BIOLOGIA DELLO SVILUPPO

L’organismo modello alla base della biologia dello sviluppo è il rospo (Xenopus laevis) e il suo processo di
formazione viene chiamato segmentazione, ma si preferisce chiamarlo con i nomi inglesi, ovvero:

 Cleavage
 Gastrulation
 Neurulation
 Organogenesis
 Metamorphosis
 Fertilization
Alla fine delle divisioni si forma la blastula con cellule che si muovono e si dispongono in maniera caratteristica
formando la gastrula con i 3 foglietti embrionali tramite un processo chiamato gastrulazione. Dopo di ciò si ha la
formazione del sistema nervoso, organogenesi e formazione del girino che poi metamorfosa in un adulto.
Come avvengono queste fasi viene spiegato tramite la biologia dello sviluppo.

La storia delle idee sullo sviluppo degli organismi

Talete: Con Talete siamo nel 600 a.C. e lui è l’iniziatore della filosofia naturalistica ed è importante perché vuole
uscire dai canoni dell’epoca che cercavano di spiegare la realtà attraverso il mito o comunque tramite qualcosa di
trascendentale, mentre lui cerca di dare una spiegazione + naturale. Talete pensa che alla base della vita ci sia
l’acqua che secondo lui è l’archè, ovvero il principio originario di tutto, cioè dice che dall’acqua si origina tutto,
l’acqua sostiene la vita, e quando scompare interviene la morte. Talete aveva per esempio visto che l’acqua, o
meglio l’umidità, portava allo sviluppo dei semi in quanto dava lo stimolo per iniziare la vita della pianta.

Anassimandro: è un altro pensatore del 600 a.C., ma secondo lui l’acqua non è l’elemento primigenico. Lui
affermava che c’è una sostanza infinita che permea tutta la natura, e questa sostanza primigenica è quella che
compone tutte le cose che non si distruggono ma si trasformano continuamente l’una nell’altra.
Lavoisier: vive nel 1700 e crea un postulato secondo cui nulla si crea, nulla si distrugge ma tutto si trasforma. Questo
è molto simile a ciò che affermava molti anni prima Anassimandro.
Leucippo e Democrito: Attualmente si pensa che esistono gli atomi composti da particelle elementari sub-atomiche,
ma Leucippo e Democrito erano 2 pensatori greci del 5° secolo a.C. e venivano definiti atomisti perché affermavano
che tutto quello che ci circonda è fatto di atomi, cioè particelle indivisibili che si muovono nello spazio vuoto in
maniera casuale. Ovviamente non si parlava degli atomi che conosciamo oggi, ma l’idea che la materia è fatta da
particelle molto piccole che si muovono era molto interessante.
Aristotele: Il primo filosofo che ha idea di come avviene lo sviluppo è anche definito il primo embriologo, ed è
Aristotele che vive nel 300 a.C. e spiega lo sviluppo enunciando 2 principi che sono contrastanti l’uno con l’altro,
ovvero:

1. Un organismo potrebbe derivare da un altro organismo che ha dentro di sé l’organismo successivo. In poche
parole un organismo secondo questa idea si formerebbe per espansione
 2. Un organismo si sviluppa per gradi successivi trasformandosi
Questi 2 modi di interpretare lo sviluppo sono definiti preformismo ed epigenesi.
Il preformismo è l’idea che parte dal presupposto che ogni organismo ha dentro sé tutti gli organismi che lo seguono
proprio come una matriosca. Questa idea sopravvive fino al 1600/1700.

L’epigenesi è un processo che vede uno sviluppo graduale, si parte dall’uovo da cui si forma pian piano l’organismo.

Nel 1700 c’è un grande dibattito tra preformismo ed epigenesi. Gli studiosi che erano preformisti erano per esempio
Marcello Malpighi, Malebranche, Hartsoeker. Il dibattito all’interno dei preformisti era tra quelli che sostenevano
che coloro che portavano gli organismi che si sarebbero sviluppati, erano gli spermi, e quelli che sostenevano che
invece erano le uova, quindi spermisti ed ovisti.

Gli epigenetisti erano invece Cartesio, Harvey, Descartes e Maupertuis.

Il microscopio e la cellula

Prima dell’invenzione del microscopio gli organismi non potevano essere osservati. Il microscopio viene inventato da
Zaccaria Janssen che costruiva lenti e costruì un attrezzo con lenti che ingrandivano gli oggetti 3-9 volte, ma questo
ingrandimento non era ovviamente sufficiente. Hooke successivamente costruì un microscopio + complesso che gli
permise di vedere in alcune sezioni di piante quelle che lui chiama cellule. Il suo microscopio aveva una risoluzione
bassa, ovvero una bassa capacità di vedere 2 punti particolarmente vicini tra loro come distinti. La luce veniva fuori
da una lampada ad olio e veniva convogliata sul campione tramite una fiasca che conteneva acqua. Il microscopio
aveva un obiettivo molto piccolo e una lente oculare, ma il problema era l’aberrazione sferica, ovvero il fatto che
quando si mettono lenti insieme danno aberrazioni e quindi devono essere corrette.

Una descrizione + accurata viene fatta da Antoni van Leeuwenhoeck che si era costruito una specie di microscopio
che arrivava fino a 200 ingrandimenti a differenza di quello di Hooke che arriva a 30 ingrandimenti. Questo
microscopio era fatto da una lente sferica che gli permetteva di vedere il campione ingrandito molte volte e grazie a
ciò aveva visto rotiferi, spermi, nematodi e li aveva descritti.
Più tardi Nicolas Hartsoeker diventa famoso perché usando il microscopio di van Leeuwenhoeck disegna uno
spermio particolare nella cui testa c’è un omunculus che giustifica la teoria per cui un individuo viene fuori da
individui preformati che poi crescono in quanto l’omunculus era un bambino già formato che stava all’interno dello
spermio.

Un altro è Van Helmont che vive nel 1500 ed è interessato a cose misteriose ed è uno studioso che vuole mettere in
pratica il metodo scientifico di Galileo, ed inoltre è importante perché riesce a capire che l’aria è fatta da tanti gas
diversi. Lui scrive una ricetta secondo la quale si possono far nascere spontaneamente i topi e questa ricetta
implicava di prendere un secchio, degli stracci, del pane e del formaggio e dopo 20 giorni c’erano i topi che oggi
sappiamo che arrivano da fuori, ma al tempo si pensava che ci fosse una generazione spontanea.

Francesco Redi

Francesco Redi era un ricercatore e studiava la riproduzione delle mosche della ciliegia che fanno le uova nelle
ciliegie che vanno a male e portano un danno per l’agricoltura. Studiando queste ciliegie vide che all’interno vi erano
delle uova dalle quali nascevano delle larve da cui poi si formavano le pupe e poi le mosche, e con questo dimostra
che le mosche non nascono da una generazione spontanea ma da uova che vengono deposte. Questa è una
dimostrazione che la generazione spontanea non esiste.
Anche Charles Bonnet era un preformista, ovvero uno studioso che faceva parte degli ovisti e studiava le dafnie nelle
quali aveva visto la partenogenesi e aveva pensato che nelle uova, siccome non serviva l’altro sesso, c’erano già
dafnie preformate, ovvero l’individuo che si sarebbe sviluppato successivamente.

Anche Marcello Malpighi è un preformista che faceva il medico e fece scoperte importanti come i tubuli malpighiani.
Lui studiò il rene, il cervello, il fegato, i tubuli malpighiani nei reni, i corpuscoli di malpighi nella pelle, ed ha studiato
lo sviluppo del pollo. Lui disegnò un embrione nel quale un pollo non c’è e quindi è strano che sia un preformista in
quanto i suoi studi portano a pensare all’epigenesi in quanto secondo i preformisti nell’embrione doveva esserci un
piccolo pollo.

Sostenitori epigenesi

I sostenitori dell’epigenesi sono:

- William Harvey: lui era un medico che pubblicò molti studi che descrivono il sangue, il circolo sanguigno, il
cuore, ovvero studi che implicano che l’individuo esaminato si trasformi in adulto
- Pierre Maupertuis: è un matematico che propone l’idea per cui l’embrione si sviluppa attraverso vari stadi di
sviluppo, quindi l’embrione non è un piccolo adulto che poi cresce, ma è qualcosa di completamente diverso
dall’adulto e che si trasforma tramite stadi precisi.

Se ci pensiamo bene i cromosomi, le informazioni che riceve l’organismo sono preformate, quindi oggi non si parla di
preformismo inteso come la presenza di un omuncolo, ma il preformismo esiste. L’epigenesi è lo sviluppo graduale e
oggi è diventata il centro dell’embriologia.
Per capire come si è evoluto lo studio dello sviluppo si considerano vari studiosi:

- Kaspar Wolff: studia lo sviluppo embrionale del pollo, un animale facile da studiare in quanto se visto al
microscopio c’è un’area bianca in cui avviene lo sviluppo dell’embrione, e si pone varie domande, tipo: “dove si
trovavano le istruzioni per l’embrione?” Oppure “com’era organizzato l’embrione?”. Fu il primo quindi a parlare
della teoria embriologica dell’epigenesi, secondo la quale l’embrione si sviluppa gradualmente, a partire da un
germe indifferenziato, con la comparsa successiva di parti dell’organismo nuove per morfologia e struttura. Parla
inoltre di una forza che definisce “Vis Essenzialis”. Wolff è dunque in contrasto con la teoria all’epoca prevalente
del preformismo, secondo la quale nel germe (uovo o spermatozoo) si trova già precostituito in miniatura, con
tutte le sue parti, l’individuo adulto.
- Christian Pander: Durante la fine del ‘700, Pander studia lo sviluppo embrionale del pollo e riesce a vedere i 3
foglietti embrionali (ectoderma, endoderma, mesoderma) e in più riesce a vedere le cellule germinali.
- Haeckel: formula la legge biogenetica. Ogni fase successiva nello sviluppo di un individuo rappresenta una delle
forme adulte che sono apparse nella sua storia evolutiva. Quindi ciò ci porta a dire che embrioni di specie diverse
sono uguali. Per esempio, Haeckel affermò che le scanalature faringee tra gli archi faringei nel collo
dell’embrione umano non solo assomigliano alle fessure brachiali dei pesci, ma rappresentano direttamente uno
stadio di sviluppo simile al pesce. Questa teoria prende il nome di ontogenesi e deriva dalla filogenesi.
- Karl Ernst Von Baer: il suo lavoro sull’embriogenesi dei pulcini rappresenta la morte del preformismo, perché
secondo lui l’embrione di una specie assomiglia a quello di specie diverse ma non sono uguali, hanno degli
aspetti in comune ma non sono uguali, come invece diceva Haeckel.
- Schleiden e Schwann: affermano la Teoria cellulare secondo la quale ogni organismo vivente è composto da una
o più cellule, nuove cellule possono formarsi solo dalla divisione di cellule preesistenti. Schleiden fu il primo a
dire che le piante erano organismi fatti da cellule e Schwann postulò la teoria secondo la quale tutti gli organismi
viventi sono composti da cellule.
- Laurent Chabry: parla della Teoria dello sviluppo a mosaico. Chabry isola 4 blastomeri, ovvero le prime 8 cellule
che si formano dal cleavage dello zigote e ne toglie 1 e si accorge che quello che ha tolto era il blastomero che
determinava l’origine dei muscoli, quindi pensa che i blastomeri siano tutti diversi gli uni dagli altri e che ognuno
porta alla formazione di parti diverse dell’organismo. In questo modo tutti blastomeri sono necessari per lo
sviluppo.
- Wilhelm Roux: effettua un esperimento con un uovo di rana per testare la teoria dello sviluppo a mosaico.
L’uovo infatti può essere considerato come un mosaico di determinanti discreti, variamente distribuiti. Roux
diceva che lo sviluppo della rana è basato su un meccanismo a mosaico, secondo cui il carattere e il destino delle
cellule vengono determinati ad ogni divisione di segmentazione. Nel suo esperimento vediamo che se una delle
 2 cellule viene bucata muore, mentre l’altra continua a vivere e si forma un organismo fatto da una parte
funzionale e da una parte morta (derivata dal blastomero che ha distrutto con l’ago)

- Hans Driesch: ripete l’esperimento effettuato da Roux, ma utilizza le uova del riccio di mare. Lui non distrugge
un blastomero ma allontana i 4 blastomeri e vede che ogni blastomero da origine ad un individuo completo.
Questo esperimento è in contrasto con il mosaicismo e lo sviluppo viene definito regolativo. Quando si ha
l’allontanamento dalla membrana di fecondazione e in seguito la separazione delle cellule, si ottengono 4
individui diversi. Questo sviluppo viene chiamato sviluppo regolativo.

La discrepanza tra i 2 esperimenti è data dal fatto che Roux aveva ucciso 1 dei 2 blastomeri e quello vivo continuava
a dividersi supponendo la presenza di un altro che si divide allo stesso modo. Quindi anche qui lo sviluppo è in realtà
regolativo.
Biologia dello sviluppo ed embriologia

L’embriologia descrive lo sviluppo degli organismi senza porsi problemi sui meccanismi che regolano questo
sviluppo.

La biologia dello sviluppo invece non si basa sulla semplice osservazione ma si basa sulla genetica, biologia
molecolare, biologia cellulare e biochimica, ovvero discipline che messe insieme servono a capire ciò che dirige lo
sviluppo, cioè come una cellula diventa diversa da un’altra.

Quindi, mentre l’embriologia è limitata allo sviluppo iniziale, embrionale, la biologia dello sviluppo si pone problemi
che riguardano lo sviluppo dell’adulto come l’invecchiamento, la forma, la crescita, la simmetria, la rigenerazione.
Un aspetto importante alla base della biologia dello sviluppo è come una cellula riesca a diventare diversa da un’altra
dato che derivano tutte da 1 sola cellula iniziale. Le cellule si diversificano, organizzano tessuti, organi e quindi
l’organismo, e per questo si cerca di capire quali sono i meccanismi che appunto portano alla formazione
dell’organismo.

Lo sviluppo è qualcosa che segue leggi basate sulle informazioni contenute nelle cellule. La riproduzione umana è un
processo tutt’altro che efficiente. Il 50% degli embrioni muoiono prima di essere impiantati perché avvengono degli
errori, cioè lo sviluppo è soggetto ad errori che possono portare a patologie importanti come nanismo o microcefalie
derivate da errori su organelli che sembrano banali, ma in realtà non lo sono.

Le domande che ci poniamo per capire come avviene lo sviluppo sono:

- Quali sono le istruzioni per lo sviluppo, chi le da, chi le riceve e come vengono interpretate e utilizzate
- Quale è il materiale di riserva accumulato nell’uovo e come viene usato durante lo sviluppo e come influisce sullo
sviluppo
- Come possono le cellule capire dove si devono trovare e a quali tessuti devono dare origine e come fanno a
muoversi. Le cellule germinali per es. nascono in una zona e poi si muovono e quindi ci si chiede chi le guida così
come le cellule della cresta neurale.

La domanda di base è però come fanno le cellule che hanno la stessa informazione a diventare cellule diverse, per es.
come fa la cellula dell’epidermide a diventare cellula che produce cheratina.

Lo sviluppo può essere diviso in:

1. Processo di crescita: da un uovo si ha la formazione di una struttura pluricellulare come la blastula con cellule
tutte uguali che poi si devono differenziare
2. Processo di differenziamento: le cellule devono differenziarsi e questo richiede l’interazione tra cellule per
scambiarsi segnali che poi dovranno essere interpretati.
3. Formazione di un pattern: Quando le cellule si sono differenziate si deve formare un pattern, ovvero
un’organizzazione dell’embrione secondo le coordinate spaziali, infatti le cellule devono sapere se si trovano in
una parte anteriore, posteriore, dorsale o ventrale.
4. La morfogenesi: interviene per la formazione dei tessuti e si basa sul numero di cellule che deve essere
adeguato, infatti le cellule possono cambiare di forma in quanto la morfogenesi comprende il rimodellamento
dei tessuti, sull’affinità tra cellule, infatti ce ne sono alcune che aderiscono altre che si staccano e migrano, sulla
polarità delle cellule che devono sapere quale è la parte apicale e quale basale, sul movimento cellulare che si
basa su varie informazioni.

Il primo processo quindi porta ad una cellula uovo unicellulare che va incontro a divisione mitotica per formare una
blastula pluricellulare. La mitosi serve anche per rigenerare parti danneggiate. Quindi la divisione è estremamente
importante, e per questo deve essere regolata, le cellule non si possono dividere a caso ma deve esserci una
divisione controllata per capire quando iniziare a dividersi e quando smettere per evitare un’eccessiva proliferazione.

Un altro aspetto che si cerca di spiegare con la biologia dello sviluppo è come si separa la linea germinale da quella
somatica.
La polarità

La biologia dello sviluppo studia inoltre come cambiano le proporzioni durante la crescita, per esempio, i bambini
hanno una testa molto + grande rispetto agli adulti se messa in relazione con le altre componenti del corpo, questo
ci permette di capire che durante la crescita le proporzioni cambiano e questo avviene in base a informazioni
precise. La simmetria è importante, noi abbiamo una simmetria dx e sx, ma ci possono essere delle anomalie che
portano a patologie come la sindrome di Kartagener che rappresenta una mutazione che colpisce la dineina
assonemale e fa sì che gli assonemi non si possano muovere, e siccome gli assonemi stanno anche nelle ciglia della
trachea ci sono anche problemi di tosse. L’embrione ha inoltre un nodo con ciglia che spostano informazioni che
spostandosi determinano la parte sx del corpo, ma in Kartagener essendo che le ciglia sono ferme c’è un 50% di
possibilità che queste informazioni rimangano a dx e un 50% di possibilità che vadano a sx.
Gli assi di simmetria sono importanti perché nei vertebrati il sistema nervoso è dorsale, mentre negli insetti è
ventrale per la diversa simmetria.

Telomeri ed età, invecchiamento

Uno degli aspetti di cui si interessa la biologia dello sviluppo è lo sviluppo embrionale ma anche post-embrionale.

L’invecchiamento e lo studio dell’invecchiamento sono legati alla lunghezza dei telomeri che sono delle ripetizioni di
basi di DNA localizzate all’estremità dei cromosomi e si è visto che man mano che la cellula si divide i telomeri si
accorciano e quindi le cellule non hanno una vita infinita. Quando la lunghezza è sotto una certa soglia interviene un
controllore del ciclo cellulare che fa sì che la cellula vada in apoptosi. I telomeri sono quindi importanti e servono per
la protezione dei cromosomi durante la mitosi e ad un certo punto portano alla morte cellulare per evitare
un’eccessiva proliferazione come invece avviene nelle cellule tumorali. Nelle cellule somatiche c’è l’enzima
telomerasi che aggiunge le basi che altrimenti verrebbero a mancare ad ogni divisione cellulare e quindi mantiene
costante la lunghezza dei telomeri. Le nostre cellule di solito hanno il gene per la telomerasi ma è spento, si trova
invece acceso nelle cellule embrionali, staminali e tumorali che infatti non muoiono mai.

In teoria si può controllare l’invecchiamento perché si può controllare la cellula con:

 Farmaci antinfiammatori
 Riattivazione della telomerasi
 Eliminazione del DNA danneggiato

Ma in realtà se la telomerasi viene riattivata le cellule non muoiono + in quanto hanno sempre la corretta lunghezza,
e questo può essere pericoloso per l’organismo.

La rigenerazione
Ci sono organismi particolari come le talpe e le planarie che sono lontani tra loro dal punto di vista evolutivo, la
planaria è potenzialmente immortale, infatti se viene tagliata la parte mancante si rigenera. La talpa muore ma vive
molto a lungo, ma noi sappiamo che l’idea generale è che + gli animali sono piccoli + hanno una vita breve, quindi la
talpa essendo piccola dovrebbe vivere poco e invece vive molto e può addirittura resistere al cancro. Quindi può
dare indicazioni sulle cellule tumorali in quanto ha qualcosa di particolare nel suo genoma, inoltre resiste a patologie
che potrebbero svilupparsi con l’avanzare dell’età. Le talpe sono quindi soprattutto studiate per i geni che danno
resistenza ai tumori.

Organismi modello
Non è semplice allevare una talpa in laboratorio e quindi non si può considerare un organismo modello ma ci sono 2
organismi modello principali che possono essere usati nella ricerca che sono il Caenorabditis elegans e il Moscerino
che ha un mutante, il Methudelah che vive dagli 85 ai 90 giorni, mentre un wild type ne vive solo 50-60. Il mutante,
non solo vive di + ma è anche + resistente, infatti senza mangiare vive 80 ore mentre il wild type vivrebbe solo 50
ore. Il methuselah resiste a 46° invece che 12 come i wild type. C’è un diserbante, il Paraquat che fa rallentare il
movimento dei wild type che muoiono dopo 2 giorni mentre il 50% dei mutanti sopravvive.
Ciò ci fa pensare che esistono dei geni che possono essere accesi o spenti e che determinano questa situazione
particolare. I moscerini hanno il 60/70% dei geni condivisi con l’uomo, quindi se si studia il moscerino si hanno
informazioni importanti anche sull’uomo stesso.

Apoptosi

Come detto i telomeri che si accorciano portano alla morte cellulare per apoptosi, e la morte cellulare è un processo
molto importante perché è programmata ed è importante nell’adulto perché evita la proliferazione incontrollata di
cellule anomale, e anche durante lo sviluppo è importante la morte cellulare, per esempio, in un embrione di un
pulcino il numero di neuroni diminuisce durante lo sviluppo grazie a questa.

L’apoptosi è importante anche perché l’embrione umano, di un topo, di un pulcino, tra le dita ha una membrana
interdigitale fatta da cellule e quando le dita devono essere individualizzate, le cellule di questa membrana muoiono.
Ci sono però anche casi in cui questa membrana non se ne va o se ne va solo parzialmente.

La biologia dello sviluppo si occupa anche del processo con cui gli arti si formano, in quanto un arto ha una polarità
determinata da geni che se non funzionano portano ad avere per esempio dita + corte, o un dito medio in + a causa
di un gene.
La rigenerazione
La rigenerazione è un processo che si trova negli organismi adulti ed è quel processo tramite il quale, per esempio, la
planaria può rigenerare una parte del corpo, e anche il crostaceo può rigenerare un pezzetto di zampa ecc. Quindi la
rigenerazione riguarda l’adulto ed è inversamente proporzionale alla complessità degli organismi, ovvero organismi +
in basso nella scala evolutiva rigenerano meglio il loro corpo rispetto a quelli che stanno + in alto e viceversa. Per
esempio, il tritone è un vertebrato che sa rigenerare il cristallino dell’occhio e anche una zampa quindi ossa, muscoli,
nervi ecc.

Ci sono molti laboratori che studiano il processo di rigenerazione perché si vuole scoprire se questo processo può
essere trasferito all’uomo anche se in realtà è molto difficile, in quanto, in un Tritone, quando la zampa viene
amputata partono segnali dalla parte rimasta che inducono alcune cellule indifferenziate a proliferare e
differenziarsi, ma l’uomo queste cellule non ce l’ha.

In realtà, nell’uomo c’è un po’ di rigenerazione ma il processo rigenerativo si limita ad alcuni tessuti e serve per
mantenere la struttura dell’organismo, infatti la rigenerazione è alta nella pelle, nell’intestino, ma è assente in
muscoli, cuore e cervello. Alla base del processo di rigenerazione ci sono cellule indifferenziate che quando ricevono
segnali proliferano e si differenziano. Queste cellule sono le cellule staminali che sono indifferenziate e sono di 2 tipi:

1. Staminali embrionali: alla fine della segmentazione dell’embrione si forma una blastocisti vuota in cui da una
parte ci sono le cellule della massa cellulare interna che sono le staminali embrionali
2. Staminali adulte

Le potenzialità di questi 2 tipi di cellule sono diverse, le embrionali danno origine alle cellule del nostro organismo,
mentre quelle adulte originano solo alcuni tipi di cellule come quelle della pelle, dell’intestino ecc.

L’idea generale è quella di riuscire a riprogrammare le cellule, e per fare ciò si prende un fibroblasto, ovvero una
cellula somatica con potenzialità 0 che si vuole far tornare a cellula bambina indifferenziata, ovvero a cellula pseudo-
staminale, quindi si vuole far tornare la cellula ad essere totipotente. Oggi sappiamo che le cellule si diversificano
per la presenza di geni attivi o spenti, quindi le cellule staminali hanno le stesse cellule del fibroblasto ma hanno geni
spenti che si attivano nel fibroblasto quindi l’idea è di prendere il fibroblasto e fargli esprimere i geni delle cellule
staminali.

Clonazione
Prima di fare ciò si deve però dimostrare che la cellula somatica può dare un organismo, e per questo lo scienziato
Gurdon clona Freddy, ovvero prende una rana a cui toglie il nucleo femminile e al suo posto ci mette una cellula
epidermica estremamente specializzata e questa si inserisce nell’ovocita nucleato e nasce Freddy. I figli di Freddy che
è pigmentato sono tutti albini e questo significa che dalla femmina sono stati presi gli ovociti ma è stato tolto il
pronucleo che conteneva i geni per la pigmentazione e al suo posto è stato messo il nucleo con i geni di una rana
albina. Quindi da qui si arriva a capire che il nucleo della cellula somatica guida lo sviluppo.
Ci fu anche la clonazione di Dolly clonata usando una cellula somatica della ghiandola mammaria e Dolly ha avuto un
figlio quindi si è riprodotta.
Sono stati clonati anche i Makaki ma questa non è una vera clonazione perché si sono prese cellule fetali piuttosto
che cellule somatiche.
Problemi etici e organoidi

Le cellule staminali che danno maggiori possibilità sono quelle embrionali che però vanno prelevate da una
blastocisti e questo crea un problema etico per cui ci si chiede se la blastocisti è già una vita oppure no. Per risolvere
questo problema, pochi anni fa dei ricercatori sono riusciti a convertire i fibroblasti in cellule staminali dette
pluripotenti indotte prendendo un fibroblasto dal corpo, riprogrammandolo, cioè facendogli esprimere geni che
impediscono il differenziamento e permettono la proliferazione e si vide che quelli si comportavano come cellule
staminali che si possono differenziare nei tessuti che si vuole. Così si riesce a differenziare queste cellule verso la via
della neurogenesi in quanto le cellule vengono fatte proliferare e poi tramite sistemi complessi si formano organoidi,
strutture rotondeggianti, e i + importanti sono gli organoidi cerebrali che simulano un cervello in formazione.
Studiando questi organoidi si può studiare il perché di microcefalie che fanno ridurre la massa cellulare, come il virus
Zita che determina una proliferazione ridotta delle cellule staminali nervose.

Un organoide cerebrale ha 2 strutture pigmentate che se si tagliano hanno un epitelio pigmentato come quello della
retina fatto da cellule che esprimo il gene Pax6 tipico degli occhi e questo sembra che risponda a stimoli nervosi,
quindi vuol dire che questo sistema ci permette di capire come si formano gli occhi. Questi organoidi sono piccoli e
hanno all’interno una cavità come nel sistema nervoso all’inizio della formazione e le strutture, se trattate con acido
retinoico, si formano in numero pari e inoltre sembra che queste cellule reagiscano alla luce quindi sono veri e propri
occhi in formazione.

La sindrome di Seckel è una sindrome che riguarda un centriolo che porta ad una ridotta corteccia cellulare e questo
si può spiegare prendendo fibroblasti, facendoli proliferare, e costruendo gli organoidi Seckel in cui si vede che
hanno il problema di cellule staminali che non si orientano correttamente e quindi non si differenziano, e ciò può
permetterci di spiegare questa sindrome.

ORGANISMI MODELLO

Per capire come certi processi avvengono si cercano organismi modello che in realtà però sono pochi. Gli organismi
sono molto diversi tra loro, la natura consente lo sviluppo di una quantità diversa di animali diversi che si sviluppano
con meccanismi simili. Lo sviluppo embrionale è guidato da geni che si trovano dal nematode fino all’uomo e questo
perché c’è un ancestore comune a tutti.

L’organismo modello si può scegliere in base alle dimensioni, infatti si preferisce il Caenorhabditis di appena qualche
millimetro ad un elefante molto grande perché anche se si osserva meglio un elefante, questo ha una gestazione di
23 mesi, mentre il Caenorhabditis ha una gestazione particolarmente + veloce e quindi si preferisce.

Gli organismi modello si scelgono in base ad alcune caratteristiche:

- Capacità di trovare sistemi di studio adatti, facili

- L’organismo deve essere malleabile dal punto di vista genetico

I sistemi per studiare questi organismi, i ceppi mutanti devono essere ripartiti tra la comunità.

Animali diversi possono dare vantaggi sperimentali diversi, infatti non tutti gli organismi modello si prestano allo
stesso modo, lo Xenopus per esempio non si può usare geneticamente, e molto spesso la scelta di un animale
modello dipende anche da ciò che vogliamo vedere.

Gli animali modello sono:

- Moscerino
- Caenorhabditis
- Topo
- Pesce
- Lievito
- Rapditopsis (pianta)
- Riccio di mare

I motivi per cui si scelgono questi organismi modello sono:

1. Allevamento degli animali: l’allevamento degli animali dipende anche dalla disponibilità economica, infatti se si
hanno pochi soldi a disposizione si devono usare organismi che non sono molto dispendiosi per quanto riguarda
il loro allevamento. Un esempio è il moscerino o Drosophila che per essere allevata ha bisogno solo di lievito,
acqua e agar.
2. Embriologia: si scelgono gli organismi modello perché è importante la quantità di progenie, ovvero la quantità di
figli che riescono a produrre, quindi si cercano animali che producono molti embrioni, si controlla il tempo, in
quanto il processo riproduttivo deve essere continuo e non legato ad una sola stagione per esempio. Inoltre si
deve anche considerare la possibilità che si ha di studiare un embrione, infatti un embrione umano sarebbe
praticamente impossibile studiarlo perché ha una fecondazione interna, mentre il riccio di mare si presta bene
per lo studio della fecondazione perché è esterna. Inoltre, gli embrioni presi devono essere quelli che si possono
 manipolare, per esempio, per fare un trapianto di cellule si ha bisogno un embrione grande, se si vuole iniettare
RNA per accendere o spegnere geni si deve prendere un embrione che è + grande, infatti alcuni embrioni sono +
robusti e resistenti di altri. Ma questo non è sempre valido perché se si vuole fare uno studio di biologia
cellulare, ovvero la distribuzione e il ruolo delle proteine durante lo sviluppo, devo usare una tecnica che è
l’immunofluorescenza. Se per esempio prendo la tubulina e voglio studiare come si forma il fuso mitotico e come
si muovono i cromosomi, sicuramente ho la necessità di vedere come prima cosa, i microtubuli e quindi devo
usare un anticorpo contro i microtubuli, ovvero contro la tubulina. Questo anticorpo riconosce il microtubulo e ci
si lega e per riuscire a vedere questo 1° complesso mi serve un 2° anticorpo che si lega al 1° e ho bisogno che sia
legato a sostanze fluorescenti e quindi a questo punto posso fare l’osservazione tramite il microscopio a
fluorescenza. Quindi è chiaro che un altro aspetto da tenere in considerazione è la possibilità di fare
un’osservazione al microscopio per localizzare proteine, o antigeni e quindi devo avere un embrione senza strati
protettivi perché sennò è difficile osservarlo. La fissazione e la colorazione devono essere semplici, ad esempio
per vedere i microtubuli e i microfilamenti in un embrione devo prenderne uno privo di guscio, con tessuto poco
spesso, quindi non si usa l’uovo dello Xenopus che è molto grande e quindi pieno di tuorlo perché è
autofluorescente e quindi andrebbe chiarificato per riuscire a vedere qualcosa.
3. Biologia cellulare e microscopia: Un embrione in cui si può fare una semplice osservazione di microtubuli e
microfilamenti è quello del moscerino nel quale, però se si fissa il campione per i microtubuli non si vedono i
microfilamenti e viceversa quindi c’è un problema di localizzazione degli antigeni, alcuni sono preservati da
alcuni fissativi ed altri da altri fissativi.
4. Biochimica: Se si vogliono fare studi di biochimica serve tanto materiale in poco tempo e quindi si devono
prendere organismi modello che sono in grado di produrre tantissime uova in poco tempo come il riccio di mare,
lo Xenopus, il moscerino, ma non si usa il topo per esempio perché ne produce poco.
5. Genetica: La genetica è importante perché per esempio posso avere la necessità di spegnere un gene perché
voglio vedere quale è il suo ruolo e ho 2 possibilità:
 Ho il mutante in cui il gene è deleto o non funziona
 Devo spegnere il gene
Per spegnere il gene mi serve un embrione geneticamente predisposto con una vita breve. Si può modificare
l’embrione in maniera tale da far sovraesprimere un gene ma per fare ciò devo conoscere il gene che sto
analizzando, quindi il genoma deve essere sequenziato e l’organismo deve essere trattato geneticamente e deve
avere una generazione molto veloce. Il Caenhorabditis produce 1 generazione ogni 4 giorni, la mosca ogni 12,
mentre il topo impiega 10-11 settimane. Se voglio spegnere il gene devo fare il knock-out un processo che richiede
3/4 generazioni e quindi si impiega quasi 1 anno per farlo con il topo, mentre con la mosca o con il Caenhorabditis ho
il mutante e quindi in 1 settimana si risolve il problema. Nonostante ciò però il topo è sicuramente + attendibile.
6. Genoma: Nella scelta di un organismo modello è importante anche il fatto di avere a disposizione o meno un
genoma sequenziato, e quindi è importante anche la lunghezza del genoma, in quanto un genoma + corto è
migliore perché in un genoma + grande c’è + DNA spazzatura ed è + complesso da studiare. Nel protottero ci
sono 130.000 milioni di paia di basi, nella mosca 170 Mpb quindi è + semplice sequenziare il suo genoma.
7. Posizionamento nella scala evolutiva: L’organismo modello va scelto anche in base alla sua posizione nella scala
evolutiva e lo studio deve far riferimento ad aspetti che ci interessano in maniera personale quindi si scelgono
organismi che condividono con l’uomo geni ed in particolare si prendono quelli che nell’uomo portano a
patologie. Lo Xenopus è un vertebrato molto vicino all’uomo, ma il topo è ancora + vicino. Per capire quanto 2
organismi sono vicini tra loro ci si basa anche sul preciso momento in cui avviene la divergenza tra uomo e altri
organismi.
La scelta degli organismi modello però a volte si basa su fattori storici, infatti il modello degli anfibi è lo Xenopus che
è molto grande, ha un uovo pieno di tuorlo e non c’è genetica perché il suo genoma è estremamente grande, e
infatti questo organismo si studia solo perché tradizionalmente è sempre stato studiato quello, quindi con
metodiche che non possono essere adattate ad altro e per questo viene usato.

Il genoma di alcuni organismi modello è sequenziato e ci sono sistemi di riferimento dove si cercano i geni come nel
FlyBase che è la banca del moscerino in cui si trova come sono fatti i geni, chi li ha studiati ecc. e queste ci sono anche
per topi, zebrafish ecc.
Lo sviluppo dello Xenopus
Lo Xenopus è un rospo grande con testa piccola. È un vertebrato, ha uno sviluppo delle uova esterno, non costa
molto mantenerlo ed ha embrioni grandi e quindi utili per esperimenti di trapianto.

Lo sviluppo parte da un uovo con 1 emisfero pigmentato + scuro e 1 giallino + chiaro perché si tratta di un uovo con il
tuorlo che contiene informazioni di riserva che vengono accumulate in maniera simmetrica, mentre la regione
pigmentata è quella con il pronucleo femminile. Nell’uovo entra lo spermio a 30 gradi rispetto all’equatore, inizia la
divisione che è la segmentazione o cleavage per formare tanti blastomeri e alla fine si forma la blastula nella quale le
cellule si muovono in maniera tale da avere rapporti spaziali diversi e si forma la gastrula importante perché con lei si
identificano i 3 foglietti embrionali, ectoderma, mesoderma ed endoderma. Si va poi al processo di neurulazione con
formazione del sistema nervoso e poi si ha organogenesi con formazione del girino che si muove, si nutre,
metamorfosa nell’adulto e perde la coda per apoptosi.

Nella parte scura dell’uovo c’è una porzione + chiara e questo si spiega pensando alla meiosi che nello Xenopus si
blocca alla seconda metafase e riprende quando entra lo spermio con la formazione di un fuso di cui una parte va a
costituire una protuberanza che è il globulo polare che poi viene espulso, quindi se si vede la struttura + chiara si
capisce che la meiosi è ripartita.

L’uovo dello Xenopus è grande e può essere micromanipolato. Nell’uovo si inietta un RNA per un gene dorsalizzante
che da inizio a una serie di segnalazioni a cascata che portano alla formazione di una testa e si ottengono girini con 2
teste, quindi queste uova si prestano a micromanipolazione.
Lo Xenopus ha però anche degli svantaggi, quello + grande è che non si può fare uno studio genetico su esso perché
è tetraploide e non si possono avere mutanti. Il knock out non si può effettuare ma si possono iniettare molecole
che interferiscono con l’espressione di RNA messaggeri.

Il Pollo
L’uovo di un pollo

L’uovo vero e proprio del pollo è il tuorlo perché l’albume è solo un elemento di protezione e una fonte di
approvvigionamento. Nell’uovo del pollo c’è una camera d’aria che raccoglie l’aria durante lo sviluppo e questo da
un’indicazione sull’età dell’uovo perché la camera diventa sempre + grande quando l’uovo invecchia. L’uovo è una
cellula e lo sviluppo dell’embrione avviene in una piccola regione bianca, un dischetto in cui c’è un citoplasma libero.
Tutto il resto è materiale che l’embrione usa per diventare pulcino.
Per quanto riguarda la tempistica, il cleavage implica 1 giorno per avvenire poi si forma il blastoderma, poi l’uovo
viene deposto, continua la gastrulazione e siamo a 50 ore dopo la deposizione e alla fine la gallina si vede dopo 60
giorni quindi il tempo di sviluppo è molto elevato e quindi questo embrione non si può usare per fare il knock out.
Inoltre il problema principale è che non si può usare la genetica nello sviluppo del pollo e quindi non si può fare
praticamente nulla se non esperimenti di trapianto.

L’embrione del pollo è utile per vedere come si forma il precursore del sistema nervoso, ovvero il tubo neurale, i
somiti, in quanto questo processo di formazione nel pollo è molto simile a quello dell’uomo. Nell’embrione si
sviluppa prima la parte anteriore e poi quella posteriore, e questo si può sapere perché l’embrione è grande e quindi
facile da osservare.

