microrganismi che venivano normalmente inibiti
dalle condizioni di ossido-riduzione del prodotto originario.
Lampliamento dellarea geografica di commercializzazione e consumo di molti prodotti ha
imposto nuovi criteri per il trasporto e la conservazione dei prodotti; tempi di vita pi
lunghi e un numero maggiore di manipolazioni, anche se di prodotti confezionati,
nonostante i controlli non possono che aumentare il rischio di occasionali contaminazioni.
Inoltre, uno dei momenti chiave per lo sviluppo di potenziali pericoli presenti nel prodotto
la conservazione al punto di vendita. Non in tutti i casi, in particolare alla vendita al
dettaglio, sono rispettate, le temperature e i tempi di conservazione ottimali previste per
garantire la sicurezza del prodotto. Spesso si dimentica o si ignora che le condizioni di
stoccaggio o di conservazione possono risultare determinanti nel concretizzare un rischio di
natura microbiologica
che altrimenti, nelle corrette condizioni previste per la
conservazione, non avrebbe avuto modo di svilupparsi.
Sensibilit individuale e cambiamenti demografici - in differenti gruppi di persone

vi unampia variabilit nella sensibilit alle infezioni in funzione dellet, dello stato di
salute e di altre caratteristiche. Due fattori principali possono nello specifico risultare
determinanti: linvecchiamento della popolazione, fenomeno che riguarda soprattutto i Paesi
pi sviluppati, e laumento di individui con sistema immunitario indebolito o compromesso,
come coloro sottoposti a massicce terapie antibiotiche o chemoterapiche, o i malati di AIDS.
In questo senso necessario ad esempio ricordare che i derivati del latte costituiscono un
alimento preferenziale per alcuni gruppi di persone, come anziani o bambini, che possono
risultare pi sensibili alle infezioni e alle intossicazioni.
Data laccertata variabilit individuale nei confronti della capacit a contrarre malattie, i
cambiamenti nelle caratteristiche delle popolazioni determinano forti implicazioni nel
profilo epidemiologico di certe infezioni.
Il turismo di massa e i flussi migratori, secondo lOrganizzazione Mondiale della Sanit,
sono altri elementi ai quali si deve il riemergere di vecchie malattie e la diffusione di nuove.
Cambiamenti delle abitudini alimentari. Si sta sempre pi affermando il consumo di
alimenti precotti, refrigerati, surgelati, porzionati, conservati in atmosfere modificate, etc.
Nonostante la qualit igienica iniziale di norma elevata di questi nuovi prodotti i
cambiamenti delle abitudini alimentari che essi inducono, associati a comportamenti errati in
fase di manipolazione e conservazione domestica dei cibi (riscaldamenti o cotture
insufficienti, condizioni inadatte di conservazione, pratiche di igiene domestica
inappropriate), rappresentano un ulteriore fattore di rischio.
Questo tipo di nuove problematiche in realt coinvolge solo indirettamente i prodotti
lattiero-caseari, che per spesso sono componenti di alimenti pi complessi (es: prodotti
precucinati) pi esposti a questi tipi di rischio.
La gestione dei prodotti da parte del consumatore presso la sua abitazione sicuramente una
delle fasi a maggiore rischio di contaminazione e sviluppo da parte di microrganismi
patogeni. Questo aspetto difficilmente semplificabile perch dipendente in larga misura
dalle abitudini soggettive e dai modi di vita del singolo consumatore. A nostro parere rimane
sicuramente una dei punti pi fragili del sistema di controllo e salvaguardia della salubrit
dei prodotti sulla filiera di produzione e consumo. Lunico strumento efficace in questa fase
parrebbe essere la corretta informazione del consumatore. Non si tratta sicuramente di un
sistema di controllo del rischio paragonabile per efficacia a quelli previsti dai protocolli di
produzione perch non controllabile e soggetto allumore del consumatore, alla sua fiducia
nellinformazione che gli viene fornita e in chi la fornisce e, pi in generale, alle sue
condizioni di vita nel loro complesso. Chi ha problemi di sussistenza, ad esempio,
solitamente meno disposto allintransigenza rispetto al rischio. Lentit del danno
riconducibile a questa fase del consumo comunque ridotta dal numero di persone coinvolte
