1/10/2020

La biologia molecolare è lo studio a livello molecolare di tutti i sistemi viventi. Inizialmente si erano
sviluppate due aree di ricerca:

1) La biochimica
2) La genetica

Queste sono le due materie più affini alla biologia molecolare. Queste due aree di ricerca sono oggi
collegate dalla biologia molecolare, ma inizialmente le due aree erano completamente separate tra di loro
ed erano due aree non solo scientificamente, ma anche culturalmente diverse.

In questa tabella a sinistra vediamo le grandi scoperte della genetica prima della nascita della biologia
molecolare, che la facciamo nascere intorno al 1953 quando Watson e Crick scoprono la struttura
tridimensionale del DNA, ma già la biologia molecolare aveva cominciato a porre le sue basi con gli studi
della scoperta che il DNA era il materiale genetico.

Ad esempio, nel 1865 si scoprì che i geni sono dei fattori particolari tramite gli studi genetici; nel 1900 che i
cromosomi sono unità ereditarie grazie agli studi di Mendel; nel 1910 che i geni sono localizzati nei
cromosomi e nel 1930 si vide che le mutazioni sono cambiamenti fisici nei geni. Ma ancora non si sapeva
chi erano i geni e chi portava l’informazione genetica, si pensava che fossero le proteine perché avevano un
grado talmente complesso che si pensava che solo una cosa così complessa può portare l’informazione
genetica.

Mentre, invece, i biochimici nel 1879 avevano scoperto il DNA, ma non l’avevano collegato al fatto che
potesse essere la molecola che portava l’informazione genetica, per cui anche nel 1910 fecero delle analisi
chimiche e degli studi biochimici del DNA.

Queste due aree, quindi la genetica e la biochimica, erano separate tra di loro per 3 motivi:

1) Mentre la biochimica era legata ad un filone medico-fisiologico, cioè volevano capire come funzionava
ad esempio il fegato, quindi prendevano un fegato, lo sminuzzavano, separavano i vari composti e
cercavano di capire, tramite l’analisi di ciascun composto, come potesse funzionare tutto l’insieme.
Quindi erano orientati più ad un settore biomedico, fisiologico. La genetica, invece, era nata per
un’altra esigenza ovvero per una questione agroalimentare. La genetica serviva per migliorare gli
incroci fra gli animali o migliorare gli incroci fra le piante per avere una maggiore produzione o una
maggiore resa degli allevamenti. Quindi, la genetica non era collegata allo studio biomedico.
2) La biochimica e la genetica utilizzavano metodi scientifici diversi perché mentre la biochimica usava un
metodo riduzionistico, cioè tendeva a prendere un organo e subito sminuzzarlo, separare i vari
componenti e cercare di capire come i vari componenti funzionavano da soli per poter capire come poi
avrebbe funzionato quel tessuto o quell’organo; la genetica usava un sistema olistico, cioè andavano ad
esaminare l’organismo in toto per cercare di capire qual era il funzionamento che stava al di sotto
 dell’intero organismo, ad esempio studiavano la morfologia dei piselli (lisci, rugosi, gialli o verdi) per
capire come i caratteri ereditari venivano trasmessi. Quindi non c’era ancora il collegamento che i
caratteri ereditari si trovassero sul DNA, che il DNA era il materiale genetico.
3) Inoltre, usavano sistemi biologici diversi: in genetica usavano il pisello, altri tipi di piante; la biochimica
usava organi come il fegato.

Erano, quindi, campi separati. La biologia molecolare è sorta unendo le due branche della scienza perché la
grande scoperta della biologia molecolare è stata quella di scoprire che il DNA porta l’informazione
genetica, cioè i geni sono portati dal DNA. Il DNA è stato scoperto nel 1879 siamo arrivati al 1944 prima di
capire che il DNA era il portatore dell’informazione genetica.