Zibrafish
Lo zibrafish è un pesce con strisce chiare e scure, ha un uovo relativamente grande e ricco di tuorlo con sporgenze
fatte da 2 dei 4 blastomeri. L’uovo è ricco di materiale di riserva e quindi la segmentazione avviene in un punto
periferico che contiene il citoplasma. Per quanto riguarda la durata, la gastrulazione inizia dopo 8 ore, ma per avere il
pesce si necessita di 90 giorni.

Il vantaggio è quello di essere un vertebrato, piccolo e quindi in un acquario ci possono stare tanti, sono trasparenti e
quindi si possono vedere gli organi interni, hanno un enorme quantità di cromosomi e quindi genoma enorme. Lo
zibrafish è però stato introdotto recentemente e quindi la conoscenza è limitata.
Il Caenorhabditis elegans
Il Caenorhabditis elegans è un nematode molto lontano da noi nella scala evolutiva ma ha fornito importanti
informazioni sull’uomo perché condivide molti geni con i mammiferi e i loro meccanismi sono stati spiegati in questo
piccolo nematode e si sono rivelati poi gli stessi dei mammiferi e in particolare dell’uomo. Questo Nematode è stato
introdotto in tempi recenti (1935). Nel 1965 Brenner allevava questi nematodi perché li riteneva interessanti per
capire certi aspetti del loro sviluppo. Il Caenorhabditis è un nematode e i nematodi sono molto numerosi,
rappresentano i 4/5 degli animali, e sono importanti perché molti sono parassiti come le Filarie, il Lhoa lhoa, il
Dracunculus ecc. poi ci sono parassiti delle piante. Il Caenborhabditis però non è un parassita. L’interesse per la
ricerca di questo nematode è cresciuta in pochissimo tempo e ancora oggi continua a crescere.

Il nematode è trasparente, all’interno si vedono addirittura le uova, sono piccoli ma nonostante ciò sono molto utili
perché hanno un tempo di generazione da uovo ad adulto di poco meno di 3 giorni e questo è interessante per
studiare lo sviluppo, ma anche per applicare tecniche di genetica in quanto il tempo di generazione è corto.
L’embrione è trasparente e quindi è + facile da visualizzare. I nematodi sono eutelici ovvero hanno il corpo fatto da
un numero fisso di cellule, nel Caenhorabditis le cellule sono 1031. In realtà ci sono 2 forme di Caenorhabditis uno
ermafrodita e l’altro che sono i maschi. L’allevamento di questi nematodi costa poco e hanno un genoma
estremamente piccolo e quindi + semplice da analizzare in termini di genetica. L’aspetto negativo di questo modello
è che non è un vertebrato ma comunque condivide molti geni con i vertebrati stessi.

I Caenhorabditis hanno 2 forme:

- XX: ermafroditi che si riproducono velocemente e si possono incrociare con i maschi

- X0: maschi che sono pochi

Loro si nutrono di batteri e nel terreno di coltura si trovano gli adulti che sono + grandi delle larve ma sono
comunque di dimensioni molto piccole. Questi possono crescere a una temperatura dai 12° ai 26-28° e questo è
importante perché la temperatura può essere variabile, sopravvivono anche molti mesi senza mangiare. Le cellule si
possono conservare nell’azoto e usarle dopo molti anni, e se io costruisco un ceppo mutante di questo nematode e
lo metto a -180° questo viene conservato e può essere usato successivamente perché riprende la sua vita quando
viene riportato a temperature + elevate.
Fasi di sviluppo
Per quanto riguarda le fasi di sviluppo del Caenorhabditis si passa dall’uovo estremamente piccolo all’adulto che è
poco + di 1 mm.
L’uovo è trasparente, ha 2 strutture che sono i pronuclei perché l’uovo è fecondato quindi c’è pronucleo maschile e
femminile e su quest’uovo si possono fare varie operazioni come per esempio evidenziare l’actina che circonda il
cortex in rosso, in verde i microtubuli, ovvero il primo fuso zigotico e in blu i cromosomi, quindi si evidenzia la prima
divisione mitotica. L’unico problema è che l’uovo è circondato da parete quindi se si vuole fare la fluorescenza e
quindi evidenziare i microtubuli si deve far entrare un anticorpo contro la tubulina all’interno e quindi il problema
principale è la fissazione, per questo a volte si fanno dei piccoli buchi con il laser e si fanno entrare i coloranti.

Ciclo vitale

Il ciclo vitale parte con l’uovo fecondato, dopo si ha la segmentazione poi si forma larva al 1° stadio (ci sono 4 stadi
larvali) e infine si ottiene l’adulto. Tutto ciò impiega poco + di 2-3 giorni quindi il tempo di sviluppo è molto breve.
Essendo che questo nematode è trasparente si può vedere in vivo il processo di cleavage e ciò è importante perché è
un organismo eutelico. L’uovo si divide in 2 blastomeri che originano l’organismo e così si può costruire un albero
genealogico delle cellule dell’embrione che danno l’idea di quello a cui le cellule daranno origine.
Ci sono dei punti in questi alberi di divaricazione in cui si formano 2 cellule ma solo 1 va avanti. L’albero genealogico
parte dallo zigote, blastomeri e si segue a cosa danno origine gli stessi blastomeri.

Questa possibilità di seguire il destino delle cellule unito al fatto che in questi alberi si trovano cellule che si fermano
nello sviluppo ha portato a parlare di apoptosi ovvero la morte cellulare programmata. Sempre in questo nematode è
stato descritto il funzionamento del processo di RNA interference.

L’apoptosi
Il Caenorhabditis ha dei mutanti in quanto ha il genoma piccolo e si possono isolare le mutazioni. Tra i mutanti c’è la
classe dei Ced con cellule che ad un certo punto si arrestano nello sviluppo, quindi una figlia continua a dividersi e
l’altra no, quelle che non si dividono muoiono, ma sono sempre le stesse che muoiono e questo si può notare
guardando gli alberi genealogici. Essendo che sono sempre le stesse a morire, allora si pensa che queste hanno
un’informazione che le porta a morire in quel preciso momento, ovvero una morte cellulare programmata.

Il meccanismo di apoptosi viene fuori studiando i mutanti, ovvero organismi in cui le cellule che morivano per
apoptosi in un preciso momento, non muoiono. Si vide che tutti i mutanti davano lo stesso fenotipo, ma il problema
è che se queste mutazioni avvengono tra geni diversi si deve capire come interagiscono i geni tra loro. Ciò si spiega
affermando che tutte le cellule hanno un segnale che attiva il meccanismo di morte, ma non tutte le cellule
rispondono a questo segnale.
I geni coinvolti nel processo sono Ced9, Ced4, Ced3 che sono proteine trascritte a partire da geni omologhi. Ced9 è
una proteina che sta sulla membrana del mitocondrio e quando essa è funzionante e attiva, il recettore per il segnale
di morte non funziona. Ced9 inibisce Ced4, quindi quando Ced9 è attiva inibisce Ced4, e la sua inibizione attiva Ced3
ecc. Quando arriva il segnale di morte si attiva il recettore che sta sulla membrana che si lega al ligando e il recettore
va a fosforilare Ced9 e lo inattiva. Quindi il recettore attivato inattiva Ced9 che non ha + la capacità di inibire Ced4
quindi Ced4 funziona e attiva a cascata una serie di proteine tra cui proteasi e nucleasi. Le proteasi degradano le
proteine e le nucleasi degradano la cromatina e quindi si vede il nucleo diviso in tante zolle e questo indica la morte
della cellula.

Nell’uomo non ci sono i geni con lo stesso nome ma geni molto simili, non c’è Ced9 ma Bcl2 che funziona allo stesso
modo, Bcl2 sta sulla membrana mitocondriale e inibisce Apaf1 che corrisponde a Ced4. Quando Bcl2 è inattivato dal
sistema di morte e Apaf1 funziona, determina una cascata di proteine che sono Caspasi che portano all’attivazione di
proteasi e nucleasi.

Quindi il meccanismo è simile e per questo si definisce universale.

L’apoptosi è un processo che riguarda l’eliminazione delle cellule che hanno dei difetti e sarebbe utile da applicare
alle cellule tumorali che hanno sviluppato meccanismi che non consentono l’apoptosi e quindi non muoiono per
particolari mutazioni. Ci sono delle patologie neurodegenerative come il Parkinson in cui sarebbe importante capire
come avviene l’apoptosi.
RNA interference
La scoperta di RNAi si basa su dati già raccolti. In passato si vide che inserendo nell’embrione del nematode RNA
double strand (RNA a doppio filamento), il gene omologo all’RNA introdotto veniva silenziato, quindi è un processo
che permette di silenziare un gene per esempio per capire che funzione ha il gene stesso, perché per capirlo si deve
vedere che succede quando il gene viene spento o sovrascritto. Se si vuole spegnere il gene per la Dineina non posso
intervenire direttamente sul gene stesso, ma devo intervenire sull’RNA messaggero prodotto dal gene e lo degrado
andando a costruire un RNA double Strand, ovvero con 2 catene complementari così da fargli contenere una
sequenza simile a quella dell’mRNA per la dineina e lo inserisco nell’organismo e con un particolare processo si ha
l’isolamento di una sola sequenza di RNA double strand che è quella complementare all’mRNA per la dineina e
quindi spengo il gene per la dineina stessa.
Questo RNAi segue un meccanismo universale applicabile in tutti gli organismi ed è facile e veloce da usare.
Il topo

Il topo è l’organismo modello + importante perché è un vertebrato mammifero molto vicino all’uomo. Il topo
condivide con l’uomo quasi tutti i geni ma non è facile da allevare, il suo tempo di generazione è di 3 mesi quindi +
lento del nematode. Non ci sono topi mutanti e quindi non si possono usare le mutazioni spontanee del topo e
quindi si deve indurre una mutazione costruendo i topi knock out spegnendo il gene di interesse che implica la prima
generazione e questi topi li devo incrociare e poi incrociare l’altra generazione un’altra volta e quindi si deve
aspettare 9 mesi per ottenere un risultato. Ci sono 2 svantaggi:
 - Ha un genoma enorme
- La fecondazione e lo sviluppo sono interni
Ciclo del topo

Per quanto riguarda il ciclo del topo si parla di giorni, la prima divisione avviene dopo 1 giorno, la blastocisti, ovvero
la fine della segmentazione si ha dopo 5-6 giorni e il topo nasce dopo 50-60 giorni quindi le tempistiche sono molto
lunghe.

Un gene di solito può essere attivato in seguito al legame con un’informazione esterna, ovvero un ligando che si lega
al recettore sulla membrana di una cellula, il recettore così dimerizza e quindi si uniscono 2 catene grazie al ligando e
il recettore dimerizzato può fosforilare fungendo da chinasi e tramite una serie di fosforilazioni si fosforilano varie
proteine e la proteina arriva sul DNA dove viene attivato o spento il gene target.

Il recettore inattivo si lega al ligando, il recettore dimerizza, si attiva la coda citoplasmatica che fosforila le varie
proteine. Se il recettore è mutato e manca la coda citoplasmatica, o è presente solo in 1 delle 2 molecole del
recettore, il recettore non funziona, non ho il segnale, non ho la trasduzione e il gene non viene né attivato né
spento.

Esempio: ho un recettore Kit che viene attivato dal legame di un ligando Steel che attiva il recettore che ha attività
tirosin-chinasica, fosforila una proteina e poi altre fino a che l’ultima entra nel nucleo e attiva la trascrizione di geni
specifici per la melanina.

Mutazione

Si prende un topo mutante per il ligando e per il recettore e si nota che questo topo ha una pancia bianca perché il
recettore attivato porta ad una trasduzione del segnale con attivazione di geni per la melanina, ma il recettore
mutato non funziona e i geni per la melanina nella pancia non sono attivi.

L’uomo ha una mutazione simile a questa del topo, la mutazione del gene Kit che porta ad un fenotipo dell’uomo
sovrapponibile a quello del topo. Nell’uomo però l’effetto di questa mutazione da anche problemi di sterilità, anemia
e sordità.

Questo processo porta all’attivazione di geni specifici per la melanina grazie al legame dell’ultima proteina con il
promotore del gene specifico per la melanina dove c’è la proteina MITF, e se muta ci si aspetta un fenotipo simile.
Quindi le mutazioni nel topo sono simili a quelle dell’uomo. Un’altra mutazione è quella del gene Pax3 che nel gatto
determina occhi di colore diverso e pelo bianco e probabilmente questi gatti sono sordi come nell’uomo.

Drosophila

La Drosophila è un altro organismo modello ed ha un tempo di generazione breve, si tiene a 24° con tempo di
generazione di 14 giorni, sopravvive in laboratorio, è facile da nutrire mangia lievito, costa poco. Alcune cellule come
le ghiandole salivari hanno cromosomi enormi e Drosophila ha tante mutazioni e i mutanti possono essere
mantenuti. Sono piccoli organismi ed è facile riconoscere il maschio dalla femmina. Ci sono 14.000 geni di cui 2/3
sono omologhi a quelli che si trovano nell’uomo.

Drosophila ha un gene omologo a quello del Parkinson giovanile nell’uomo, infatti la Drosophila ha geni simili a geni
per malattie neurodegenerative nell’uomo.
Nella Drosophila la parte terminale dell’addome del maschio è scura ed è + piccolo della femmina. Le uova portano
agli embrioni, poi 3 stadi larvali e poi la pupa da cui esce l’insetto adulto che è la mosca. Il tempo di sviluppo in
Drosophila è rapido. Dall’uovo fecondato alla fine della segmentazione ci sono 3 ore quindi una divisione avviene
ogni 9 minuti. Dopo 24 ore esce fuori la larva, la prima, la seconda e la terza, si impupa e dopo si forma l’adulto.

Morgan studiò la Drosophila e tutto inizia quando scopre una mosca con occhi bianchi che è il mutante white e da
qui Morgan fa incroci e scoperte importanti sugli alleli che si assortiscono in maniera indipendente, che i geni
segregano in maniera indipendente se stanno su cromosomi distinti, mentre geni che stanno sullo stesso
cromosoma non fanno ciò.

Muller era un collaboratore di Morgan che fa vedere che le mutazioni nei cromosomi spesso sono dovute a fattori
ambientali. Bridges studia i cromosomi enormi, nel cariotipo ci sono 2 cromosomi X, 2 puntiformi e 2 cromosomi
somatici, quindi sono pochi ed è facile capire dove si localizzano i geni. Bridges usa cromosomi politenici che sono
enormi e stanno nelle ghiandole salivari e sono migliaia di cromatidi appaiati che si formano per duplicazione di DNA
che non è seguita da divisione. I cromosomi politenici sono bandeggiati e usando le bande Bridges è riuscito a capire
dove si trovano i geni stessi.
Le bande si possono colorare per capire se avvengono riarrangiamenti, delezioni ecc. e lui riuscì a capire dove si
localizzano i geni e quindi fa una mappatura.

Mutanti

La Drosophila ha molte mutazioni naturali come per esempio nei geni per la sopravvivenza, geni per lo sviluppo
embrionale, altri importanti per stabilire le coordinate spaziali dell’embrione e quindi per la formazione degli organi.
Un altro aspetto importante è che accanto a questi mutanti naturali, le mutazioni si possono anche indurre usando i
raggi X che però frammentano il DNA in grandi frammenti, oppure l’RNAi in una mosca intera per studiare per es. la
dineina assonemale ecc. e inattivo l’mRNA di quel gene nel tessuto che mi interessa quindi si può indirizzare la
mutazione dove si vuole.

Quando si ha una mutazione naturale 1 gene sta su 2 alleli, se sono fortunato la mutazione è in omozigosi, mentre se
ho il mutante white i 2 alleli per la pigmentazione sono spenti, ma se lo incrocio con wild type la mutazione dopo un
po’ scompare. Per mantenere la mutazione ci sono sistemi che non fanno nascere embrioni con entrambi gli alleli
selvatici ma nascono solo quelli eterozigoti. Per riconoscere quali sono gli omozigoti o eterozigoti ci sono marcatori
che mi dicono quale è l’omozigote. Il moscerino wild type ha le ali dritte e il mutante ce l’ha piegate quindi li
riconosco in base alla forma delle ali.

Se voglio vedere la pupa omozigote o eterozigote prendo un marcatore che consiste nella forma, i wild type sono +
magri i mutanti sono + cicciotti.

Studio di Drosophila
Si prendono mosche con gene mutato per l’orientamento, se scuoto le piastre, le mosche wild type si muovono e
camminano tranquillamente, ma le mosche mutanti rotolano perché non hanno orientamento. Questa mutazione si
ha anche nell’uomo ma nel Golgi quindi su geni omologhi ma con funzioni diverse.
Ci sono mutazioni che danno informazioni basilari nella biologia dello sviluppo. La mosca ha il corpo diviso in
metameri con torace 1, torace 2 con le ali e torace 3 con i bilancieri che hanno strutture sensoriali e si muovono
dando alla mosca la posizione nello spazio quando vola e poi ci sono i segmenti addominali.

Ci sono dei geni che determinano la suddivisione del corpo come l’Engrailed che c’è anche nell’uomo e determina la
polarità dorso-ventrale del braccio. Nel topo si nota che quando si forma il cervelletto, se si fa il knock out per quella
proteina il cervelletto scompare, e se introduco Engrailed di Drosophila il cervelletto si riforma. Quindi l’Engrailed di
Drosophila è simile a quello del topo e può determinare la capacità di un gene, di una proteina di riportare alla
normalità un fenotipo che altrimenti non sarebbe normale.

Geni omeotici

La Drosophila ha i geni omeotici. Ci sono 2 mutanti naturali per questi geni omeotici:
1. Ultrabithorax: è un mutante che non ha bilancieri ma ha un paio accessorio di ali perché si duplica il torace
ma non riesce ad orientarsi.
2. Antennapedia: un gene mutato trasforma le antenne in zampe e questo è curioso perché le zampe sono
completamente diverse dalle antenne.

Quindi la mutazione in 1 solo gene è in grado di trasformare una struttura in un’altra. In un organismo ci sono dei
geni e una cellula si differenzia da un’altra perché ha geni spenti e accesi, ma per accendere o spegnere un gene si
pensava che ci dovesse essere per ogni gene un altro gene che regola appunto quel determinato gene ma questi geni
non ci sono se osserviamo il genoma. Ciò si spiega con i geni omeotici che sono in grado di regolare tanti geni e non
solo 1.

I geni omeotici funzionano quando ci sono strutture ripetute e anche l’uomo ce l’ha, per esempio la colonna
vertebrale, gli arti. I geni omeotici lavorano anche nell’uomo e sono presenti fin dalle spugne. Le spugne hanno 1
solo gene omeotico quindi il loro numero è proporzionale alla posizione degli organismi nella scala evolutiva.

Nel caso dei vertebrati i geni omeotici sono importanti per la determinazione dell’asse prossimodistale.
Si prende la struttura della zampa di un topo e si nota che ci sono geni omeotici espressi nel mesoderma quando si
differenziano le parti dell’arto e sono numerati in sequenza perché si esprimono in sequenza. Se costruisco un topo
dove spengo un gene, e quindi faccio un knock out, se spengo il gene in posizione 11 che da origine ad ulna e radio
questi spariscono quindi questi geni sono estremamente importanti.

Questo succede anche nell’uomo con una patologia a livello del gene omeotico ultimo in sequenza Hox 13.

Confronto tra effetto fenotipico di una mutazione in Drosophila e nel topo

Nel moscerino ci sono 2 alleli wild type e il moscerino è normale, nell’eterozigote ho 1 allele mutato e 1 normale ma
il moscerino è normale perché basta 1 copia del gene sano per avere un fenotipo normale. Per avere uno mutato
servono 2 alleli mutati.

Nel topo se ho i 2 alleli normali il topo è normale, se sono tutti mutati il topo muore, se è eterozigote il topo
sopravvive ma ha coda deforme perché nel topo in eterozigosi non è detto che il fenotipo sia determinato dall’allele
wild type ma ci può essere una componente dell’allele mutante che altera il fenotipo.

Quindi in Drosophila per controllo prendo l’eterozigote, nel topo l’omozigote dominante.

Differenza genetica tra modelli

La differenza tra moscerino e topo è importante quando si inducono le mutazioni perché nel caso del moscerino la
mutazione come occhi bianchi è visibile solo in omozigosi, mentre nel caso di un moscerino eterozigote il fenotipo è
normale, per esempio occhi rossi quindi è sufficiente un allele per determinare il moscerino wild type. Mentre nel topo
il wild type è dato da 2 alleli dominanti, mentre la mutazione si vede in omozigosi recessiva, ma in eterozigosi 1 allele
non è sufficiente per generare un moscerino wild type.
Questo è importante per gli incroci e per vedere la mutazione.

Utilizzo degli organismi modello

La semplicità di utilizzo non giustifica perché uso determinati organismi modello, ma il motivo è un altro, ovvero che
questi individui hanno una grande quantità di geni in comune con l’uomo. Questo significa che studiare il moscerino
o il Caenorhabdtis semplifica molto le cose perché quando si vuole studiare l’espressione di geni umani si devono
usare le cellule in coltura ma non sempre danno risposte attendibili.

Se si considera il gene Pax6 nel topo, si nota che la sua delezione porta ad una mutazione, ovvero una riduzione
dell’occhio. Pax6 regola quindi lo sviluppo dell’occhio non solo nel topo ma anche nell’uomo e nelle seppie,
nell’occhio normale c’è l’iride mentre nel mutante non c’è e il suo funzionamento è limitato.

Ovviamente Pax6 c’è anche nella mosca. Negli insetti l’occhio è composto e diverso da quello umano ed è particolare
perché fatto da tanti ommatidi. Ogni ommatidio ha la sua lente e 7 cellule fotorecettrici che non sono orientate
verso la luce. Ma Pax6 è coinvolto anche nella formazione dell’occhio anche nel moscerino e quindi nonostante la
diversità regola la formazione degli occhi.

Nell’uomo con mutazione si perde l’iride, in eterozigosi si ha la mutazione, nel topo invece per perdere
completamente l’occhio deve esserci l’omozigote recessivo, nella mosca l’omozigote porta alla perdita dell’occhio.
Quindi la mosca è utile perché l’idea è che se io Pax6 lo faccio esprimere in una regione diversa dalla testa, siccome
durante lo sviluppo degli olometaboli la larva si trasforma in pupa e poi adulto, nella larva ci sono strutture
indifferenziate ma determinate che sono i dischi immaginali, quindi nella larva queste strutture sono schiacciate e
ognuna da origine ad una parte del corpo, zampe, ali, occhi. Quando la larva si trasforma in pupa e quindi entra in
azione l’ecdisone le cellule dei dischi proliferano e formano la struttura e quindi ci si aspetta che formino gli occhi
nella testa.
Nel moscerino si possono far esprimere i geni dove vogliamo con il sistema GAL4 che viene inserito vicino all’enancer
che indirizza l’espressione di un gene in un tessuto e quindi nel promotore metto GAL4, ma in un’altra mosca metto
Pax6 legata alla sequenza di attivazione UAS che si attiva quando le 2 mosche si incrociano. Nella progenie GAL4 attiva
UAS quindi GAL4 porta il Transgene (Pax6) ad essere attivato dove si vuole come nelle zampe. Allora succede che si
sviluppa un occhio nelle zampe o + occhi che però ovviamente non sono funzionanti.

Quindi così si dimostra che Pax6 quindi un solo gene è in grado di costruire una struttura che somiglia ad un occhio.
Se prendiamo una seppia, ha un occhio simile a quello dell’uomo e la sua formazione è controllata da Pax6 e se
prendo Pax6 della seppia e lo faccio esprimere nella zampa di una mosca succede che si formano gli ommatidi come
quando usavo Pax6 della mosca. Quindi questo dimostra la conservazione di questo gene.

Ci sono animali diblastici come le cubomeduse che hanno geni Pax che però non sono ortologhi cioè sono diversi da
Pax6. Nella medusa di un idrozoo c’è il manubrio e sul margine ci sono strutture fotorecettrici e si è visto che in
queste ultime viene espresso un gene chiamato Pax-A che è stato isolato e fatto esprimere nel moscerino e si è visto
che induce la formazione di occhi nel moscerino.

Ciò significa che la formazione dell’occhio è regolata da un gene estremamente conservato durante l’evoluzione.

Da tutto ciò viene fuori la possibilità che l’occhio abbia un’origine monofiletica cioè potrebbe derivare da una
struttura ancestrale dalla quale negli animali bilateri si è sviluppato Pax6. Quindi questo gene è comunque
estremamente conservato durante l’evoluzione. Anche il gene per la tubulina è conservato, quindi ci sono tanti geni
conservati, ma questo Pax6 è + interessante perché è sufficiente 1 gene per costruire la struttura.

Come studiare lo sviluppo in biologia

Le metodiche che si usano nella biologia dello sviluppo sono:

- Osservazione diretta
- Esperimenti di manipolazione
Quindi lo studio può essere descrittivo che però fa fare domande alle quali si può rispondere solo vedendo chi
determina il fenomeno tramite lo studio di genomica, di biochimica, biologia cellulare e poi devo capire come
funzionano i geni e ho 2 possibilità: o tolgo il gene per capire che funzione ha o incremento la funzionalità del gene.
Ma ci sta che poi un gene va ad interagire con altri per definire una funzione. Quindi di solito tolgo il gene, ne faccio
il knock out.

La biologia dello sviluppo si basa su 3 sistemi di studio fondamentali:

1. Biologia molecolare
2. Genetica
3. Biologia cellulare

Mappe del destino

Io ho un embrione, poco prima dell’inizio della gastrulazione, vorrei sapere queste cellule che apparentemente sono
uguali a cosa danno origine nell’adulto in quanto ho una disposizione particolare delle cellule. Gli esperimenti si fanno
principalmente sulla rana. Si prendono delle zolle di agar colorate con colorante vitale, si mettono sopra all’embrione,
le cellule assumono il colorante e quando si sviluppano mantengono il colore e quindi posso capire quale è il loro
destino.

Si chiamano mappe del destino perché seguo il destino delle cellule segnate.
All’inizio della fase di neurulazione si possono identificare cellule con colorante fluorescente e quando questo
gruppo di cellule si divide queste delimitano una struttura e quindi questo indica che le cellule segnate formeranno
quella struttura.

Ciò permette di dire che, guardando l’uovo di uno Xenopus con parte chiara con tuorlo e parte pigmentata, le cellule
in regione equatoriale della blastula originano il mesoderma, quelle della regione vegetativa danno origine
all’endoderma e la parte sopra al mesoderma da origine ad ectoderma e quindi sistema nervoso. Ciò si può capire
marcando le cellule prima del loro differenziamento.

Nello Xenopus è + semplice perché ci sono uova, ovvero embrioni grandi. È + difficile nel pollo anche se è comunque
possibile effettuare esperimenti in cui posso tracciare linee cellulari. Prendo un embrione di quaglia dopo la
segmentazione, ovvero un embrione di specie diverse e se ne inserisce una parte nell’embrione di pollo e si vede che
le cellule della quaglia si inseriscono nel tubo neurale e quindi seguo il destino delle cellule.
Manipolazione sperimentale

Gli esperimenti implicano di isolare e trapiantare blastomeri. In un esperimento si dimostra che nell’embrione di un
tunicato se separo dei blastomeri allo stadio di 8 blastomeri, separo una coppia e si forma un embrione che manca di
muscoli, mentre nell’altro embrione si formano solo i muscoli. I muscoli vengono evidenziati tramite l’espressione
dell’acetilcolina esterasi e quindi se rimuovo i 2 blastomeri e i muscoli non si formano è chiaro che quelli sono
responsabili della formazione dei muscoli.

Questo accade anche con la rana quando isolo 2 blastomeri che formano 2 girini, ma si formano solo 2 girini perché il
blastomero di dx contatta il blastomero che non funziona + ma non sa che non funziona e quindi si differenzia solo
una parte.

Nel riccio di mare si separa l’embrione allo stadio di 4 blastomeri e ognuno forma una larva con sviluppo regolativo.

Spemann e Mangold sono 2 scienziati che fecero un esperimento in cui trapiantarono pezzi di tessuto. Nell’embrione
della rana, allo stadio di inizio di gastrulazione, si prende un pezzetto di tessuto di una regione di un embrione e lo
trapiantano nella parte opposta di un secondo embrione e succede che la regione trapiantata porta alla formazione
di un secondo embrione con formazione di 2 girini siamesi. Questo esperimento è importante perché si vede
l’influenza di un tessuto rispetto allo sviluppo di altri tessuti.
In questo esperimento si fa vedere che si trapiantano alcune cellule di una gastrula su un’altra gastrula e si forma un
secondo embrione attaccato all’altro ma ciò non aveva nessuna spiegazione a quel tempo.

Per capire cosa succede intervengono altre analisi. Per vedere quali sono le proteine espresse durante certe fasi dello
sviluppo si possono fare varie analisi:

 Western Blot: si basa su una reazione antigene-anticorpo, ovvero si ha una proteina che devo andare a vederla
e la posso vedere se qualcosa la marca e quindi ho un anticorpo contro la proteina. Per esempio per vedere la
tubulina in un insieme di proteine, devo fare un marcatore specifico per la tubulina e quindi un anticorpo che
io posso costruire. Questo è l’anticorpo primario che si mette in contatto con le proteine, l’anticorpo primario
si lega alla tubulina e per vedere il complesso antigene-anticorpo devo usare qualcosa che evidenzia
l’anticorpo ovvero un anticorpo secondario che si lega al primario. L’anticorpo secondario riconosce il primario
e vedo il complesso perché il secondario è legato o a una perossidasi o a una sostanza fluorescente e quindi si
può riconoscere dove si lega.

Quindi si ha un embrione di un moscerino e voglio vedere quando sono espresse determinate proteine, oppure di
una rana e la prima cosa che faccio è prendere l’embrione di rana, lisarlo, denaturare le proteine che hanno un
folding (ripiegamento) e è difficile che l’anticorpo le riconosca in quanto esso riconosce pochi amminoacidi quindi
il riconoscimento è + semplice se la proteina non ha un folding e quindi faccio srotolare le proteine tramite la
denaturazione. A questo punto ho una provetta con tutte queste proteine e all’inizio avevo preparato un gel di
poliacrilammide che permette di separare le proteine e qui ci sono pozzetti in cui metto le proteine denaturate.
Sottopongo il gel ad un’elettroforesi e quindi queste proteine vengono separate perché ci sono fori attraverso i
quali passano solo le proteine piccole mentre le grandi stanno in alto e ciò è permesso anche dalla carica delle
proteine. Quindi sottopongo il gel ad una differenza con catodo e anodo e quindi le proteine si separano, le +
leggere + veloci vanno in basso e quelle + pesanti stanno in alto. A questo punto arriva un altro processo, le
proteine vengono trasferite tramite un processo che attiva cariche elettriche, ad una membrana tramite contatto.
La membrana porosa si mette a contatto con il nostro anticorpo primario e poi con il secondario e se l’anticorpo è
fluorescente con i raggi UV vedo dove è localizzato l’anticorpo.
Per localizzare le proteine si osservano delle bande e tramite il processo di blot rimane una sola banda che ci fa
localizzare la proteina.
 Northern Blot: riconosce e localizza l’RNA ed è un sistema simile al western per le proteine. C’è un gel sul quale
ci sono pozzetti in cui si mettono gli RNA che prima erano stati isolati. Tramite una differenza di potenziale gli
RNA corrono, quelli intrappolati nel gel vengono trasferiti nel filtro poroso e a questo punto li devo evidenziare.
Per evidenziarli uso probe che sono frammenti di RNA marcati con sonde radioattive oppure con coloranti legati
ai probe e quindi i probe fanno la funzione dell’anticorpo. Il probe è un qualcosa di complementare all’RNA
quindi si legano all’RNA che si cerca e quindi all’RNA si lega il probe che per esempio è il fosforo radioattivo. Nel
caso di probe radioattivi si possono evidenziare ai raggi X.

Un esempio è quello che ci fa vedere gli RNA espressi durante lo sviluppo dell’embrione di uno Xenopus. Il gene
pagliaccio è espresso nella gastrulazione ma non + nel girino e determina la formazione del mesoderma, per questo
si trova nell’ovocita e poi nella gastrulazione ma poi se ne va.
DNA microarray
- Southern blot: riconosce il DNA
- DNA microarrays: i microarrays sono scatoline con un CIP piccolo con tante finestrelle, unità nelle quali ci sono
i probe all’interno che sono sequenze a singola catena.

Queste sequenze rappresentano dei probe che corrispondono ai geni. Quando voglio vedere l’espressione dei geni
devo preparare i DNA complementari, ovvero devo estrarre RNA che non è sufficiente perché devo creare DNA
complementare perché i probe sono a singola catena. Devo fare quindi una trascrizione inversa da RNA a DNA e lo
dobbiamo fare in laboratorio. L’RNA viene trascritto in DNA a singola catena che viene legato a dei coloranti, a
questo punto questi DNA vengono messi a contatto con il CIP e quelli che riconoscono il probe ci si legano e danno
un colore.

Tutto va letto con uno scanner. Questo esperimento ci fa vedere come un gene si attiva dall’interazione con un’altra
proteina. Quando la proteina chiamata attivina che è un ligando viene messo a contatto con il CIP si accende un solo
spot e lo scanner dice che questo spot acceso corrisponde al gene Chordin in quanto lo scanner memorizza tutte le
posizioni, mentre nel controllo dove c’è solo acqua quel gene è spento. Quindi questo gene si attiva solo in presenza
del lingando dell’attivina.
Questo esperimento ha una limitazione perché molto costoso.
Per vedere dove si localizzano gli antigeni, dove l’RNA viene espresso, devo costruirmi un cDNA isolando gli RNA,
prendendo l’RNA che mi serve e con la trascrittasi inversa faccio il cDNA a singola catena che così si lega all’RNA
messaggero in quanto voglio vedere proprio dove si localizza quell’mRNA. Il cDNA viene legato alla digoxigenina
legata all’uridina quindi a questo punto il cDNA si lega all’RNA portandosi dietro la digoxigenina. Per evidenziare il
complesso prendo un anticorpo contro la digoxigenina, l’anticorpo porta dietro la fosfatasi alcalina con cui è legato.
L’anticorpo riconosce la digoxigenina ma ciò non mi permette di vedere la localizzazione perché non c’è colore fino a
che con la fosfatasi rimuovo i gruppi fosforo della fosfatasi alcalina e così si colora di viola e posso vedere dove è
localizzato l’RNA.

Per vedere la proteina uso l’immunofluorescenza. Io ho un’immunofluorescenza diretta che vede il fluorocromo
legato all’anticorpo primario e quella indiretta vede l’anticorpo primario legato alla proteina e il secondario legato al
primario e alla sostanza fluorescente.

Ci vuole un preciso microscopio a fluorescenza che consiste in una lampada da cui esce un raggio luminoso che viene
selezionato e viene riflesso da uno specchio verso un campione che emette luce che torna in alto e si vede con
l’oculare. Questo perché la sostanza fluorescente legata all’anticorpo secondario è una sostanza che colpita dalla
luce emette luce. La + usata è la fluoresceina, ovvero un fluorocromo che viene colpito da luce blu con una certa
lunghezza d’onda, gli elettroni salgono di livello perché acquisiscono energia potenziale che viene persa e quindi
salgono di livello e riscendono e riscendendo emettono energia, ma quella presa è maggiore di quella persa e quindi
io vedo verde perché lui ha lunghezza d’onda inferiore.

Quindi se inserisco il campione in cui il fluorocromo legato all’anticorpo secondario è la fluoresceina, la luca parte lo
specchio seleziona la luce, quella blu passa, gli elettroni del campione salgono e poi scendono di livello ed emettono
luce verde che passa dallo specchio e io la vedo.
In blu si vedono i nuclei, in rosso i microtubuli e in giallo i centrioli. Quindi questo sistema fa visualizzare le proteine.

Per avere maggiore risoluzione si usa un microscopio elettronico a scansione che usa un fascio di elettroni che
vengono prodotti da un filamento eccitato e gli elettroni che colpiscono il campione devono essere riflessi quindi il
campione deve essere ricoperto da una patina di oro perché così gli elettroni vengono riflessi.
L’altro microscopio è l’elettronico a trasmissione in cui c’è la produzione di elettroni che vengono spinti in basso e
convogliati da lenti verso il campione che sono delle fette sottilissime e gli elettroni le attraversano in modo diverso,
dove è trasparente passano e colpiscono la fascia fluorescente che si illumina e l’illuminazione dipende dall’energia,
dove il campione è più scuro si perde energia e quindi si vedono colori + scuri. Ciò porta a capire la struttura,
l’organizzazione e quindi per studiare le mutazioni si preferisce questo strumento per capire le modificazioni.
Se voglio vedere dove si localizza la proteina, il centriolo è colorato tutto ma io voglio sapere dove sta 1 sola proteina
non posso vederlo con la fluorescenza ma con un adattamento della fluorescenza ovvero immunoelettroscopia in cui
devo sostituire il fluorocromo con palline di oro colloidale che si possono vedere al microscopio elettronico perché
gli elettroni non passano.
La sezione di una ghiandola salivare ha un disc large e si vuole capire se ha la stessa funzione di una proteina
nell’uomo e si è potuto capire con il microscopio dove si è localizzata la sua posizione.
Per capire la funzione:

- Inibire proteine tramite farmaci

- Costruire organismi knock out

Gli embriologi si erano accorti che mettendo cloruro di litio in acqua dove crescevano i girini, questi perdevano la
loro forma e diventavano tutta testa e si è visto che il litio determinava un fenotipo perché interagisce con i fattori
che determinano la polarità dell’embrione.

I geni omeotici determinano la posizione per es delle zampe e se io faccio crescere un girino in acido retinoico, il
girino presenta coda con zampe perché si altera l’espressione dei geni omeotici.

Differenza tra topo transgenico e knock out

Un topo transgenico è quello in cui si è inserito un nuovo gene e il knock out è quello in cui il gene viene spento. Per
ottenerli ho bisogno di un topo chimerico che è un ibrido tra + genitori, ovvero nasce dalla combinazione di cellule
staminali di 2 parenti diversi. Nello sviluppo alla fine del cleavage si forma la blastocisti, ovvero una sfera cava fatta
da cellule piatte, all’interno c’è la cavità e in posizione asimmetrica ci sono le cellule della massa cellulare interna,
che sono le cellule staminali da cui deriva l’embrione.