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che raramente superano quelle del nucleo famigliare. I danni prodotti da erronea
conservazione sono sicuramente pi pericolosi nel caso coinvolgano sistemi di ristorazione
collettiva e quindi un numero di utenti pi vasto.
Linsieme di questi fenomeni e la loro evoluzione ha modificato, e di fatto incrementato, le
possibilit di contatto fra popolazioni e microrganismi patogeni abituali, emergenti o riemergenti.
Laccelerazione dellevoluzione di tutti i settori della vita delluomo ha coinvolto non solo le
abitudini delle popolazioni ma, di riflesso, anche le caratteristiche dellintero ecosistema. Questo
non pu non avere ripercussioni anche sul mondo dei microrganismi che coabitano con luomo;
non si tratta di accreditare teorie apocalittiche che vedano luomo soccombere alle infezioni ma,
piuttosto, interpretare come i nostri stili di vita possano modificare i pericoli ed aumentare specifici
rischi dovuti alla presenza di cellule microbiche negli alimenti. Gli indiscutibili progressi in tutti i
settori della ricerca bio-medica costituiscono un sicuro strumento utile a questo fine.
Criteri microbiologici e norme igieniche
E comunque indispensabile disporre di limiti di presenza numerica definiti per differenti gruppi di
microrganismi e per differenti classi di prodotto con la duplice funzione di tutela della salute del
consumatore e di verifica della correttezza dei parametri di processo adottati in produzione.
Perci quando la legislazione Comunitaria ha stabilito limiti di tolleranza per le cariche microbiche,
i cosiddetti criteri microbiologici, ha posto laccento sulla necessit che, attraverso gli strumenti
previsti dallautocontrollo, si debbano comunque raggiungere risultati misurabili per i differenti
prodotti e che questi limiti di presenza per i differenti gruppi microbici siano da ritenersi necessari
per garantire la sicurezza. Allo stesso tempo la CEE, con linsieme delle Direttive in materia di
igiene degli alimenti e con le nuove norme in via di definizione, ha inteso anche sottolineare la
necessit di applicare regole comuni ai produttori e che questi debbano porre, nellambito del loro
ruolo, in posizione prioritaria la garanzia della salute del consumatore.
Imporre ragionevoli regole comuni, elaborate in base alle attuali conoscenze in materia di sicurezza
alimentare, e farle rispettare, equivale a garantire condizioni di concorrenza uguali tra produttori; al
contrario leventuale tolleranza per coloro che non rispettassero le regole corrisponderebbe,
indirettamente, a penalizzare i produttori che hanno dedicato al loro prodotto specifici sforzi
produttivi, con investimenti economici, per renderlo pi sicuro.
Le Direttive comunitarie, elaborate come detto agli inizi degli anni 90 e recepite in differenti
momenti dai singoli paesi, hanno introdotto il principio dell'
autocontrollo come strumento
innovativo, finalizzato a garantire la qualit igienico-sanitaria attraverso una attivit di controllo
"preventivo", trasferendo al produttore la responsabilit del controllo della sicurezza dei prodotti.
Ci avviene applicando un sistema di controllo basato su misure atte a prevenire i possibili rischi
(QA-Quality Assurance),
attraverso una scrupolosa applicazione delle buone norme di
fabbricazione (GMP-Good Manufacturing Practices) ed un costante e rigoroso monitoraggio di
punti chiave del processo di produzione (HACCP- Hazard Analysis Critical Control Point).
Nel suo insieme il sistema prevede che, in base allanalisi dei possibili pericoli e della probabilit
che questi si traducano in rischio in un particolare prodotto, si stabiliscono delle procedure di
produzione codificate (GMP codificate in manuali di produzione) e dei precisi e validati sistemi di
controllo dei punti critici (HACCP) e delle procedure che devono intervenire in presenza di
anomalie. Si tratta di evitare le improvvisazioni e di studiare procedure stabilite e rigorose che
devono intervenire in caso di eventi negativi occasionali. Questo sistema di controllo impone
rispetto al passato una modificazione del modo di valutare ed ottenere la qualit igienica di un
prodotto e, conseguentemente, anche costi e strutture aziendali differenti (Tab.1.10).
Il produttore assume un ruolo centrale e diventa figura attiva non solo nel produrre e