Come mai c’è voluto così tanto tempo? il DNA è una catena polinucleotidica, cioè formata da una serie di
nucleotidi tutti in fila l’uno all’altro legati da un legame fosfodiesterico. Questi nucleotidi portano 4 diversi
tipi di basi: adenina, guanina, citosina e la timina. Il DNA è una molecola che se si estrae da un tessuto può
essere degradata perché nel tessuto ci sono degli enzimi che possono degradare il DNA, per cui se non si
usano degli inibitori per quegli enzimi il DNA si degrada. Degradandosi il DNA si ottengono piccole
molecole. Il DNA fu scoperto da Miescher che lo scoprì dai globuli bianchi, estrasse una sostanza bianca che
lui chiamò nucleina e questa era una sostanza a basso peso molecolare perché i metodi di estrazione del
DNA di quel tempo non impedivano al DNA di essere degradato per cui veniva degradato in frammenti di ca
il peso di 1000 kDa che corrisponde a quattro nucleotidi. Per cui, essendo 4 le basi, tutti gli scienziati di quel
tempo pensavano che il DNA fosse una molecola costituita da 4 nucleotidi e che questa fosse la struttura
originale del DNA:

Naturalmente una molecola così piccola non può portare l’informazione genetica e quindi il DNA non venne
preso in considerazione.

Dalla scoperta del DNA si cominciò a misurarne il

peso molecolare: vediamo che il peso molecolare
prima del 1890 fino al 1910 erano una molecola
di ca 1000 Da, quindi una molecola piccola che
corrispondeva benissimo al tetranucleotide, che
si pensava fosse la struttura reale del DNA. Col
passare degli anni dal 1930 al 1970 vediamo che
la misurazione delle molecole di DNA aumenta
enormemente, cioè già nel 1950 abbiamo che una molecola di DNA è intorno a 10^7 KDa. Vediamo come
col progredire delle tecniche di purificazione del DNA migliora anche la stabilità del DNA stesso, quindi si
nota che il DNA è una molecola ad alto peso molecolare. Questo sarà uno dei passi fondamentali per capire
la struttura tridimensionale del DNA.

Qual è stato l’esperimento che ha permesso di capire che il DNA ha il ruolo come portatore
dell’informazione genetica, cioè che il DNA è il materiale genetico?

Fu fatto questo esperimento da Griffith, ma fu fatto nel 1928 dove ancora culturalmente non si poteva
accettare che il DNA fosse il portatore del materiale genetico. Questo esperimento permise di indirizzare
esperimenti successivi che portarono alla vera scoperta del DNA come materiale genetico. Questo
esperimento fu basilare, non se ne capì bene il significato, ma permise esperimenti futuri che portarono alla
scoperta del DNA.

In che cosa consisteva questo esperimento?

A quei tempi Griffith studiava un vaccino contro la polmonite portata da un batterio. Questo batterio, lo
streptococcus pneumoniae, aveva due caratteristiche:

1) Ceppo rugoso
2) Ceppo liscio

Questa è una coltura batterica su una piastra di Agar: all’esame miscroscopico si vede che le cellule rugose
formano delle colonie più piccole rispetto alle colonie lisce questo perché i batteri, che sono del ceppo
rugoso, non posseggono una capsula polisaccaridica. Questa capsula polisaccaridica previene il
riconoscimento da parte del sistema immunitario del topolino.
Per cui se noi iniettiamo in un topolino i batteri del ceppo liscio, il topolino si prende la polmonite e muore;
se, invece, iniettiamo nei topi il
batterio del ceppo rugoso il topolino
non muore, non prende la polmonite
perché il suo sistema immunitario
attacca i batteri e li sconfigge. Ma,
cosa succede se noi prendiamo i
batteri del ceppo liscio, li uccidiamo
con il calore, poi prendiamo questi
batteri morti e li mescoliamo con
quelli del ceppo rugoso, li iniettiamo
nei topolini e quest’ultimo prendono
la polmonite e muoiono, ma come?
Quelli lisci erano morti, quelli rugosi
non causano la polmonite come mai il
topolino muore di polmonite? Griffith
prese il sangue dei topolini morti e
vide che i batteri erano del ceppo
liscio. Cosa aveva trasformato questi
batteri da rugosi a lisci? Non si
sapeva, venne chiamato “principio
trasformante”.

Solo, in seguito, si scoprì che questo principio trasformante era il DNA. Questo lo scoprì Oscar T. Avery, il
suo esperimento venne chiamato la “bomba di Avery” perché fu un esperimento base per capire che il
DNA è il materiale genetico, cioè il DNA porta i geni. Purtroppo, quando Avery fece questa scoperta i tempi
erano ancora prematuri e prima che venne giudicata una scoperta fondamentale per il campo scientifico
mondiale e per la biologia molecolare passarono diversi anni.