Per costruire il topo chimerico prendo le cellule staminali della massa cellulare, le metto in coltura, così si separano e
poi le metto nella blastocisti di un altro topo. Il donatore ha pelliccia colorata, mentre l’accettore è albino. Le cellule
vengono inglobate nella massa cellulare e il topo che si sviluppa è a macchie perché prende info dalle nuove cellule
trapiantate.
Per fare un topo chimerico posso anche prendere prima della fine della blastocisti, 2 embrioni, 1 derivato da genitori
albini e 1 da genitori colorati e tramite un enzima isolo le cellule, le fondo e iniziano a dividersi per formare
blastocisti ibrida con un po’ di cellule colorate e un po’ albine. Le blastocisti sono messe nell’utero della madre e
nasce un topo a macchie e strisce che deriva da 4 genitori. Un topo a macchie di 3 colori deriva da 6 genitori, ovvero
il marrone da 2 genitori marroni, il bianco da 2 bianchi ecc.

Topo transgenico

A questo punto posso voler aggiungere un gene e creare un topo transgenico e lo posso fare con cellule che possono
crescere in coltura e dare tutte le cellule di tutto l’organismo, ovvero le staminali embrionali che sanno dare tutti i
tipi cellulari che formano l’organismo. Quindi devo prendere le cellule staminali e la GFP che è una fluoresceina che
si deve far esprimere nelle cellule della massa cellulare interna per dimostrare che queste cellule originano tutto
l’organismo e infatti il topo è tutto di colore verde fluorescente.

A questo punto quindi si prendono madre e padre da cui deriva la blastocisti con la massa cellulare interna e hanno
entrambi pelliccia chiara. Prendo le staminali embrionali, le metto in coltura dove proliferano, faccio in modo che il
gene che voglio clonare in un plasmide batterico venga inglobato nelle staminali, le staminali vengono messe nella
blastocisti ottenuta da 2 topi di colore diverso. Le cellule staminali con il transgene si mettono nella blastocisti
ottenuta da 2 genitori bianchi, così la blastocisti viene messa nell’utero di una femmina che fa da madre
temporanea. I topi che nascono sono a strisce o comunque chimerici. Ma io non posso vedere il gene, so che ce
l’hanno ma non riesco a capire dove sta.

Allora devo fare un altro incrocio tra chimerico e wild type e vengono fuori 2 topi eterozigoti e ancora non riesco a
vedere il risultato. Incrocio i 2 eterozigoti e ottengo ¼ wild type, ½ eterozigoti e ¼ transgenici e così ottengo i topi in
cui si esprime questo transgene.
L’esperimento è quindi molto lungo.
Knockout

Se io voglio vedere il fenotipo e quindi la funzione del gene i mutanti sono pochi e quindi non ho la stessa possibilità
degli altri 2 modelli per capire la funzione del gene, ma io posso eliminare il gene con il knockout e così capisco quale
è la sua funzione anche se non è detto che per forza il gene corrisponde a una funzione perché certi geni lavorano in
sequenza.

Per eliminare il gene si considera il gene BMP7. Un gene si trova su 2 cromosomi, si costruisce un plasmide in cui il
gene è interrotto in quanto è una sequenza di basi azotate, e all’interno inserisco un altro gene per interrompere
quella sequenza e il gene non funziona perché non può essere letto. Quindi si inserisce un gene che da resistenza alla
neomicina nel nostro gene di partenza, e si ottengono 2 effetti:

1. Si annienta la funzione del gene

2. Si riconoscono le cellule che hanno incorporato il gene mutato

Si prendono le cellule della massa interna, si mettono in cultura, poi con elettroporazione si permeabilizza la
membrana in quanto deve far entrare il pezzetto di DNA mutato, il gene mutato entra nel nucleo delle cellule, in
alcune viene incorporato e per sapere quale è la cellula che ha incorporato il gene mutato uso la resistenza per la
neomicina, quindi aggiungo neomicina e quelle che non hanno resistenza muoiono e rimangono vivi e solo quelle
con gene mutato. Prendo così quelle cellule e le inserisco in una blastocisti ottenuta da genitori che hanno pelliccia
diversa dai genitori che hanno originato le cellule staminali. Si mette la blastocisti nell’utero della madre e nascono i
topi chimerici che si incrociano con i wild type, nascono eterozigoti che si incrociano tra loro e dal loro incrocio
nascono ¼ topo dominanti per BMP7, ½ eterozigoti e ¼ in cui il gene non funziona. Dopo tutto ciò quindi si capisce
che il mutante non ha l’occhio quindi BMP7 è coinvolto nella formazione dell’occhio ed inoltre il mutante ha rene +
piccolo quindi il knock out da un fenotipo che mi aiuta a capire la funzione del gene.

RNAi

L’RNA interference è un processo che hanno già i batteri che devono difendersi dai virus. I batteri hanno un
meccanismo che porta alla degradazione di RNA virale. Il virus inserisce l’RNA double strand nel batterio in cui il
meccanismo presente degrada questo RNA virale. Questo meccanismo è stato chiarito nel Caenorhabditis e viene
usato per spegnere la funzione di geni in un organismo o in cellule.
Questo meccanismo c’è nei batteri ma è usato in organismi interi o in cellule o embrioni.
Deve essere preparato un RNA double strand ovvero a doppia catena, e non posso agire sul gene ma sulla sua
espressione quindi silenzio la sua espressione, ovvero interferisco con mRNA prodotto dal gene impedendo che
l’RNA trascritto venga tradotto.

Io voglio che non si esprima l’RNA per la tubulina, allora preparo l’RNA double strand con un pezzetto che è omologo
dell’RNA per la tubulina. Questo double strand lo metto nella cellula e tramite una endoribonucleasi Dicer si taglia il
in corti pezzetti che vengono inglobati in un complesso in cui sono parzialmente degradati. Nella catena le 2
sequenze vanno in senso opposto e questi pezzetti vengono separati in maniera tale che la parte senso dell’RNA
venga degradata e rimangano solo catene anti-senso che riconoscono la parte senso dell’RNA per la tubulina e ci si
legano e quando questo riconoscimento avviene, il complesso RISC si attiva e fa attivare un altro enzima che
spezzetta l’mRNA per la tubulina che sparisce dalla cellula che rimane così priva di tubulina.

Tutto ciò consiste nel costruire un RNA double strand che corrisponde a una sequenza dell’mRNA per la tubulina così
da degradare quell’mRNA tramite l’attivazione di endonucleasi.

L’RNAi si fa per una Caderina in embrione di topo. Nel primo sviluppo del topo ho 8 cellule, allo stadio di 8 cellule si
ha la compattazione in cui questi 8 blastomeri si avvicinano molto grazie all’espressione di Caderine che sono
proteine di adesione. Se io creo RNAi per la caderina la compattazione non avviene e quindi non c’è sviluppo
dell’embrione.

L’RNAi ha vantaggi e svantaggi:

- Non tutti i geni possono essere inibiti

- L’RNAi non funziona nel 100% delle cellule che si hanno
- C’è variabilità nei risultati
- È un sistema molto veloce

L’RNAi è importante dal punto di vista medico perché posso spegnere la funzione di geni che non gradisco con 3
sistemi:

1. Si può inserire l’RNA attraverso delle nanoparticelle lipidiche che si fondono alla membrana, entrano nel
citoplasma, liberano l’RNA che si lega all’mRNA che si vuole eliminare e tramite il complesso RISC c’è la
degradazione dell’RNA che non deve essere espresso
2. Si introduce l’mRNA come plasmide tramite un vettore virale che inserisce il plasmide nel nucleo, il plasmide
codifica per un mRNA che va nel citoplasma e contribuisce alla costruzione del RISC che serve per la
degradazione dell’mRNA da eliminare

Tecniche di trasformazione genica

CRISPR-Cas9

Questa metodica ci fa individuare il punto del DNA che ci interessa e ce lo fa tagliare per inserire o rimuovere una
sequenza. Anche questa si basa su un meccanismo di difesa dei batteri perché c’è un sistema di protezione contro i
virus.

Questo è un meccanismo di immunità dei batteri che si sfrutta per cambiare i geni. Il CRISPR (brevi ripetizioni
palindrome raggruppate a intervalli regolari) indica una regione di DNA con repeats che sono sequenze palindrome
ripetute e tra esse ci sono spazi ovvero dei frammenti di informazione genetica di virus che sono arrivati a contatto
con la cellula. C’è una sequenza leader che serve per indirizzare il meccanismo di distruzione del processo verso i
geni CAS che codificano per nucleasi, polimerasi ecc e quindi sono proteine che servono per tagliare il DNA.
Arriva un fago nella cellula in cui inserisce il suo DNA e un pezzetto viene preso dal batterio e integrato nella
sequenza CRISPR che è una sorta di biblioteca in cui si accumulano le caratteristiche dei fagi con cui il batterio è
venuto a contatto. Ora arriva un altro fago dello stesso tipo, inserisce il suo DNA nel batterio che si ricorda o
riconosce il genoma di quel virus e trascrive un pezzetto della sequenza che lui aveva immagazzinato e viene
trascritto l’RNA CRISPR che si lega al complesso per tagliare il DNA o RNA del fago che ha infettato il batterio.

Sperimentalmente si ha un gene e si vuole tagliare quel gene. Io ho la sequenza target che deve essere tagliata,
allora viene trascritto un RNA CRISPR che è il corrispondente della sequenza di DNA da tagliare. C’è il riconoscimento
in quanto nelle sequenze spaziatrici c’è già memorizzata quella sequenza. L’RNA riconosce la sequenza ma ciò non è
sufficiente perché la sequenza deve essere tagliata e mi serve il gene Cas nel punto da tagliare e viene portato dalla
sequenza leader. La sequenza leader segue il CRISPR in quanto l’RNA si lega al CRISPR RNA e si forma l’RNA guida
fatto dalla sequenza CRISPR e dalla sequenza trascritta dalla sequenza leader quindi l’RNA guida indirizza Cas9 nella
zona da tagliare. L’altro problema è come fa Cas9 a tagliare in maniera precisa il DNA. Lo fa grazie a sequenze PAM
che delimitano le zone di taglio.

Il gene editing si basa su questo procedimento. Per modificare una sequenza mi serve un mRNA che riconosce la
sequenza e quindi ho in laboratorio l’RNA guida con sequenza leader e RNA che corrisponde alla sequenza target. Dal
punto di vista medico quindi posso inserire un gene funzionante togliendo quello non funzionante e questo è
estremamente importante perché per esempio posso correggere il diabete.
DIVISIONE CELLULARE

All’inizio dello sviluppo, quando l’uovo è fecondato va incontro ad una serie di divisioni cellulari che non si trovano
solo sull’embrione, ma anche nei tessuti adulti per mantenere l’omeostasi. Le cellule si dividono continuamente ma
se una cellula sbaglia la divisione nascono problemi importanti. La divisione cellulare consiste in meiosi e mitosi.
La divisione cellulare è stata descritta per la prima volta da Flemming alla fine del 1800 che aveva visto che durante il
processo di divisione i cromosomi che lui chiama filamenti, non ci sono in interfase ma poi iniziano a disporsi in
maniera sempre + ordinata in struttura equatoriale in metafase e poi si separano e vanno in 2 cellule figlie. Aveva
inoltre visto che in metafase i filamenti erano doppi. Flemming dice che questi filamenti sono appaiati prima che le
cellule figlie si formino e ognuna ne riceve 1.
Fusione dei gameti, fertilizzazione

In seguito viene dimostrato che nel riccio di mare l’embrione deriva dalla fusione di 2 cellule. Inoltre il numero di
filamenti nei gameti è la metà delle cellule in mitosi. Così si distinguono 2 tipi di cellule ovvero le cellule somatiche
con filamenti doppi durante la divisione e i gameti che ce l’hanno la metà. Quindi si propone che ci siano 2 tipi di
divisione perché se da una parte ho cellule aploidi e dall’altra diploidi, i meccanismi che portano ad esse sono diversi
e quindi si propone il termine di meiosi per la divisione che porta alla formazione dei gameti.
Poi i filamenti vengono chiamati cromosomi (corpi colorati) perché venivano colorati con coloranti particolari, quindi
poi tramite le colorazioni si scopre che i cromosomi sessuali sono diversi dagli altri e quindi i cromosomi si dividono
in autosomi e cromosomi sessuali.

Il cromosoma è, negli eucarioti, un filamento di DNA che si arrotola intorno alle proteine che sono gli istoni e c’è una
regione particolare che è il centromero che serve per l’aggancio di microtubuli del fuso. Un organismo di solito ha
coppie di cromosomi omologhi e gli alleli sono quindi duplicati, ci sono 2 cromosomi 1, 2 cromosomi 2 ecc. Questi
cromosomi derivano 1 dal padre e 1 dalla madre. I cromosomi si visualizzano bene quando la cellula si deve dividere
perché la cromatina prima è distribuita in modo da non vederla in quanto è fatta da DNA + proteine e il DNA deve
essere trascritto quindi non è compattato. Quando la cellula inizia a dividersi la cromatina si condensa e quindi si
vedono i cromosomi. In metafase i cromosomi sono 10 000 volte + corti che in interfase proprio perché la cromatina
si condensa. In metafase ci sono 2 cromatidi per ogni cromosoma e la regione centrale è il centromero.

Prima della divisione il DNA deve duplicarsi quindi il cromosoma è fatto da 1 solo cromatidio, poi i cromatidi
duplicano e ogni cromosoma appare fatto da 2 cromatidi, ma il numero di cromosomi rimane sempre lo stesso.

Mitosi

La duplicazione dei cromatidi avviene durante l’interfase in fase S perché le cellule figlie devono avere la stessa
quantità di patrimonio genetico della cellula madre e ciò si ottiene con il ciclo cellulare che porta 1 cellula a fare 2
cellule uguali alla prima quindi cloni cellulari, ma non è proprio vero perché una cellula ha mitocondri, ribosomi, RE,
Golgi che non sono ripartiti in modo uguale tra le 2 cellule, ma le cellule figlie sono cloni per quanto riguarda la
porzione genetica, ma non contengono la stessa quantità di mitocondri, ribosomi ecc.

Il ciclo cellulare per le cellule somatiche è composto da 2 fasi:

1. Interfase: molto lunga che è fatta da 3 sottofasi:

- G1
- S
- G2

Le G sono le fasi di crescita in cui la cellula trascrive e traduce le proteine che servono per la divisione e c’è un
meccanismo che fa dividere la cellula solo quando è aumentata la dimensione in quanto per esempio ci vogliono
tanti microtubuli per il fuso mitotico e quindi durante le fasi G vengono sintetizzate tante proteine che servono per la
divisione successiva. La fase S è quella in cui si ha la duplicazione del DNA perché le 2 cellule figlie devono avere la
stessa quantità di DNA. La cellula continua a crescere fino a che non arriva a potersi dividere con la mitosi.

2. Mitosi: ci deve essere qualcosa che permette la separazione dei cromatidi fratelli nelle 2 cellule figlie e questo
è il fuso mitotico con i microtubuli che si agganciano ai centromeri e i microtubuli stanno ai 2 poli opposti da
cui si dipartono altri microtubuli detti astrali. Il fuso ha i cromosomi in piastra metafasica e sono legati
attraverso il cinetocore ai microtubuli che vengono dai poli opposti e i microtubuli sono detti microtubuli del
cinetocore, infatti nel centromero ci sono proteine che formano il cinetocore a cui si agganciano i microtubuli.
Ai poli ci sono microtubuli astrali e poi ci sono i microtubuli che non contattano i cromosomi ma che corrono
antiparalleli e si sovrappongono nella parte centrale del fuso e sono microtubuli interpolari. I fusi sono tutti
organizzati dal centrosoma che è un organello perché nel centrosoma ci sono tante proteine tra cui la gamma
tubulina che è una proteina che si dispone a formare anelli corti sui quali crescono i microtubuli e quindi è il
punto di creazione di microtubuli del fuso.
Evoluzione cellula in mitosi

Prima della Mitosi il DNA si duplica in fase S e la cellula in interfase ha 1 solo centrosoma, ovvero 1 sola struttura per
organizzare i poli, ma i poli sono 2 e quindi anche il centrosoma deve essere duplicato durante la fase G1/S e quindi
si ha DNA duplicato e centrosomi duplicati. I centrosomi sono vicini e poi iniziano ad allontanarsi e si formano i
microtubuli che si sovrappongono e tramite proteine motrici allontanano i centrosomi fino a farli disporre ai poli
opposti. In profase inizio a vedere i cromosomi che si muovono per andare in piastra grazie ai microtubuli del fuso. In
metafase i cromosomi sono in piastra e dopo che si sono allineati si separano e vanno ai poli opposti dopo in seguito
a divisione si formano le 2 cellule figlie.

Dopo che i cromosomi sono allineati in piastra, i cromatidi fratelli che compongono un cromosoma, si separano in
anafase e vanno nelle 2 cellule figlie.
A guidare il processo di movimento dei cromosomi sono i microtubuli che si agganciano al cinetocore che determina
il loro spostamento ai poli opposti. Il cinetocore è fatto da una piastra scura + interna, 1 piastra chiara e ancora 1
scura su cui si agganciano i microtubuli.

Quando i cromosomi sono in piastra si attiva un meccanismo che dice che i cromatidi possono separarsi.

Separazione dei cromatidi fratelli

I cromatidi sono legati tra loro tramite una proteina che è la coesina. Per separare i cromatidi fratelli ci deve essere
un enzima che la degrada e funziona solo alla fine della metafase e questo è importante perché altrimenti i cromatidi
fratelli si separerebbero quando non sono allineati in piastra e una cellula ne riceverebbe + dell’altra. Il meccanismo
di controllo fa sì che il complesso APC venga attivato e attiva l’enzima che serve per degradare la coesina che si
chiama separasi che è presente nella cellula, in interfase, in prometafase, ma non funziona perché la separasi è
legata in interfase, prometafase e profase ad una proteina inibitrice ovvero la securina che lega prima della metafase
la separasi e viene inattivata. Quando alla fine della metafase viene attivato l’APC degrada la securina, così la
separasi funziona e degrada la coesina e così i cromatidi fratelli si separano e sono liberi di muoversi perché le
proteine motrici li fanno scorrere lungo i microtubuli.

La distanza polo-polo aumenta dall’inizio alla fine della metafase perché i microtubuli interpolari scivolano l’uno
sull’altro e favoriscono lo spostamento dei fratelli. I cromatidi si spostano passivamente perché i microtubuli del
cinetocore si accorciano in quanto depolimerizzano nel cinetocore e nella regione del poro e man mano che si
accorciano. Nel cinetocore c’è la dineina che sposta verso il minus quindi man mano che i microtubuli si accorciano la
dineina va verso il minus e sposta i cromatidi fratelli verso le regioni polari.

La parte del plus depolimerizza e i microtubuli si accorciano e quindi la dineina sposta i cromosomi verso il polo
minus. Così i cromosomi raggiungono il polo e iniziano a decondensarsi e si riforma l’involucro nucleare che era
scomparso all’inizio della profase e si formano le 2 cellule figlie.

Questo meccanismo è universale, vale per tutte le cellule somatiche e embrionali.

L’involucro nucleare a un certo punto scompare perché i microtubuli devono contattare il cinetocore e se questo
rimanesse non lo potrebbero contattare. L’involucro è contiguo con le cisterne del reticolo quindi i pori nucleari
iniziano a scomparire e l’involucro si frammenta fino a scomparire e in telofase si riforma.

I filamenti intermedi, ovvero le lamine, rivestono la parte interna dell’involucro nucleare e da resistenza all’involucro
e permette l’aggancio della cromatina all’involucro. Quando inizia la divisione le lamine si dissolvono.
Meccanismo di divisione cellulare
Il passaggio da unicellulare a multicellulare, ovvero da zigote a blastula, implica una serie di divisioni cellulari. Il
meccanismo di divisione cellulare è praticamente lo stesso tranne qualche meccanismo di controllo, quindi la
divisione cellulare è importante per lo sviluppo dell’organismo ma anche per il rinnovamento di tessuti nell’adulto.
In Metafase, i cromatidi fratelli si allineano in piastra metafasica. Durante la divisione cellulare, in particolare in
Mitosi, le 2 cellule figlie sono geneticamente dei cloni e la mitosi serve per originare cellule identiche dal punto di
vista genetico e quindi questo processo deve avvenire in maniera corretta.

I cromosomi in metafase si allineano e ogni cromosoma è fatto da 2 cromatidi che si devono separare e andare ai
poli opposti in Anafase. Nella mitosi si ha:

- Interfase: fase Gap di crescita e fase S

- Profase
- Metafase
- Anafase
- Telofase: si formano le 2 cellule figlie dopo la citodieresi

I cromatidi fratelli si separano perché sono uniti dalla Coesina che li mantiene uniti ed è importante perché se si
separano prima della metafase si ottiene una cellula aneuploide. Si separano perché in metafase viene attivato un
segnale che monitora che i cromatidi siano tutti allineati in piastra quindi si attiva l’APC (complesso proteico che
promuove l’anafase) che svolge vari ruoli come ubiquitinare una proteina che si complessa all’enzima che serve per
tagliare la coesina, ovvero la separasi che è presente durante tutto il ciclo cellulare ma non può funzionare prima, la
sua funzione viene inibita perché prima della metafase è complessata con la securina che la inibisce quindi il
complesso securina-separasi fa sì che la separasi sia inattiva. Quando la cellula vede che tutti i cromosomi sono
allineati in piastra si attiva l’APC che ubiquitina la securina. Ubiquitinare significa che lega alla proteina target una
sequenza che viene riconosciuta da un altro complesso proteico, il proteasoma, che riconosce e degrada le proteine
ubiquitinate. La securina viene ubiquitinata e la separasi diventa attiva e degrada la coesina e allora i cromosomi non
sono + legati e si possono allontanare.

L’allontanamento dei cromosomi è un aspetto dinamico, c’è qualcosa che li deve spostare, ovvero le fibre del fuso
mitotico che è fatto da 3 ordini di microtubuli nucleati a partire dai 2 poli dove ci sono i centrosomi:

- Microtubuli del cinetocore: dal centrosoma vanno a legarsi al cinetocore dei cromatidi
- Microtubuli interpolari: partono dai poli e si sovrappongono nella parte mediana e rappresentano proteine
per la sovrapposizione e lo scorrimento
- Microtubuli astrali: si allontanano a formare una specie di stella

Quando la cellula esce dalla metafase e i cromatidi si separano, i microtubuli interpolari scivolano e i poli si allontanano,
i microtubuli del cinetocore si accorciano a causa di proteine che degradano i microtubuli con meccanismo “packman”.
Il ciclo cellulare si divide in tante fasi ma non ci sono punti precisi che ci fanno separare le fasi, il ciclo è in completa
continuità. Si parla di anafase A quando i cromatidi iniziano ad allontanarsi, anafase B quando sono quasi arrivati ai
poli.

I microtubuli del cinetocore sono molto + corti perché i microtubuli sono fatti da 13 protofilamenti di alfa e beta
tubulina che determinano una specie di tubo. I microtubuli interagiscono con il cinetocore dei cromatidi e la parte che
fronteggia il cinetocore del microtubulo che è il plus end viene degradata e si perdono dimeri che fanno accorciare i
microtubuli, ma il cromatidio segue l’accorciamento perché nel cinetocore ci sono proteine motrici come la dineina
che muove dal plus al minus. Se la dineina si lega al cinetocore allora si sposta verso il minus seguendo l’accorciamento
e si porta dietro il cromatidio. I cromatidi raggiungono i poli opposti, la cromatina si spiralizza e si riforma l’involucro
nucleare delle 2 cellule figlie.
L’involucro nucleare è una doppia membrana perché è in continuazione con il reticolo, l’involucro è interrotto da pori
nucleari e sotto troviamo le lamine che costituiscono una specie di reticolo che si intreccia e che da sostegno
all’involucro nucleare, ma non solo danno sostegno, servono anche per ancorare la cromatina. L’involucro nucleare
però quando si forma il fuso deve scomparire sennò i microtubuli non arrivano al cinetocore.

Quando si arriva in profase i pori nucleari se ne vanno, i cromosomi si compattano e in metafase l’involucro nucleare
non c’è +.

Si localizza in vivo la lamina A che è presente intorno al nucleo e scompare in metafase.

L’involucro nucleare quindi poi si disgrega perché le lamine sono all’inizio della divisione, fosforilate, e la loro
fosforilazione le porta a disgregarsi. Nelle cellule ci sono enzimi chinasi che fosforilano e le fosfatasi defosforilano. Le
lamine sono fosforilate e questa fosforilazione porta alla degradazione di esse che quindi si frammentano nel ciclo
cellulare, ma alla fine della telofase si riaggregano perché vengono defosforilate e la defosforilazione inizia quando
l’APC inizia a lavorare alla fine della metafase. L’APC non solo ubiquitina la securina ma fa sì che venga degradato
anche il responsabile della fosforilazione delle lamine, e così le lamine non sono + fosforilate e si riaggregano.

Il responsabile della fosforilazione delle lamine è l’MPF che è un complesso che regola il ciclo cellulare. Questo MPF
fosforila le lamine, poi viene degradato grazie all’azione dell’APC quindi nel passaggio da metafase a anafase l’APC
ubiquitina anche una parte di MPF fatto da 2 proteine e quindi non funziona + e non fosforila le lamine che così si
riaggregano a riformare l’involucro nucleare.

Le 2 cellule figlie si formano quando il citoplasma si divide in citodieresi. La citodieresi avviene grazie alla formazione
di un anello contrattile fatto da microfilamenti e miosina e questo anello spinge sempre + fino a determinare una
strozzatura dove si localizzano i microtubuli interpolari che fanno da ponte tra le 2 cellule. Il materiale denso serve per
far localizzare l’anello contrattile contiene delle proteine la cui interazione con microfilamenti e miosina localizza
l’anello contrattile. Una proteina Pavarotti si localizza nella regione dove si deve formare l’anello contrattile. Nei
mutanti in cui non si forma l’anello contrattile la proteina Pavarotti non si posiziona in maniera precisa ma causale.
L’anello contrattile si stringe sempre di + fino a separare le cellule figlie, ma poi è stato scoperto che l’anello si stringe
per formare un ponte + stretto ma la separazione tra cellule implica un complesso proteico ESCRT che viene descritto
per il budding dei virus perché i virus per uscire dalla cellula devono fondere le membrane e l’altro processo in cui è
richiesto è il sorting dei cromosomi.

Si ha il complesso proteico isolato che è una sorta di molla e in una vescicola degli endosomi questo è orientato in
maniera tale che la parte + sottile è rivolta nel punto in cui c’è la fusione delle membrane. Quando deve iniziare il
budding si ha l’assemblaggio del complesso che forma un complesso che si approfonda nella membrana.

In coltura si vede che nel ponte citoplasmatico c’è una zona di costrizione in cui si vede una struttura a spirale che
viene interpretata come l’analogo di ESCRT e quindi anche la citodieresi richiede questo complesso.

La citodieresi richiede la formazione dell’anello contrattile localizzato in base a proteine, l’anello determina una
strozzatura che però non determina la separazione delle cellule data da un complesso a spirale.

La mitosi da origine a cloni cellulari e quando le 2 cellule si dividono una tiene il ponte citoplasmatico e l’altra no quindi
anche la divisione mitotica ha aspetti di asimmetria.

Il fuso
Il fuso è complesso e fatto da microtubuli e ai poli ci sono i centrosomi che sono organelli non delimitati da membrana
ma fatti da tante proteine e a livello dei quali risiedono gli anelli di gamma tubulina necessari per la nucleazione dei
microtubuli. Il nome centrosoma è stato inventato da un ricercatore Bovery che studiava la segmentazione in un
nematode, nell’Ascaris, perché ha uova grandi e trasparenti, e nella prima divisione si ha il fuso zigotico e in metafase
si vedono i cromosomi in piastra, le fibre del fuso e punti scuri che lui chiamò centrosomi perché vide che erano
strutture dinamiche che si muovono e duplicano e quindi sono al centro dell’importanza della cellula.

Il centrosoma è una struttura fatta da una serie di proteine che è fondamentale perché contiene gli anelli di gamma
tubulina necessari per la nucleazione dei microtubuli che crescono in maniera centrifuga e questi microtubuli sono dei
binari sui quali grazie alle proteine motrici possono essere spostati organelli.
Il centrosoma è fondamentale per la costruzione del fuso mitotico. La proteina ASPM è una mutazione del moscerino
e nell’uomo c’è un gene quasi uguale al gene ASP di Drosophila e che nell’uomo da origine ad una cefalia.
Se prendiamo l’anticorpo di Drosophila per ASP colora il centrosoma e questo significa che una mutazione in questa
proteina determina una condizione in cui i centrosomi non lavorano o lavorano male.
Un altro esempio è la Pericentrina la cui mutazione porta a microcefalie ma anche al nanismo perché se noi prendiamo
fibroblasti umani normali, la pericentrina sta nel centrosoma. Se la pericentrina non c’è ai poli, molte cellule non si
dividono e noi sappiamo che la formazione delle ossa lunghe è data dalla divisione di cellule e quindi se la divisione
non c’è le ossa sono + corte.

Il centrosoma è una struttura da cui si originano i microtubuli e al centro del centrosoma ci sono 2 cilindri che sono i
centrioli, ma questi sono importanti perché organizzano il materiale pericentriolare. Il centrosoma è fatto da 2 centrioli
perpendicolari e sono circondati da materiale pericentriolare con pericentrina. Quindi quando si parla di centrosoma
si intendono i centrioli e il materiale che sta intorno. I centrioli sono importanti perché hanno la possibilità di
raggruppare il materiale pericentriolare. I centrioli fanno da calamita e organizzano così il materiale pericentriolare
andando a compattarlo. Inoltre determinano la dinamica del materiale pericentriolare. I centrioli sono piccoli e
caratterizzati dal fatto che in interfase e metafase sono perpendicolari tra loro, e non solo, ma i 2 centrioli si possono
riconoscere in base alla loro posizione con centriolo madre che origina il centriolo figlio.

I centrioli sono stati visti per la prima volta quando è stato costruito il primo microscopio elettronico e si è visto che i
centrioli dei vertebrati. Il centriolo madre è fatto da appendici distali che servono, le subdistali per organizzare i
microtubuli e le distali servono per permettere l’interazione con la membrana plasmatica per formare il ciglio primario.
Il centriolo figlio non ha appendici perché deve crescere ed ha il cartwheal, immaginando di tagliare la parte basale si
vede che il centriolo è fatto da 9 triplette di microtubuli chiamate A, B, C e la struttura all’interno è il cartwheal ovvero
una ruota di carro che ha una specie di tubo circolare centrale e delle braccia che si connettono con il tubulo A. quindi
il centriolo è fatto da una parete di 9 triplette di microtubuli + il cartwheal.

Il centrosoma e quindi i centrioli determinano la formazione del fuso ma in interfase c’è 1 solo centrosoma con 2
centrioli, ma in profase ho 2 poli che si stanno formando e quindi significa che il centrosoma si è duplicato e la
duplicazione è determinata dalla duplicazione dei centrioli che portano dietro una parte di materiale pericentriolare.

La duplicazione deve essere 1 perché non si possono essere + di 2 coppie di centrioli. In fase G1 i 2 centrioli si
allontanano e ognuno dei 2 inizia ad assemblare il centriolo figlio, poi il centriolo figlio cresce e arriva quasi a
dimensioni normali a fine fase G2 dove ho 2 coppie di centrioli vicini perché legati da strutture filamentose che
vengono degradate e le coppie si allontanano portando dietro del materiale pericentriolare. Così si posizionano ai poli
del fuso organizzando i microtubuli.
Questa duplicazione deve avvenire una volta sola perché il fuso deve essere fatto da 2 poli e quindi se io avessi +
centrosomi avrei + poli del fuso e questo porterebbe ad anomalie. Le cellule tumorali hanno spesso + centrosomi,
quindi un’alterazione nel numero di centrosomi porta un’alterazione del numero di fusi mitotici.
La conseguenza di avere troppi centrosomi è che le cellule costituiscono + fusi e questo comporta che si formano
cellule con un numero non corretto di cromatidi e di solito muoiono, ma può succedere che 1 delle 2 cellule perda i
tumor suppressor genes. Ci sono geni che dicono alla cellula di dividersi e questi geni devono essere regolati dai tumor
suppressor genes, quindi ci sono i protooncogeni che regolano la proliferazione sia geni che regolano i primi ovvero i
tumor, se i tumor si perdono la cellule si divide in modo incontrollato come le cellule tumorali.
Oppure ci sono dei geni fondamentali per il controllo della mitosi come il P53 che va a vedere che se il DNA della cellula
non è corretto la cellula deve morire per apoptosi, ma se la cellula tumorale perde il P53 si dividono anche le cellule
con corredo genetico non corretto quindi la presenza di + poli può portare a delle aneuploidie, ma anche ad alterazioni
della formazione delle ciglia primarie che si formano in interfase e servono come antenne per regolare la divisione, in
un glioma le cellule tumorali perdono le ciglia e si dividono sempre perché non hanno i corretti segnali. Quindi il
numero di centrosomi è fondamentale.
Le cellule staminali si dividono in maniera tale che una figlia è staminale e l’altra si differenzia, ma se ho una staminale
che si divide originando 2 staminali queste proliferano in continuazione e sono cellule tumorali.
La cellula tumorale una volta che è diventata tale non può permettersi di costruire fusi multipolari perché poi muore.
Il fuso tripolare può essere importante per acquisire la capacità proliferativa, ma quando la cellula l’ha acquisita avere
troppi centrosomi è pericoloso anche per la cellula tumorale.

Nella cellula tumorale con 5 centrosomi origina un fuso tripolare che ripartisce il materiale genetico in maniera non
corretta e ho 3 cellule che hanno difficoltà a sopravvivere. Se la cellula tumorale vuole sopravvivere si deve dividere
formando un fuso bipolare e lo fanno tramite il processo di centrosome clustering che significa che i centrosomi si
localizzano in 2 cluster opposti, 3 da una parte e 2 dall’altra e questo è un fuso bipolare. Quindi la cellula tumorale ha
tanti centrosomi e se organizza un fuso tetrapolare produce figlie che muoiono, ma questo non succede perché i
centrosomi formano 2 cluster opposti e formano i poli di un fuso bipolare che origina cellule che sopravvivono.

Se io impedisco alle cellule tumorali di fare il clustering alterando l’interazione tra la proteina che forma i centrioli e la
proteina, queste non riescono a fare il clustering e la cellula muore per apoptosi.
Troppi centrioli o centrosomi sono incompatibili con la normale proliferazione cellulare ma ci sono anche cellule con
tanti centrioli ma normali. Nella trachea ci sono cellule multiciliate e ogni struttura ciliare deriva da un centriolo. Tanti
centrioli si trovano anche nello sviluppo partenogenetico della mosca, compaiono tanti centrioli ma solo 1 è usato per
lo sviluppo, gli altri degenerano.

Lo spermio di una termite di solito ha un solo centriolo, ma se lo spermio è multiflagellato con centinaia di assonemi
che siccome derivano dai centrioli, questo indica che ci sono centinaia di centrioli. All’inizio della spermiogenesi i
centrioli proliferano e se ne ottengono tanti e il numero di centrioli è + alto del normale e il numero di centrosomi è
giustificato dalla funzione che hanno le cellule.

Sviluppo del sistema nervoso

Dal tubo neurale si forma il sistema nervoso. Nel tubo neurale ho una cavità con epitelio con cellule neuroepiteliali
allungate che proliferano. Queste si dividono in modo simmetrico perché il numero di cellule deve aumentare. Ad un
certo punto si ha uno shifting tra proliferazione simmetrica e quella che origina le cellule staminali nervose. Quindi le
cellule epiteliali si trasformano in cellule staminali nervose. Questa transizione tra cellule è quella che porta pian piano
alla formazione del sistema nervoso completo.

Nel topo ho un inizio in cui la divisione è asimmetrica quindi le cellule che si formano sono uguali e sono neuroepiteliali
che poi si trasformano in staminali che si dividono in maniera asimmetrica. Quando la divisione è proliferativa il fuso
è orientato parallelamente alla superficie apicale, quando inizia la divisione asimmetrica il fuso cambia di posizione.
Quando avviene la divisione asimmetrica che da origine a figli che hanno una capacità proliferativa diversa, ovvero la
staminale può andare incontro a una neurogenesi diretta o indiretta. Con la diretta si origina una figlia uguale a se
stessa e a un neurone che si differenzia subito, mentre la neurogenesi indiretta da origine alla staminale e a un
progenitore intermedio che è una cellula che non è differenziato ma si differenzia dopo.
Quindi la diretta da origine a una sola cellula mentre l’indiretta origina molte cellule differenziate.

Ciò si vede nel virus Zika che origina microcefalie nei bambini appena nati e qui il materiale pericentriolare è ridotto.
Quindi questo comporta un errato orientamento delle cellule staminali nervose. L’orientamento del fuso è
determinato dai microtubuli del fuso, quindi dalla loro interazione, e se questi sono in numero ridotto non c’è
interazione e quindi si privilegia la situazione per cui il numero di cellule è molto ridotto. Si ha una ridotta formazione
delle cellule nervose, si ha una proliferazione delle staminali che porta a una ridotta formazione di cellule nervose,
quindi cambia l’orientamento del fuso e si formano solo quelli planari quindi il numero di cellule differenziate è molto
ridotto e questo da origine a microcefalia.

I centrioli

I centrioli sono fondamentali e sono strutture cilindriche che organizzano il centrosoma, o meglio il materiale
pericentriolare con gamma tubulina che sta alla base dell’organizzazione dei microtubuli. I centrioli generalmente
sono 2 e da questa regione si dipartono i microtubuli per formare una sorta di raggera. Quindi una funzione del
centriolo è organizzare il centrosoma. Ma durante l’omeostasi dei tessuti si può organizzare la struttura ciliare che
viene organizzata in interfase quando i 2 centrioli migrano in superficie, il centriolo madre contatta la membrana
plasmatica e siccome i centrioli hanno 9 triplette di microtubuli, il centriolo madre prolunga il doppietto A-B formano
un lungo assonema che è il ciglio primaria ed è circondato dalla membrana plasmatica.
Ci sono anche cellule multiciliate come quelle della trachea.
Il ciglio primario è importante perché nell’uomo ci sono ciglia olfattorie, dell’ovidutto, respiratorie, i conocettori, il
rene e le ciglia nodali che sono quelle che si trovano nel nodo embrionale e sono responsabili della simmetria dx e
sx.