commercializzare, ma anche nel valutare i pericoli e i conseguenti rischi relativi alla produzione e
nella loro gestione. Questo aspetto modifica sostanzialmente il ruolo delle aziende alimentari nel
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garantire la salute pubblica; si tratta di unimpegno continuativo per ridurre la quantit di rischio
associata al proprio prodotto.
Ovviamente, anche se ha comportato una modificazione epocale del controllo della salubrit degli
alimenti ed ha certamente diminuito nel suo complesso il rischio igienico associato
allalimentazione, limpiego dellautocontrollo non ha risolto di per s tutte le problematiche
delligiene in produzione. Differenti sono i problemi che restano aperti:
come gi discusso sia oggi che in prospettiva futura osserveremo una continua
modificazione dei pericoli e dei rischi legata ad eventi che attengono, come detto, a
modificati comportamenti sia dei microrganismi che degli uomini;
lautocontrollo e il sistema HACCP non sono obbligatori a livello di produzione della
materia prima;
lefficacia dellautocontrollo termina alla fine della produzione aziendale; la gestione delle
problematiche che attengono alla preservazione della salubrit dei prodotti dopo
labbandono della struttura produttiva, nel corso del trasporto, conservazione e
commercializzazione necessitano di attenzione e controlli aggiuntivi;
la gestione dei prodotti nelle case dei consumatori spesso completamente al di fuori del
controllabile; questo aspetto comporta modificazioni del rischio associato al consumo di
un prodotto significative e probabilmente rappresentano uno dei momenti di maggiore
fragilit di tutto il sistema di garanzia della sicurezza alimentare;
il rischio che la messa a punto di protocolli di comportamento codificati e di procedure
precise di intervento comporti, almeno a livello irrazionale, una deresponsabilizzazione di
chi produce, che si sente tranquillo almeno dal punto di vista formale;
unoperazione sotto controllo solo quando il pericolo eliminato o ridotto ad un livello
accettabile, compatibilmente con le possibilit tecniche e la fattibilit economica di
processo. Il sistema HACCP a tutt'
oggi applicato generalmente in modo qualitativo
mentre per unappropriata gestione del rischio invece necessaria una determinazione
quantitativa del pericolo associata al consumo dellalimento;
per ottenere la determinazione quantitativa del rischio sarebbe necessario incorporare
nellHACCP elementi di analisi quantitativa del rischio.
Indipendentemente da queste considerazioni il sistema di garanzia della sicurezza alimentare
legato allautocontrollo risulta quello maggiormente idoneo a confrontarsi con le problematiche
collegate alla globalizzazione della produzione e del commercio di alimenti e, probabilmente,
deve essere considerato un punto di partenza per levoluzione di strategie di valutazione e
controllo del rischio sempre pi efficaci.
Uno strumento: lanalisi dei rischi
A fronte delle nuove emergenze si stanno affermando nuove tecniche, da applicare a livello
aziendale, per la valutazione e la diminuzione del rischio associato alla produzione di alimenti; si
tratta ancora in molti casi di filosofie di approccio non ancora applicabili compiutamente ma che
indicano una strada da seguire per ottenere labbattimento del rischio.
L'
analisi dei rischi (Risk Analysis - RA) definibile come un approccio strutturato per definire il
rischio e conseguentemente prendere decisioni funzionali alla sua diminuzione. La RA un sistema
che comprende la raccolta di informazioni sui pericoli potenziali, lelaborazione di modelli
descrittivi e la loro validazione, lelaborazione di protocolli per mitigare o ridurre rischi ed
incertezze e la definizione di azioni e procedure opportune a mantenere i rischi sotto controllo.
Questo sistema include la valutazione (Risk Assessment), la gestione (Risk Management) e la
diffusione dell'
informazione (Risk Communication).
Si deve ricordare che ad eventuali eventi negativi sulla linea di produzione e commercializzazione
di un alimento pu corrispondere un danno di differente entit. La concretizzazione di uno
specifico pericolo in un rischio reale avviene in relazione ad errori di gestione del prodotto e pu
70