Avery sfruttando lo stesso streptococcus pneumoniae di Griffith fece degli esperimenti senza iniettarlo nei
topi perché lui guardava semplicemente sulle piastre di Agar se i batteri che ne uscivano erano lisci o rugosi.
Avery prese i batteri lisci, li coltivò, raccolse i batteri e cominciò a separare le varie frazioni. In realtà,
l’esperimento iniziale non fu proprio così, prese gli estratti di questi batteri e li trattò con vari inibitori delle
proteasi, con delle DNAasi, RNAasi. Lui analizzò:

- DNA
- RNA
- Lipidi
- Proteine
- Polisaccaridi
In seguito, ripeté l’esperimento purificando i vari
composti, cioè purificando le proteine, l’RNA, DNA,
lipidi e polisaccaridi.

Ma il concetto base qual era? È che se mischiava

dei batteri rugosi con le proteine i batteri
rimanevano rugosi; se mischiava i batteri rugosi con
l’RNA i batteri rimanevano rugosi; se li mischiava
con i lipidi e i polisaccaridi rimanevano sempre
rugosi; ma se li mischiava con il DNA diventavano
lisci, questo voleva dire che il DNA era la molecola
che portava l’informazione genetica.

Tuttavia, i suoi esperimenti vennero fatti in un’epoca precoce, non c’era ancora l’idea che il DNA potesse
essere il portatore dell’informazione, e quindi si pensava che fossero le proteine a portare l’informazione
genetica proprio perché le proteine sono complesse, svolgono funzioni molto particolari. In realtà, la
scoperta di Avery non ebbe molto successo, lo ebbe un altro esperimento, ovvero “l’esperimento del
frullatore”. Questo esperimento del frullatore trasmise a tutta la comunità scientifica che il DNA era il
materiale genetico e questo esperimento è del 1952. Un anno prima che Watson e Crick scoprirono la
struttura tridimensionale del DNA e capirono come da un punto di vista molecolare viene portata
l’informazione genetica.

In che cosa consisteva questo esperimento del frullatore?

È un esperimento meno elegante rispetto a

quello fatto da Avery. Questo esperimento
fu fatto da due scienziati, una donna e un
uomo, Martha Chase e Alfred Hershey, e
questi due utilizzarono il sistema del
batteriofago. I batteriofagi sono dei virus
che infettano i batteri. Come li infettano?
Noi oggi sappiamo che il virus si pone sulla
parete del batterio e introduce il suo
materiale genetico all’interno della cellula
batterica, qui il materiale genetico viene
replicato, si formano nuove particelle virali
che portano alla lisi del batterio e alla fuoriuscita di nuove particelle virali che possono infettare altri batteri.
Qual era la molecola che portava l’informazione genetica? Fecero l’esperimento di marcare con due isotopi
radioattivi diversi le proteine e il DNA. Dimostrarono così che era il DNA perché marcarono il DNA con il
fosforo radioattivo, mentre marcarono le proteine del capside dei fagi con lo zolfo 35 per cui potevano
separare i due tipi di radiazioni diverse. Questi fagi marcati, quelli con il 32P e quelli con lo 35S vennero messi
a contatto con i batteri, questi infettarono i batteri e i ricercatori, poiché il capside rimane esterno,
frullarono i vari batteri staccando tutte le particelle che rimangono nella parte esterna del batterio in modo
tale che non ci fossero equivoci sul fatto che quello che rimaneva ed era radioattivo all’interno del batterio
fosse la vera molecola che portava l’informazione genetica. Dopo aver frullato i due batteri infettati con i
due diversi tipi di marcatori videro che mentre che i batteri, che erano stati infettati con i fagi che avevano il
capside marcato con 35S non presentavano nessun tipo di radiazione, non erano radioattivi perché il
capside era rimasto eternamente, il frullatore lo aveva allontanato, erano stati raccolti solo i batteri e questi
nono erano radioattivi; mentre, invece, erano stati frullati, erano stati allontanati i capsidi dalla parete del
batterio e i batteri risultavano marcati, radioattivi, quindi vuol dire che il DNA era entrato, questo vuol dire
che era il DNA a trasportare l’informazione. Questa fu la prova definitiva che il DNA è il materiale genetico.