Il ciglio primario si assembla e si disassembla in maniera particolare, infatti una cellula può rimanere in G0 e
diventare quiescente e così si assembla un ciglio primario, ma può essere creato anche da una cellula che fa
replicazione e lo assembla in G1 perché i 2 centrioli migrano in superficie, il centriolo madre contatta la membrana, i
tubuli A-B si allungano e si forma il ciglio primario.

Ciò significa che il centriolo madre e quindi anche il figlio quando sono coinvolti nella formazione del ciglio primario,
non possono organizzare il materiale per formare il centrosoma, ma siccome la cellula vuole dividersi, la cosa +
semplice che può fare è far scomparire il ciglio primario, infatti questo può essere riassorbito in quanto ha
l’assonema con microtubuli e quindi per farlo retrarre è sufficiente depolimerizzare la tubulina e infatti c’è l’enzima
deacetilasi che depolimerizza la tubulina.

Noi sappiamo che le cellule esprimono proteine che poi possono avere modificazione post-traduzionale, la tubulina
può essere acetilata e porta a maggiore resistenza dei microtubuli e se uso l’enzima si toglie l’acetilasi i microtubuli
diventano instabili e il ciglio scompare. Così i microtubuli vanno verso il nucleo dove duplicano tra la fase G1 e S e poi
ho i centrosomi che organizzano il fuso e la cellula si divide.

Il ciglio primario è anche un’indicazione che quando lui c’è la cellula non si può dividere.

Il controllo della divisione del ciglio primario è determinato dal fatto che è una sorta di antenna della cellula e quindi
recepisce ligandi che si legano a recettori sulla membrana del ciglio primario e così riceve segnali tra cui quelli della
proliferazione.
Alla mancanza del ciglio primario nascono patologie dette cigliopatie legate al malfunzionamento del ciglio primario
come:

- La segnalazione nel ciglio non viene recepita

- Il centriolo che dovrebbe originare il ciglio è difettoso e non lo forma

Il centriolo quando organizza il centrosoma si chiama centriolo, quello che organizza il ciglio primario o flagello è detto
basal-body.
Nel rene ci sono cellule ciliate e se mancano si ha un rene policistico con cisti. La polidattilia non è solo legata a un
gene omeotico ma anche a difetti di formazione di ciglia, anche la degenerazione retinica è legata al ciglio perché
coni e bastoncelli hanno struttura ciliare. Il situs inversus è legato a ciglia nodali che si muovono e battono da dx a
sx, lo spostamento determina un flusso ma quando avviene una mutazione nelle ciglia primarie con sindrome di
Cartagener, la dineina non funziona e le ciglia sono immobili, non c’è flusso e c’è situs inversus ovvero il cuore è a dx
invece che a sx come altri organi.

In condizione normale quando la cellula si divide deve riassorbire il ciglio primario. C’è una mutazione in una
proteina legata all’organizzazione del centriolo nell’uomo si chiama CPAP che nel Caenorhabditis si chiama SAS4 ed è
una proteina legata all’assemblaggio del centriolo. Si vede che la mutazione in questa proteina determina una
microcefalia cioè un non corretto sviluppo della corteccia cerebrale.
Quando la cellula si divide deve riassorbire il ciglio, se non viene riassorbito non si liberano i centrioli che non
possono duplicarsi e non possono organizzare il centrosoma.

I fibroblasti presi da un paziente con sindrome di Seckel, ovvero microcefalia, in parte hanno una lunghezza quasi
corretta e altri invece hanno ciglio particolarmente lungo o lunghissimo e ciò significa che il ciglio cresce tanto. I
centrioli sono irregolari perché le appendici sono disposte in modo casuale. In una grande quantità di fibroblasti il
ciglio è molto lungo e questo è il punto chiave.

Si costruiscono 2 tipi di organoidi dalle cellule pluripotenti e dai fibroblasti quindi si formano organoidi wild type e
organoidi Seckel si costruiscono a partire da fibroblasti umani Seckel. Si vede che usando il marcatore Pax-6 si
colorano le cellule staminali che poi daranno origine alle figlie che si differenziano, quindi si ha un notevole numero
di cellule staminali e progenitori che si differenzieranno. Nel caso di Seckel la colorazione è ridotta perché ci sono
poche staminali.

Se si guarda l’organoide Seckel si vede che ci sono tante cellule ciliate con ciglio primario molto lungo. Questo ci
porta a concludere che in condizioni normali le cellule staminali hanno ciglio che riassorbono, si dividono e
continuano a proliferare e determinano l’espansione delle cellule che daranno origine alla corteccia cerebrale.
Mentre nel Seckel la mancanza della proteina interagisce con la possibilità di riassorbire il ciglio che quindi non viene
riassorbito, la cellula non si divide ma si differenzia e quindi si perdono le cellule neuroepiteliali, per questo ne ho
poche e quindi il numero di cellule nervose che formano il cervello è ridotto. Quindi il fatto che il ciglio primario non
venga riassorbito determina un rallentamento della divisione e alla fine alcune cellule muoiono e alcune si
differenziano quindi perdo le cellule epiteliali alla base del cervello.

Il glioma è caratterizzato da cellule staminali nervose che si dividono in continuazione. Probabilmente queste cellule
del glioma che sono cellule staminali non hanno un ciglio primario, o comunque se ce l’hanno non funziona, quindi
non ho il controllo del ciglio sulla divisione, cioè si dividono continuamente, proliferano e continuano a dividersi in
maniera simmetrica.
Il processo di cigliogenesi è quindi soppresso e se io riesco a fare in modo che queste cellule vadano a riformare il
ciglio primario, le posso riportare a comportarsi in maniera normale e a questo punto addirittura queste cellule
potrebbero entrare in G0, smettere di dividersi e iniziare a differenziarsi in cellule nervose.

Ci sono chinasi coinvolte nel disassemblaggio del ciglio quindi parto dall’idea che queste chinasi siano espresse in
maniera costitutiva nelle cellule del glioma, cioè io ho la cellula che non smette di proliferare perché priva di ciglio.
La regolazione del ciglio, l’accorciamento e la degradazione dei microtubuli dipende da chinasi e quindi suppongo
che queste siano sempre espresse e così il ciglio primario non si forma. L’idea è quella di fare un RNA interference
per 1 di queste chinasi. Se escludo la chinasi NEK-2 che determina il riassorbimento del ciglio, il ciglio si riforma e
quindi questo significa che l’RNA interference per questo mRNA fa si che il ciglio si riformi. Quindi se io nelle cellule
di glioma faccio in modo che il ciglio si riformi, faccio entrare le cellule in un ciclo normale e quindi queste cellule
possono anche andare a differenziarsi.

Alla base di tutto ciò ci sono i centrioli.

I centrioli sono tubetti con parete fatta da 9 triplette di microtubuli con all’interno il Cart-wheal. In passato si
pensava, vista la sua struttura precisa, che come i mitocondri anche i centrioli avessero delle informazioni in quanto
riescono a duplicarsi.

Le informazioni vengono dallo studio del Caenhorabditis perché ha un uovo trasparente e quindi si seguono meglio
certi aspetti. In questo organismo l’ovocito non ha centrioli e quindi non può assemblare un fuso mitotico. In
condizione normale lo spermio si fonde con la membrana dell’ovocito e entrano i 2 centrioli che sfruttando il
materiale pericentriolare presente nell’uovo e si duplicano. Quindi si ha un fuso con 2 centrioli paterni e 2 nuovi
materni. Questi si duplicano ancora e avrò le successive divisioni. Lo spermio quindi porta i centrioli mentre i nuovi
derivano da materiale pericentriolare materno.

Se io ho un difetto e lo spermio porta 1 solo centriolo ho un fuso monopolare, mentre se ho un difetto nel materiale
pericentriolare nell’ovocito i centrioli non si duplicano.

Tutto ciò permette di isolare geni che riguardano l’assemblaggio del centriolo. Nel vermetto è stato scoperto un
gene SPD-2 la cui assenza determina un fuso monopolare quindi questo è importante per la duplicazione dei
centrioli.
Zyg-1 si trova nell’uomo e nel moscerino e la sua assenza determina dei fusi monopolari quindi non c’è duplicazione.

Sas-4 è l’ortologo di CPAP e la mancanza di questa proteina porta a fusi monopolari.

Sas-6 se assente determina la presenza di 1 solo centrosoma con assenza di duplicazione dei centrioli.
Sulla base di ciò i geni fondamentali per la costruzione del centriolo sono zyg-1 ortologo di Sak, Sas-4 e Sas-6 che
hanno una relazione descritta usando una metodica a RNA interference. Io ho 1 centriolo del Caenorhabditis e ci
sono singoletti al posto di triplette. Quando si fa l’RNA interference per zyg-1 trovo un centriolo, mentre se lo faccio
per Sas-4 vedo un centriolo che è quello iniziale portato dallo spermio e un’altra struttura che è una specie di tubo
che è fatto dalla proteina Sas-6 e questo significa che quando faccio l’RNA interfernce per Sas-4 si forma questo
tubetto senza microtubuli. Quindi Sas-6 origina un tubetto con microtubuli assemblati intorno, ma per il loro
assemblaggio è necessario Sas-4.

L’idea è che zyg-1 determina l’attivazione di Sas-6 che a sua volta con Sas-4 costruisce il centriolo e intorno i
microtubuli. Il cart-wheal non si vede perché il segnale viene considerato background e il computer lo scarta, ma ciò
crea problemi perché secondo questa interpretazione Sas-6 da origine a quella sorta di tubo.

Un centriolo diverso da quello del Caenhorabditis ha 9 triplette, A, B, C, la parte centrale unita da braccia laterali al
tubulo A.

Nela Caenorhabditis si ha un tubo alla periferia della struttura centrale. L’hub viene visto come braccia con al centro
le strutture dimeriche, ma successivamente con uno studio + approfondito su Sas-6 si vede che il cart-wheal è fatto
da dimeri con una specie di coda e le code sono arrotolate, e la testa va a delimitare l’hub centrale. Quindi io ho
l’hub centrale che è determinato dalle teste di Sas-6, le code, ovvero il loro CH si estende fino al tubulo A, ma Sas-6
non tocca il tubulo A ma esiste una proteina che fa da ponte.

CPAP sta a lato del tubulo A quindi sarà necessario per l’organizzazione del tubo.
Il Cart-wheal quindi è fatto da Sas-6 organizzato in modo diverso dal Caenorhabditis perché Sas-6 è un dimero la cui
testa determina il tubo e la coda proietta al di fuori verso il tubulo A delle triplette e la cosa importante è che le teste
sono disposte tra loro a 40° e si ha una simmetria a 9 universale, la simmetria è data da Sas-6 che dimerizza e che è
disposta in modo che le teste siano orientate a 40° e quindi ci entrano 9 dimeri di Sas-6 che formano il cart-wheal.

Sas-6 interagisce con Sas-4 per la formazione della parete dei microtubuli che avrà simmetria a 9. Sulla base di ciò si
ritiene la simmetria universale. Ma ci sono eccezioni come:

 Centrioli con 14 doppietti nel proturo. Ciò si spiega dividendo 360° per 14 e si trova un angolo di 25,7° che è la
disposizione di Sas-6. Nella stessa pubblicazione però si trova un altro centriolo di un insetto, un dittero, ed è
un centriolo che ha dai 60 ai 70 doppietti, ma prima non era stato riportato perché inspiegabile rispetto a Sas-
6 quindi a volte i dati + difficili da spiegare sono messi un po’ da parte. L’unica spiegazione è che Sas-6 in
questo insetto ha una struttura e un’organizzazione diversa da quelle normali.
La duplicazione dei centrioli è importante e deve avvenire in maniera corretta e avviene per crescita di un centriolo
alla base del centriolo madre. Nell’uomo c’è una proteina STIL che lega Sas-6 a CPAP o Sas-4. Nell’uomo la
duplicazione del centriolo se avviene con difetti delle proteine del centriolo si hanno microcefalie.

Ci sono 3 modelli usati per studiare la duplicazione:

 C. elegans: SPD-2 attiva la chinasi Zyg-1

 Drosophila: Asterless attiva la chinasi Plk-4
 Cellule in coltura dell’uomo: ha SPD-2 e Asterless quindi un po’ di 1 e un po’ dell’altro. Queste proteine sono
alla base dell’attivazione della chinasi Plk-4 che sta alla base della duplicazione dei centrioli.

Quando ho una duplicazione corretta ho livelli normali di Plk-4, SAS-6 e STIL, ma se ne manca una ho solo il centriolo
madre, quindi nell’uomo è fondamentale la loro presenza. Se invece le overesprimo si formano tanti centrioli intorno
al centriolo madre, in una microcefalia STIL viene overespresso, le cellule con tanti centrioli non si dividono e quindi
ho cellule nervose in numero inferiore.

SAS-4, quindi la parete del centriolo, si assembla dopo che si è assemblato il cart-wheal.
PLK-4 e STIL interagiscono tra loro e quando STIL è attivato richiama SAS-6 e determina la formazione del cart-wheal.
Nell’uomo per il richiamo di Plk-4 al centriolo madre è necessario Asterless, il centriolo madre è circondato da CEP-
152, cioè l’ortologo di Asterless. La proteina richiama Plk-4 dal citoplasma nel punto dove CEP-152 è presente,
ovvero di solito sta in una struttura circolare alla base del centriolo madre. Plk-4 all’inizio è distribuito in tutta la
struttura e ad un certo punto STIL viene richiamato, ma lui si localizza in un punto ben preciso della struttura
circolare e la sua localizzazione porta ad una focalizzazione in quel punto di Plk-4 che si autofosforila, ovvero si
degrada Plk-4 in periferia e rimane solo intorno a STIL perché STIL sembra che abbia doppia funzione:

 Fa autofosforilare Plk-4 dove non è presente

 Non permette auofosforilazione dove c’è STIL

Quindi ciò porta ad un aggregato di Plk-4 e STIL. Ora STIL richiama Sas-6 che si autoassembla nella struttura
nonamera che è il cart-wheal. Così viene richiamato anche Sas-4 che determina la parete del centriolo.

Nel C. elegans zyg-1 porta all’attivazione di Sas-5 che corrisponde a STIL e quando si forma il cart-wheal poi viene
richiamato Sas-6 che determina la formazione della parete.

Quindi l’unica differenza è che in C. elegans è sufficiente Sas-4 per costruire la parete del centriolo mentre negli altri
serve una proteina aggiuntiva.
Qualche anno fa si dice va che la duplicazione del centriolo richiedeva la presenza di un centriolo che faceva da
stampo, e quindi nel centriolo madre ci doveva essere un punto a partire dal quale il centriolo madre veniva
formato. Ciò non è vero infatti se si guarda la partenogenesi, durante la fecondazione lo spermio porta il centriolo e
gli ovociti non hanno centrioli ma compaiono ex-novo e compaiono senza un centriolo preesistente quindi non è
vero che serve un centriolo per crearne un altro. Questa idea però resiste per molti anni e prende il nome di
template.

Il centriolo non si deve formare in un punto preciso perché se io distruggo il pericentriolo vedo che quello nuovo si
forma da un’altra parte quindi la localizzazione di Stil per formare il centriolo è casuale.
Duplicazione centrioli

Il numero di centrioli va regolato, perché se sono troppi c’è un non funzionamento. La duplicazione avviene in un
punto preciso del ciclo cellulare, inizia nel passaggio da G1 a S, ma si duplicano 1 sola volta durante il ciclo perché se
si duplicassero anche in profase e metafase ne avrei troppi e questo porterebbe per esempio a cellule tumorali. La
duplicazione dei centrioli è parallela alla duplicazione di DNA e deve essere regolata in modo preciso. La duplicazione
inizia in fase G1- S e finisce in fase G2.

Qualche anno fa è stato pubblicato un lavoro in cui si spiega la regolazione della duplicazione dei centrioli. Gli autori
videro che i centrioli durante la mitosi sono messi uno vicino all’altro perpendicolari, all’anafase questi centrioli si
allontanano e perdono il loro orientamento per cui in interfase non ho centrioli perpendicolari ma lontani quando la
cellula si deve dividere. Si sapeva che se i centrioli sono vicini non sono in grado di dividersi. Allora gli autori
pensarono che c’è qualcosa che mantiene uniti i centrioli. Videro che i centrioli iniziano a separarsi quando si
separano i cromatidi a fine metafase quando l’APC degrada la securina e si attiva la separasi che taglia la coesina e i
cromatidi si separano. Così si pensa che ci sia un meccanismo simile per i centrioli. Loro fecero RNA interference
inattivando la separasi e videro che i centrioli non si separavano, allora ipotizzarono che fosse la separasi ad essere
coinvolta nell’allontanamento dei centrioli. Nel momento in cui c’è l’attivazione della separasi i centrioli
effettivamente si allontanano e li trovo separati in interfase e così possono duplicarsi. Ognuno crea 1 centriolo figlio
che rimane unito al centriolo madre.

C’è un’isoforma della coesina che mantiene uniti i centrioli tra loro quindi come i cromatidi fratelli anche i 2 centrioli
parentali vengono separati dall’azione della separasi sulla coesina che li tiene uniti.
Nonostante i centrioli siano molto piccoli sono fondamentali, infatti alterazioni su essi portano a problemi anche
nello sviluppo embrionale. Molti dei processi che non sono portati a termine durante lo sviluppo embrionale sono
dovuti ad errori nella mitosi. Quindi i difetti di mitosi dipendono da difetti nell’organizzazione dei centrioli e sono
problemi che nascono quando il processo di duplicazione non funziona e quindi se ho questo processo che non è
corretto posso avere + centrosomi, il fuso multipolare che porta a cellule che muoiono o aneuploidi che proliferano
in modo incontrollato. La divisione asimmetrica delle cellule staminali si basa proprio sull’orientamento del fuso e se
è sbagliata possono avere cellule tumorali. Se io ho una cellula con tanti centrioli e centrosomi molto grandi, essendo
i centrosomi gli organizzatori di microtubuli, questi ne formano tanti legati all’invasione delle cellule. Oppure se ho
troppi centrioli non si formano le ciglia primarie e siccome queste devono ricevere i segnali di proliferazione, se non
ci sono, le cellule si dividono continuamente.

Le proteine + importanti che compongono il centriolo sono Sas-4, Sas-6, STIL ecc. e se le proteine coinvolte nel
processo di controllo della duplicazione dei centrioli non funzionano, per esempio se Plk-4 e STIL sono overespresse
si formano troppi centrioli che sono una caratteristica di cellule tumorali, oppure le microcefalie, Plk-4 in livello
ridotto porta a pochi centrioli e così se STIL è mutato ho pochi centrioli, CEP-152 sta alla base della duplicazione dei
centrioli. Quindi le microcefalie sono legate a geni che regolano la duplicazione di centrioli, e inoltre si possono avere
anche dimensioni corporee ridotte.
I centrioli organizzano il centrosoma che organizza il fuso mitotico, ma le cellule possono sbagliare durante la
divisione e non c’entrano niente i centrioli. Quando la cellula si divide deve ereditare gli stessi cromatidi e se non
succede ci può essere aneuploidia che potrebbe essere il primo passo verso la proliferazione incontrollata. Ci sono
meccanismi che regolano ciò, ma non ci sono nell’embrione, ci sono nella divisione di cellule somatiche. Quando ci
sono errori questi a volte portano a cellule tumorali.
Controlli nella divisione cellulare
È importante che la divisione cellulare avvenga correttamente e ci devono essere dei controlli perché la divisione
deve ripartire i cromosomi tra le cellule figlie. Il ciclo cellulare richiede 3 fasi nelle cellule somatiche:

 Interfase con Gap 1 e Gap 2 in cui la cellula cresce

 Fase S con duplicazione di DNA e tra G1 e S c’è la duplicazione dei centrioli
 Mitosi M

Le cellule trascorrono gran parte della vita in interfase. La lunghezza del ciclo cellulare è variabile. Tipi di cellule
diverse hanno una lunghezza del ciclo diverso, alcune cellule somatiche non si dividono mai. Le cellule della pelle si
dividono circa ogni 2 settimane, quelle dell’intestino ogni 4-5 giorni, nel fegato da 300 a 500 giorni e poi ci sono
quelle che non si dividono mai come quelle nervose e muscolari che vanno in fase G0.
La divisione è correlata all’aspettativa di vita delle cellule perché a un certo punto muoiono e devono essere
rimpiazzate. Se nel tessuto le cellule hanno vita breve si hanno divisioni + frequenti.
Le cellule somatiche per completare un ciclo impiegano 1 giorno, quelle embrionali anche 9 minuti. Le somatiche
non sono sincrone, le divisioni non sono sincronizzate, mentre quelle embrionali sono sincrone. Le somatiche hanno
una dimensione costante, ho la fase G1 e G2 in cui le cellule crescono e poi ho un controllo che mi dice che la cellula
si può dividere se grande e le cellule figlie avranno le dimensioni della madre. Nelle embrionali ciò non succede, per
esempio, l’uovo della rana si divide una volta ma le 2 cellule che si formano sono la metà e poi ¼ ecc. quindi nelle
divisioni embrionali i blastomeri sono sempre + piccoli.
Le cellule embrionali hanno dimensioni sempre + piccole e hanno un ciclo veloce perché le embrionali non hanno
fasi G1 e G2 e quindi in interfase ci passano poco tempo necessario solo per la duplicazione di DNA, e non possono
trascrivere il DNA quindi non possono crescere in volume. Le embrionali non lo fanno perché nell’uovo c’è già tutto
quello che serve per le divisioni successive. Un’eccezione sono i mammiferi come il topo in cui la prima divisione
dello zigote impiega 1 giorno perché c’è la fase G1.

Controllo del ciclo cellulare

Un’ipotesi è che nel citoplasma ci sono segnali o fattori che in qualche maniera determinavano il controllo del ciclo
cellulare. Per vedere se ciò è vero alcuni autori hanno fatto degli esperimenti fondendo cellule. Hanno preso cellule
in fase S con duplicazione di DNA e le hanno fuse con quelle in G1 e hanno visto che quelle in S inducono la
duplicazione nella cellula in G1. Hanno fuso una cellula in divisione con una in G1 e hanno visto che quella in G1 inizia
a dividersi anche se non ha DNA duplicato. Ma la cellula in S non induce in quella G2 la duplicazione. Le conclusioni
sono che ci sono fattori diffusibili che promuovono il passaggio da S a M, ovvero fattori presenti nelle cellule. Questi
fattori che promuovono la fase S funzionano solo in G1, ma non in G2 mentre i fattori che promuovono la fase M
funzionano sempre.
Nelle cellule ci sono informazioni sottoforma di fattori diffusibili che possono alterare il ciclo cellulare. Sono stati fatti
altri studi sulle rane in quanto gli anfibi hanno uova grandi e poi anche sul lievito che da indicazioni su come è
regolato il ciclo e sono:

 Budding Yeats in cui le cellule non si dividono a metà ma si forma una gemma

 Fission Yeast si divide con un setto

Questi lieviti hanno tanti mutanti e studiandoli si capisce quali sono i segnali che regolano il ciclo cellulare e questo
studio da info per capire come funziona in organismi superiori perché i geni sono gli stessi.

Anfibi

L’ovocito è arrestato in G2, in seguito al rilascio di progesterone l’ovocito riprende la meiosi e poi si arresta in
metafase 2 fino a che non arriva lo spermio e la meiosi termina e inizia il cleavage. L’ovocito è arrestato in G2 e con
l’arrivo di progesterone riprende la meiosi come meiosi 1 e 2 e poi l’ovocito si arresta in metafase della meiosi 2 e
quando arriva lo spermio finisce la metafase e inizia il cleavage.

Si è visto che se prendo del citoplasma dall’ovocito che ha ripreso la meiosi e lo trasferisco in un ovocito arrestato in
G2, questo ovocito riprende la meiosi quindi se trasferisco citoplasma dall’ovocito che ha ripreso la meiosi e lo metto
in quello bloccato riprende la meiosi e ciò significa che nel citoplasma c’è qualche fattore che induce la ripresa della
meiosi stessa.
Si usa l’uovo della rana perché grande e quindi con una micropipetta posso prendere citoplasma e trasferirlo in un
altro uovo e così si fa l’esperimento descritto in precedenza. Gli autori che fanno questo esperimento concludono
che quando prendo il citoplasma e lo inserisco nell’ovocito in fase G2 inducono la meiosi e quindi chiamano questo
fattore che non sanno cosa è ma sanno che c’è, MPF (fattore che promuove la maturazione). Questo rimane attivo
nel citoplasma fino a che non si arresta la meiosi.

Quindi c’è il trasferimento di citoplasma con MPF che implica la ripresa della meiosi nonostante l’assenza di
progesterone.

Un altro esperimento si basa sulla domanda “il progesterone agisce se rilasciato all’esterno o se iniettato
all’interno?”. Il progesterone agisce solo se rilasciato all’esterno, se lo inietto in un ovocito non succede nulla perché
gli ormoni sono fattori che portano una segnalazione e attraversano la membrana della cellula trovando il recettore
nel citoplasma, ma il progesterone ha recettori nella superficie quindi se lo inietto all’interno i recettori non vengono
attivati.

Si vede che l’MPF non regola solo la meiosi ma promuove la maturazione dell’ovocito e si vede che lo spermio entra
nell’uovo, la meiosi riprende e avvengono le divisioni. L’MPF c’è anche in mitosi.
Sulla base di ciò si può dire che il ciclo cellulare è regolato da una concentrazione diversa di MPF che implica l’inizio
di meiosi o mitosi. Livelli bassi di MPF si alternano a livelli alti e i livelli bassi fanno sì che i cromosomi segregano e la
divisione viene completata. Quindi la concentrazione di MPF oscilla durante il ciclo ed è questa che determina le fasi
del ciclo cellulare. Alta concentrazione in metafase, nella prima metafase della divisione zigotica, nella seconda
divisione zigotica, quindi i picchi corrispondono alle fasi del ciclo.

Chi regola l’oscillazione di MPF?

Tim Hunt studiava il ciclo cellulare nel riccio di mare e vide che durante le mitosi embrionali dello sviluppo
embrionale c’erano 2 proteine espresse in quantità diverse in relazione al ciclo cellulare. L’mRNA per queste
proteine durante la mitosi è in alta quantità poi scompare, poi di nuovo in alta concentrazione ecc. queste proteine
le chiama cicline, la ciclina A e B, e vide che questo aumento di concentrazione di cicline corrisponde all’aumento di
MPF, cioè vede che ciclina A e B ma essenzialmente B ha un’alta concentrazione quando l’MPF raggiunge il massimo,
poi la ciclina scompare e MPF non c’è e MPF ha alta concentrazione quando la ciclina si ripresenta. Quindi ci sono 2
proteine la cui espressione è regolata all’MPF.

L’MPF

L’MPF è il fattore la cui concentrazione cresce in relazione al ciclo cellulare. Ci sono le cicline che anche esse hanno
una concentrazione crescente in relazione all’MPF. L’MPF è un complesso fatto da 2 proteine: 1 chinasi che spiega il
lavoro di MPF e la ciclina. La chinasi dipende dalla ciclina, cioè funziona se presente la ciclina, e anche l’MPF funziona
solo se presente la ciclina. La chinasi non è attiva se non è legata alla ciclina. Quando la chinasi si lega alla ciclina si
attiva e fosforila andando per esempio a disgregare il Golgi, l’involucro nucleare ecc. questa chinasi praticamente
determina le prime fasi del processo di divisione.
Nel processo di divisione cellulare sono fondamentali 2 gruppi di proteine che sono le chinasi che fosforilano e le
fosfatasi che defosforilano.
L’MPF è la chinasi come Cdk che dipende da ciclina, e quando attiva determina la condensazione della cromatina,
fosforila le lamine e degrada l’involucro, fosforila le proteine associate ai microtubuli e contribuisce alla formazione
del fuso mitotico. Il ciclo cellulare, quindi, è legato alla concentrazione di chinasi e ciclina. L’attività della chinasi è
legata all’attività della ciclina. Se la ciclina non c’è la chinasi non funziona +.

All’inizio del ciclo in interfase viene sintetizzata la ciclina ma la chinasi c’è già. Si forma il complesso chinasi-ciclina
ovvero l’MPF che porta la cellula fino alla metafase, dove si blocca se il complesso rimane attivo. Per passare in
anafase e uscire dalla mitosi il complesso deve essere disattivato. Si deve degradare la ciclina e ciò accade perché a
fine metafase quando i cromosomi sono in piastra si attiva l’APC che ubiquitina la ciclina B, quindi, lega alla ciclina
l’ubiquitina e ciò fa sì che il proteasoma riconosca la ciclina ubiquitinata e la degradi. Così l’MPF perde la ciclina, la
chinasi rimane sola e non funziona +. Così la cellula esce e rientra in interfase dove deve sintetizzare di nuovo la
ciclina.

I livelli di ciclina B sono regolati, in inizio G2 la ciclina sta nel citoplasma della cellula, poi in profase la ciclina si
localizza nel nucleo, sul fuso e poi all’anafase scompare perché degradata.

All’inizio della mitosi la ciclina B è citoplasmatica, poi entra nel nucleo, poi la troviamo nell’involucro nucleare e poi
in anafase scompare.
Controllo del ciclo

Questa oscillazione di MPF non è una garanzia sulla corretta divisione cellulare perché ci sono 2 punti importanti
nella divisione e se si superano indietro non si può tornare quindi ci devono essere controlli che garantiscono che la
cellula non si trovi nella condizione si avere materiale genetico non replicato, replicato con errori o cellule
aneuploidi.
Se questo accade, io ho una cellula che può mutare e non posso tornare indietro quindi ci devono essere controlli
repentini perché non devo avere 2 cellule con materiale genetico non replicato o replicato con errori o cellule
aneuploidi.
Ciò non accade perché ci sono dei controlli che evitano questi errori e sono i check point che bloccano la divisione se
c’è qualcosa che non va.

Lui va a guardare che un processo non venga messo in atto fino a che tutto ciò che è successo prima non è eseguito
in modo corretto, quindi, va a vedere che la cellula abbia fatto tutto in modo giusto prima di passare allo stadio
successivo. Ci sono 3 punti di controllo:
1. Fine fase G1: controlla che la cellula abbia dimensioni corrette perché quando si divide deve avere dimensioni
che sono quasi il doppio di quelle normali, quindi, una troppo piccola non deve dividersi. Inoltre questi check
point controllano anche la disponibilità di nutrienti nel terreno perché ovviamente se questi non ci sono la
cellula non si accresce. Il DNA ereditato dalla precedente divisione ha errori? È danneggiato? All’esterno ci sono
fattori che influenzano la stabilità del DNA come raggi X, UV, nitrati nei salumi ecc. e quindi il check point
controlla che il DNA non sia danneggiato prima che possa duplicarsi.
2. Fine fase G2: una cellula non può andare in M se il DNA non è completamente duplicato e quindi il check point
guarda se è duplicato in maniera corretta sennò aspetta fino a che non c’è la riparazione del danno
3. Fine della fase M: mi garantisce che non ci sia la formazione di cellule aneuploidi quindi va a vedere che i
cromatidi siano tutti allineati in piastra sennò non c’è la divisione. Se ho 1 cromosoma non allineato e la cellula si
divide le 2 figlie prendono metà di quelli allineati e 1 avrà quello non allineato e l’altra no come nella sindrome di
down.
Questi check point sono fondamentali nel garantire la corretta divisione cellulare delle cellule somatiche e garantire
che quando si riparano i tessuti non ci siano errori. Tutti questi check point danno alla cellula un certo lasso di tempo
per correggere gli errori, se questo non succede in quel tempo stabilito, le cellule vanno verso l’apoptosi.
Quando la cellula arriva al check point può, se il check point viene superato, iniziare la duplicazione del DNA, ma ci
sono cellule che rimangono in G0 e quindi non entrano in mitosi fino a che non arrivano certi segnali. Ma se la cellula
che deve dividersi è bloccata e non riesce a riparare il DNA va in apoptosi e viene eliminata per impedire che questa
cellula con errori proliferi in maniera incontrollata.

Growth factors
Vari fattori esterni possono influenzare la divisione cellulare, nei mammiferi sono importanti i growth factors che
sono proteine che vengono rilasciate da alcune cellule per influenzare la proliferazione delle cellule target. Questi
fattori sono fondamentali perché una volta rilasciati, il segnale è recepito dalla cellula target e lei entra in divisione.
Il growth factor è un segnale rilasciato da cellule segnale e si diffonde raggiungendo le cellule target con un recettore
nella loro membrana e questo recettore si lega al ligando, il recettore si attiva e determina l’attivazione di una serie
di proteine, ovvero fa trasduzione del segnale perché il segnale è trasportato fino al nucleo e questo segnale dice alla
cellula di iniziare a dividersi.

Nel nucleo questa trasduzione attiva la trascrizione di una proteina, di mRNA per la proteina ciclina D che si
complessa a Cdk e così ho MPF attivo che determina il passaggio da G1 a S.

Ci sono 2 aspetti da tenere in considerazione:

1. La ciclina D non è costitutivamente presente ma la sua sintesi è permessa dal growth factor, quindi è questo
segnale che dice quando e per quanto tempo la ciclina D deve essere sintetizzata, e di conseguenza indica
quando e per quanto la cellula deve dividersi. Nelle cellule tumorali questa ciclina D è sempre attiva e quindi si
dividono sempre.
2. Se il DNA è danneggiato la cellula non si deve dividere ma ci deve essere un controllo determinato da altri geni
come il retinoblastoma RB che è un gene la cui mutazione determina un’alterazione dell’occhio, ed è un tumore
giovanile che se scoperto in tempo da + del 90% di sopravvivenza e da una propensione ad altri tipi di tumori. Il
RB è legato ad un’altra proteina chiamata E2F, e quando RB è legato a E2F porta all’impossibilità della
trascrizione dei geni che portano in fase S, quindi RB è sempre presente nella cellula cioè viene sintetizzato
sempre. Di solito RB è legato a E2F e il complesso si lega al promotore dei geni che dovrebbero permettere il
 passaggio in S ma non lo consentono. Quando la cellula può dividersi MPF è attivo e Cdk che è la chinasi fosforila
il RB. Quando il growth factor dice alla cellula di dividersi la ciclina D si lega a Cdk, la chinasi fosforila RB e E2F si
stacca e si lega ai geni che poi determinano il passaggio alla fase S. Quindi non è direttamente l’MPF a
determinare il passaggio in fase S ma MPF fosforila il RB e E2F si libera e si lega al promotore dei geni che
vengono trascritti per passare in S.

In fase S la cellula duplica il DNA. Ogni check point è rappresentato da 3 passaggi:

1. Sensore che va a vedere se c’è qualcosa di sbagliato o meno nel processo che deve avvenire e quindi si
accorge dello sbaglio e trasmette la sua informazione al trasduttore
2. Trasduttore è l’agente intermedio che poi porta all’attivazione dell’effettore
3. Effettore dice alla cellula ciò che deve fare in seguito alla segnalazione ricevuta dal trasduttore

Nel caso di danneggiamento al DNA deve avere un sensore che vede che è danneggiato e quando si accorge che c’è
un danno non interviene direttamente sull’effettore ma indica al trasduttore di attivare l’effettore.

Nel passaggio da G1 a S il DNA può essere danneggiato da vari fattori esterni e la cellula può rimanere in fase G1 o
G0 per molto tempo. Il DNA danneggiato viene recepito dal sensore che comunica con l’effettore che dice alla cellula
di riparare il DNA per andare a duplicarsi e passare in S, altrimenti se dopo un certo periodo di tempo non è riparato
la cellula muore in apoptosi.

Sensore, trasduttore ed effettore

Si ha il DNA è danneggiato con catena interrotta, il sensore determina un incremento di sintesi di P53 che si lega al
promotore per un altro gene che è il P21 che è l’effettore e controlla 2 aspetti:

1. Inibisce la duplicazione del DNA

2. Inibisce il ciclo cellulare, cioè l’MPF

P53 si lega a P21 e lo attiva andando a trascrivere la proteina che inibisce MPF e impedisce la duplicazione di DNA
tramite l’inattivazione della polimerasi PCNA. Se la cellula ripara il DNA va avanti.

Questo processo inizia da DNA danneggiato da raggi X, il danno attiva una chinasi che è il sensore. Il P53 è
normalmente presente nel citoplasma ma di solito non funziona perché viene continuamente degradato dal
proteasoma. Quando il DNA è danneggiato il sensore, cioè la chinasi fosforila P53 che non viene + degradato e quindi
P53 diventa attivo e si lega alla regione regolatrice per P21 che trascrive l’mRNA che viene tradotto nella proteina
P21 che inattiva MPF legandosi al complesso Cdk-ciclina. Questa sequenza di eventi fa arrestare la cellula in G1.
Il sensore è una chinasi ed è l’ATM perché il nome deriva da una patologia presente raramente nell’uomo. Se la
proteina è mutata la chinasi non funziona e quindi la patologia implica una chinasi non funzionante che non
monitora + se il DNA è normale o danneggiato e quindi si è predisposti al cancro perché le cellule si dividono
nonostante il DNA danneggiato e questa mancanza di poter riparare il DNA porta al cancro. L’ATM viene richiamata
dal DNA danneggiato e fosforila P53.
Il sensore è quindi l’ATM che è una chinasi che se attivata porta alla fosforilazione di P53 e alla sua stabilizzazione.

Molto simile è ciò che accade nel passaggio da G2 a S, c’è un check point in G2 dove si monitora che il DNA sia
correttamente duplicato ed entrano in gioco P53, P21 e ATM. Superati questi controlli la cellula può entrare in mitosi
e può dividersi. Uno dei compiti della mitosi è la separazione corretta del patrimonio genetico, le 2 cellule figlie
devono avere lo stesso numero di cromatidi. Se 1 cellula ha 3 cromosomi 2 vanno in piastra e quando si formano le 2
figlie le avrò aneuploidi perché 1 ha un cromosoma in + e 1 in –.