comportare differenti conseguenze, non tutte di paragonabile entit. E evidente, ad esempio, la
differenza che intercorre tra un semplice mal di pancia che si risolve in poco tempo e , al
contrario, lesito letale di alcune tossinfezioni alimentari; la gravit del danno differente e il
rischio che levento negativo accada comporta tolleranza diversificata.
Lentit del rischio connesso ad uno specifico pericolo deve essere, perci, valutata non solo in
funzione della probabilit che levento negativo si traduca in un danno per la salute del consumatore
ma anche in relazione alla gravit di tale danno.
La garanzia della sicurezza assoluta nella filiera alimentare, anche se rimane lo scopo al quale
tendere, deve realisticamente confrontarsi con una serie di fattori biologici e tecnologici che si
intersecano in differente modo, in relazione al tipo di pericolo (agente patogeno), alle
caratteristiche del prodotto, alle modalit di produzione, alla gestione a valle del processo
produttivo ed alle abitudini ed alla sensibilit del consumatore. Linsieme di questi fattori, che non
sono facilmente controllabili, condiziona il rischio associato ad un potenziale pericolo .
La valutazione del rischio (Risk Assessment) la misura dei rischi la valutazione di fattori che li
influenzano. La valutazione del rischio comprende quindi sia aspetti qualitativi che quantitativi e
include:
(a) l'
identificazione (hazard identification) del pericolo che pu essere causa di un
evento negativo per la salute umana e che costituisce parte integrante e preliminare
della effettiva valutazione del rischio che questo pericolo rappresenta. Comprende
la frequenza del danno e la valutazione della sua severit per il consumatore; si tratta
di uninsieme di informazioni epidemiologiche e di studi di esperti in merito alla
possibile presenza in un alimento di pericoli;
(b) la determinazione dellentit del pericolo nellalimento al momento del consumo
(exposure assessment), determina la frequenza della contaminazione e leventuale
numero di microrganismi o la quantit di sostanze tossiche presenti nellalimento;
(c) la valutazione del rapporto dose/risposta (dose/response assessment) finalizzata a
mettere in relazione gli aspetti quali-quantitativi del pericolo (numero, virulenza,
patogenicit, durata della malattia) con la sensibilit dellorganismo umano. Questa
parte della risk assessment fornisce informazioni in relazione tra il numero di
patogeni consumati e probabilit di infezione, malattia o morte ed quindi
finalizzato alla definizione di criteri microbiologici di controllo;
(d) la stima della probabilit e della gravit di questo evento (risk characterization) che
pu risentire dell'
imprecisione o incertezza dei dati usati per valutare il rischio
stesso. In pratica, una volta definito un pericolo, lazienda produttrice deve valutare
se questo possa essere presente nella materia prima (contaminazione primaria), possa
sopravvivere ai trattamenti tecnologici di trasformazione, sia in grado di accrescersi
nel prodotto, possa ricontaminare il prodotto e colonizzarlo (contaminazione
secondaria) prima del consumo, possa accrescere in relazione alle modalit di
commercializzazione, conservazione e utilizzo domestico da parte del consumatore.
La risk characterization include la descrizione delle incertezze di natura statistica o
biologiche che caratterizzano le differenti fasi della risk analysis.
Uno strumento utile per la valutazione-gestione (Risk Assessment) quantitativa del rischio pu
essere la microbiologia predittiva, una disciplina che si pone il compito di prevedere il
comportamento dei microrganismi in relazione a variazioni delle condizioni ambientali.
Il primo approccio a questo strumento di interpretazione del modo microbico pu essere collegato
allo sviluppo allinizio del secolo scorso di metodi matematici per calcolare la retta di mortalit dei
microrganismi a differenti temperature. Da allora sono stati sviluppati differenti tipi di modelli
predittivi dello sviluppo batterico in differenti condizioni che possono essere utili nellambito
dellanalisi dei rischi.
La microbiologia predittiva si basa sullo sviluppo di modelli matematici che tengono conto
dell'
effetto di diversi fattori intrinseci (aw, pH, Eh, additivi) ed estrinseci (tempi e temperature di
71