Nel 1952 comincia a nascere la biologia molecolare, ma avrà la consacrazione con due scoperte
fondamentali:

- 1953 il DNA ha una struttura a doppia elica

- 1959 il DNA si replica in modo semiconservativo.

Permisero alla biologia molecolare di unire quelle branche che fino ad allora erano state separate: la
biochimica e la genetica. Quindi la biologia molecolare inizialmente ha questo grande scopo: quello di unire
due branche scientifiche e di unificarle nella ricerca e nel cambiare il nostro modo di vedere la scienza.

Qual è il dogma centrale della biologia molecolare? È che il DNA è la molecola che porta l’informazione
genetica. Quest’informazione genetica viene trasmessa ad un’altra molecola che è la molecola di RNA,
questo processo prende il nome di trascrizione. Una volta trascritta l’informazione dal DNA al RNA, l’RNA
subisce una lettura da parte di un complesso costituito principalmente da RNA e proteine e che sono i
ribosomi. Per cui l’RNA messaggero viene letto dai ribosomi e questo meccanismo si chiama traduzione,
cioè l’informazione genetica viene tradotta nelle proteine con un codice di lettura a triplette, cioè ogni tre
nucleotidi corrisponde un’aa delle proteine. Le proteine saranno, poi, quelle che determineranno il
fenotipo dell’organismo, cioè se una proteina viene espressa o non viene espressa può determinare un
cambiamento del fenotipo, se svolge una funzione o un’altra.

QUINDI: il dogma centrale della biologia molecolare è che il DNA porta l’informazione genetica, viene
trasmessa tramite la trascrizione all’RNA il quale viene tradotto in proteine tramite la traduzione mediata
dai ribosomi e da altre molecole e questa traduzione di proteine viene fatta tramite la lettura di un codice a
triplette che porta alla formazione delle proteine e degli aa che costituiscono le catene polipeptidiche.

Quello che è stato più importante subito dopo la scoperta del DNA come materiale genetico, è stato
scoprire come funziona il DNA. Per capire come funziona il DNA bisogna conoscerne la sua struttura
tridimensionale perché solo conoscendone la sua struttura tridimensionale si può capire come possa
funzionare. C’è stata una grandissima corsa da parte degli scienziati di quel tempo per cercare di capire
come era la struttura tridimensionale del DNA. Ci furono dei grossi centri di ricerca e tutti si dedicavano a
questo studio senza, però, riuscire a venirne a capo perché a quel tempo le proteine venivano studiate
mediante tecnica di diffrazione dei raggi X. Però, per studiare la diffrazione dei raggi X delle proteine
dovevano essere cristallizzate e per le proteine era abbastanza semplice, ma il DNA è una molecola
difficilmente cristallizzabile e quindi c’erano grosse difficoltà a studiarla con la diffrazione raggi X, quindi
molti fecero dei tentativi. Tuttavia, il DNA non cristallizza in
maniera vera e propria, ma forma delle fibre che si possono
allineare fra di loro e sono abbastanza stabili. A quei tempi era
difficilissimo ottenere delle fibre omogenee di DNA per poterle
studiare con la diffrazione dei raggi X. Chi riuscì ad ottenere degli
ottimi cristalli? Fu una scienziata, ma lei non ebbe il coraggio di
mostrare quello che aveva scoperto. Crick quando vide
quest’immagine capì subito che si trattava di un’elica, capì che il
DNA aveva una struttura a forma di elica dalla regolarità della
diffrazione a raggi X. Insieme a Watson cominciarono a costruire
dei modelli artificiali per riprodurre quello che avveniva
realmente nella natura. Prima che crick avesse quest’intuizione si sapevano alcune cose del DNA, cioè il
DNA veniva studiato. Ci fu uno scienziato che studiando il DNA di vari organismi si rese conto che non
avevano la stessa % di C e G o di A e T, cioè se prendevano individui della stessa specie questi avevano la
stessa identica concentrazione di C G, ma se prendevano individui di specie diverse il contenuto C G
variava, ma soprattutto si rese conto di una cosa fondamentale che permise di arrivare alla struttura
definitiva del DNA che oggi viene chiamata la regola di Chargaff. Questa regola dice che
indipendentemente dagli individui e dalle specie, la % di A è sempre uguale alla % di T e la % di G è
uguale alla % di C. Questo permise a Watson di avere la grande intuizione.