La corretta separazione dei cromosomi implica che avvenga la formazione dei cromatidi fratelli e quindi che il DNA
sia duplicato bene, la cromatina si condensa, si assembla il fuso e i cromosomi si devono allineare in piastra e poi
devono dividersi. La separazione avviene grazie alla separasi quindi grazie alla degradazione della coesina i
cromosomi si duplicano e ci deve essere un controllo che impedisca che una cellula riceva + cromosomi dell’altra.
Esiste un punto di controllo in metafase e la presenza di questo check point è stato scoperto dall’osservazione
diretta, il passaggio da prometafase a metafase ha un tempo variabile, mentre da metafase a metà anafase passa un
tempo preciso e ciò fa pensare che il tempo che la cellula impiega per organizzare i cromosomi in piastra varia e
quindi significa che c’è qualcosa che alla fine controlla che i cromosomi siano allineati in maniera corretta.
Un esperimento che sottolinea ciò è quello in cui si ha la meiosi della cavalletta con cellule molto grandi e questo è
importante perché si fa un esperimento in cui si prendono i cromosomi in metafase, 1 cromosoma viene rimosso e
questa cellula così non si divide. Se questo cromosoma viene rimesso al suo posto permette la divisione della cellula
dopo 20 minuti. Quando il cromosoma non c’è la cellula non può dividersi quindi c’è un controllo che va a vedere che
i microtubuli siano correttamente agganciati al cinetocore dei cromosomi. Serve un sensore, un trasduttore e un
effettore. Il sensore nella metafase è il cinetocore, i cromosomi hanno il centromero che è una strozzatura che porta
proteine che formano il cinetocore a cui si legano i microtubuli. Quando il cinetocore è libero invia un segnale da
parte di un sensore che viene trasportato all’effettore che impedisce il passaggio all’anafase. Quindi il cinetocore
libero costituisce il checkpoint rilasciando il segnale. Quando il cinetocore è agganciato ai microtubuli il segnale
svanisce e la cellula si divide.

L’effettore
Si ha l’APC che è presente già in metafase ma non deve funzionare quindi è inattivo. Questo viene attivato dalla
proteina Cdc20 che si complessa all’APC e lo attiva, in assenza di essa l’APC è inattivo. L’APC attivato ubiquitina la
securina e libera la separasi che è l’enzima che degrada la coesina che mantiene uniti i cromatidi fratelli. La proteina
che mantiene inattiva la separasi è la securina, quindi prima della metafase c’è APC inattivo, separasi inattiva,
mentre quando avviene che tutti i cromosomi sono allineati in piastra, l’effettore viene attivato da Cdc20.
Il target del check point alla metafase: quando il cinetocore non è legato ai microtubuli parte un segnale che
potrebbe interessare l’APC ma è inattivo, la securina, la separasi ma anche lei è inattiva. Quindi può interessare il
Cdc20 che attiva l’APC e infatti si rilascia il segnale dal cinetocore che inibisce Cdc20. Se Cdc20 è inibito, l’APC non
può essere attivato e non può ubiquitinare la securina e la ciclina D quindi la metafase si arresta.

Il proteasoma è una specie di struttura con varie ciambelle proteiche con un lume centrale dove si introduce la
proteina da degradare e viene riconosciuta dal legame con l’ubiquitina che è un segnale per fargli riconoscere le
proteine ubiquitinate e le degrada.
I cromatidi fratelli sono uniti dalla coesina e la separasi non degrada la coesina ma degrada la subunità della coesina
detta cleisina e la separasi taglia la cleisina, l’anello si apre e i cromatidi si muovono ai poli opposti. Se la securina
non viene degradata, la separasi non funziona e si formano lunghi ponti citoplasmatici in quanto i cromosomi non si
separano.
Il sensore

Fisicamente il sensore è il cinetocore libero che emette un segnale. In mitosi il cromosoma è agganciato da un polo e
all’altro tramite i suoi 2 cinetocori. Quando i 2 cinetocori sono occupati dai microtubuli e sono sottoposti alla stessa
tensione i cromosomi si allineano in piastra. Il cinetocore è la regione da cui viene emesso il segnale, ma il sensore è
stato scoperto nel lievito in cui c’è il gene Mad, ovvero Mad1 e Mad2 che sono importanti nella regolazione del
check point. Le mutazioni sono state viste perché i lieviti continuavano a dividersi anche in presenza di sostanze che
disassemblavano i microtubuli del fuso mentre normalmente si attiva il check point e si blocca la divisione. I mutanti
erano chiamati Mad ovvero geni che mancavano dell’arresto in mitosi. Tutto ciò si lega al controllo del check point
perché io ho il cinetocore dove non ci sono microtubuli legati e ciò porta all’aggancio di Mad1 e si forma un dimero
di Mad1 a cui si lega Mad2.

Questi Mad1 e Mad2 sono presenti sempre nel citoplasma con una particolarità, Mad1 si lega al cinetocore libero da
microtubuli e dimerizza, il dimero richiama Mad2 presente nel citoplasma in conformazione inattiva detta OPEN, e
quando Mad2 si lega a Mad1 questo cambia conformazione e va in CLOSED.

Quindi Mad1 è inattivo in conformazione aperta, ma quando si lega Mad2 al dimero si chiude e ottengo un
tetramero fatto da 2 Mad1 e 2 Mad2 chiusi e questo ha attività catalitica, cioè richiama dal citoplasma altre molecole
di Mad2 open che si legano al tetramero e diventano CLOSED. Il tetramero rimane integro ma le nuove molecole di
Mad2 sono rilasciate nel citoplasma e si legano al Cdc20 quindi Mad2 in conformazione OPEN si trasforma in CLOSED
e viene rilasciato nel citoplasma dove si lega a Cdc20 e lo inattiva. Cdc20 inattivo non si lega ad APC e questa quindi è
inattiva, ovvero l’effettore è inattivo, la ciclina D non viene degradata e neanche la securina e quindi il cinetocore
che non ha contatti con i microtubuli indica che il cromosoma non è allineato correttamente e richiama Mad1 che
dimerizza e richiama Mad2 che è OPEN e si lega al dimero e forma un tetramero che richiama Mad2 OPEN e le
trasforma in CLOSED così da rilasciarle nel citoplasma dove si legano a Cdc20 e lo inattivano. Il ciclo è arrestato fino a
che non arrivano i microtubuli.
Quando arrivano i microtubuli e si legano al cinetocore il tetramero viene allontanato dal cinetocore, non richiama +
Mad2 ma viene allontanato e il P31 si lega al Mad2 legato a Cdc20. Cdc20 è inattivato da Mad2 CLOSED, quando i
microtubuli si legano al cinetocore, non ho + Mad2 CLOSED e P31 porta via Mad2 da Cdc20 e così questo rimane
libero e va a legarsi all’APC e inattiva MPF e la cellula separa i cromatidi ed esce dalla metafase. Mad2 viene
trasformato da CLOSED a OPEN e per questo si inattiva.

Il check point assicura una stabilità genomica, cioè fa sì che non ci possano essere aneuploidie, ma neanche cellule
che ricevono DNA danneggiato. Il controllo del check point nelle cellule tumorali si impedisce. Le cellule tumorali si
dividono continuamente e sono immortali, per cui in esse non funziona il controllo perché ci sono errori che portano
ad aneuploidie come:

- Errori in organizzazione del fuso

- Errori in duplicazione di DNA
- Errori nei centrosomi
Si ha il fattore di crescita che si lega al recettore, tramite la trasduzione si fosforilano le proteine e ciò porta nel
nucleo alla fosforilazione di RB, l‘E2F è libero e garantisce la trascrizione di geni e quindi proteine che portano alla
fase S.

Quindi esistono 2 categorie di geni:

- Protooncogeni che possono diventare oncogeni

- Tumor suppressor genes che controllano i precedenti

Se 1 proteina muta, ovvero 1 gene muta, ho una continua fosforilazione del RB e quindi ho continuamente una
cellula che entra in S. Se muta il recettore per growth factor, questo è sempre attivo e quindi viene sempre attivata
la trasduzione che porta sempre la cellula in S. Quindi il recettore di growth factor potrebbe essere un
protooncogene, mentre il tumor suppressor genes controlla che la proliferazione della cellula avvenga solo quando
deve avvenire. Il P53 è un gene che controlla la progressione tramite il ciclo cellulare e se non funziona la cellula si
divide continuamente.
I protooncogeni
Sono un esempio di protooncogeni il recettore per il growth factor mutato che è attivo e attiva la trasduzione che
determina il passaggio in S. Le proteine coinvolte nella trasduzione del segnale se sono sempre attive arriva sempre
nel nucleo il segnale che la cellula deve dividersi.

Tumor suppressor genes

Sono un esempio di tumor suppresor genes il RB e il P53 che sono quelli mutati nei tumori. P53 controlla il check
point in G1 e il RB va a controllare tramite il legame con E2F il passaggio all’attivazione dei geni per andare in S.

Il RB di solito è legato a E2F e quando succede che il RB lega l’E2F la cellula non trascrive per i geni e in seguito alla
trasduzione E2F si libera e implica il passaggio in S. Se il RB è mutato E2F è sempre libero e la cellula si divide anche
quando non ci sono segnali per farla dividere

Ci sono proteine virali che spiazzano i RB, cioè si legano al RB e liberano l’E2F come il virus del papilloma, si legano a
RB allontanano E2F e lo attivano quindi queste proteine virali fanno proliferare la cellula indipendentemente dai
controlli che ci possono essere.

Il P53 non c’è nelle mosche, e infatti c’è un mutante per il moscerino che manca di SAS4 ma la mosca si forma anche
senza centrioli perché si formano dei fusi senza la presenza di centrioli e quindi centrosomi. Nei mammiferi ciò non
succede, se prendiamo l’embrione di topo, questo si sviluppa ma c’è P53 che è uno dei tanti controllori della
divisione cellulare. Se creo un topo knock out per SAS4 non fa i centrioli, ma non si forma l’embrione perché le
cellule muoiono per apoptosi dato che P53 vede che non ci sono centrioli e impedisce la divisione. Ma se io faccio un
doppio knock out per SAS4 e P53 anche nel topo si formano fusi bipolari nonostante non ci siano centrioli. Il P53
quindi è fondamentale nel controllo della proliferazione cellulare.

MEIOSI
Formazione dei gameti, cellule uovo e spermatozoi

La meiosi è un processo fondamentale nello sviluppo perché è un processo di divisione cellulare che porta alla
formazione dei gameti, ovvero uova e spermi.

La meiosi è necessaria perché è alla base della riproduzione sessuale in quanto lo sviluppo embrionale inizia con la
fusione di spermio e uovo. Il problema è che lo zigote è 2n, ovvero diploide, e se si fondono 2 cellule che sono 2n il
risultato è una cellula tetraploide 4n che non è compatibile con la vita. Quindi la meiosi porta alla formazione di 2
cellule, ovvero spermio e uovo, aploidi e questo perché se fossero diploidi appunto lo zigote sarebbe tetraploide e
ciò non è compatibile con la vita. Quindi la meiosi ha la funzione di ridurre il corredo cromosomico dei gameti a metà
in quanto devono essere aploidi e quando si fondono formano lo zigote diploide che fa successive divisioni, fa
cleavage, gastrulazione e lo sviluppo successivo.
L’uomo ha 46 cromosomi e quindi ogni gamete ha 23 cromosomi.

Una delle funzioni della meiosi è quella di ridurre il numero dei cromosomi in maniera perfetta per creare 2 gameti
aploidi, e nel caso dell’uomo l’ovocito e lo spermio devono avere 23 cromosomi. Per fare ciò servono 2 divisioni
successive, con 1 sola divisione non si può ottenere l’aploidia. Nella prima divisione avviene il crossing over che
garantisce la variabilità che è alla base dell’evoluzione. La meiosi richiede 2 divisioni successive dalle quali si
ottengono 4 cellule ognuna delle quali è aploide. Quindi la meiosi è un processo che dimezza il numero di cromosomi
ma come la mitosi richiede una duplicazione del DNA all’inizio delle divisioni. La duplicazione avviene all’inizio della
prima meiosi ma non c’è nella seconda meiosi. Come la mitosi, prima dell’inizio della prima divisione quindi c’è la
duplicazione del DNA.
Replicazione
All’inizio della meiosi si hanno 2 cromosomi, 1 materno e 1 paterno nella cellula che entra in meiosi e i cromatidi si
duplicano e quindi ho 2 cromosomi ognuno fatto da 2 cromatidi fratelli. Nella mitosi i cromosomi vanno in piastra in
modo indipendente, mentre in meiosi gli omologhi si appaiano a formare le tetradi con 4 cromatidi e lo fanno
tramite il complesso sinaptonemale. Gli omologhi si riconoscono tra loro e tramite la struttura a scaletta si uniscono
tra loro e quindi alla metafase non ho i 2 cromosomi separati ma appaiati. Gli omologhi sono uniti tramite il
complesso proteico sinaptonemale.
Tutto ciò avviene nella profase della prima meiosi nella quale quindi assisto alla scomparsa dell’involucro nucleare, la
condensazione dei cromosomi e l’appaiamento grazie al complesso. Successivamente avviene il crossing over.

Appaiamento omologhi

Inizialmente i cromatidi si appaiano tramite i centromeri, all’estremità ci sono i telomeri e c’è l’appaiamento
determinato dal complesso sinaptonemale che consiste in una struttura centrale + una laterale che si connette alla
cromatina dei cromosomi. Nel microscopio elettronico si vedono i cromosomi duplicati, ma inizialmente non c’è
appaiamento, poi si appaiano e vedo il complesso sinaptonemale fatto da una struttura a 3 strati, un complesso
centrale legato tramite filamenti a uno laterale alla cui periferia si ha la cromatina, e inoltre c’è la coesina che serve
per tenere uniti i cromatidi fratelli.
Complesso sinaptonemale

Il complesso sinaptonemale è fatto da tante proteine nel complesso centrale che sono fatte come dei dimeri, ci sono
2 monomeri che si avvolgono l’uno sull’altro in maniera opposta, quindi l’estremità COOH di una corrisponde a NH2
dell’altra. Questi sono paralleli così che le teste si incontrano nella parte centrale e ancorano la cromatina degli
omologhi proprio nella parte centrale. Sono proteine del complesso sinaptonemale e il complesso è fatto da varie
proteine che determinano la parte centrale e laterale e la + importante è il dimero che costituisce i filamenti del
complesso.

Il complesso si assembla in profase 1 e si assembla gradualmente. Sulla base della formazione del complesso poi si
divide la profase in altre sottofasi. All’inizio si ha il leptotene quando si formano i cromosomi omologhi che sono
duplicati e nello zigotene inizano ad appaiarsi e a formare il complesso formato in pachitene. Poi il complesso si
disassembla perché gli omologhi si separano in diplotene.

Quindi la profase 1 è divisa in:

 Leptotene
 Zigotene
 Pachitene
 Diplotene
Tutto ciò accade perché una seconda caratteristica della meiosi è il crossing over che è uno scambio complesso che
consiste in uno scambio di pezzi di DNA tra cromatidi vicini. Quindi ci deve essere qualcuno che taglia e ricuce il DNA.
L’attore di tutto ciò sono i noduli di ricombinazione RN. Nel crossing over ho 2 cromosomi omologhi che si
scambiano un pezzetto di cromosoma tramite il chiasma che è il punto di fusione a livello del quale agiscono i noduli
che hanno enzimi che tagliano e ricuciono. Il nodulo taglia la cromatina di entrambi i cromatidi e poi ricuce
garantendo lo scambio della cromatina con quella della parte opposta. In anafase 1 cromatidio ha un pezzo del
cromatidio paterno e l’altro 1 pezzo materno.
I noduli riconoscono il punto e fanno un processo complesso e delicato che può portare a degli errori. Ma dal punto
di vista dell’evoluzione della specie, se avvengono pochi errori in pochi individui non è importante, il crossing over
infatti incrementa la fitness e quindi è un processo che garantisce una variabilità genetica favorevole per le specie.

Gli omologhi duplicati si appaiano e dopo che si sono appaiati si formano i chiasmi e si ha uno scambio di cromatina
tra i 2 fratelli di omologhi diversi. Lo scambio infatti deve avvenire tra cromosomi diversi e non tra gli omologhi. Si
visualizza perché al diplotene ci sono punti di contatto, alla metafase i cromosomi iniziano a separarsi e nella prima
meiosi alla metafase si separano coppie di cromatidi, ovvero gli omologhi.

Così si può arrivare ad una variabilità importante. Indipendentemente dal crossing la meiosi porta a variabilità. È
chiaro che il crossing over porta al massimo della variabilità, ma io posso avere variabilità anche basata sulla diversa
combinazione degli omologhi in piastra. Ho solo 2 cromosomi, l’1 e il 2 che si sono duplicati, si appaiano, e quando si
dividono si separano le coppie e se sono disposti in un senso e quindi l’1 e il 2 azzurri stanno in una determinata
parte opposta al rosso avrò 2 cellule con cromosomi azzurri. Ma se l’azzurro e il rosso stanno dalla stessa parte ho
una metafase della seconda meiosi in cui la cellula ha cromosomi di colore diverso e quindi i gameti hanno
combinazioni diverse. Ciò mi da variabilità perché 1 cellula ha parte delle informazioni del cromosoma 1 che
derivano solo dal padre e il 2 della madre ecc.
Ma la variabilità maggiore c’è con il crossing over che scambia un pezzo di cromosoma, i 2 omologhi si appaiano e si
scambiano un pezzo del braccio. Ci deve essere un sito di taglio, il taglio va fatto in modo perfetto perché si deve
tagliare la cromatina e il pezzetto deve essere portato sull’altro cromosoma e ricucito. Ci sono errori che portano a
traslocazione, rotture ecc.
Il crossing over quindi porta alla formazione di un’enorme quantità di combinazioni.

Meiosi
Si parte dall’interfase, duplicazione della cromatina, formazione dei cromosomi ciascuno con 2 cromatidi. Gli
omologhi si appaiano, i 2 1 si uniscono a formare un solo cromosoma ecc. e queste sono tetradi. A questo punto si
vedono i chiasmi in cui avviene taglio e ricucitura. I cromosomi vanno in piastra alla metafase e all’anafase si
separano. Durante la mitosi gli omologhi vanno in piastra in modo indipendente e quindi quando si dividono 1
cromatidio va da una parte e 1 dall’altra. In meiosi, 1 cromosoma è fatto da 4 cromatidi e quindi all’anafase 1 vanno
ai poli gli omologhi che si separano. Alla telofase le cellule che si formano hanno gli omologhi che sono duplicati e
quindi ho gli omologhi e ognuno ha 2 cromatidi ma è necessaria una seconda divisione per ridurre il numero in
quanto ogni gamete deve ricevere 1 cromatidio per ogni cromosoma. Ciò avviene con una seconda meiosi che
somiglia ad una mitosi perché si ha un disassemblaggio dell’involucro, i cromosomi si allineano in piastra, ovvero gli
omologhi con 2 cromatidi, ora i cromatidi si separano e ogni cellula riceve 1 solo cromatidio per ogni cromosoma e
quindi è aploide.

Differenza meiosi e mitosi

Nella meiosi alla metafase 1 si appaiano gli omologhi, all’anafase si separano gli omologhi con 2 cromatidi. In mitosi
ogni cromosoma ha 2 cromatidi e si separano e vanno da parti opposte. Quindi la meiosi 2 assomiglia ad una mitosi
perché in piastra vanno a finire gli omologhi fatti da 2 cromatidi che si separano. Nella meiosi 2 gli omologhi vanno in
piastra e si separano i cromatidi fratelli che migrano ai poli opposti e poi si riformano le cellule. Dalla meiosi 1 si
formano 2 cellule, e ognuna ha una coppia di omologhi fatti ciascuno da 2 cromatidi, questi vanno in piastra, si
separano e l’involucro si riforma intorno a cellule aploidi.
Alla metafase 1 e anafase 1 si separano gli omologhi mentre i cromatidi rimangono uniti tra loro e ciò è possibile
perché c’è la coesina che unisce tra loro i cromosomi omologhi e quindi quando arriva la separasi taglia la coesina e
gli omologhi si separano. Ma la coesina tiene uniti anche i cromatidi fratelli e viene degradata in meiosi 2 perché
questa coesina nei fratelli nella meiosi 1 è protetta da un’altra proteina Shugoshin che è una sorta di guscio intorno
alla coesina che sta nel centromero. Lo Shugoshin protegge la coesina dalla separasi. Alla meiosi 2 Shugoshin viene
degradata e quindi la coesina viene degradata dalla separasi e i fratelli si separano.

Processo di risposta della meiosi ai check point

Anche la meiosi ha un controllo del check point che monitora che i cromosomi siano in piastra. Siano in prometafase
1 e si hanno gli omologhi lontani tra loro con cinetocore libero che da un segnale che porta all’inattivazione di APC.
Quando ho un attacco bipolare, ovvero quando sul cinetocore si agganciano i microtubuli, il check point si silenzia e
si attiva il Cdc20 che attiva APC che ubiquitina la securina che inattiva la separasi, quindi se la securina è degradata la
separasi è attiva e taglia la coesina che unisce gli omologhi. Successivamente anche la separasi agisce sulla coesina
dei fratelli che si separano.

Si hanno 2 tipi di meiosi:

1. Meiosi legata alla gametogenesi maschile

2. Meiosi legata alla gametogenesi femminile
I processi sono simili. Nella meiosi maschile si parte da una cellula diploide, lo spermatocito, in meiosi 1 si formano
le tetradi, gli omologhi vanno ai poli opposti, il DNA si decondensa, in metafase vanno gli omologhi in piastra e poi si
formano 4 cellula aploidi ovvero gli spermi.
Quella femminile porta sempre a 4 cellule ma diverse tra loro mentre gli spermi come dimensioni sono tutti uguali.
Nella femminile si parte dall’ovocito diploide, il ciclo è lo stesso, e in telofase si formano 2 cellule con dimensioni
diverse, 1 grande e 1 piccolissima e quindi queste si separano e alla base della differenza c’è la disposizione del fuso
in modo asimmetrico. Nella meiosi 2 la cellula grande si divide e anche quella piccola e si ottengono, dalla cellula
grande si forma 1 grandissima e 1 piccola quindi alla fine ci sono 4 cellule aploidi ma diverse, 1 molto grande che è
l’ovocito che sarà l’uovo.

Costruire una cellula uovo significa grande dispendio di energia perché nell’uovo si accumulano tutte le sostanze per
l’embrione, se poi lo sviluppo embrionale è diretto come una larva serve un uovo ricco di materiale di riserva. Se
tutte fossero grandi il dispendio energetico sarebbe eccessivo quindi la differenza di dimensioni si deve relazionare al
fatto che l’uovo ha il materiale necessario per lo sviluppo dell’embrione e ce ne può essere solo 1, mentre le altre
sono polar bodies che vengono poi eliminate ma ha senso che si formano perché in meiosi 1 gli omologhi si
separano e devono finire in parte su 1 e in parte sull’altra.

Quindi durante la gametogenesi maschile si formano tutte cellule piccole e durante la spermiogenesi c’è
l’eliminazione del citoplasma che da noia per il movimento, mentre nella gametogenesi femminile va mantenuto il
citoplasma che serve per lo sviluppo.

Meiosi vs mitosi

La meiosi produce cellule aploidi diverse per contenuto di DNA grazie al crossing over. Queste differenze derivano da
crossing over ma anche dall’allineamento causale degli omologhi. Nella mitosi invece si hanno cellule identiche come
contenuto di DNA.

Dal punto di vista del processo nella mitosi si parte da 2 cromosomi, 1 del padre e 1 della madre che duplicano, si
allineano in piastra e ogni cellula riceve 1 cromatidio di 1 dei 2 cromosomi. Nella meiosi si parte dai cromosomi
parentali che si duplicano e si appaiano per formare le tetradi che vanno in piastra e in meiosi 1 si separano gli
omologhi mentre in meiosi 2 si separano i fratelli. La mitosi ha cellule tutte uguali, mentre la meiosi le ha tutte
diverse.

La mitosi è 1 sola divisione, la meiosi sono 2, dalla mitosi si formano 2 cellule, dalle meiosi 4. Le cellule sono
identiche in mitosi ma diverse in meiosi. Il contenuto dei cromosomi in cellule figlie in mitosi è lo stesso della madre,
mentre è diverso in meiosi perché c’è aploidia.

La mitosi riguarda le cellule somatiche, la meiosi quelle germinali. La mitosi serve per lo sviluppo e riparazione e c’è
per tutta la vita, la meiosi invece si attiva alla maturità sessuale e si ha nel periodo riproduttivo.
Problemi in meiosi

Gli errori durante la meiosi possono portare a gravi conseguenze:

Nel moscerino, nella gametogenesi maschile, si ha il passaggio da metafase a telofase. Si ha il mutante delle proteine
per formare il fuso e se non c’è il fuso non si forma in modo corretto, le cellule non si dividono, e questi fusi irregolari
portano ad un’errata distribuzione dei cromosomi. Nel wild type, in entrambe le cellule si formano i nuclei, nel
mutante i nuclei vanno solo in 1 cellula. Quindi nel mutante si va incontro ad un aneuploidia ma non c’è controllo o
non funziona. Nell’uomo questi problemi possono essere mutazioni cromosomiche, ovvero difetti durante la
separazione degli omologhi:

1. Delezione: si perde un pezzo di cromosoma

2. Inversione: al crossing over un pezzo di DNA viene attaccato in maniera invertita
3. Traslocazione: un pezzo di cromosoma va da un’altra arte
4. Non disgiunzione: aneuploidie

In metafase se c’è delezione ho un cromosoma che si rompe quindi ho 1 cellula con cromosoma corretto e 1 che
manca di un pezzetto. Questa rottura si associa alla patologia che è la leucemia mieloide.

Oppure possono esserci problemi di non disgiunzione e ciò porta ad aneuploidie e quindi a conseguenze gravi. Di
solito ho una meiosi da cui ottengo cellule aploidi, ma se ho una non disgiunzione, ho 1 cellula con cromosoma e 1
senza quindi 1 gamete ha quel cromosoma in + e gli altri non ce l’hanno. Alla fecondazione l’uovo aploide feconda lo
spermio con 2 cromosomi e ho un embrione aneuploide e quindi si ha una trisomia. Un esempio è la sindrome di
down con 3 cromosomi 21, la sindrome di Turner dove manca Y, Klinefelter con 1X in +.
Checkpoint e meiosi
Gli errori avvengono perché funziona male il check point. Il check point in mitosi monitora che tutti i cromosomi
siano allineati in piastra, che i cinetocori siano legati ai microtubuli ai poli opposti, si attiva APC che taglia la securina
e la separasi attiva taglia la coesina che unisce i fratelli e quindi in seguito al messaggio del check point si separano i
cromosomi. Ci sono proteine dette del complesso del SAC che sono proteine Mad1 e Mad2 e Cdc20 che attiva APC.
Durante la profase e prometafase i cromatidi non si devono separare e quindi il check point manda il messaggio di
Mad1 e Mad2 con inattivazione di Cdc20 e APC non funziona. Quando i cromosomi sono in piastra il check point
attiva Cdc20 che si lega ad APC che funziona e degrada le cicline, la securina ecc.

Durante la meiosi si suppone che ci sia, come in mitosi in cui in prometafase il SAC ha proteine che vengono
informate che i cinetocori sono liberi e i cromosomi non sono in piastra e il Cdc20 è inattivo e l’APC non funziona,
quando i cromosomi sono Allineati SAC si spegne e si attiva APC e anche in meiosi le SAC inattivano Cdc20 quando
non sono allineati e lo attivano quando i cromosomi sono in piastra.

Gli errori in spermatogenesi sono minori che in ovogenesi. Quindi già questo indica una grande differenza e quindi ci
si chiede il motivo di questa differenza in quanto c’è 1 aborto spontaneo su 6 concepiti.
Ciò può dipendere dal fatto che si pensa che nel topo l’inizio dell’anafase, quindi il controllo del check point, sia
labile, cioè probabilmente l’inizio dell’anafase nel topo non richiede l’allineamento di tutti i cromosomi in piastra e
l’aggancio di tutti i centromeri ma si va a vedere una massa critica e l’anafase va avanti anche se non tutti sono in
piastra e ciò può spiegare perché si hanno molte aneuploidie. Nella meiosi maschile anche 1 solo cromosoma non
allineato può bloccare la meiosi, nell’ovocito + cromosomi non allineati non influiscono sul completamento della
meiosi. Ciò si può spiegare dicendo che le proteine del check point monitorano l’allineamento dei cromosomi ma
hanno difficoltà a controllare quando il volume della cellula è molto grande ed effettivamente il volume nell’ovocito
è circa 200 volte + grande delle somatiche e quindi il check point da una segnalazione ma non è recepita
correttamente per l’enorme volume.
Oppure il malfunzionamento del check point non necessariamente dipende solo dal volume ma nelle somatiche si
richiede il richiamo di Mad1 e Mad2 nel citoplasma e se la cellula è grande ciò è complesso. Quindi c’è un difetto di
reclutamento di proteine Mad1 e Mad2. Ci sono cromosomi non allineati e poca Mad1 va sul cinetocore e quindi ci
sono difetti nel reclutamento delle proteine del cinetocore e quindi difficilmente le proteine sono chiamate nel
tempo breve che si ha a disposizione.

Sindrome di Down

La trisomia 21 è legata all’età della madre, + la madre ha età avanzata + aumenta la possibilità di avere un figlio con
trisomia 21.

Ciò si spiega perché i cromosomi omologhi sono uniti tra loro dai complessi sinaptonemali. La meiosi femminile è
caratterizzata dal fatto che gli ovociti sono bloccati in profase e si sbloccano a 13 anni fino a 50 e quindi riprendono
la meiosi e quindi i cromosomi negli ovociti sono tenuti insieme dalla coesina che con il passare degli anni da
problemi di degradazione.
Nel topo si hanno i cromosomi omologhi legati dalla coesina, avviene il crossing e rimangono bloccati. Se facciamo
un topo knock out per quella coesina questo incrementa gli errori in meiosi e quindi la non disgiunzione e ciò
suggerisce che potrebbe essere la coesina ad essere coinvolta nell’incremento della trisomia 21 con l’età. Gli ovociti
si formano durante la vita embrionale e poi si arrestano in profase e i cromosomi sono uniti dalla coesina fino a 50 e
+ anni e questo indica che questa coesina è + difficile da separare con l’età.

Quella maschile è molto veloce e quindi problemi di non disgiunzione sono difficili, mentre nella meiosi femminile i
cromosomi sono legati per anni e anni e quindi ci sta che questa coesione porta a problemi per la separazione.

METODI DI RIPRODUZIONE

La riproduzione può essere:

 Sessuata: c’è la fecondazione e garantisce grande variabilità genetica

 Asessuale: è quel tipo di riproduzione che da 1 cellula origina 2 cellule figlie identiche come nel paramecio in
cui c’è divisione binaria. L’idra è un pluricellulare e non si divide come il protozoo ma si formano delle gemme
e quindi la parete prolifera, si formano le gemme che rimangono attaccate alla parete o si staccano e formano
un nuovo individuo. Questa comporta o la divisione della cellula in un organismo unicellulare o la gemmazione.
Questo implica che questi animali non siano particolarmente complessi e quindi si spiega come da una cellula
somatica possa derivare un organismo

La partenogenesi è il processo per cui l’uovo si sviluppa senza la fecondazione da parte del gamete maschile. La
partenogenesi richiede la presenza di un gamete che comunque deriva da meiosi iniziale quindi è un metodo di
riproduzione sessuata.

La riproduzione sessuata è il frutto dell’unione del gamete maschile e femminile e la loro fusione porta allo zigote
che si divide per mitosi successive con il cleavage. È importante la variabilità genetica perché ogni gamete è diverso
dall’altro anche strutturalmente.
Negli organismi superiori si hanno 2 classi di cellule che formano l’organismo:

1. Somatiche: + di 200 tipi cellulari che formano tessuti e organi

2. Germinali: responsabili della formazione dei gameti e necessarie per la riproduzione e propagazione delle
specie
Negli organismi superiori c’è una segregazione precoce della linea germinale cioè segregano prima delle altre cellule.
Quindi le cellule germinali si possono già riconoscere ai primi stadi di sviluppo quando i tessuti non sono formati e
ciò accade dagli insetti ai vertebrati. Le cellule germinali portano alla produzione dei gameti con:

 Spermatogenesi: seguita da spermiogenesi porta alla formazione di gameti maschili

 Oogenesi: porta ai gameti femminili
Ciò implica la divisione mitotica e negli ovociti grandi ci deve essere il materiale per lo sviluppo mentre gli spermi
sono molto piccoli perché devono muoversi e infatti si perde il citoplasma.
Le cellule germinali segregano precocemente e ci sono 2 sistemi di segregazione:
1. Specificazione autonoma: avviene grazie alla presenza di determinanti nel citoplasma, cioè nei nematodi come
C. rabditis fino ai vertebrati si ha la presenza nell’ovocito di particolari informazioni che sono legate alla
specificazione delle cellule germinali.
2. Nei mammiferi è diverso ma non molto chiaro perché è difficile studiare lo sviluppo nei mammiferi perché è
interno, ma non sembra che ci siano informazione già prestabilite all’interno dell’uovo. Le cellule germinali nel
topo, nell’uovo si formano dopo la segmentazione e quindi + tardi che nei nematodi, mosche o rana. Si pensa
che si siano segnali che arrivano dalle cellule vicine e che dicono alle cellule che poi diventano germinali cosa
devono fare.

La formazione delle cellule germinali avviene tramite:

 Differenziamento
 Migrazione: dalla mosca all’uomo le cellule si formano in distretti diversi da dove si formano le gonadi e
quindi devono migrare seguendo certi binari fino ad arrivare al punto dove si formano le gonadi fatte sia da
cellule germinali che da tessuto somatico.

Si parla di cellule germinali primordiali che all’inizio sono precursori, mentre le cellule germinali vere e proprie sono
staminali che si dividono nelle gonadi in maniera asimmetrica e quindi quando si divide forma 2 figlie, 1 rimane
germinale e l’altra si differenzia in oocito o spermatocito.

Ci sono 2 modalità per stabilire la linea germinale:

1. Ci sono già delle informazioni presenti nell’oocito
2. Nel topo o nell’uomo le cellule germinali non si formano per informazioni preesistenti ma grazie all’influenza
di cellule vicine quindi la segregazione nei mammiferi avviene + tardi.

Il plasma germinale è rappresentato da informazioni, ovvero degli mRNA o ribonucleoproteine che sono presenti
nell’ovocito alla fecondazione e poi segregano in punti ben precisi.

Caenorhabditis
Il Caenorhabditis è un nematode eutelico di cui si può seguire il destino delle cellule e quindi si sa quale cellula forma
la linea germinale. Lo zigote si divide la prima volta e il blastomero da origine alla linea germinale. Ci sono
informazioni che sono granuli P che sono aggregati di proteine e mRNA. Alla fecondazione i granuli stanno in tutto il
citoplasma dell’ovocito e poi quando i pronuclei si fondono i granuli P vanno tutti nella parte posteriore
dell’embrione e quindi quando la cellula si divide si trovano in 1 sola. Poi le cellule continuano a dividersi fino a che i
granuli P rimangono nel gruppo di cellule che originano le cellule germinali.

Una proteina dei granuli P è legata a una proteina fluorescente e si vede la formazione della prima larva. I granuli P
stanno all’inizio in tutto il citoplasma, ma quando i pronuclei si formano vanno ad un polo e quindi quando lo zigote
si divide rimangono in 1 delle 2 cellule e così via fino a che i granuli P non rimangono solo nei precursori delle
germinali. Ciò dimostra che la presenza dei granuli P è necessaria per la linea germinale e quindi ci sono informazioni
segregate precocemente nello sviluppo embrionale.
Drosophila
Nel moscerino alla fine del cleavage c’è un gruppo di cellule nella regione posteriore e sono cellule polari ovvero i
precursori della linea germinale. Dentro a queste cellule nel citoplasma ci sono aggregati che sono fatti dal plasma
germinale che segrega al polo posteriore dell’ovocito perché viene trasportato attraverso il citoscheletro in quella
posizione. Viene trasportato cioè non è l’ovocito che produce il plasma germinale ma è prodotto da cellule nutrici,
infatti l’ovocito è legato a 15 cellule nutrici che producono il materiale di riserva e va nella parte di citoplasma vicina
alle cellule nutrici quindi nella parte anteriore ma poi deve andare posteriormente. Ci sono meccanismi di
movimento lungo i microtubuli che lo portano successivamente nella parte posteriore.
Quindi anche nel moscerino ho informazioni al polo posteriore che sono un mix di proteine e mRNA che sono
specifici per certe proteine che per esempio sono Vasa, Tudor, Valois, ovvero 3 linee regnanti che non hanno avuto
figli e si riferiscono al fatto che i mutanti che hanno difetti nella produzione di queste proteine sono sterili. Quindi
basta l’assenza di una di queste informazioni nel plasma germinale per determinare la sterilità del ceppo.
Quando il plasma germinale si localizza al polo posteriore determina la cellularizzazione. Inizialmente il nucleo sta nel
citoplasma, si divide tante volte e queste divisioni però non sono accompagnate da citodieresi. Poi i nuclei dalla
parte interna migrano in superficie ma rimane un sincizio, cioè i nuclei non sono separati da membrane plasmatiche,
ma quelli che stanno nella parte posteriore e a contatto con il plasma germinale sono circondati da membrana.
Quindi i precursori delle germinali si formano e si identificano con la membrana prima di tutte le altre. Quindi si ha
una segregazione veloce della linea germinale e precoce.
Gli mRNA sono localizzati al polo posteriore grazie allo spostamento lungo il citoscheletero e sono localizzati grazie
alla presenza di un altro mRNA che è Nanos che determina lo spostamento degli altri mRNA, quindi è fondamentale
per la localizzazione di mRNA legati alla sterilità.

Quando la mosca non ha 1 di questi mRNA: c’è un embrione privo di plasma germinale e quindi saranno sterili. Nel
mutante non ci sono le cellule polari e quindi non ci sono cellule germinali.

Esperimento
Si ha l’ovocito con plasma germinale posteriore e quando viene fecondato e va incontro al primo processo di
sviluppo e si formano le cellule polari.
Se prendo il plasma germinale della parte posteriore e lo trapianto in quella anteriore di un altro ovocito si formano
le germinali sia nella parte anteriore che posteriore e quindi il plasma germinale è necessario e sufficiente per la
formazione delle cellule germinali.

Proteine Vasa
I nuclei si dividono nel citoplasma dell’ovocito e stanno all’interno, ma dopo una serie di divisioni senza citodieresi
alcuni nuclei migrano e vanno nella parte posteriore dove si trova la proteina Vasa e quando i fusi mitotici
contattano la parte posteriore, catturano il plasma germinale che si lega ai microtubuli e questo induce la
cellularizzazione e si formano le cellule polari precursori della linea germinale
Un esempio di mutante in cui manca una proteina è un moscerino. Il wild type ha un testicolo con cellule germinali
che sono spermatociti, spermatogoni ecc. e vengono marcati perché hanno la proteina Vasa e ci sono le germinali. In
un mutante manca Vasa o è limitata perché le cellule somatiche costruiscono la gonade ma non viene popolata dalle
germinali perché non ci sono e quindi le mosche sono sterili.