trattamento e di conservazione, atmosfera di conservazione) sulla crescita, o sul tempo necessario
per raggiungere una determinata carica microbica o la produzione di metaboliti. Questi modelli
dovrebbero tenere conto anche dei fattori impliciti legati alla presenza della microflora saprofita di
molti alimenti che a seguito di fenomeni di antagonismo o sinergismo possono modificare il
comportamento anche dei batteri potenzialmente pericolosi. Le diverse applicazioni di questo
approccio sono quindi finalizzate a conoscere
preventivamente l'
evoluzione della qualit
microbiologica di un alimento, e perci dello stato di salubrit, nelle diverse fasi del processo di
produzione e nelle diverse condizioni di conservazione, per permettere di adottare le decisioni
necessarie per garantire la salute del consumatore.
I modelli matematici utilizzati in microbiologia predittiva sono elaborati in base ad analisi
statistiche di dati disponibili in letteratura o ottenuti da studi sperimentali opportunamente
pianificati; la loro validazione effettuata confrontando i risultati teorici con quelli reali ottenuti
con saggi di contaminazione controllata (challenge test) o con impiego di prodotti naturalmente
contaminati. La validazione dei modelli predittivi lelemento decisivo nel definirne lutilit
applicativa e non la semplice validit teorica. A tale fine devono essere condotte prove sperimentali
con inoculi di batteri patogeni negli alimenti e studio della pertinenza in relazione a differenti
condizioni di conservazione o in relazione alla biodiversit della specie allo studio. Si pu
ragionevolmente ritenere che la biodiversit batterica, intesa come variabilit delle caratteristiche di
individui appartenenti alla stessa specie, sia uno dei fenomeni che maggiormente interferiscono con
la validit dei modelli che si prefiggono di descrivere il comportamento dei microrganismi in
sistemi complessi come gli alimenti.
La microbiologia predittiva dovrebbe consentire quindi di avere in tempi rapidi informazioni
importanti per:
- ottimizzare i parametri di processo e le procedure di controllo;
- definire la durata del periodo di conservabilit di un alimento al fine della valutazione del
rischio igienico e in funzione dei parametri di conservazione;
- studiare le conseguenze di modificazioni della composizione di un alimento nella formulazione di
nuovi prodotti;
- permettere un approccio sistematico e quantitativo all'
analisi dei pericoli e al controllo dei punti
critici nell'
ambito del sistema HACCP.
La gestione del rischio (Risk management) la fase che comprende l'
individuazione, la selezione
e l'
implementazione di misure atte a permettere il controllo, eliminando o riducendo il rischio.
Banalizzando, questa fase di lavoro pu essere ridotta al fare le scelte produttive migliori per ridurre
il rischio, in base alle informazioni disponibili sul rischio stesso; ovviamente tutto ci comporta la
valutazione della fattibilit tecnologica delle soluzioni e dei rispettivi costi.
La comunicazione la parte che, attraverso lo scambio e l'
acquisizione di informazioni e
conoscenze sia allinterno che allesterno dellazienda, permette di meglio comprendere i rischi e le
modalit della loro gestione. Si tratta di uno scambio interattivo di informazioni relative alla
valutazione e gestione del rischio tra i differenti operatori e fruitori della catena di produzione e
commercializzazione (produttori, consumatori, ispettori). Laspetto informazione-formazione
rimane uno strumento essenziale per favorire un consumo cosciente ed una corretta gestione del
prodotto in fabbrica, sulla linea di commercializzazione e nelle case dei consumatori.
Recenti studi (Risk Assessment-Risk Management) basati sullelaborazione statistica di dati relativi
alla presenza residuale di microrganismi in grado di produrre tossine nel latte pastorizzato e alle
abitudini di consumo dei consumatori in Olanda hanno posto in evidenza come sia possibile
definire, in base alla conoscenza della qualit igienica del prodotto, il rischio connesso a
conservazioni prolungate a temperature non idonee. Allo stesso modo stato possibile definire quali
debbano essere i tempi e le condizioni di refrigerazione necessarie per abbattere il rischio e quindi
comunicarle ai consumatori (Risk Communication).
La RA deve evolvere come approccio di sistemi integrati per il controllo e la prevenzione e,
indipendentemente dai limiti che oggi possono essere riconosciuti, resta comunque una strada da
72