Mentre lui stava costruendo i suoi modelli di cartone non riusciva ad appaiare le basi e ad un certo punto si
rese conto che le A si appaiavano con le T e se appaiava le A con le T e appaiava le C con le G c’era la stessa
distanza e soprattutto si potevano infilare una sopra all’altra. Era per questo che l’elica aveva una struttura
regolare e non era distorta perché se invece l’appaiamento fosse stato casuale cioè A con C o A con G la
doppia elica avrebbe avuto un andamento distorto e non regolare come lo vedeva la Franklin e quindi si
rese conto che l’appaiamento A con T e C con G tornava con la regola di Chargraff. Inoltre, si rese conto che
queste basi potevano essere impilate all’infinito e formare delle molecole lunghissime di DNA. C’era stato in
precedenza qualche autore che aveva capito che il DNA era una struttura data da base zucchero-fosfato -
zucchero-fosfato con le basi che venivano estromesse dal nucleotide, ma questo scienziato aveva posto la
catena zucchero-fosfato all’interno, invece la grande intuizione di Watson e Crick fu quella di mettere la
catena zucchero-fosfato all’esterno, mentre le basi si affacciavano all’interno della molecola di DNA.

Questo è il modello originale costruito da Watson e crick alto ca 2 m

e questa fu pubblicata sulla rivista “nature” nell’aprile del 1953.

Per questo Watson e Crick ricevettero il premio Nobel per la

fisiologia e la medicina nel 1962 e un terzo del premio lo prese
Wilkins che dirigeva il laboratorio dove lavorava la Franklin.

Veniamo ora alla struttura del DNA:

Le basi azotate che compongono il DNA sono 4:

- Adenina
- Guanina
- Citosina
- Timina
- Uracile (RNA), sostituisce la timina. L’uracile è diverso dalla timina solo per metilico in pos 5.
L’altra grande differenza tra DNA e RNA è il fatto che sono si costituiti entrambi da un pentoso (zucchero 5
C; dato che la numerazione nel pentoso è come nelle basi, la numerazione negli zuccheri si differenzia con
la posizione di un “ ‘ “) ma in posizione 2’ nel RNA abbiamo un ossidrile, mentre nella posizione 2’ nel DNA
abbiamo un’H, quindi il DNA manca del gruppo -OH in posizione 2’ del pentoso. Questo rende il DNA una
molecola più stabile rispetto al RNA. Quindi RNA, possedendo il gruppo OH in posizione 2’ è una molecola
più reattiva rispetto al DNA, quindi è meno stabile.

Nel RNA abbiamo il ribosio, nel DNA abbiamo il

deossiribosio (indicato con la d).

Se noi abbiamo un pentoso legato ad una base in posizione 1’, cioè l’N è legato in posizione 1’ del pentoso
noi parliamo di nucleoside. Un nucleoside è dato dal legame fra una molecola di ribosio o deossiribosio
con una base azotata.

Il nucletide, invece, è quella molecola

che è costituita da un nucleoside più un
gruppo fosfato per cui il nucleotide è
costituito da gruppo fosfato-zucchero-base azotata.

Il nucleotide può presentare il gruppo fosfato sia in posizione 5’ sia in posizione 3’. Ma, la maggior parte dei
nucleotidi che si trovano presenti e che servono per la sintesi del DNA sono del tipo trifosfato, hanno 3
gruppi fosfato legati al C in posizione 5’ e questi 3 gruppi fosfato, a secondo della loro distanza dal sito di
legame, vengono chiamati α β γ, allontanandosi dal 5’.
ES *importante domanda compito*

dATP: è un nucleotide perché ha il fosforo; è un nucleotide che si trova nel DNA perché il ribosio con la d
intende che è deossiribosio e quindi è un nucleotide che fa parte del DNA.