Xenopus
Nello Xenopus accade + o – la stessa cosa perché anche lo Xenopus ha un plasma polare, ci sono granuli presenti
nell’ovocito e segregano nei precursori della linea germinale.
Mammiferi

Nei mammiferi non c’è il plasma germinale già presente fin dall’inizio, ma le cellule germinali si formano + tardi
durante lo sviluppo.
Nel topo si ha il primo processo di sviluppo che porta alla blastocisti, poi le cellule che formano la blastocisti si
muovono e vanno incontro alla gastrulazione. I precursori della linea germinale compaiono quando inizia la
gastrulazione. Quando si forma la blastocisti ho una massa cellulare interna composta da cellule dell’epiblasto e
cellule dell’ipoblasto, quelle dell’ipoblasto formeranno il rivestimento del sacco del tuorlo, mentre quelle
dell’epiblasto origineranno le cellule di tutti i tessuti. Le cellule primordiali germinali si formano al margine
dell’epiblasto.

Si localizzano nella regione dell’embrione 2 geni, 1 fragilis espresso in tutto l’epiblasto ma maggiore nella parte
periferica e questa maggiore espressione sembra accendere il gene stella che si accende solo nella regione periferica
in cui si formano le germinali. Quindi stella è un marker delle cellule primordiali germinali. Quindi a differenza dei
primi esempi in cui servono dei determinanti che ci sono già nell’ovocito, qui non ci sono informazioni preesistenti
ma è un insieme di messaggi che arrivano e la segnalazione di fragilis attiva stella che si attiva solo nella regione in
cui fragilis è + abbondante e questo indica che fragilis controlla l’attivazione di stella che avrà dei siti a bassa affinità,
ovvero stella può essere attivato solo con un’alta concentrazione di fragilis.

Il gene Vasa si trova anche nei mammiferi ovvero nella loro linea germinale.

Migrazione cellule germinali

Quando le germinali primordiali si formano, si formano in punti dell’embrione lontani da dove si formano le gonadi
perché le gonadi si formano grazie a cellule somatiche e devono poi essere popolate dalle germinali che devono
migrare.

Drosophila

Alla fine del cleavage, in Drosophila, si forma il blastoderma con cellule e ci sono le cellule polari che stanno
appoggiate nella parte posteriore, ma le gonadi si formano all’interno. Formato il blastoderma inizia la gastrulazione
che è uno spostamento delle cellule così da farle interagire. La gastrulazione nel moscerino avviene perché la regione
posteriore si sposta anteriormente ruotando in senso antiorario e si forma un’introflessione che è il precursore
dell’intestino posteriore, poi il processo continua e le cellule polari sono inglobate in un sacchetto che va all’interno
dell’embrione, e origina l’intestino. Perciò queste cellule polari devono attraversare l’epitelio.
Tudor è un mutante che non produce cellule polari e se si guarda l’interno dell’embrione si vede che l ‘intestino si
forma ma è vuoto perché non ha cellule polari.

Le cellule polari devono attraversare l’epitelio, e l’interazione con l’epitelio porta all’apertura delle giunzioni. Nella
regione apicale ci sono le giunzioni zonules aderentes che sono fatte da proteine di adesione e che sono
caratterizzate dall’avere una cintura di microfilamenti e questo vuol dire che queste cellule sono unite da giunzioni
non troppo resistenti. Queste cellule polari riescono ad aprire le giunzioni e ciò accade anche nell’uomo in seguito ad
un’infiammazione. Le cellule polari forzano le giunzioni ed entrano nelle cellule epiteliali, si muovono, attraversano
l’epitelio e finiscono nella parte opposta. Continuano poi a muoversi e si localizzano nella regione dove si
formeranno le gonadi che quindi si formano per cellule somatiche differenziate e poi sono popolate dalle germinali
primordiali.
Proteina Nanos

Nanos è importante per lo spostamento di mRNA ma anche per il movimento delle cellule polari e ciò viene
dall’analisi del fenotipo. Il mutante per Nanos ha cellule che formano ammassi irregolari e non migrano in maniera
corretta e infatti ci sono gli ovarioli solo con la parte somatica ma privi di germinali e quindi il mutante è sterile.
Topo

Nel topo le cellule primordiali si formano in un punto e devono spostarsi. Le cellule germinali primordiali si formano
al confine dell’epiblasto grazie al gene stella. Le cellule iniziano a migrare mentre l’embrione si sta formando. Le
primordiali germinali migrano lungo l’intestino che si sta formando e poi finiscono nelle pieghe genitali dove si
formano le gonadi.

Per la migrazione ci sono binari fatti da proteine legate alla matrice ma non è chiaro il processo.
 DETERMINAZIONE DEL SESSO
Differenziamento del sesso
Il Caenorhabditis ha poche cellule, ha 2 fenotipi sessuali, maschio X0 ed ermafrodite XX che si può autofecondare e
dall’autofecondazione nel 99% dei casi si ottengono ermafroditi e l’1% di maschi e ciò mi permette di fare incroci con
un ermafrodita e ottenere il 50% di ermafroditi e il 50% di maschi.

I sessi possono essere differenziamenti da cromosomi sessuali. Si può avere un sesso eterogametico o omogametico.
Eterogametico ha cromosomi sessuali diversi, mentre nell’omogametico ci sono solo le femmine. Si ha una
determinazione del sesso legato alla cimice e viene detto modo Protenor e in questo caso il maschio è X0 e la
femmina XX.

Nel caso del modo Lygaeus della cimice la femmina è XX e il maschio XY. Quindi ho un sistema XX-X0 in cui
l’omogametico è la femmina e l’eterogametico è il maschio.
Il sistema XX-XY sta nei mammiferi, ma negli uccelli, farfalle, pesce e serpenti ho un sistema per cui il maschio è
omogametico e la femmina eterogametica.

Un altro sistema di determinazione del sesso è quello aplodiploide che significa che l’organismo diploide è femmina
e i maschi sono aploidi come nelle api, le vespe, le formiche ecc. quindi questo sistema è diverso e va al di la del fatto
di essere omo o etero gameti.

Cromosomi sessuali e determinazione del sesso

Il moscerino ha maschio XY e femmina XX come nell’uomo. La femmina fenotipicamente è + grande e con busto +
chiaro. Ci sono pochi cromosomi, 2 puntiformi che non hanno geni, 2 sessuali, e cromosoma 2 e 3 che contengono la
gran parte dei geni.

Nell’uomo il maschio è XY e la femmina XX, ma esiste una sindrome XXY di Klinefelter in cui il fenotipo è maschile
quindi è fondamentale la presenza di Y, mentre Turner è X0 ma comunque il fenotipo è femminile.
Nella mosca non si ha necessita dell’Y perché il maschio si forma sia in presenza che in assenza di Y, X0 è maschio
mentre XXY è femmina. Quindi l’Y non c’entra nella determinazione del sesso ma è importante il numero di
cromosomi X o meglio il rapporto tra X e Autosomi. Ciò significa che gli X hanno la capacità di determinare la
regolazione di certi geni implicati nella determinazione del sesso e il numero di X:A deve essere 1 o maggiore di 1.
Nel maschio si ha 1X e 2A e quindi il rapporto è 0,5, nella femmina si hanno 2X e 2A quindi il rapporto è 1 e questo
consente l’accensione di alcuni geni che possono regolare il processo di determinazione del sesso.

Sxl

Nella femmina ci sono 2X e 2A con rapporto pari a 1, mentre nel maschio è 0,5. Nella femmina il rapporto permette
la trascrizione di fattori che si legano al promotore precoce di un gene che è Sxl (sex-lethal), quindi c’è l’attivazione
di geni che portano alla trascrizione di proteine che fanno da fattori di trascrizione e si legano al promotore del gene
che sta a monte della determinazione del sesso. Il gene ha 2 siti su cui le proteine prodotte possono legarsi, c’è un
punto che da origine alla trascrizione del fattore precoce e un altro sito dove si ha la trascrizione dello stesso gene
trascritto continuamente.

Quindi il rapporto 1:1 determina la trascrizione di fattori che controllano la trascrizione del gene Sxl che sta a monte
della determinazione del sesso di Drosophila.
La trascrizione del promotore precoce Sxl fa sì che venga tradotta e trascritta la proteina con vari esoni tra cui
l’esone di stop. Quindi il promotore precoce attraverso lo splicing elimina l’esone di stop e la proteina che si forma
funziona e quindi Sxl funziona. Sxl precoce si lega al promotore tardivo per cui ha 2 promotori. La proteina Sxl attiva
il promotore tardivo che mantiene attiva la trascrizione di Sxl ma anche qua c’è l’esone di stop che va tolto con lo
splicing e quindi si forma un mRNA che da proteina funzionante.

Nel maschio il rapporto 0,5 non mi fa attivare il promotore precoce, mentre è presente la trascrizione del promotore
tardivo e quindi Sxl dovrebbe essere trascritto ma c’è l’esone di stop che non viene tagliato perché non ho Sxl
precoce, quindi l’mRNA non funziona e quindi nel maschio non ho Sxl.
Per sapere quale embrione da una mosca maschio o femmina si deve vedere quale embrione trascrive Sxl.

Sxl è legato all’attivazione di Transformer che è legato a dsx (doublesex). Nel maschio c’è solo dsx che porta
all’attivazione di geni maschi o femmina specifici.
Il transformer c’è nella femmina ma nel maschio no. Sxl è attivo nella femmina e fa splicing su Tra e quindi anche Tra
ha un codone di stop e se viene trascritto così com’è, la proteina transformer non c’è. Sxl agisce come fattore di
splicing su Tra che è trascritto anche nel maschio ma c’è il codone di stop e non può essere tradotto perché non c’è
Sxl.
In teoria dsx può essere trascritto per la sua intera lunghezza e ciò accade nel maschio. Nella femmina però c’è
Transformer che fa splicing di dsx quindi nella femmina solo una parte di dsx viene trascritta e tradotta. Quindi la
femmina ha dsx + corto del maschio. La presenza di dsx nella femmina porta all’attivazione di geni che determinano
la femmina. L’assenza di Transformer e quindi dsx + corto porta alla repressione dei geni femmina specifici e c’è
l’espressione di quelli che determinano il genotipo maschile.

Determinazione del sesso

La maggior parte delle specie sono divise in maschi e femmine e ci sono solo poche eccezioni che sono ermafroditi.
Ci sono 2 fattori per la determinazione del sesso:

1) Cromosomi sessuali
2) Fattori esterni

Nell’uomo le gonadi circa a 5/6 settimane sono bipotenziali, ovvero non hanno ancora stabilito quale è il loro
destino, può essere ovario o testicolo, dopo queste settimane, le cellule che migrano e si sviluppano nel cortex della
gonade danno origine all’ovario, mentre quelle che si sviluppano nella medulla originano il testicolo.

Le cellule germinali migrano lungo la parete dell’intestino, arrivano al mesentere e si spostano nelle pieghe dove si
formeranno le gonadi. La gonade ha una regione corticale, il cortex, e una centrale che è la medulla. Quando le
cellule rimangono nella regione corticale si sviluppa la gonade femminile, mentre se le cellule germinali vanno nella
medulla si originano i tubuli seminiferi e quindi il testicolo.

Formazione testicolo e ovario

Si formano tubuli seminiferi nella medulla, mentre gli ovari si formano nella regione corticale. Le cellule germinali
maschili implicano il blocco della meiosi, mentre le femminili ne implicano l’inizio e poi si blocca. Nel caso della
gonade femminile i follicoli ovarici si formano nel cortex. Quindi c’è un differenziamento spaziale.

Chi guida la scelta?

Le cellule non vanno a caso nel cortex o nella medulla, ma la direzione dipende dalle informazioni legate ai
cromosomi sessuali. Nel caso del topo i cromosomi sono XX o XY perché siamo eterogametici. Nel moscerino il sesso
non è determinato da cromosomi sessuali ma dal rapporto tra X e A. Nel topo non è così perché XX o XXX danno un
fenotipo femminile, mentre XY e XXY danno un fenotipo maschile anche se genotipicamente ci sono 2 X. Se è
sufficiente 1Y per passare da femmina a maschio si suppone che in Y ci sia un fattore che porta alla formazione del
testicolo. Femmine XY genotipicamente sarebbero maschi, ma può essere femmina se manca un pezzetto del
cromosoma Y, ovvero un braccio terminale. XX è una femmina ma se si aggiunge a X un pezzetto di Y gli individui
sono maschi. Quindi nella parte terminale di Y c’è un fattore che determina il sesso maschile.

Il fattore è il gene SRY che codifica per una proteina molto corta che è un fattore di trascrizione che attiva altri geni
coinvolti nella determinazione il sesso. Y ha il centromero subapicale e SRY sta nel braccio + corto quindi SRY che
codifica per questa piccola proteina è fondamentale per la determinazione del sesso, tutto il resto come le regioni
PAR, servono per l’appaiamento in meiosi e il resto del cromosoma esprime pochi geni maschio specifici.
Le regioni PAR su Y hanno omologia con X e servono per l’appaiamento.

La regione SRY legata alla trascrizione di mRNA per la proteina corta è importante perché sul topo, se togliamo SRY,
XY non è fenotipicamente un maschio ma una femmina a dimostrazione che è sufficiente quella piccola regione per
la determinazione del sesso.
Esperimento
Si costruiscono topi transgenici in cui si inietta SRY nell’embrione all’inizio della segmentazione e si vede che molti
individui che nascono sono XX ma sono maschi e infatti hanno SRY. Per la determinazione del sesso intervengono
anche geni autosomali.

Geni autosomali

SOX9 è un gene autosomale fondamentale e si trova in tutti i vertebrati ma SRY è specifico solo dei mammiferi.
Quindi nei vertebrati la determinazione del sesso richiede SOX9, mentre nei mammiferi ci deve essere anche SRY.
Anche qua un individuo XX che ha una copia in + di SOX9 sviluppa testicoli, quindi è genotipicamente femmina e
fenotipicamente maschio anche se non ha SRY. Quindi SOX9 è importante per la determinazione fenotipica del sesso
perché anche se non c’è SRY ma c’è SOX9 si sviluppano testicoli.

SRY sta nei mammiferi, SOX9 in tutti i vertebrati. Nei mammiferi ci sono eccezioni, l’ornitorinco sembra che non
abbia SRY, ma se si sale nella scala evolutiva si trova la talpa che non ha SRY. In tutti i casi, sia che ci sia SRY o meno ci
deve essere SOX9.
SOX9

SOX9 è necessario per lo sviluppo di testicoli, femmine che non hanno SRY ma hanno SOX9 sono maschi così come le
femmine che hanno una copia in + di SOX9. SOX9 infatti attiva l’ormone AMH per lo sviluppo di testicoli.
Un altro fattore è SF1 che è un fattore di trascrizione e la sua espressione non c’è nelle gonadi femminili, ma c’è in
quelle maschili quindi anche questo gene è necessario per la formazione e il mantenimento dei testicoli e infatti
trascrive per una proteina che produce testosterone.
Inoltre c’è Dax1. In passato si descrivono sorelle XX genotipicamente femmine ma fenotipicamente maschi. Anni
dopo si evidenziò che il gene Dax1 è presente normalmente nel cromosoma X ma in queste sorelle era duplicato.
Questo significa che di solito si ha 1 copia di Dax1 e SRY, Dax1 non può interferire da solo con SRY quindi SRY vince su
Dax1, ma se ho 2 copie di Dax1 come nelle sorelle, producono il doppio della proteina e annullano la funzione di SRY.
Quindi una duplicazione di Dax1 impedisce a SRY di funzionare e quindi il genotipo è XY ma fenotipicamente sono
femmine.
Sappiamo che Dax1 che sta su X interagisce con SRY e Sox9. Dax1 è presente nelle gonadi sia maschili che femminili,
ma poi Dax1 rimane in quella femminile e scompare in quella maschile quindi è importante per determinare il sesso
ed è antagonista di Sox9. Quindi XY ha SRY in Y che attiva Sox9 che a sua volta attiva Amh e SF1 importanti per la
produzione di testosterone. Nella femmina Dax1 inattiva Sox9 e quindi non si forma il testicolo.

Alla base di tutto c’è quindi SRY nel maschio e Dax1 nella femmina che spegne Sox9, se non ci fosse Dax1 Sox9
sarebbe attivo indipendentemente da SRY.

Nel testicolo SRY funge da fattore di trascrizione per Sox9 e spegne i geni per l’ovario, Sox9 spegne i geni per la
gonade femminile e attiva i geni per la formazione del testicolo.

Sebbene il fenotipo sia determinato dalla presenza di cromosomi sessuali, questi non sono sufficienti perché c’è
anche Sox9, ma c’è anche un altro aspetto, ovvero il mantenimento della gonade durante lo sviluppo.
Alcuni studi sul topo hanno evidenziato 2 geni Dmrt1 e Foxl2 che interagiscono tra loro e hanno un ruolo importante
per il fenotipo finale. Dmrt1 è acronimo di doublesex di Drosophila come Foxl2.

Nella femmina Foxl2 spegne Sox9, c’è la gonade maschile o femminile e nel caso di SRY Sox9 viene mantenuto attivo
e attiva Amh mentre nella gonade femminile interviene Foxl2. Il mantenimento del testicolo non dipende da SRY
perché SRY viene trascritto all’inizio della determinazione del sesso. Nella gonade iniziale maschile SRY viene
trascritto ma poi non viene + trascritto e il mantenimento della sua struttura e la produzione di spermi si ha perché
Sox9 viene mantenuto attivo. Sox9 viene mantenuto attivo anche se SRY non c’è +. Nella gonade femminile si attiva
Foxl2 e spegne Sox9, mentre nel maschio Sox9 è mantenuto attivo da Dmrt1.

Foxl2 e Dmrt1 sono omologhi ad altri geni di Drosophila. Alla fine della determinazione del sesso di Drosophila c’era
lo splicing che accendeva geni femmina specifici e nel maschio si accendevano i geni maschio specifici perché non
c’era splicing. Nel topo alla fine della determinazione del sesso c’è Dmrt1 che mantiene acceso Sox9, mentre nella
femmina è attivo Foxl2 che è in competizione con Dmrt1, ovvero 1 spegne l’altro, Dmrt1 viene spento.

La competizione tra Foxl2 e Dmrt1 nel topo permette il mantenimento del sesso nelle successive fasi di sviluppo, in
quanto mantiene Sox9 e quindi i testicoli.
Il fatto che l’uomo sia eterogametico quindi XX e XY, XX avrebbero la possibilità di esprimere il doppio di geni di XY
quindi ci si chiede come si può fare ad avere la stessa quantità di geni e tutto si spiega con la compensazione di dose
che è un meccanismo che deve impedire che nella femmina sia espresso il doppio di geni che nel maschio. Nei
mammiferi tutto questo avviene perché 1 X viene inattivata e quindi la femmina ha 1 solo X funzionale come il
maschio. Nella mosca invece l’X non viene inattivato nella femmina, ma viene ipertrascritto l’unico X del maschio.
Nell’ermafrodita del Caenorhabditis l’espressione dei 2 X viene dimezzata quindi ognuno fa la metà.

Compensazione di dose
Nell’uomo si inattiva 1X condensando la cromatina, perché se compatto gli istoni, 1X viene compattato e quindi non
può essere trascritto quindi ci sono 2X ma 1 estremamente compattato e ciò si vede nei granulociti dove vicino al
nucleo si ha il corpo di Barr che è il cromosoma X inattivato ed estremamente compattato. Nell’XY il corpo di Barr
non c’è ma neanche in X0, c’è 1 in XX, ma anche in XXY quindi è legato al numero di cromosomi X.

La femmina ha 1X del padre e 1X della madre, quindi secondo Lyon c’è un’inattivazione casuale di X durante il
cleavage. Un esempio di Lyonizzazione è il gatto la cui pelliccia dipende da geni su X quindi se il gatto eredita 1X solo
ha pochi colori, mentre un gatto nero, arancione e bianco è uno zigote con 1X materno e 1X paterno, la cellula si
divide e le figlie mantengono attivi i cromosomi e alla successiva divisione c’è l’inattivazione casuale di 1X. Il
daltonismo e l’emofilia sono patologie legate ad X, la femmina per essere daltonica deve avere 2X malati quindi deve
ereditare 1X malato dalla madre e 1 X malato dal padre. Ma se la femmina è eterozigote e ha l’X paterno malato,
quando c’è l’inattivazione casuale dei geni rimangono un 50% di geni funzionanti e quindi la femmina è sana mentre
il maschio è malato perché ha 1 solo X.

Drosophila

In Drosophila c’è overespressione di X nel maschio. Nel moscerino c’è il complesso di compensazione di dose DCC
che determina l’overtrascrizione di X. Su X ci sono siti a cui si lega DCC fatto da proteine come MSL2 che attiva le
altre proteine se attivo. MLS2 viene attivato quando manca Sxl e MSL2 si combina con le altre proteine e si forma il
DCC che si lega a punti specifici su X e lo fa ipertrascrivere. Nella femmina Sxl è attivo e quindi MSL2 è spento. Se per
mutazione nella femmina viene trascritto MSL2 cioè se si forma il DCC la femmina muore perché non può
ipertrascrivere i cromosomi X.
Sxl non solo determina l’attivazione e lo splicing di Transformer ma impedisce anche la trascrizione di MSL2 nella
femmina. Se MSL2 è trascritto origina la proteina omologa, si lega alle proteine e origina DCC e quindi il cromosoma
X della mosca maschio ipertrascrive e così il maschio ha la stessa quantità di proteine della femmina.

Se si prendono i cromosomi politenici con DCC si vede che sono espresse in X del maschio e quindi gli RNA traducono
per proteine che danno origine a DCC.

Il paradigma di Jost
Ci sono casi in cui la determinazione del sesso è legata all’ambiente come per esempio alla temperatura, ma anche
dalla quantità di femmine che ci sono nella comunità. Il pesce pagliaccio vive in gruppi con 1 femmina dominante, se
lei muore, il gruppo ha necessità di un’altra femmina dominante e quindi il maschio + grande si trasforma in
femmina. Ciò dipende dall’Aromatasi, un enzima che controlla il rapporto tra estrogeni ed androgeni come il
testosterone. Gli enzimi, se alzo la temperatura, lavorano meglio e quindi se aumento la temperatura l’aromatasi è +
attiva, trasforma testosterone in estrogeno e quindi sparisce l’ormone maschile. Ciò si trova nei rettili come
tartarughe che sotto a 31° sono maschi mentre sopra si hanno solo femmine e ciò si spiega con l’attività di Aromatasi
che appunto aumenta con la temperatura. In un alligatore succede che i maschi si sviluppano solo in un range di
pochi gradi, tra 32 e 34° mentre sotto e sopra si formano solo femmine.

Distruttore endocrino
Gli ormoni hanno spesso una conformazione molecolare che è simile a insetticidi, ovvero sostanze inquinanti come
DDT o PCB che sono composti che si sovrappongono ad ormoni legati allo sviluppo del sesso. L’atrazina è un’erbicida
che ha un grande effetto sulle gonadi dei girini. I girini hanno gonadi che inizialmente non hanno scelto se diventare
ovari o testicoli e l’atrazina interferisce con questa scelta. Un testicolo di una rana esposta ad atrazina ha ovociti e
quindi si traforma in ovario. Quindi nei maschi di controllo si ha molto testosterone, ma nei maschi trattati con
atrazina se ne ha meno che sulle femmine di controllo quindi l’atrazina interferisce con lo sviluppo delle gonadi della
rana.

La quantità che provoca alterazione è 0,1 parti per miliardo.

Parassita che determina il sesso
Una ricchezia è un batterio gram negativo, ovvero un batterio che deve vivere in cellule, perché sennò all’esterno
muore e quindi è simbionte, parassita. La presenza di batteri gram negativi Wolbachia nelle cellule degli insetti,
nematodi parassiti, determina l’inversione del sesso, il male killing, cioè drosophile con questo parassita producono
embrioni solo femminili quindi muoiono tutti i maschi, da partenogenesi, gli imenotteri sono aplodiploidi quindi la
femmina nasce solo da uova fecondate, ma la Wolbachia diploidizza uova aploidi non fecondate e forma le femmine.
Un gatto con Toxoplasma gondii può attaccarlo all’uomo, se vi viene a contatto una donna incinta l’embrione
potrebbe avere effetti gravi. Il rapporto tra maschi e femmine è ½ nell’uomo, e questo rapporto può essere
influenzato da stress ecc. in passato sono state studiate donne infettate da Toxoplasma per la prima volta e si è visto
che avevano figli maschi maggiori rispetto a quelle non infette.

Divisione asimmetrica cellule staminali germinali

Le cellule germinali staminali si trovano all’interno di una struttura detta nicchia delle cellule staminali in cui queste
hanno rapporti e scambio di segnali con cellule somatiche specializzate. La nicchia delle cellule staminali contiene
cellule somatiche che inviano segnali che servono perché la divisione asimmetrica della staminale implica la
formazione di 2 cellule di cui 1 rimane staminale e 1 si differenzia e i segnali servono per mantenere la staminalità.

L’idea della nicchia nasce dal fatto che prendendo cellule ematopoietiche della milza, si vede che hanno capacità
proliferativa inferiore di quelle prese dal midollo osseo quindi si ipotizza che c’è una regione in cui le cellule
ematopoietiche si sviluppano che da segnali che garantiscono la proliferazione. Partendo da ciò, la nicchia, è
importante perché mantiene l’equilibrio tra staminali e cellule che si differenziano. Se questo equilibrio si altera
verso la produzione di cellule differenziate perdo le staminali e altrimenti ho eccessiva proliferazione di staminali e si
formano le cellule tumorali.

L’ipotesi nella nicchia si verificò nel moscerino dove sono stati scoperti meccanismi che regolano la divisione
asimmetrica e sono stati scoperti nell’ovario e nel testicolo. I precursori delle cellule polari migrano nell’intestino,
attraversano la parete e si localizzano nelle gonadi che sono quindi popolate da un certo numero di cellule
primordiali germinali.

Nel caso dell’ovario si trovano 2 ovari, c’è l’ovidutto comune e gli ovari sono fatti da 18-20 collane di strutture che
crescono dalla parte apicale e sono detti ovarioli fatti da tante camere che diventano sempre + grandi fino a formare
l’uovo che viene espulso. Le camere crescono sempre di + perché l’ovocito aumenta di dimensioni, le cellule nutrici
forniscono materiale di nutrimento e quindi si accrescono e poi le nutrici scompaiono. All’apice dell’ovariolo
vengono selezionate le cellule staminali, qui si trova il germario che ha il filamento terminale fatto da cellule
somatiche appiattite, che serve per ancorare l’ovariolo alla parte apicale e per garantire la staminalità. Al di sotto ci
sono altre cellule somatiche, cap cells e al lato le escort cells. Queste cellule somatiche del filamento terminale, le
cap fanno un cappuccio sulle staminali e le escort accompagnano lateralmente le staminali e formano la nicchia. Le
staminali germinali si dividono in maniera asimmetrica, quella vicina alla cap è staminale e quella lontana forma il
cistoblasto che poi si divide per mitosi, fa 4 mitosi e si formano 16 cellule germinali unite di cui 1 origina l’ovocito. In
un mutante con difetti nella divisione di cellule germinali, le germinali non si dividono e gli ovarioli rimangono vuoti.

Nicchia delle cellule staminali

Le cellule somatiche della nicchia inviano segnali grazie ai quali la cellula si divide in maniera simmetrica o meno. La
cellula si divide in maniera asimmetrica e quella che rimane vicina alle somatiche è staminale mentre quella lontana
si differenzia come se ci fosse un gradiente di concentrazione. Partono quindi segnali che con un gradiente
influenzano sempre meno le cellule + lontane. Se la cellula staminale non riceve segnali, cioè non riceve segnali per
rimanere staminale, si divide e le 2 figlie si differenziano e perdo la staminale. La staminale persa nell’ovariolo del
moscerino fa sì che non ci siano + uova.

Nel moscerino è stato scoperto un mutante Bam. Il germario di un wild type ha filamento terminale e cellule
germinali che si dividono. Nel mutante Bam ci sono camere ovariche che contengono cellule tumorali perché le
staminali non si dividono ma proliferano e formano una massa tumorale.

Nel caso di Bam la staminale germinale ha qualcosa che non va e si divide in modo simmetrico e quindi origina 2
cellule staminali germinali che proliferano e quindi ho ovarioli tumorali. Bam è un gene fondamentale nel
determinare il differenziamento durante la divisione asimmetrica quindi è necessario e sufficiente per determinare il
differenziamento della staminale.

Se si usa una fluorescenza per Bam si nota che la proteina va dove ci sono i cistoblasti e ciò indica che lì il gene Bam è
acceso mentre nella staminale germinale è spento.
Regolazione gene Bam

Le cellule cap, escort e del filamento sono importanti per l’attivazione e lo spegnimento di Bam che deve essere
spento nella staminale e acceso nel citoblasto. Nel filamento terminale si produce un ligando UPD che trova il suo
recettore nelle cellule cap ed escort quindi il recettore che viene attivato in queste cellule attiva una via di
segnalazione jak stat. Jak stat attiva nel nucleo delle cellule cap e escort, e implica la trascrizione di 2 geni della
famiglia Bmp che sono Dpp e Gpp e sono ligandi. Il Dpp trova il suo recettore nelle cellule + vicine perché ha una
diffusione limitata e quindi interessa la cellula + vicina ovvero la staminale germinale. I recettori fosforilano proteine
citoplasmatiche e quindi Dpp attivato fosforila Smad. Questa proteina fosforilata si attiva e si lega a Co-Smad e
quindi formano un dimero che entra nel nucleo e spegne o non fa attivare Bam.
Il cistoblasto è + lontano e quindi sulla sua parete ci sono recettori per i ligando della famiglia Bmp ma o sono
inattivati o sono troppo lontani per essere raggiunti dal segnale che parte dalle cellule cap. Se non viene attivato il
recettore, Smad non è fosforilato, non si forma il dimero che inattiva Bam e quindi Bam nel cistoblasto è attivo.

Testicolo

Una cosa simile avviene nel testicolo, le staminali stanno all’apice di un lungo tubo e lì si trova la nicchia con le cellule
Hub che inviano il segnale. Vicino alle cap, intorno ad esse, c’è una corona di 9-10 cellule staminali germinali. La cellula
vicina alla fonte del segnale rimane staminale mentre quella lontana si differenzia e va in contro a 4 mitosi perciò si
formano 16 spermatociti che poi crescono e fanno spermatogenesi per formare spermi.
L’orientamento del fuso è tale che il piano di divisione sia parallelo alle cellule dell’hub, se la cellula avesse il fuso
perpendicolare si formerebbero 2 cellule a contatto con le cellule dell’hub e riceverebbero lo stesso segnale mentre
devo avere una cellula vicina e una lontana.

Il segnale è sempre AMP prodotto dalle cellule dell’hub che sono analoghe come funzione alle cellule del filamento
terminale. Il segnale di AMP attiva le cellule staminali circondate da cellule somatiche, si hanno 4 mitosi successive e
le 2 cellule iniziali che circondavano la staminale rimangono e sono sempre 2. Le somatiche sono importanti perché
UDP attiva nelle somatiche la produzione di Dpp e sono analoghe alle cap. Dpp trova il suo recettore nella staminale
e Bam è spento come nella femmina.

Caenorhabditis

La sua gonade è particolare a forma di tubo e ha una nicchia fatta da 1 sola cellula somatica molto grande che
avvolge la parte apicale della gonade e infatti si chiama cellula distale apicale e da essa partono segnali che
influenzano il destino delle cellule a contatto con essa. Le cellule a contatto con quella somatica rimangono
staminali, mentre quelle + lontane proliferano, fanno mitosi, mentre le + distali fanno meiosi.
Segnali

Dalla cellula distale partono alcuni segnali, 1 in particolare detto LAG che è di tipo delta, e trova il recettore Notch
che si attiva e spegne i geni che determinano il differenziamento e se questi geni sono spenti la cellula vicina rimane
staminale quindi come nel moscerino la cellula somatica della nicchia invia un segnale della famiglia delta che trova
Notch nella staminale vicina, si attiva e attiva geni che spengono i geni del differenziamento come Bam nel
moscerino. Questi geni porterebbero al differenziamento ma sono spenti e quindi la cellula rimane staminale.

Topo
Nel topo le cellule staminali sono quelle che stanno alla base del tubulo seminifero e le staminali, spermatociti,
spermatogoni ecc. si riconoscono in base alla loro posizione rispetto alla base del tubulo. Una cellula vicina alla
lamina basale è staminale e fa mitosi formando tanti spermatogoni che poi fanno meiosi per formare spermatociti
primi e secondi e alla fine si formano spermatidi + vicini al lume perché vicino ad esso si formano gli spermi rilasciati
nel canale del tubulo seminifero.

Segnali

I geni Oct4, Nanos2 che ha un ortologo che si trova anche nel moscerino, Nodal che si trova nei vertebrati per la
simmetria ecc. questi geni sono espressi nelle staminali. Le cellule del Sertoli sono somatiche e rappresentano la
nicchia delle staminali, e si pensa che producano un segnale, un fattore che fa dimerizzare un recettore e questo
determina il mantenimento della staminalità. Bmp è una famiglia di proteine e anche questa è coinvolta nel
mantenimento della staminalità. La cellula che si differenzia riceve segnali diversi come SCF che è un ligando che si
lega al recettore Kit che determina il differenziamento della figlia della staminale. Kit determinava le macchie nella
pelle e la sterilità, quindi una mutazione in Kit non consente il differenziamento delle figlie della staminale e quindi
porta alla sterilità.

GAMETOGENESI

La gametogenesi è un processo che tramite la meiosi porta alla formazione dei gameti che se sono spermi si parla di
spermatogenesi che va dalla divisione asimmetrica della staminale allo spermatidio, ed è quella modificazione dello
spermatidio per formare lo spermio maturo. L’ovogenesi indica la formazione delle uova e comprende tutto dalla
divisione asimmetrica all’uovo.

La gametogenesi è divisa in 3 fasi:

1. Periodo di moltiplicazione: la figlia della staminale fa una serie di divisioni mitotiche

2. Periodo di crescita: dopo le divisioni le cellule entrano in meiosi e accrescono il loro citoplasma e si parla di
spermatociti primari e oociti primari che si accrescono
3. Periodo di maturazione: nel caso del gamete maschile gli spermatociti si dividono 2 volte e poi dopo la
formazione degli spermatidi si trasformano in spermi maturi. Nel caso di gameti femminili ho 2 divisioni
meiotiche che sono però asimmetriche cioè si forma 1 cellula + grande e 1 + piccola che è il globulo polare che
viene espulso e alla fine ottengono 1 solo ovocito, mentre nel maschio ottengo 4 cellule.
Lo spermatocito entra in meiosi, duplica il DNA, poi fa la seconda meiosi, si formano 4 spermatidi e quindi 4 spermi.

Nel caso dell’ovocito fa meiosi ma dopo la prima le 2 cellule sono diverse, poi si dividono, la + grande si divide con
divisione asimmetrica, mentre le piccole sono eliminate e rappresentano i corpi polari. Nella gametogenesi
femminile si ottiene 1 solo uovo.
Ovocito
Si considerano 2 ovociti, 1 del riccio di mare e 1 del topo che sono 2 modelli interessanti per capire come avviene la
fecondazione, inoltre l’uovo del riccio di mare è trasparente:

1. Riccio: al di sopra della membrana plasmatica c’è l’involucro vitellino e tutto è circondato da uno strato
gelatinoso, poi ci sono la membrana e la cellula con il nucleo

2. Topo: si ha all’interno l’ovocito con il nucleo, la membrana plasmatica, la zona pellucida al di sopra della
quale si hanno tante cellule che la circondano e sono dette cumulo ooforo o cellule follicolari.

L’ovocito è il gamete femminile che non ha completato la meiosi mentre l’uovo l’ha completata.

L’uovo è + grande dello spermio perché ha materiale di riserva, proteine del tuorlo, tRNA, mRNA e sostanze per lo
sviluppo.

Dall’uovo del pollo, così come anche da quello di un serpente, di una tartaruga esce un piccolo, in questo caso un
pulcino già in grado di nutrirsi e quindi nell’uovo ci deve essere già tutto il necessario per far sì che il pulcino sia in
grado di nutrirsi da solo. Nella rana invece l’uovo è + piccolo perché da esso nasce un girino che solo dopo si
differenzia. Nell’uomo l’embrione si nutre dalla madre e quindi può essere piccolo.
Il tuorlo sono le sostanze di riserva che devono sostenere lo sviluppo dell’organismo. Il fatto di avere il tuorlo
nell’uovo ci fa determinare una polarità perché il tuorlo è ripartito in maniera asimmetrica. La parte dell’uovo dove
c’è poco tuorlo è il polo animale mentre quella dove ce n’è tanto è il polo vegetativo e quindi si distingue un’asse
che va dall’uno all’altro. Nel polo vegetativo ci sono mRNA necessari per lo sviluppo e l’asimmetria porta ad una
particolare divisione. Quando l’uovo si divide si forma il solco di divisione che inizia nella regione dove non c’è il
tuorlo e poi lo incontra ma è difficile da dividere quindi o il solco rallenta oppure si arresta nel tuorlo e le cellule che
si formano, i blastomeri stanno solo nella parte superficiale dove non c’è il tuorlo perché non può essere separato ed
è una sostanza amorfa e quindi nelle uova con tanto tuorlo la segmentazione è incompleta.
Crescita ovocito
Nell’anfibio la crescita dell’ovocito è lenta. All’inizio gli ovociti sono piccoli e le cellule germinali sono unite tra loro da
un ponte. Gli ovociti poi accumulano materiale e poi si riesce a distinguere il polo animale da quello vegetativo, il
polo animale è giallo perché ha tuorlo e quello vegetativo è scuro perché non ha tuorlo e perché sotto la membrana
plasmatica c’è il pigmento. Il nucleo sta fuori asse rispetto al centro e quando l’uovo viene a contatto con il
progesterone riprende la meiosi e si può capire che è ripresa perché al polo della regione animale c’è una chiazza
chiara che corrisponde all’eliminazione del primo polo polare e quindi rinizia la meiosi.