percorrere al fine di una pi consapevole gestione dei rischi associati alla produzione di alimenti e
probabilmente bisogner aspettare alcuni anni per misurarne il successo.
Una adeguata gestione dei rischi pu essere effettuata nell'
ambito del sistema di controllo HACCP.
In pratica, affrontare il sistema HACCP secondo i principi della RA significa introdurre una
valutazione quantitativa nell'
analisi dei pericoli (Hazard Analysis) e nella determinazione
dei punti critici di controllo (Critical Control Points). In particolare a livello dei CCP deve
essere quantificato il grado di eliminazione o riduzione dei pericoli individuati in modo da poter
stabilire dei criteri di riferimento che, in condizioni di ottimale applicazione delle GMP, permettano
di assicurare una costanza dei requisiti di salubrit del prodotto finito.
Come definito in precedenza inevitabile che il sistema di produzione degli alimenti risulti
vulnerabile in relazione alla comparsa di rischio igienico per il consumatore. Questo perch i livelli
di sicurezza raggiungibili devono essere compatibili sia col mantenimento delle caratteristiche
organolettiche e nutrizionali che identificano il prodotto, sia con i costi commerciali del prodotto
stesso. Si tratta, da parte degli operatori della filiera alimentare, di assimilare che il lavoro e le
risorse da destinare alla diminuzione del rischio non sono un una tantum, ma una strategia
continuativa.
Il consumatore rimane, deve divenire, una figura centrale della gestione della sicurezza alimentare.
Coinvolgere il consumatore nella gestione dei problemi che competono alla sua salute favorisce la
sua educazione alimentare e stimola quindi un consumo responsabile. Informare il consumatore
significa permettergli di gestire nel modo pi opportuno i differenti alimenti e quindi farlo diventare
parte attiva della riduzione del rischio alimentare. Questo difficile compito non pu essere
demandato solo alle aziende produttrici ma, in particolare per ci che concerne la formazione, deve
vedere in primo piano il coinvolgimento di strutture pubbliche specializzate.
Una corretta e completa informazione del consumatore riduce la vulnerabilit del sistema di
prevenzione del rischio alimentare. Questultimo aspetto centrale nella nuova filosofia di
approccio al rischio igienico sanitario. Rendere edotto il consumatore, permettergli di scegliere
coscientemente, favorisce nel lungo periodo linstaurarsi di un proficuo rapporto tra chi produce e
chi consuma ed equivale ad incentivare il consumo consapevole dei differenti prodotti.
Le modalit sul come informare ed istruire il consumatore senza generare allarmismi ingiustificati o
incontrollati rappresenta, a nostro avviso, un obbiettivo ed una sfida col quale dovranno essere
chiamati al confronto esperti di differenti discipline sia tecniche che sociali e che deve veder
coinvolti le strutture pubbliche deputate allispezione e alla repressione, i tecnologi alimentari, i
medici e gli educatori scolastici.
Tabelle e Figure
Tabella 1.1.
Effetti delle modificazioni ambientali sullo sviluppo batterico (Guerzoni e
Manfreda, 2001; Montville e Matthews, 2001)
FATTORI
ESTERNI
EFFETTO PRINCIPALE SULLE