Quindi dobbiamo scrivere così:

Disegno un petagono dove metto il gruppo -OH solo in posizione 3’, il 2’ lo lascio libero perché la formula di
struttura è un deossiribosio. Poi c’è l’adenina e come faccio? Noi sappiamo che le basi possono essere o
purine o pirimidine, le purine sono la A (adenina) e la G (guanina) che hanno il doppio anello aromatico,
mentre invece le pirimidine hanno un solo anello e sono la T (timina), la C (citosina) e la U (uracile). Quindi
devo disegnare un doppio anello eterociclico. Questo è un trifosfato e quindi devo fare tre gruppi fosfato.

Secondo esempio: UMP

Stiamo parlando di RNA, quindi in 2’ l’OH; la U è una pirimidina quindi disegno un esagono; M significa
mono fosfato e quindi ci andrà un solo gruppo fosfato. (Se ci sono due gruppi fosfato troviamo DP; 3 TP).

A seconda delle basi che hanno i nucleosidi prendono il nome di:

- Adenosina
- Guanosina
- Citidina
- Timidina
- Uridina

Quando invece viene legato un gruppo fosfato prendono il nome di:

- Acido adenilico
- Acido guanilico
- Acido citidilico
- Acido timidilico
- Acido uracilico
Dato che il fosfato conferisce acidità.

Come sono legati i vari nucleotidi tra di loro? I nucleotidi sono legati tramite un legame che viene chiamato
legame fosfodiesterico. Generalmente quando si forma un legame fosfodiesterico sono due nucleotidi che
vengono uniti e sono due nucleotidi trifosfato, ma il fosfato che rimane legato alla catena è il fosfato α, cioè
quello più vicino all’atomo di C. Perché gli altri due non vengono incorporati? Perché vengono liberati e
vengono degradati fornendo energia. Per cui quando noi esaminiamo una catena polinucleotidica, cioè una
catena di DNA, osserviamo che il fosfato presente nei vari legami fosfodiesterici è il fosfato α del
nucleotide. Ma la grande caratteristica del legame fosfodiesterico, che permette l’aggiunta infinita di
nucleotidi, è quella di dare una polarità alla molecola di DNA. La molecola di DNA è una molecola polare
perché ha una direzione, che noi chiameremo direzione 5’ 3’. Questo perché se osserviamo la molecola
l’unione avviene fra il gruppo OH in posizione 3’ e il C in posizione 5’; quindi il legame avviene fra questo
due atomi di carbonio 5’ 3’. Mentre nella parte centrale la molecola è indistinguibile non si capisce qual è
la direzione, in base alle estremità riusciamo a capire la sua polarità.
Perché è così importante la direzione in cui orientiamo la molecola di DNA?

Per convenzione quando scriviamo una molecola di DNA e mettiamo in fila i suoi nucleotidi scriviamo
semplicemente delle lettere:

*IL DNA SI SCRIVE SEMPRE IN DIREZIONE 5’3’* perché noi sappiamo che il DNA è una molecola a doppia
elica quindi come c’è un filamento 5’3’ ci sarà un filamento complementare che va in direzione 3’5’,
perché le due catene sono complementari e antiparallele.
5’
La vera molecola di DNA sarà questa: ATGCTTAAC 3’

(per regola le troviamo sempre scritte in direzione 5’3’ perché il filamento complementare lo dobbiamo
ricavare noi tramite l’appaiamento di basi)

Se io scrivessi una sequenza in direzione 3’ 5’ cambierei completamente la fase di lettura. Abbiamo visto
qual è il dogma della biologia molecolare cioè quello di trasformare le triplette in aa:

quindi se io prendo : 5’ ATGCTTAAC 3’ io ho che questa sequenza di 9 basi mi traduce per 3 aa perché sono 3
triplette che vengono lette e che mi traducono 3 aa. Ma se io scrivessi questa sequenza 3’5’ il ribosoma
leggerebbe dalla parte opposta e ovviamente leggendo dalla parte opposta gli aa sarebbero diversi. Per cui
dobbiamo sempre scrivere in direzione 5’ 3’.

Il DNA può essere scritto in vari modi:

- Schema a bastoncini: stiamo parlando di

RNA perché prima di tutto vediamo la
presenza di uracile e poi in posizione 2’
c’è l’OH. La direzione è 5’3’ quindi
leggerò AUCG.