Il tuorlo viene accumulato con 2 meccanismi:

1. Intrinseco: l’ovocito produce parte del tuorlo perché in molti anfibi ci sono cromosomi che vanno in contro a
modificazione che danno un aspetto curioso ai cromosomi a spazzola. Il DNA fa delle anse molto estese e su
queste anse inizia la produzione di rRNA e quindi i cromosomi sono attivi durante il diplotene e producono tanto
rRNA e quindi + ribosomi ho + si legano all’mRNA e + proteina si può produrre che si accumula nel citoplasma
dell’ovocito.

2. Estrinseco: il tuorlo o il materiale di riserva arriva dall’esterno. La ghiandola pituitaria produce FSH che è
l’ormone follicolostimolante che arriva alle cellule follicolari tramite il sangue e queste cellule sono stimolate e
producono un estrogeno che tramite il sangue arriva al fegato dove le cellule del fegato producono vitellogenina
e si rilascia nel sangue e va all’ovocito dove deve essere inglobata. L’FSH aiuta ad inglobare la vitellogenina
attraverso le cellule follicolari che la inglobano al loro interno e poi la portano all’interno dell’ovocito. Così ho
tanta vitellogenina e quindi tuorlo nell’uovo.
Ovogenesi mammiferi

L’ovogenesi è quel processo che indica la maturazione del gamete femminile e quindi implica un periodo di crescita,
la cellula staminale si divide e origina 2 cellule di cui 1 rimane staminale e 1 va incontro a varie mitosi. Dopo queste
mitosi si formano oogoni che fanno crescita e vanno in meiosi. Nei mammiferi gli oociti continuano la meiosi e poi si
bloccano e la seconda meiosi è completata alla fecondazione.

All’inizio della meiosi nell’ovocito si forma il primo fuso in anafase e l’ovogenesi consiste in un processo in cui c’è 1
cellula + grande che sarà l’ovocito mentre vengono eliminati i globuli polari. In tarda anafase il fuso meiotico non ha
centrioli ed è disposto asimmetricamente cioè non è centrale perché se devo ottenere una cellula grande e una
piccola ho il solco di divisione. Nell’altra avrò sempre un fuso asimmetrico che porta alla formazione dell’ovocito.

Nel grafico si nota che il numero delle cellule germinali è altissimo e diminuisce alla nascita. Gli ovociti nei mammiferi
si arrestano in profase della meiosi e 1 volta al mese la riprendono fino ad età avanzata.

Nell’embrione ho la staminale che si divide e forma tante figlie che per mitosi moltiplicano il numero di cellule ed
entrano nella prima meiosi come ovociti primari e si arrestano in profase 1 quindi alla nascita ce n’è un numero
elevato e ogni mese un ovocito primario rientra in meiosi e in seguito l’ormone LH stimola la ripresa della meiosi e si
ha la formazione del fuso asimmetrico, si elimina il primo globulo e l’ovocito secondario si arresta. L’ovocito arriva in
metafase e completa solo se fecondato altrimenti degenera. Quindi si hanno ovociti bloccati in profase 1 e 1 al mese
riprendono la meiosi fino ad arrestarsi in metafase 2 e la meiosi è completata solo se fecondati.
Oogenesi nella mosca

L’oogenesi della mosca propone interrogativi importanti. La mosca ha 2 ovari che sono fatti da 1 catenella di
strutture che crescono che sono ovarioli e strutture che crescono per originare l’uovo e sono le camere ovariche.
Tutto inizia nella parte apicale che è il germario da cui si staccano le camere con una parete di cellule somatiche e
all’interno le germinali, quindi la camera è fatta da cellule somatiche che circondano 16 germinali di cui 1 diventa
ovocito che cresce sempre di +. Le cellule che affiancano l’ovocito sono le cellule nutrici che forniscono nutrimento
all’ovocito. Le cellule nutrici sono interconnesse da ponti citoplasmatici.
Ci sono 16 cellule e ci si chiede quale diventa ovocito. 2 delle 16 cellule hanno 4 ponti citoplasmatici, ovvero in esse
la citodieresi non è completa e le cellule rimangono unite per far passare materiale di riserva. Le 2 unite da 4 ponti
sono le prime che si formano e l’ovocito è 1 di queste 2 cellule. Tra queste 2 cellule ci sono 4 ponti perché la
staminale si divide e 1 rimane staminale e 1 si divide 4 volte, si divide 1 volta e rimane il ponte, poi si divide ancora e
ne rimane un altro e così via fino a formare 4 ponti. Di queste 2 cellule 1 rimane ovocito.

Caratteristiche che caratterizzano le cellule

Nel germario queste cellule fanno meiosi per cui ci sono cisti con 16 cellule e le cellule con 4 ponti. Delle 2 non so
quale è l’ovocita ma ci sono complessi sinaptonemali che si trovano nella prima meiosi e caratterizzano gli omologhi
appaiati. A questo livello varie cellule hanno complessi sinaptonemali e quindi sono entrate in meiosi, ma allo stadio
di 16 cellule ce l’hanno solo le 2 con 4 ponti e sono dette così proovociti. Vado avanti nello sviluppo e quando la
camera esce dal germario vedo che 1 sola cellula rimane in meiosi e quello è l’oocito, ma non si sa se è la cellula 1 o
2. Tutte le altre diventano cellule nutrici e aumentano il nucleo diventando poliploidi per produrre tanto materiale di
riserva.

Quando avvengono le mitosi che portano alla formazione delle 16 cellule della camera, le mitosi sono sostenute da
fusi mitotici con centrioli, finite le mitosi i centrioli ci sono e ad un certo punto si spostano e vanno a finire, passando
per i ponti, tutti in 1 cellula che conserva il complesso sinaptonemale e quella è l’ovocito.
Si pensa che le cellule si spostano seguendo tracce di microtubuli, quindi o trovo un mutante per la tubulina o do
colchicina alle mosche per bloccare la polimerizzazione dei microtubuli e così riesco a notare che se spariscono i
microtubuli comunque i centrioli si muovono.

Gli organelli si muovono grazie alle proteine motrici e siccome il movimento verso l’ovocito richiederebbe la dineina
verso il -, c’è un mutante in cui i centrioli non si muovono, se levo la dineina i microtubuli non si muovono e quindi si
ipotizza che ci siano dei microtubuli che non si vedono.
Quindi l’ovocito accumula centrioli e mantiene il complesso sinaptonemale.
Un altro aspetto della cellula che diventa ovocito è: l’ovocito è la figlia della staminale o 1 delle 2 figlie del
cistoblasto? C’è un aspetto morfologico perché i centrioli che stanno al polo della staminale sono corti mentre nella
figlia ce n’è 1 corto e 1 che è 2 volte + lungo. Se io vado a vedere l’ovocito con centrioli, ne trovo 1 + lungo degli altri
e quindi questo mi dice che l’ovocito è la figlia diretta della staminale che si forma alla prima divisione.

La camera ovarica è composta dall’ovocito e 15 cellule nutrici unite da ponti citoplasmatici e il tutto è circondato da
cellule follicolari. Le cellule nutrici producono materiale di riserva che va nell’ovocito con i centrioli. Quando la
grandezza dell’ovocito equivale a quella di 15 cellule nutrici messe insieme compaiono filamenti di actina nel
citoplasma delle cellule nutrici. I filamenti si contraggono e strizzano il materiale delle cellule nutrici verso l’ovocito
che cresce di + e alla fine i nuclei delle cellule nutrici vanno in apoptosi.

Se si colora il preparato con Falloidina e Rodamina vedo al microscopio a fluorescenza la camera ovarica, l’ovocito e
le cellule nutrici con il nucleo e i filamenti, c’è un canale che fa passare le sostanze di riserva e i filamenti sono
segmentati perché scorrono l’uno sull’altro e determinano la contrazione della cellula. Se la cellula si contrae il
materiale di riserva va all’ovocito che arriva ad essere grande e poi le cellule nutrici prive di materiale vanno in
apoptosi e sono eliminate.
Il fornire materiale all’ovocito determina una distribuzione asimmetrica. I granuli P del C. elegans sono presenti in
tutto l’ovocito ma segregano in una sola parte. Nel moscerino ci sono 2 mRNA che determinano la parte anteriore e
posteriore dell’embrione. Nella parte anteriore si accumula mRNA bicoid e in quella posteriore nanos. Entrambi
partono dalle cellule nutrici e quindi ci si chiede come sono trasportati. Questi mRNA sono trasportati tramite
microtubuli, ovvero binari polarizzati con – posteriore e + anteriore e questi mRNA si spostano lungo questi
microtubuli. Il supporto delle cellule nutrici porta ad una distribuzione asimmetrica di mRNA che determinano la
parte anteriore e posteriore ma già l’embrione ha gli mRNA posizionati. Questo spostamento è quindi permesso dai
microtubuli che fanno da binari.

L’accumulo di materiale di riserva è presente quindi anche in maniera asimmetrica e dirige lo sviluppo embrionale.
Negli anfibi la stimolazione ormonale con progesterone determina la ripresa della meiosi dell’ovocito arrestato nel
diplotene. L’ovocito ha fuso asimmetrico e quindi si libera il globulo polare, il nucleo perché si deve avere 1 nucleo
aploide. Lo Xenopus quando riprende la meiosi, forma nel polo animale una macchia chiara dove avviene
l’eliminazione del globulo polare.

L’esperimento che fa scoprire MPF è fatto prendendo il citoplasma che ha ripreso la meiosi, si inietta in uno bloccato
e si vede che l’ovocito riprende la meiosi e si blocca in metafase. Quindi il progesterone induce la ripresa della meiosi
ma poi si blocca in metafase 2.
Il progesterone ha un recettore di superficie e quindi deve arrivare da fuori e non lo devo iniettare all’interno. Il
recettore attivo porta a segnalazioni che portano all’attivazione della proteina mos che attiva l’MPF che è una
chinasi + ciclina e inizialmente il complesso è inattivo e grazie a mos viene attivato. L’MPF attivo ha la chinasi che
funziona ed è una proteina che fosforila i suoi target, ovvero la cromatina che quindi si condensa, le lamine vengono
fosforilate e si disassemblano e l’involucro nucleare si disassembla.

L’ovocito riprende così la meiosi e si arresta nella 2° metafase e ci si chiede perché si arresta. Quando arriva lo
spermio la ciclina viene degradata e quindi l’MPF non funziona + perché la chinasi senza ciclina non funziona +. Se
voglio far proseguire la divisione devo quindi degradare la ciclina.

Il fattore citostatico CSF

Il fattore che blocca la meiosi è il fattore citostatico CSF. Questo viene scoperto perché si prende un uovo arrestato
in metafase dopo che è stato esposto al progesterone, si prende il citoplasma di quest’uovo e si mette in un
embrione con 2 cellule e questo citoplasma se viene messo in 1 blastomero si vide che quel blastomero non si divide
ma è arrestato in metafase mentre l’altro si divide. Quindi per questo si afferma che c’è il fattore citostatico che
impedisce la divisione.

Quando è presente CSF in metafase 2 l’MPF rimane attivo e quindi la cellula è bloccata. Se espongo la cellula alla
colchicina, i cromosomi si arrestano in metafase perché il check point non trova il fuso e blocca tutto in metafase e
anche qua qualcosa si accorge che MPF è attivo e la cellula non può andare avanti. MPF è mantenuto attivo da CSF.
Questo viene paragonato a Mad1 e Mad2 del checkpoint perché questi, quando il cinetocore è libero prima si lega
Mad1 e poi Mad2 e si inattiva Cdc20 che blocca APC e qui CSF blocca Cdc20 che non funziona e quindi APC è inattivo
e rimane la ciclina e quindi l’MPF è attivo e la cellula rimane in metafase.
Si sblocca alla fecondazione in quanto arriva lo spermio che si lega alla membrana e determina un aumento o
liberazione di ioni Calcio relegati nel reticolo ergastoplasmico e viene liberato perché c’è una trasduzione del
segnale. Il Ca attiva la proteina calmodulina modulata dal legame con il Ca, che attiva la Calpaina che degrada il CSF
e quindi il CSF così è degradato.

Negli insetti però ciò non accade perché l’uovo è attivato quando passa attraverso l’ovidutto. L’embrione maschile si
sviluppa però per partenogenesi e quindi c’è un meccanismo di attivazione diverso in quanto non si contatta l’uovo.

Nei molluschi l’ovocito è bloccato alla 1° metafase, nei mammiferi alla 2° quindi è chiaro che ci sono dei controlli
diversi. Nel riccio di mare la meiosi non si arresta ma viene completata. Quindi la situazione è diversa in base agli
organismi considerati.
Lo stress può portare a errori nella costruzione del fuso, ma non è chiaro come i radicali liberi interferiscono con il
fuso, o anche con i telomeri in quanto quando la cellula si divide i telomeri si accorciano e quindi la lunghezza è
importante per la vita della cellula.

FORMAZIONE GAMETI MASCHILI

Meno materiale ha all’interno lo spermio e meglio si muove, quindi la differenza tra spermatogenesi e oogenesi è
che da ogni spermatocito si formano 4 cellule tutte uguali perché non serve materiale di riserva. La figlia della
staminale sia nella spermatogenesi che nell’ovogenesi si divide per mitosi e porta ad un certo numero che varia di
ovociti primari che vanno incontro a meiosi, così come gli spermatociti primari. Negli spermatociti primari la meiosi
porta a 2 cellule uguali che sono gli spermatociti secondari, mentre nell’ovogenesi ho 2 cellule diverse, 1 grande e 1
piccola. Poi lo spermatocito secondario si divide ancora e forma 4 cellule uguali in dimensioni ma diverse
geneticamente, mentre l’ovocito forma 1 cellula piccola e 1 molto grande.

Da ogni spermatocita primario si formano 4 spermi uguali come dimensioni, mentre nel caso dell’ovocita primario si
forma 1 ovocita e 3 polar bodies, quindi sempre 4 cellule ma diverse. La formazione dello spermio richiede 2
processi:

1. Spermatogenesi: va dalla divisione della staminale alla formazione dello spermatidio che è una cellula rotonda
2. Spermiogenesi: cambiamenti che portano all’allungamento della cellula che è lo spermio maturo
Nell’uomo si hanno una serie di divisioni, la staminale si divide e da origine a 2 figlie di cui 1 si divide tante volte per
formare spermatociti che poi entrano in meiosi. Tutte le cellule sono unite da ponti citoplasmatici come le cellule
nutrici in Drosophila, e i ponti rimangono anche quando gli spermatidi maturano e poi sono eliminati
successivamente.

Nel moscerino le divisioni partono dalle staminali che circondano le cellule somatiche e ogni staminale origina sé
stessa e 1 figlia che fa 4 divisioni successive e si formano quindi cisti di 16 spermatociti primari. Nell’uomo se ne
formano di +.

La maturazione e quindi la spermatogensi parte dalla parete del tubulo dove ci sono le staminali che originano gli
spermatogoni che si dividono, si fa meiosi e si formano gli spermatidi e poi gli spermi maturi che cadono nel tubulo
seminifero.

Formazione degli spermi

Da una cellula rotonda si forma una cellula filiforme, quindi questo implica sicuramente la formazione della coda in
quanto quasi tutti gli spermi si muovono e devono avere una coda che si muove con assonema flagellare che deriva
dal centriolo che allunga i doppietti AB che vanno a formare l’assonema, ma nello spermio non c’è quasi per niente
citoplasma e va eliminato, l’assonema ha le braccia di Dineina per il movimento e gli serve ATP che prende dai
mitocondri, quindi significa che i mitocondri prima erano isolati e poi si assemblano a formare un manicotto intorno
alla parte basale dell’assonema e forniscono energia per il movimento.
Sulla testa del nucleo si forma l’acrosoma che è una vescicola che contiene enzimi che servono per transitare
attraverso le barriere che proteggono la membrana dell’uovo e quindi nella parte apicale del nucleo si organizza il
Golgi e quindi cisterne che producono la vescicola con enzimi. Il nucleo è inizialmente rotondo, ma lo spermio si
muove nel liquido e il rotondo da fastidio, inoltre siccome si muove può avere sollecitazioni pericolose per il nucleo e
allora si condensa la cromatina.

Il DNA è di solito superavvolto a istoni ma negli spermi non è sufficiente e gli istoni sono spostati e sostituiti con le
protammine che danno condensazione estrema della cromatina e così il nucleo è estremamente condensato e
resiste a sollecitazioni molto forti e quindi per questo diventa filiforme.

Il movimento è ondulatorio se guardo il flagello lateralmente e circolare se lo guardo dall’alto.

L’assonema flagellare

L’assonema flagellare ha un anello di mitocondri che gli corre intorno e l’assonema flagellare è fatto da 9 doppietti +
2 centrali e i doppietti presentano 2 braccia di Dineina che interagisce con il tubulo vicino, scorre e questo determina
il ripiegamento dell’assonema. La proteina è ATP-asica e quindi gli serve energia dai mitocondri.
Costruzione spermio

La costruzione dello spermio è complessa e ci sono anche anomalie che portano all’infertilità. Uno spermio può
avere testa enorme perché il DNA non è condensato, può non esserci la testa, oppure possono essercene 2 oppure è
biflagellato.

Spermio negli organismi

Nel topo c’è la testa, l’assonema, i mitocondri che si organizzano a formare l’anello e 2 centrioli ortogonali e il
centriolo che organizza l’assonema è strano perché quello vicino al nucleo è standard, mentre l’altro che organizza
l’assonema si apre e diventa anomalo e si trova nell’uomo, nel coniglio, nei ruminanti. Quindi ci sono 2 centrioli, 1
prossimale vicino al nucleo e 1 distale. Come lo spermatidio deriva dalla divisione meiotica, essa è sostenuta da un
fuso che è organizzato da centrosomi che hanno ognuno 2 centrioli e quindi lo spermatidio ha 2 centrioli.

La duplicazione dei centrioli è però legata alla duplicazione del DNA, se questo non duplica non devono duplicare i
centrioli sennò ho errori. Ma nei mammiferi, negli anellidi ho la duplicazione dei centrioli ma non del DNA. C’è meiosi
1, duplicazione di DNA, duplicazione dei centrosomi e si forma 1 cellula con 2 poli ognuno dei quali ha 2 centrioli. Poi
si formano 2 cellule in cui in 1 ho centrosoma con 2 centrioli e nell’altra 1 centrosoma con 2 centrioli.
La logica vorrebbe che siccome non ho la duplicazione del DNA non duplicassero neanche i centrioli, mentre in
questo caso i centrioli duplicano. Nell’uomo, negli anellidi, ho sempre 2 centrioli e quindi una duplicazione in assenza
di DNA.

Ma è un’eccezione perché la cellula controlla che non duplichino senza la duplicazione di DNA, qui evidentemente
non c’è controllo ma tutto funziona comunque correttamente.

Negli insetti ho 1 solo centriolo perché sulla base della regola non sono duplicati.

Da ogni spermatogenesi si formano 4 spermatidi uguali da ogni spermatocito, ma i centrioli sono diversi perché si
parte dallo spermatogonio che fa mitosi e origina gli spermatociti primari che duplicano il DNA e i centrioli e quindi
alla prima divisione lo spermatocita secondario riceve 2 centrioli diversi e con età diverse perché lo spermatogonio
ha 2 centrioli, il madre e il figlio ereditati dallo spermatocita primario. I centrioli si allontanano e si duplicano dando
figlio 3 e 4 e quindi gli spermatidi hanno tutti centrioli diversi. L’età è importante nella nucleazione del ciglio primario
e quindi nella neurogenesi.
Negli insetti non c’è duplicazione dei centrioli, quindi i centrioli sono strani, nei pidocchi ci sono 2 centrioli perché le
cellule non si sono divise ecc. quindi negli insetti ci sono vari casi, ma ci sono anche spermi privi di centrioli e quindi
ci si chiede come possano perdere i centrioli e come facciano a muoversi senza assonema.

Nei nematodi lo spermio è immobile ma ha 2 centrioli, è immobile perché non si forma l’assonema. Gli spermi quindi
si muovono come i fibroblasti tramite un movimento ameboide.

Differenze spermatogenesi e ovogenesi

- Ovogenesi: c’è una popolazione determinata di cellule staminali. L’ovocito origina 4 cellule di cui 1 grande e
3 piccole. La meiosi inizia nell’embrione e poi si blocca in profase 1 e poi riprende dopo e si arresta in metafase se
non c’è fecondazione.
 - Spermatogenesi: le staminali si dividono continuamente. Ogni spermatocita produce 4 gameti uguali. La
meiosi inizia nella pubertà.

Le cellule nella spermatogenesi sono unite da ponti citoplasmatici e non solo nel moscerino ma anche nell’uomo che
ha una meiosi in cui dalla staminale si forma lo spermatogonio e poi spermatociti uniti da ponti. Nella rana c’è un
ponte intercellulare tra 2 spermatociti, ma anche nel topo, nella mosca. I ponti sono simili tra loro quindi sono
strutture che si trovano durante l’evoluzione in generale.

Nella mosca i ponti servono durante l’ovogenesi perché le nutrici portano materiale nell’ovocito. Servono inoltre a
coordinare lo sviluppo perché le divisioni devono essere sincrone, cioè la meiosi 1 deve avvenire in tutte le cellule
della cisti nello stesso momento e così la meiosi 2, il differenziamento ecc.

Ciò si vede nel moscerino perché se io in una cisti wild type uccido 1 o 2 cellule muoiono tutte perché sono tutte in
comunicazione, questo perché una cisti con un numero diverso da 15 nutrici e 1 ovocito non può andare avanti.
Quindi durante la spermatogenesi i ponti servono per la sincronia dello sviluppo fondamentale perché le cellule non
possono fare meiosi in momenti diversi, altrimenti si ha uno sviluppo aberrante. Quindi questi ponti servono quasi
essenzialmente per la sincronizzazione della gametogenesi.

FECONDAZIONE

Il riccio di mare e il topo sono 2 modelli importanti per spiegare la fecondazione. Il processo si conosce molto bene
nel riccio di mare mentre si sa meno su quello del topo.
La fecondazione richiede la fusione di 2 gameti, spermio e uovo. Nel riccio di mare lo spermio contatta l’uovo nella
parte apicale, mentre nel topo lo contatta nella parte laterale.

La fecondazione comporta:

▪ Formazione dei gameti

▪ Riconoscimento specie specifico: importante in specie con fecondazione esterna
▪ Quando viene rilasciato l’uovo nella fecondazione esterna, anche gli spermi sono rilasciati all’esterno, e riescono
a trovare l’uovo con un meccanismo che attrae gli spermi e agisce ad una certa distanza secondo un gradiente
▪ Lo spermio deve attraversare gli involucri dell’uovo o meglio gli involucri che lo circondano. Nel riccio di mare
l’uovo è circondato da strato gelatinoso, involucro vitellino e membrana. + o – la stessa cosa si ha nei
mammiferi con la corona radiata fatta da cellule, un involucro resistente detto zona pellucida e poi membrana
plasmatica con cui lo spermio si deve fondere. Quindi ci deve essere qualcosa che garantisce il transito.
▪ Nel riccio di mare c’è la reazione acrosomale, una vescicola sopra al nucleo con enzimi necessari per
l’attraversamento
▪ Lo sviluppo deve essere garantito dalla presenza di 1 spermio solo che entra nell’uovo, altrimenti si arresta lo
sviluppo.

Quindi ci devono essere meccanismi che fanno entrare 1 solo spermio e poi quando contatta l’uovo, questo viene
attivato e poi si ha il cleavage.
L’uovo del riccio di mare è circondato da strato gelatinoso, involucro vitellino e membrana, mentre nel topo c’è lo
strato pellucido e le cellule follicolari. Quindi nel riccio di mare deve attraversare lo strato gelatinoso e l’involucro
vitellino, contattare la membrana ed entrare nell’uovo.

Riccio di mare
Nel riccio di mare lo spermio si muove in acqua per cercare l’uovo immobile, in Arbacia esiste un peptide di 14
amminoacidi detto Resact che ha la capacità di richiamare gli spermi. Se io prendo il peptide isolato e lo metto in una
soluzione con gli spermi, vedo che tutti gli spermi si accumulano dove c’è la goccia di peptide. Gli spermi si dirigono
verso la fonte di questo segnale prodotto dall’uovo, Resact si trova nel Jelly coat e quindi quando l’uovo va in acqua
libera il peptide e quindi ho un’alta concentrazione nel Jelly coat che diminuisce sempre + e creo un gradiente
seguito dallo spermio.

Sulla membrana dello spermio c’è un recettore per Resact, ovvero un enzima e quindi si legano e il recettore attivato
va ad attivare i canali del Calcio e quindi entra Calcio e si ha che:

1. Cambia il pH
2. Si attiva la capacità ATP-asica della Dineina. Il flagello ha l’assonema con modello 9+2 dove ci sono braccia di
dineina che determinano lo scivolamento dei doppietti e quindi il battito e cioè il movimento. La dineina è
un’ATP-asi che funziona con ATP e quando entra il Calcio questo aumenta il pH e attiva la produzione di ATP nei
mitocondri, quindi se ho molto ATP, la dineina funziona di + e lo spermio si muove + velocemente.
Lo spermio si muove verso la fonte del Resact perché se va in direzione opposta diventa immobile. Si muove fino a
che non arriva allo strato gelatinoso e inizia ad entrare nello strato gelatinoso ma non lo può attraversare. Nello
strato gelatinoso c’è Fucosio solfato e lo spermio nella sua membrana esterna ha recettori per il fucosio solfato che
quando sono attivati determinano la reazione acrosomale. Già nel Jelly coat c’è un parziale riconoscimento specie
specifico perché ci sono fucosi solfato costruiti in maniera diversa, ovvero con conformazione diversa, e quindi
specie diverse hanno anche recettori diversi.

La presenza del fucosio solfato attiva nella membrana dello spermio un recettore e ciò determina la reazione
acrosomale. La testa dello spermio del riccio ha il nucleo, una fossetta, una vescicola apicale che è l’acrosoma.
Quindi si ha la membrana dello spermio e la vescicola acrosomale che ha la sua membrana e quindi contiene enzimi
litici che non si possono aprire nello spermio sennò muore e quindi per questo c’è la membrana. Sulla membrana
interna della vescicola, nel lato rivolto verso il nucleo, ci sono molecole di Bindina. Nella fossetta che si trova nella
parte apicale del nucleo c’è l’actina G che è globulare e quindi al momento in cui il recettore del fucosio si lega al
fucosio si attiva la fusione della membrana esterna dello spermio con la membrana della vescicola e si ha la
frammentazione della membrana. Frammentandosi la vescicola e la membrana i contenuti vanno all’esterno e
l’actina G polimerizza in actina F che è un filamento fatto da tanti monomeri di actina G. Polimerizzando i filamenti si
allungano e premono su ciò che rimane della membrana interna della vescicola con la Bindina. Si forma così una
bacchetta con i filamenti di actina con un processo acrosomale, e la bacchetta ha sulla superficie esterna la Bindina.
Quindi il risultato è che vengono riversati all’esterno gli enzimi litici e si ha il processo acrosomale per formazione
dell’actina F e si riversa la Bindina all’esterno.
L’apertura della vescicola e la fusione delle membrane dipende dal calcio, quindi quando il recettore per il fucosio è
attivato si attivano i canali del calcio e la sua presenza permette la fusione.

Contatto tra spermio e uovo

I microvilli stanno sulla membrana dell’uovo. Il processo acrosomale implica l’esposizione della Bindina che ha il suo
recettore nella superficie dell’uovo. Un esperimento con l’anticorpo della Bindina fa notare che essa è coinvolta nel
processo acrosomale.

Lo spermio dopo l’attivazione di Resact entra nel jelly coat e trova fucosio, si attiva il recettore, entra il calcio e si ha
il processo acrosomale che espone la Bindina che riconosce il suo recettore nello spermio ma è ancora un processo
specie specifico. Nello stesso habitat si trovano 2 ricci di mare dello stesso genere e vengono prese le uova del riccio
con uova viola e vengono messe in soluzione con bindina isolata da spermi della stessa specie e quindi le uova ci si
legano. Se invece prendo le uova dell’altra specie e le metto in soluzione con bindina della specie primaria non ho
agglutinazione perché non c’è riconoscimento. Quando ho il riconoscimento nella stessa specie il recettore si lega
alla bindina, ma se li ho di specie diverse il legame non avviene e quindi lo spermio non si lega all’uovo. Quindi si ha
la necessità della reazione acrosomale, il passaggio dello spermio attraverso la membrana e lo spermio deve fondersi
e far entrare il nucleo nel citoplasma.
Si pensava che quando lo spermio si fonde entra solo il nucleo ma in realtà entra tutto lo spermio, mitocondri,
nucleo e centriolo che organizza il primo fuso mitotico.
Fusione con la membrana

Lo spermio deve entrare nell’uovo e quindi è legato alla membrana tramite la Bindina. Le 2 membrane si devono
quindi fondere e l’ipotesi è che: se guardo la sequenza della bindina mi accorgo che ha un insieme di amminoacidi
idrofobici simile alle proteine fusogeniche dei virus. L’idea è quindi che siccome c’è questa sequenza, la bindina
favorisce la fusione delle membrane.

La sequenza è quindi: lo spermio in seguito a Resact arriva a jelly coat con la reazione acrosomale si espone la
bindina che si lega al recettore sull’uovo.
Ciò che cambia nella bindina è una struttura fatta da zuccheri e così si rende la bindina specie specifica. La bindina si
lega al recettore, le membrane si fondono e lo spermio entra nell’uovo.

Ma deve entrare solo 1 spermio perché se ne entrano di +, sappiamo che l’uovo non ha centrioli funzionanti e quindi
devono essere portati dallo spermio e allora lo spermio porta 2 centrioli, madre e figlio, che duplicano e si
organizzano i 2 poli del fuso zigotico che serve per l’allineamento del materiale genetico materno e paterno. Ma se
entrano + spermi i centrioli nell’uovo catturano materiale che serve per la costruzione di microtubuli e quindi
ognuno costruisce il proprio aster e quindi si formano + fusi e si hanno divisioni anomale, e i cromosomi sono ripartiti
in maniera sbagliata.

Quindi è essenziale che entri 1 solo spermio.

Nelle uova di uccelli possono entrare + spermi e questa è un’eccezione.

Se entrano 2 spermi nel riccio di mare si ha un fuso quadripolare e quindi i cromatidi sono ripartiti in maniera
sbagliata e si ha la morte. L’uovo umano in cui entrano 2 spermi ha la formazione di un fuso con 4 poli e quindi si
hanno cellule aneuploidi e l’embrione non va avanti.
Difesa contro la polispermia

L’uovo per difendersi dalla polispermia ha 2 processi successivi:

1. Blocco veloce: nel riccio di mare c’è ma non c’è nei mammiferi. Questo processo vede l’uovo nell’acqua e quindi
c’è equilibrio tra ioni Sodio e Potassio e quindi nel citoplasma si ha un’alta concentrazione di potassio mentre in
acqua di mare ho alta concentrazione di sodio e ciò genera un potenziale di membrana che fa vivere la cellula ed
è – 70 mV. L’uovo quindi vive con la differenza di potenziale di –70 mV. Quando lo spermio entra o interagisce
con la superficie dell’uovo e quindi con i recettori della Bindina si ha la depolarizzazione della membrana e il
potenziale passa da -70 mV a +20 mV perché esce potassio ed entra sodio e quindi lo scambio di ioni determina
la depolarizzazione di membrana che dura pochissimo. Questa in versione è importante per prevenire
polispermia perché se faccio un esperimento in cui metto uova in acqua di mare, se l’acqua di mare ha sodio
500 mm di concentrazione ho una percentuale di polispermi molto bassa, ma se la concentrazione diminuisce
ho tutte le uova polispermiche perché il salto di potenziale è garantito dall’ingresso di sodio nel citoplasma e se
ce ne ho poco ovviamente non entra. Quindi la depolarizzazione è legata all’ingresso di sodio dall’acqua
circostante. La differenza è molto veloce perché la cellula non può vivere con potenziale +, ma questo è
importante perché a quel potenziale gli spermi non possono entrare. Quindi si crea una condizione e poi si torna
a quella di partenza, ma quella finestra permette all’uovo di iniziare il blocco lento.

2. Blocco lento: quando lo spermio interagisce con l’uovo si aprono granuli corticali sotto la membrana dell’uovo e
si fondono con la membrana dello spermio e riversano il contenuto tra lo spazio che c’è tra membrana e
involucro vitellino e lo spazio aumenta.

I granuli corticali si attivano 1 minuto dopo la fusione dell’uovo e dello spermio quindi la finestra di tempo è
sufficiente per far sì che i granuli riversino il loro contenuto. Nei granuli corticali ci sono 4 tipi di sostanze:
1) Proteasi: sono gli enzimi riversati per primi che tagliano i recettori per la Bindina e quindi gli spermi non si
legano +, l’involucro vitellino e la membrana sono uniti da strutture proteiche e le Proteasi degradano anche
queste strutture consentendo all’involucro vitellino di allontanarsi dalla membrana e si allontana per i muco
polisaccaridi
2) Muco polisaccaridi: sono come spugne che attraggono acqua e aumentano il loro volume e quindi se la distanza
all’inizio era una, dopo aver richiamato acqua aumenta. I polisaccaridi imbevuti di acqua sono poco resistenti e
quindi lo strato deve essere indurito.
3) Perossidasi: legano tra loro le tirosine di alcuni amminoacidi e ciò fa sì che la struttura diventi resistente e
diventa quindi l’involucro di fecondazione.
4) Ialina: non serve per la prevenzione della polispermia ma viene rilasciata perché ha un ruolo importante + tardi
nello sviluppo quando inizia la gastrulazione

Alla fine si forma l’involucro di fecondazione.

Si ha l’uovo, arriva 1 spermio per primo, lo contatta tramite recettori, i granuli si fondono riversano il contenuto,
tagliano recettori e proteine, riversano i mucopolisaccaridi induriti da perossidasi e rilasciano ialina e si forma
l’involucro di fecondazione. Gli spermi che arrivano dopo non si possono + legare perché non ci sono + recettori.

I granuli degradano i recettori per la bindina quindi i pochi spermi che si erano legati vengono allontanati e così ho il
blocco lento.

La fusione dei granuli dipende dal calcio che progressivamente viene liberato in tutto l’uovo e l’onda del calcio fa
aprire progressivamente i granuli corticali. L’onda di calcio continua fino a che l’involucro di fecondazione circonda
tutto l’uovo e gli spermi vengono allontanati.
Fecondazione nei mammiferi
Per quanto riguarda la fecondazione nei mammiferi ci sono processi simili, ma anche differenze con la fecondazione
del riccio. La differenza è che la fecondazione nei mammiferi è interna e questo crea problemi per lo studio, ma in
entrambi ci sono spermi mobili. Nei mammiferi c’è la capacitazione dello spermio che viene reso in grado di
fecondare l’uovo. Nel riccio c’è chemiotassi perché lo spermio è attratto dall’uovo grazie a Resact, nei mammiferi si
pensa ci sia gradiente termico, c’è la zona pellucida analoga all’involucro vitellino ma diversa. I gameti in entrambi
devono aderire, ci deve essere un legame tra spermio e uovo, e hanno in comune anche la prevenzione di
polispermia.

Movimento spermi
Lo spermio può essere attratto da differenza di temperatura, sostanze liberate nelle vie genitali femminili a cui
rispondono spermi capacitati. Lo spermio che esce dai tubuli non sa fecondare ma deve essere capacitato e se lo
sono, sono + attivi e si muovono + velocemente. La reazione acrosomale avviene solo se sono capacitati nelle vie
genitali femminili.

Capacitazione
La capacitazione richiede la rimozione di proteine che sono state aggiunte, o meglio che lo spermio ha accumulato
dal plasma seminale, in quanto le proteine nascono siti per il riconoscimento e devono essere rimosse e ci deve
essere una riorganizzazione del colesterolo.

Il primo passo per la capacitazione è l’ingresso di ioni carbonato che determina un cambiamento di polarità di
membrana e fa attivare una proteina che è un enzima che è l’adenilatociclasi che è responsabile dei processi di
attivazione. Entra carbonato, esso attiva canali di calcio e determina l’iperpolarizzazione di membrana che fa
spostare il colesterolo e viene riorganizzato e tramite albumina viene eliminato dalla membrana plasmatica. A
questo punto la membrana è + fluida e questo attiva i canali del calcio.

Insieme al carbonato i canali calcio attivano adenilatociclasi che fosforila una chinasi PKA che può fosforilare un’altra
chinasi e ciò porta al processo di capacitazione. La capacitazione serve per permettere un movimento + attivo degli
spermi e vengono rimosse proteine di superficie aggiunte dal liquido seminale quindi si liberano porzioni che
servono per il contatto con l’uovo. Queste regioni sono quelle che servono per contattare le regioni specifiche
sull’uovo.

Lo spermio capacitato arriva nella zona con cellule follicolari, le attraversa e quando contatta la zona pellucida
avviene la reazione acrosomale in quanto lo spermio perde componenti che nascondono i recettori. Lo spermio
contatta la zona pellucida e inizia la reazione e poi penetra e si lega alla membrana dell’uovo con cui si fonde.

Zona pellucida

La zona pellucida è analoga all’involucro vitellino ma è diversa perché è fatta da 3 proteine che sono ZP1, ZP2, ZP3.
La 2° e la 3° formano collane in cui i singoli monomeri sono alternati tra loro e la 1° serve solo per tenere unite tra
loro le collane. La 3° ha dei terminali perché è una glicoproteina quindi ha gruppi glicosidici. La 2° e la 3° sono
importanti per il legame dello spermio con l’uovo.

Si ha la zona pellucida che espone la 2° e la 3°, ma lo spermio si lega inizialmente all’acetilglucosammina della 3°
perché sulla membrana dello spermio c’è una galattosiltransferasi che riconosce acetilglucosammina della 3°. Quindi
lo spermio è intatto ma ha sulla membrana la galattosiltransferasi che si lega ad acetilglucosammina che è il residuo.
Così si attiva sulla membrana dello spermio la fosfolipasi C che determina una serie di passaggi che culminano con
l’apertura di canali Calcio e ciò determina la fusione delle membrane che si aprono e liberano il contenuto
enzimatico. Lo spermio ha la vescicola acrosomale e quando contatta la 3°, il recettore si attiva e fa aprire i canali
Calcio che portano alla fusione delle membrane che appunto si eliminano e il contenuto dell’acrosoma va all’esterno
e viene esposto alla parte interna della membrana acrosomale.