CELLULE
Abbassamento
della temperatura
rispetto
alloptimum
cellulare.
Riduzione dellattivit metabolica e della

velocit di crescita
Modificazione dello stato fisico delle
membrane e conseguente riduzione del
trasporto e dellattivit enzimatica
MECCANISMO DI
OMEOSTASI INDOTTA
(reazione cellulare con
consumo di energia)
Modulazione della
composizione degli acidi grassi
di membrana al fine di
mantenere la fluidit delle
membrane.
Aumentata sintesi enzimatica
per compensare la ridotta
73
Abbassamento
dellaw ambiente
Perdita di acqua citoplasmatica per

osmosi
Riduzione dellattivit enzimatica e
quindi del metabolismo cellulare
Collasso e plasmolisi della membrana
citoplasmatica .
Acidi dissociati
Aumento concentrazione H+
citoplasmatica e incremento attivit
trasporto allesterno
Modificazioni attivit e stabilit enzimi
Abbassamento del intracellulari
pH ambiente
Denaturazione strutture trans membrana
indotto o da
deputate al trasporto H+ allesterno
fermentazione o da cellula e conseguente abbassamento del
aggiunta diretta
pH intracellulare per permeazione di H+
acidi
nel citoplasma
Acidi deboli
Abbassamento del pH intracellulare per
diffusione acido indissociato e successiva
dissociazione per effetto del pi elevato
pH intracellulare
attivit metabolica.
Trasporto attivo selettivo per
mantenere condizioni
citoplasmatiche differenziate
rispetto esterno
Biosintesi di soluti idonei al
mantenimento di turgore
cellulare
Espulsione di protoni con

consumo di energia per
mantenere costante il pH
cellulare.
Aumentata ATPasi
Aumentata biosintesi di
aminofosfolipidi che
impartando una carica positiva
alla superficie estena agiscono
come barriera ai protoni.
74

Tabella 1.2 : Processi fermentativi
Principali fermentazioni
Fermentazioni
fermentazione alcolica
fermentazione omolattica
fermentazione eterolattica
fermentazione acido mista
prodotti principali
alcool etilico + co2
Ac. lattico
Ac. lattico, ac. acetico o etanolo + co2
Ac. lattico, ac. formico o 2,3, butilen glicole
fermentazione butirrica
Ac. butirrico, CO2 , H2
fermentazione propionica
Ac. propionico, ac. acetico, CO2
(o 2,3 butilen glicole)

(o aceton butilica)
Tabella 1.3: Degradazione degli aminoacidi
Processi biochimici a carico degli aminoacidi

Reazione biochimica
deamminazione ossidativi
deamminazione idrolitica
deamminazione riduttiva
deamminazione con desaturazione
ossidoriduzione tra 2 aminoacidi
decarbossilazione
deamminazione idrolitica + decarbossilazione
deamminazione riduttiva + decarbossilazione
deamminazione ossidativa + decarbossilazione
Prodotti principali
chetoacidi + ammoniaca
idrossiacidi + ammoniaca
ac. grassi saturi + ammoniaca
ac. grassi insaturi + ammoniaca
chetoacidi + ac.grassi + ammoniaca
ammine + CO2
alcoli primari + ammoniaca + CO2
idrocarburi + ammoniaca + CO2
ac. grassi + ammoniaca + CO2
75
Tabella 1.4 .
Effetti di alcuni trattamenti tecnologici sullo sviluppo batterico
FATTORI IMPIEGATI PER

RIDURRE PRESENZA
CELLULALE BATTERICHE
EFFETTO PRINCIPALE
SULLA CELLULA
MECCANISMO DI
OMEOSTASI INDOTTA
Trattamento termico
Danni al DNA, danni alla

membrana e alle proteine di
trasporto, inattivazione di
enzimi
Induzione dei meccanismi di

riparo del DNA, sintesi heat
shock protein con
conseguente maggiore
resistenza ai successivi
trattamenti e a cotture
prolungate a temperature
relativamente basse.
Radiazioni ionizzanti
Danni al DNA indotti dalla

generazione di radicali o ioni.
Danni alla membrana
fosfolipidica
Induzione dei meccanismi di

riparo del DNA.
Danno ossidativo da ozono, H2O2,

o conseguente ad altri stress
Formazione di radicali
ossigeno e loro reazione con
molecole e macromolecole
cellulari
Heat shock protein

Attivazione lipoxygenasi,
epossidasi, catalasi e
superossido dismutasi
76
Tabella 1.6 principali tecniche di caratterizzazione molecolare

Risoluzione
tassonomica
Applicazioni
genere, specie
genere, specie
genere, (sub)specie
filogenesi, tassonomia
filogenesi, tassonomia
tassonomia,
genere, (sub)specie
filogenesi, tassonomia,
genere, (sub)specie
specie, ceppo
genere, specie
tassonomia
tassonomia
tassonomia
ceppo
specie, ceppo, varianti
isogeniche
dinamiche di popolazione
dinamiche di popolazione,
studio ecosistemi,
rintracciabilit (es.
ceppi brevettati, OGM)
tassonomia, ecologia
microbica
A. Identificazione
Metodi genotipici
- sequenziamento del DNA
- composizione in basi (%G+C)
- ibridazione DNA-DNA (sonde,
ribotyping)
- metodi PCR (ARDRA, rRNA spacer
polymorphism)
Metodi fenotipici
- fenotipo (classico, API, Biolog)
- proteine totali/parete
- acidi grassi cellulari
B. Typing
Metodi genotipici
- profilo plasmidico
- analisi RAPD-PCR
polimorfismo di restrizione
(classico; elettroforesi in campo
pulsato o PFGE)
AFLP (amplified fragment
length polymorphism)
sequenziamento del DNA
specie, ceppo
specie, ceppo
specie, ceppo
Metodi fenotipici
- antibiogramma
specie, ceppo
specie, ceppo
specie, ceppo
SDS-PAGE proteine totali/parete

tipizzazione biochimica
tassonomia, studio
ecosistemi
tassonomia, filogenesi,
ecologia microbica
tassonomia,
epidemiologia
tassonomia, database
caratterizzazione
tecnologica
77
Tabella 1.7 Cassificazione dei batteri lattici secondo Orla Jensen e successive elaborazioni in
base a morfologia, fisiologia e metabolismo
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78
1.Identifica i rischi che possono essere prevenuti, eliminati o ridotti a livello

accettabile
2.Identifica i punti critici di controllo nelle fasi in cui il controllo essenziale per
prevenire, eliminare o ridurre il rischio
3.Definisce i limiti critici (o valori soglia) riferiti ai punti critici di controllo che
separano laccettabilit dalla non accettabilit per la prevenzione, eliminazione o
riduzione del rischio a livello accettabile
4.Definisce le procedure di monitoraggio da realizzarsi ai punti critici
5.Definisce le azioni correttive
Perch lHACCP sia efficace devono inoltre essere stabilite le procedure per la verifica che le
misure elencate siano funzionanti
79
80

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