Gli enzimi sono importanti perché fanno penetrare lo spermio nella zona pellucida.
Reazione acrosomale
Le membrane si fondono, esce il contenuto della membrana acrosomale con enzima acrosina che fanno una parziale
digestione di zona pellucida e lo spermio entra per un certo tratto. Ma la vescicola acrosomale aperta espone la
parte interna con i recettori per la 2° e quindi lo spermio tramite enzimi attraversa la zona pellucida, i recettori per la
2° la trovano e ci si legano e, mentre il legame con la 3° è transitorio, questo legame è duraturo ed è detto binding
secondario, a cui segue la fusione.
Si sa che la zona pellucida è circondata da cellule follicolari e lo spermio attraversa queste cellule che sono unite tra
loro da giunzioni e da una matrice extracellulare che è acido ialuronico. Si vide che sulla membrana dello spermio
nella testa, c’è una proteina, un enzima con attività ialuronidasica. Quindi se sulla membrana c’è l’enzima che
degrada l’acido ialuronico, lo spermio forza il passaggio tra cellule. Quando poi arriva nella zona pellucida si attiva il
binding primario, e poi il binding secondario e poi c’è la fusione.

Fusione

Nel riccio di mare o spermio arriva frontalmente perché la bindina sta nell’apice del processo acrosomale e quindi
l’interazione avviene lì.

Nei mammiferi lo spermio si adagia su un lato come se l’interazione avvenisse in regione equatoriale.

Nei mammiferi c’è una proteina, la fertilina che è presente nella membrana dello spermio e ha un ruolo
fondamentale per la fusione in quanto ha una regione con amminoacidi idrofobici. La fertilina trova il recettore
integrina nell’uovo e questa serie di amminoacidi idrofobici consente la fusione.
In realtà un’altra idea + recente è che la fusione richiede altre proteine. C’è fertilina, cintestina e izumo che guida la
fusione perché se costruisco un topo che non ha izumo, vedo che questo topo sta bene, non ha problemi a parte
quello della sterilità perché l’ovocito non fa entrare spermi e quindi si pensa che izumo serva a far entrare lo spermio
e quindi a garantire la fusione.

Si pensava che il recettore fosse Cd9 che sta sulla membrana dell’uovo. Successivamente si scopre un’altra molecola
detta juno che sta nell’uovo ed è stato dimostrato che se l’uovo non ha questa molecola non avviene la fusione
quindi si dimostra che izumo è fondamentale per la fusione e sta nello spermio, e juno è necessaria per la fusione.

Si scopre che Juno e izumo interagiscono tra loro e quindi izumo sta sullo spermio e juno sull’uovo e ciò funge da
recettore per izumo. Per il riconoscimento si pensa che contribuisca anche Cd9.

Jumo e izumo non hanno amminoacidi idrofobici ma si ritiene che determinano la fusione perché se si fa un topo
knock out per juno spermio e uovo non si fondono.

Qualche anno fa in un lavoro si fa vedere che la struttura di izumo ha delle regioni simili a proteine che determinano
l’invasione delle cellule da parte del Plasmodio che per entrare ci si deve fondere e per fondersi con le cellule, con i
globuli rossi o epatociti, usa 2 proteine che ne determinano la fusione delle membrane. Quindi izumo ha regioni
simili a queste 2 proteine del Plasmodio e allora l’idea è che izumo è il master che regola la fusione delle membrane.

Per dimostrare se è vero si può costruire un izumo che manca della parte che regola la fusione nel plasmodio.

Quando lo spermio arriva a contatto con la zona pellucida c’è il binding e quindi la reazione acrosomale. Molti lavori
suggeriscono che spermi che hanno avuto la reazione acrosomale non possono fecondare uova. È stata fatta la
reazione acrosomale usando uova di topo con difetti in Cd9 che è un recettore che sta vicino a juno e con esso porta
alla fusione dei gameti. Quindi pendendo spermi che hanno avuto reazione acrosomale in quanto i mutanti con Cd9
avevano la zona pellucida, ma il recettore non c’era o era alterato, gli spermi non entravano nell’uovo. Ma questi
spermi si potevano legare alla zona pellucida di altre uova e fecondarle e quindi erano funzionanti. Quindi potevano
attraversare le cellule follicolari e quindi ci deve essere qualcosa che permette il passaggio perché lo spermio non si
può legare alla ZP3 in quanto ha avuto la reazione acrosomale e quindi ha eliminato il recettore per ZP3. In realtà
possono attraversare lo strato e la zona pellucida senza binding primario. Allora esistono meccanismi che lo
permettono e questo processo che richiede quindi binding forse non è fondamentale.

Zona pellucida

Questa zona è fatta da catene di ZP2 e ZP3 alternate e legate tra loro da ZP1 che è una molecola che stabilizza le
catene. La ZP3 ha residui carboidratici in quanto gli zuccheri permettono il riconoscimento.

La funzione di zona pellucida è binding, reazione acrosomale e prevenzione della polispermia. Inoltre la zona
pellucida protegge l’embrione alla segmentazione e quindi avvenuta la fecondazione c’è il cleavage e si sposta
l’embrione e in questo spostamento, esso è protetto dalla zona pellucida.
Problemi per mancata fecondazione

Se c’è polispermia c’è sviluppo aberrante. La tempistica, siccome lo spermio sopravvive 48h mentre l’uovo può
essere fecondato in 24h indica un problema nella fecondazione, ovvero la possibilità che nell’uovo entrino + spermi
ma questo implica x es 3 pronuclei e ovviamente lo sviluppo non va avanti perché determinano una divisione
aberrante.

Il controllo della polispermia nei mammiferi

Nei mammiferi non c’è un blocco veloce come nel riccio di mare, ma solo un blocco lento che è una reazione
corticale dei granuli corticali. Lo spermio nei mammiferi arriva lateralmente alla superficie e nella regione
equatoriale ci sono recettori che permettono l’associazione juno e izuno. Dopo il contatto sono liberati granuli
corticali con enzimi che tagliano la parte di carboidrato di ZP3 che determinava il primo binding che quindi non
avviene. Ma segue il binding 2°. I granuli corticali in parte eliminano lo zucchero e quindi nessun altro spermio farà
binding 1°, ma ci sono spermi legati a ZP2 e altri enzimi degradano ZP2 e lo spermio si stacca.

I granuli corticali riversano enzimi nella zona pellucida.

La liberazione dei granuli

Quando arriva lo spermio questo attraversa la zona pellucida, si lega alla membrana e il contatto porta all’apertura
dei canali del Ca che fanno fondere i granuli sulla membrana e quindi l’apertura dei granuli che riversano gli enzimi
nello spazio tra membrana e zona pellucida. Gli enzimi degradano zuccheri di ZP3 e staccano lo spermio da ZP2.

Questo evita la polispermia.

Quando sono stati scoperti juno e izumo si propone un’altra possibilità per evitare polispermia: juno sta sull’uovo e
izumo sullo spermio. Se allontano juno non c’è legame dello spermio e infatti sembra che quando l’uovo è fecondato
le molecole di juno sono incapsulate in vescicole eliminate all’esterno. Le vescicole vanno poi a neutralizzare spermi
circostanti perché se c’è juno e izumo sullo spermio quindi questi reagiscono e i legami sono saturati e lo spermio
non si lega all’ovocito che oltretutto non ha + recettori. Per avere vescicolazione devo aumentare le componenti che
formano la membrana sennò diminuisce troppo e l’ovocito non esiste quindi serve apporto di nuovo materiale.

Ma se elimino il recettore il ligando dello spermio non lo trova e non si lega.

 ATTIVAZIONE DELL’UOVO
Quando l’uovo viene a contatto con lo spermio si ha l’attivazione e per prima cosa si rilascia il contenuto dei granuli
corticali per bloccare la polispermia e poi si attiva il metabolismo dell’uovo come sintesi proteica, costruzione del
fuso mitotico e tutto ciò che porta alle divisioni successive.

Quindi arriva lo spermio e si lega a juno e ciò attiva la fosfolipasi C che a sua volta fa aprire i canali Ca perché il Ca ha
canali in uscita che sono attivati dall’IP3. Ciò fa aumentare il Ca, fa aprire e fondere i granuli con la membrana e si
blocca la polispermia. L’apertura dei canali: lo spermio si lega al recettore e ciò fa attivare fosfolipasi C che sta sulla
membrana dell’ovocito e la fosfolipasi C fa formare InositoloTrifosfato che fa aprire i canali Ca, il Ca si libera.

Il legame tra spermio e uovo porta all’attivazione di fosfolipasi C che usa il fosfatidilinositolo e lo scinde in 2
prodotti: triacilglicerolo e inositolotrifosfato che si lega a recettori che sono sul reticolo ergastoplasmico e questi
recettori attivati fanno aprire i canali Ca. il triacilglicerolo attiva una pompa per lo scambio di Na. Il Ca e il Na entrano
nel citoplasma e portano ad un aumento del pH che porta a processi che sono sintesi del DNA, divisioni, traduzione
di mRNA. Quindi questo processo che inizia con il contatto tra uovo e spermio termina con l’apertura di granuli
corticali e fa aumentare il pH del citoplasma che culmina nei processi visti sopra.
Così si attiva l’uovo.
Nel riccio di mare c’è un recettore intramembrana che reagisce con la Bindina e il recettore si attiva, attiva fosfolipasi
C che taglia il fosfatidilinositolo in 2 come accadeva prima e poi il processo è lo stesso e quindi si libera il Ca e si
liberano i granuli, inoltre c’è aumento di pH grazie al Na e iniziano i vari processi e quindi si attiva l’uovo.

Come si attiva fosfolipasi C

L’attivazione richiede fosforilazione ovvero la fosfolipasi C deve essere fosforilata e ci sono 2 possibilità: L’uovo nel
riccio di mare ha la bindina che si lega al recettore che può essere di 2 tipi: o il recettore ha attività tirosinchinasica e
fosforila la fosfolipasi, oppure è associato ad una tirosinchinasi.

Il risultato non cambia.

Differenze

Un uovo non fecondato ha una sintesi proteica bassa, mentre in quello fecondato alla fecondazione la sintesi proteica
è enorme e quindi il fatto che con il contatto si determina il processo si ha l’implemento di sintesi proteica.

Protezione da polispermia

La protezione dalla polispermia si trova ovunque tranne in uova grandi in cui è consentita perché è difficile che ci sia
una reazione corticale. La polispermia diventa pericolosa perché gli spermi possono organizzare fusi mitotici in +, ma
ciò non succede in uova polispermiche in quanto gli spermi in + devono essere disattivati.

Polispermia fisiologica

Le uova si sviluppano anche se entrano + spermi.

L’uovo della rana è grande e se entrano + spermi è aberrante e quindi non sopporta polispermia, mentre il tritone si
anche se ha un uovo delle stesse dimensioni di quello della rana.
Quando entrano 2/3 spermi nell’uovo della rana, 1 contatta il pronucleo e porta allo zigote, ma anche gli altri
formano fusi e quindi ho 3 blastomeri con un numero irregolare di blastomeri. Nel tritone entrano + spermi e 1
contatta il pronucleo femminile e si forma il fuso con cromosomi paterni e materni e gli altri spermi sono inattivati.
Anche gli altri spermi costruiscono l’aster ma non vanno avanti nello sviluppo piuttosto scompaiono. Anche negli
uccelli succede ciò.

Quindi entrano + spermi ma solo 1 si fonde con il pronucleo e poi si sviluppa e forma lo zigote. Anche gli spermi
formano un fuso che arriva in anafase, ma sono aploidi e quindi il fuso contiene cromosomi aploidi e questo fuso si
blocca in anafase. Quindi solo il fuso diploide procede nello sviluppo. Ci sono 2 ipotesi:

1. Ci sono 4 spermi e 2 sono + vicini al pronucleo femminile. Lo spermio è selezionato sulla base di quello + vicino al
pronucleo femminile perché lo spermio con il basal body organizza un aster di microtubuli e ce ne sono alcuni
che contattano il pronucleo femminile. Quest’ultimo si muove con la dineina nei microtubuli fino ad arrivare al
pronucleo maschile. Si dice che questo contatto del pronucleo femminile con gli aster determinerebbe una
crescita nei microtubuli ovvero un aumento in numero e quindi si può formare il fuso mentre i + lontani non
hanno incremento. Quindi il basal body organizza i centrosomi e i microtubuli hanno attività maggiore quando il
pronucleo femminile contatta gli aster.

Negli insetti a volte può entrare 1 spermio perché la protezione dalla polispermia non funziona e costruiscono un
piccolo aster che degenera e quindi ci deve essere una protezione interna.

Quindi si ha protezione esterna dei granuli corticali e una interna.

2. In un uovo con + spermi c’è 1 solo spermio che contatta il pronucleo, mentre gli altri spermi degenerano perché
quando i 2 nuclei si uniscono si forma il fuso mitotico per la presenza di MPF e quindi chinasi attivata. Quindi c’è
un’alta concentrazione di MPF vicino e bassa + lontano. Questa concentrazione di MPF determina l’ingresso in
mitosi ma dove non c’è i nuclei vanno in interfase e quindi i 2 pronuclei che si sono fusi si dividono, mentre gli
altri nuclei maschili in + rimangono in interfase e quindi non possono dividersi e quindi degenerano. Ma si ha un
incremento di MPF intorno ai 2 pronuclei, mentre gli altri non ce l’hanno, ma in alcuni casi anche quei nuclei
vanno in anafase.
Blocco polispermia

Nei mammiferi il blocco della polispermia avviene dall’interazione tra juno e izumo, in alcuni avviene all’interno
dell’uovo che ha polispermia fisiologica.

Fecondazione
Quindi nella fecondazione, in condizioni normali entra lo spermio e inizia la divisione. Quando si forma il gamete
maschile il nucleo si condensa e quindi quando lo spermio entra nell’uovo trova 2 nuclei e il pronucleo maschile è
piccolo perché condensato e quindi deve decondensarsi. Alla base della condensazione ci sono gli istoni sulle quali si
superavvolge il DNA.

Sostituzione istoni
Si ha inizialmente uno spermio tondo e poi allungato. Un istone è una particella in cui si avvolge DNA. Il primo passo
è incorporare varianti di istoni diversi da quelli presenti e quindi rimuovere gli istoni normali poi c’è acetilazione che
rimuove le varianti acetilate. Ora avviene la sostituzione di istoni con proteine di transizione che sono rimosse e
sostituite da protammine che fanno sì che la cromatina venga compattata. Quindi si rimuovono istoni e si
sostituiscono con protammine per compattare estremamente il nucleo dello spermio.

La cromatina è compatta e quindi il pronucleo femminile è molto grande e quello maschile è piccolo e io devo
arrivare a dimensioni simili. Se la compattezza è data dalle protammine le devo togliere e sostituire con ammine. Nel
citoplasma c’è glucatione che diminuisce i ponti disolfuro di protammina che così sono eliminate e rimpiazzate da
istoni materni e quindi del nucleo maschile rimane DNA. Questa sostituzione determina la decompattazione della
cromatina e quindi si forma un pronucleo con dimensioni simili a quello femminile.

A questo punto la cromatina si ricompatta usando gli istoni per formare i cromosomi. Quindi alla base della
sostituzione c’è glucatione.

Nella formazione del fuso zigotico è importante il centrosoma che è un organello che organizza la nucleazione dei
microtubuli grazie alla gamma tubulina. Il centrosoma è fatto da materiale tra cui gamma tubulina e 2 centrioli al
centro che lo organizzano. L’uovo non ha centrioli e quindi le divisioni meiotiche nell’uovo avvengono senza l’ausilio
di centrosomi.

Durante la meiosi femminile quasi tuti gli organismi hanno un fuso che si assembla con processo acentrosomale che
riguarda la nucleazione dei microtubuli a partire dai cromosomi quindi non avviene ai poli ma nella regione del
cinetocore dei cromosomi.

La differenza è che in mitosi ho 2 poli con centrosoma e centrioli e qui ho i microtubuli astrali.

Formazione fuso zigotico, cleavage

Il fuso ha necessità di centrioli, ma l’ovocito non ce l’ha. Lo spermio invece ha anche il centriolo. Arriva lo spermio
che porta 2 centrioli all’interno dell’uovo e questi 2 centrioli duplicano e non hanno materiale pericentriolare ma lo
raccolgono intorno a loro, comunque si ha tubulina e così si organizza il fuso.
C’è differenza nell’organizzazione del fuso meiotico e mitotico. Il fuso meiotico ha micortubuli paralleli e si
localizzano grazie alla dineina ma non ci sono centrosomi.

Una divisione normale richiede 2 centrosomi, se ce l’ho 1 le cellule sono aberranti, se non ho centrioli la divisione
non avviene ma se ne ho troppi è come avere la polispermia quindi se l’ovocito portasse 2 centrioli e anche lo
spermio ne portasse 2 la duplicazione porterebbe a troppi fusi. Per questo l’ovocito non ha centrioli, o meglio ce l’ha
ma li elimina perché inizialmente la staminale si divide e forma 1 figlia e 1 cellula che crea ovociti e quindi c’è mitosi
per i centrioli ma poi scompaiono.
Se entrano pochi spermi nell’uovo frammentano la cromatina con i fusi e lo sviluppo si blocca.

I centrioli li deve perdere l’ovocito e non lo spermio sennò lo spermio non può muoversi. Di solito l’ovocito perde i
centrioli e negli insetti, nei mammiferi, i centrioli ci sono durante le divisioni della figlia delle staminali ma poi
spariscono e quindi ho i fusi in meiosi senza centrioli. Negli echinodermi i centrioli rimangono perché i fusi sono
sostenuti da centrosomi con centrioli. Quando arriva lo spermio porta altri centrioli ma alcuni vengono eliminati e
quando arriva lo spermio quelli nell’uovo non ci sono +.
Sia nei mammiferi che nel moscerino i centrioli sono persi presto e si formano fusi acentrosomali. Il fuso è fatto da
microtubuli organizzati dal centrosoma che non c’è e quindi vengono organizzati solo dalla cromatina. Negli
echinodermi i centrioli rimangono.

Nel moscerino i centrioli vengono persi e si forma un cluster e vanno a finire nell’ovocito e man mano che si sviluppa
e matura, i centrioli scompaiono e il materiale pericentriolare diminuisce a livello dei centrioli. Ci sono delle
pubblicazioni che dicono che la stabilità dei centrioli è in relazione con il materiale pericentriolare e quindi si pensa
che la scomparsa dei centrioli sia legata alla scomparsa del materiale pericentriolare e la prova si ottiene andando a
mantenere il materiale pericentriolare facendo esprimere una proteina legata all’assemblaggio del materiale, ovvero
polo che non scompare, e si vede che i centrioli sono conservati e quindi si afferma che è la presenza del materiale
pericentriolare a correlare i centrioli.

Se Polo viene degradato i centrioli scompaiono e quindi il materiale pericentriolare è legato alla presenza di centrioli.
Negli echinodermi 1 centriolo rimane e viene portato dallo spermio ma non si formano fusi multipolari. Gli autori
marcano il centriolo madre e figlio nella metafase 1. La metafase 1 ha ai 2 poli 2 centrioli per polo e quindi 2 centrioli
vanno nel globulo polare che viene eliminato e gli altri 2 rimangono legati ai microtubuli nella regione che organizza
il secondo fuso. Non c’è duplicazione dei centrioli, i centrioli si allontanano e vanno ai poli opposti per formare il
secondo fuso che ha 1 centriolo per polo. A questo punto il globulo polare ha il centriolo madre che si lega alla
membrana, ovvero si associa con la membrana plasmatica e non il centriolo figlio che sta al polo opposto. Ci si
chiede perché dei 2 solo il centriolo madre si lega alla membrana e la risposta sta nella differenza strutturale. Il
centriolo madre ha appendici che servono per associarsi con la membrana, inoltre il centriolo madre organizza i
microtubuli e ciò non lo fa il centriolo figlio. Quindi il centriolo madre ha appendici e sa organizzare microtubuli
astrali che tramite la dineina si associano alla membrana plasmatica. Il fuso in metafase fa sì che i 2 gruppi di
cromatidi aploidi si separino e quindi si forma una cellula piccola che viene espulsa come globulo polare che
contiene il centriolo madre, mentre il figlio rimane nell’uovo ma non si forma un fuso multipolare.
Nella prima mitosi ho il primo fuso con i poli che è organizzato dai centrioli portati dallo spermio e si duplicano e
formano i 2 centrosomi. Il centriolo figlio non organizza un aster perché solo il centriolo madre può reclutare il
materiale ma non il figlio che quindi non può nucleare i microtubuli. A un certo punto il centriolo figlio scompare.
Non c’è eliminazione all’inizio dell’ovogenesi ma il centriolo è ereditato anche se non può organizzare il centrosoma
e quindi degenera con un meccanismo sconosciuto.
Se viene mantenuto l’ultimo polar body rimangono il centriolo madre e figlio e se il figlio non da fastidio, il centriolo
madre organizza il centrosoma e si forma un aster che interferisce con il fuso bipolare organizzato dai centrioli dello
spermio. Se non elimino nessun globulo polare ho un centriolo quadripolare. Quindi i centrioli madre sono espulsi
perché funzionano e il centriolo figlio non funziona e poi sparisce.

Nel moscerino con la perdita del materiale pericentriolare scompaiono i centrioli. Quindi rimangono 2 centrioli, il
centriolo madre con le appendici e i microtubuli astrali. Il centriolo madre si ancora alla superficie, fa divisione e si
elimina il secondo globulo polare. Il centriolo figlio scompare.
Lo spermio porta i centrioli che attirano il materiale pericentriolare ed entrano determinando la raccolta di questo
materiale dal citoplasma dell’uovo. Quindi il centrosoma dello zigote è un ibrido fatto da materiale pericentriolare
materno e centrioli paterni.

Il pronucleo maschile e il pronucleo femminile si fondono e i cromosomi possono avere delle disposizioni diverse. Nel
riccio di mare e nel moscerino si riconoscono i cromosomi materni da quelli paterni per la loro disposizione. Nel topo
invece si mischiano e quindi alla prima metafase non li riesco + a distinguere, cosa che nel moscerino posso fare.

Nella fecondazione è lo spermio che porta il centriolo e i centrioli dell’ovocito scompaiono. Normalmente i centrioli
che costituiscono i poli del fuso zigotico sono i centrioli dello spermio e ciò vale per tutti tranne che per il topo.
Il topo come eccezione

L’ovocito del topo non ha centrioli ma ce l’ha lo spermio che entra nell’ovocito che in reltà non porta i centrioli, o
meglio li porta ma non sono funzionanti. Il topo ha un fuso privo di centrosomi e quindi le divisioni avvengono senza
centrioli e senza centrosomi. Nella seconda metafase c’è il fuso meiotico che dal punto di vista strutturale è uguale al
primo fuso zigotico perché entrambi non hanno centrosomi, ma durante la seconda meiosi compaiono nel
citoplasma dei piccoli asters di microtubuli nei quali si localizza la pericentrina tipica dei centrioli e poi i microtubuli si
assemblano e la pericentrina circonda i nuclei e si iniziano ad organizzare microtubuli che poi è come se si
allungassero e al centro si inseriscono i cromosomi e si forma una struttura senza centrioli, ma c’è un po’ di
materiale pericentriolare. Quindi la differenza tra fuso zigotico e meiotico è che il fuso meiotico è formato grazie ad
un processo dipendente dall’organizzazione dei microtubuli che avviene nella cromatina che nuclea i microtubuli e li
organizza e quindi il fuso è acentrosomale. Il fuso zigotico non ha centrioli ma ai poli del fuso c’è la gamma tubulina,
pericentrina, quindi c’è accumulo di proteine necessarie per l’organizzazione di microtubuli.

Alla seconda meiosi lo spermio porta centrioli che non funzionano, compaiono stelle di microtubuli e quando si va
avanti gli aster si avvicinano tra loro fino a disporsi ai poli opposti in 2 gruppi diversi.

Nella prima divisione ai poli del fuso c’è materiale pericentriolare come gamma tubulina che organizza i microtubuli
ma non ci sono centrioli e infatti il fuso è largo ai poli. Il meccanismo di assemblaggio del fuso continua dopo la prima
divisione e tutte le divisioni hanno quindi fusi senza centrioli e a un certo punto nella blastocisti precoce, compaiono
i centrioli all’improvviso. La blastocisti è la struttura con una cavità e ha le cellule del trofoblasto che originano le
strutture accessorie e queste sono le cellule della massa cellulare interna.

I centrioli compaiono all’improvviso.

Nell’uomo è diverso, la situazione è quella tradizionale, in cui alla prima divisione c’è il fuso e alla seconda metafase
lo spermio porta centrioli che organizzano il fuso.

In Drosophila i 3 pronuclei non vengono espulsi. Il pronucleo femminile si muove lungo i microtubuli grazie alla
dineina fino a raggiungere il pronucleo maschile. Quando sono a contatto i nuclei si decondensano.

Maternal haploid
Il fatto di avere i cromatidi che seguono strade separate all’inizio spiega il mutante maternal haploid che è un
mutante sterile che porta a embrioni aploidi che poi muoiono e ha un fenotipo in cui la cromatina paterna si
decondensa + lentamente della materna. In prometafase i cromosomi materni condensano e quelli paterni meno.
Nel controllo + o – è lo stesso, all’inizio la cromatina è indistinguibile e anche nel controllo ho un ritardo della
cromatina paterna perché la cromatina paterna è estremamente condensata e poi quando arriva nell’uovo si
decondensa quindi se il corredo paterno decondensa + lentamente anche la condensazione avviene con ritardo.
Nella prima fase del fuso zigotico i 2 corredi sono condensati ma separati. Nel mutante i cromosomi maschili non
sono condensati in metafase mentre quelli femminili si. Quindi entrambi i cromosomi vanno ora in piastra.

Nel controllo all’anafase si separano e poi migrano ai poli opposti. In anafase A nel mutante si muovono solo i
cromosomi femminili che in B arrivano ai poli opposti mentre quelli paterni stanno in mezzo perché il movimento dei
cromatidi dipende da proteine, cinetocore e microtubuli e nel controllo i cromosomi hanno una proteina che
riconosce il centromero, il cinetocore e quindi hanno un cinetocore formato. Nel mutante i cromosomi femminili
vanno ai poli e ce ne sono 4, e quindi alcuni cromatidi condensati male che non hanno cinetocori non si dividono e
quindi i cromosomi paterni non vanno ai lati opposti e si formano embrioni aneuploidi. Nel mutante ho un ponte di
cromatina perché i cromosomi vengono stirati e quindi lo sviluppo non va avanti.

Si dice maternal haploid perché alcuni embrioni arrivano alla fine come aploidi perché eliminano il corredo paterno
ma l’aploidia non è compatibile con la vita e quindi muoiono.

Wolbachia
Wolbachia è un batterio gram negativo che deve essere associato ad altre cellule per vivere, questa infetterebbe il
70% di insetti e artropodi. È una ricchezia che può portare a reazioni problematiche, ma se viene riconosciuta è
curabile. La ricchezia + diffusa è la Provazebia che interessa i vertebrati. Wolbachia interessa insetti, artropodi e
filarie e sta nelle cellule e si muove lungo i microtubuli. La Wolbachia può essere confusa con i mitocondri in sezione
e le proteine motrici ne determinano movimento e accumulo intorno ai microtubuli astrali perché si muovono dal +
al -. Quindi le wolbachie si muovono nel citoplasma e vanno nelle cellule, hanno effetti di:

 Incompatibilità citoplasmatica: processo che porta alla morte di un embrione se ho un determinato incrocio.
Questa incompatibilità riguarda Drosophila, zanzare, isopodi, libellule, imenotteri ecc. della stessa specie. Ci
sono popolazioni infette e altre sane e alcuni studi fanno vedere che la Wolbachia non diminuisce il numero di
individui nella popolazione, ma anzi li fa aumentare. Quindi ci sono popolazioni infette e altre sane, se si
incrociano maschi e femmine infetti nascono embrioni infetti e vivono, se incrocio femmine infette e maschi
sani nascono embrioni infetti perché wolbachia è un batterio portato dall’uovo. Se incrocio femmine sane e
maschi infetti muoiono tutti gli embrioni e questa è l’incompatibilità.
Ci sono studi fatti su 2 popolazioni di Drosophila siculans e non melanogaster, si prendono 2 popolazioni che stanno
da lati opposti di un fiume, la popolazione che sta nella città è detta DSU e l’altra DSR. La DSR è infetta, mentre la
DSU è non infetta. Se incrocio femmine sane e maschi sani nascono figli sani, se incrocio maschi infetti e femmine
infette nascono femmine infette, se incrocio maschio non infetto e femmina infetta nascono femmine infette. Se
incrocio maschio infetto e femmine sane muoiono tutti gli embrioni e quindi c’è’ incompatibilità citoplasmatica. Lo
spermio infetto porta qualcosa rilasciato dalla wolbachia che quando entra nel citoplasma dell’uovo sano questo
qualcosa determina la morte. Quando lo spermio entra nell’uovo che ha già wolbachia il fattore che porta lo spermio
viene annientato da wolbachia nell’ovocito. Se è vero che lo spermio infetto non ha nessuna azione quando arriva
nell’uovo della mosca infetta se incrocio mosche infette mi aspetto che sia così ma non è vero. Un altro ceppo infatti
fa vedere che se incrocio maschio infetto delle Hawaii e maschio infetto DSR muoiono tutti quindi si deve avere lo
stesso ceppo. Nell’incrocio tra maschio infetto e femmina sana si ha che all’inizio nel controllo, in prometafase, i
cromatidi femminili condensano e i maschili no. alla metafase nel controllo sono tutti condensati, mentre nell’altro si
condensa solo il femminile e non il maschile. I corredi sono separati e quindi ciò fa sì che si abbia l’anafase, corredo
femminile condensato e maschile no. Nell’incompatibile succede quello che accadeva nel maternal haploid, i
cromosomi femminili vanno ai poli opposti e i maschili stanno al centro o vanno da una parte sola e quindi si
formano embrioni aploidi. So che il corredo maschile non condensa perché so che il cromosoma X ha un punto
compatto di cromatina e quindi siccome ci sono solo gli X quello che è eliminato è il corredo paterno. Se io ho
l’incrocio incompatibile il maschio è infetto e i cromosomi paterni non condensano e quindi spesso stanno al centro
e sono eliminati o ridistribuiti in modo asimmetrico. L’eredità di wolbachia è trasmessa verticalmente ovvero tramite
l’uovo.
In una cisti di spermatociti alla seconda meiosi, colorando il DNA, si colorano anche i batteri che infettano la metà
delle cellule. Se ho incompatibilità citoplasmatica totale e il 50% delle cisti non sono infette, allora il 50% degli
spermi non sono infetti ma ho il 100% degli embrioni che muoiono perché non dipende dalla presenza del batterio,
ma da qualcosa che esso produce e si diffonde nelle cellule vicine. Il meccanismo cellulare che regola
l’incompatibilità è un ritardo della condensazione dei cromosomi paterni quindi un procariote regola la
condensazione di DNA nell’eucariote. Il qualcosa è un fattore diffusibile che passa da cellule infette a sane perché gli
spermatociti sono tutti collegati da ponti citoplasmatici e quindi il fattore può essere diffuso in tutte le cellule.

Quando lo spermio termina la maturazione c’è un’eliminazione massima del citoplasma e i batteri, quando avviene
questo processo di maturazione si elimina tutto il citoplasma in eccesso che va nel cestino posteriore dove si
raccolgono tutte le wolbachie e quindi lo spermio non ha wolbachie appunto ma solo qualcosa che hanno rilasciato.

Meccanismo di azione

Per vedere cosa rilascia wolbachia bisognerebbe allevarlo, ma è gram negativo e dovrebbe crescere dentro alle
cellule quindi non è possibile allervarle. Le ricchezie sono lipopolisaccaridi che portano alla morte cellulare e sono
metaboliti, perciò si dovrebbero cercare i fattori che rilasciano e non usano e che potrebbero interagire con la
condensazione del DNA. Queste sostanze potrebbero interagire con gli istoni, e quindi quando lo spermio entra nel
citoplasma dell’uovo la sostituzione è molto difficile. In uno studio l’idea era di prendere spermateche che sono
sacche in cui sono contenuti gli spermi nel momento in cui c’è l’incontro tra maschio e femmina, prendo le
spermateche di 2 ceppi, quelle con spermi infetti dall’incrocio incompatibile e quello con spermi sani. In un lavoro si
fa una corsa per vedere le proteine che sono contenute nei 2 tipi di spermateche e si vede che ci sono tante proteine
perché ci sono quelle che formano la spermateca, quelle del liquido che dovrebbero essere uguali nelle 2 tipologie,
quindi le differenze dovrebbero essere poche e dovrebbero corrispondere alla presunta sostanza. Si identifica poi
una proteina e si dice che lei sarebbe coinvolta nell’incompatibilità citoplasmatica.

Più tardi in un lavoro + recente, lo stesso gruppo isola un enzima CID-B che servirebbe per lo scambio tra
protammine e istoni, quindi se l’enzima viene variato lo scambio diventa + complesso. In un altro lavoro si afferma
una teoria per cui si identificano 2 geni Cif-A e Cif-B. il meccanismo di azione sarebbe: lo spermio infetto entra
nell’uovo sano, quando lo spermio matura rimangono cif-a e cif-b che formano un complesso e quando lo spermio
va nell’uovo non infetto il complesso viene rilasciato e nell’uovo, c’è proteasi che degrada cif-a. Quindi nell’uovo
sano ci sono queste proteasi che degradano cif-a, ma cif- b rimane libero e nel nucleo trova una proteina target e ci
si lega, così da formare il complesso cif-b e target che impedisce lo scambio protammina istoni e questo spiega
perché il corredo paterno rimane nella parte centrale del fuso. Quindi quando lo spermio infetto entra in un uovo
infetto con incrocio compatibile, lo spermio porta cif-a e cif- b entra nell’uovo con le wolbachie che producono cif-a e
cif-b e quindi quando le cif-a sono degradate, le cif-a sono nuovamente prodotte da wolbachia e quindi cif-a che
rimane si lega a cif-b che non dimerizza con il target e quindi il target rimane isolato e così avviene lo scambio tra
istoni e protammine.

Quindi l’incompatibilità è unidirezionale in quanto l’uovo sano non riesce a sostituire cif-a dello spermio che viene
degradato.
Dopo un po’ la condensazione del patrimonio paterno però avviene mentre secondo questo modello non avviene
mai.
La presenza di wolbachia determina l’incompatibilità citoplasmatica ma anche:

 Male killing: tutti gli embrioni maschili muoiono in mosche, lepidotteri e in una particolare Drosophila. In
questo processo se incrocio femmina infetta e maschio sano ottengo solo femmine e muoiono tutti i maschi.
Questo processo è mediato da wolbachia e si lega al rimodellamento della cromatina. Tutti i fusi sono uguali e
la condensazione dei cromosomi è uguale ovunque, mentre nell’incrocio tra femmina infetta e maschio sano si
hanno nuclei soli molti dei quali condensati e quindi la presenza di wolbachia porta a problemi di
compattazione della cromatina. Per la determinazione del sesso in Drosophila il gene che viene acceso nella
linea femminile è sex-lethal per cui ci sono gli anticorpi e quindi se tratto l’embrione con sex-lethal, uno è + e
uno - .

 Inversione del sesso: in alcuni gruppi di isopodi, la wolbachia porta ad una inversione del sesso, quindi se ho
femmina infetta e maschio sano in alcuni casi si inverte il sesso.

 Partenogenesi: in alcuni individui aplodiploidi come formiche, vespe e api c’è partenogenesi. Gli imenotteri
hanno già partenogenesi nei maschi che sono aploidi, mentre le femmine sono diploidi. Quindi in questo caso
si ha una partenogenesi particolare per cui nelle specie infette da wolbachia la partenogenesi porta a femmine
diploidi, ovvero il contrario di ciò che avviene tradizionalmente perché di solito la partenogenesi porta a
maschi aploidi. La partenogenesi di wolbachia è tipica di imenotteri parassitoidi che depongono le uova nelle
pupe di altri insetti.
Quindi…

Le filarie sono brutti nematodi in cui vivono le wolbachie, nei tessuti questi nematodi hanno wolbachia che è la
stessa degli artropodi. Le wolbachie sono simbionti di cui le filarie hanno necessità, quindi se elimino le wolbachie le
filarie muoiono quindi semplici antibiotici possono eliminare le wolbachie e far morire le filarie.

Il Dengue è un virus a RNA ed è portato dalla zanzara tigre ed è caratteristico di regioni sub-tropicali e può dare
febbre anche emorragica. Molti anni fa in Australia si sono accorti che le zanzare infette da Wolbachia non
trasmettevano il virus Dengue.
Il virus del Dengue entra nella cellula tramite recettori e il virus porta il suo RNA che va sul reticolo e trascrive le
proteine virali e nel reticolo il virus si assembla e ricoprendosi di membrana plasmatica esce dal RE e va nel cis Golgi
dove viene elaborato e dal Trans Golgi esce funzionante dalla cellula. Si pensa che Wolbachia possa limitare la
replicazione del virus interferendo con la produzione della membrana virale. Ciò che si vede è che la presenza di
wolbachia impedisce la replicazione e la trasmissione del virus.
Partenogenesi
C’è una partenogenesi naturale non indotta da Wolbachia ed è quel processo in cui l’uovo si sviluppa senza corredo
paterno ed è una forma di riproduzione per cui la femmina produce uova che si sviluppano senza fecondazione e sta
in pesci, anfibi, rettili ma non nei mammiferi. La partenogenesi può essere:

▪ Telitoca: nascono femmine

▪ Arrenotoca: si trova negli imenotteri e nascono maschi aploidi
▪ Deuterotoca: nascono sia maschi che femmine

Nella partenogenesi ci sono individui come gli afidi che producono 2 tipi di uova, durature per superare la stagione
invernale e sono fecondate e formano femmine diploidi, e poi ci sono uova partenogenetiche che originano maschi
aploidi. I vantaggi sono quelli di avere un’esplosione della popolazione quando c’è il cibo.

La partenogenesi richiede quindi lo sviluppo dell’uovo senza la fecondazione, ma allora se durante l’ovogenesi
l’ovocito perde centrioli e non ha centrioli funzionali, perché devono essere portati dallo spermio, come avviene la
partenogenesi?

Nella normale fecondazione si ha l’ovocito con fuso meiotico e non ha centrioli ma questi sono portati dallo spermio
e poi si duplicano e organizzano il fuso. Nella partenogenesi non ci sono centrioli ma il fuso si organizza grazie ai
centrioli. Si vede negli imenotteri che alla fine della meiosi sulla superficie dell’uovo compaiono tanti aster, circa
300/400, e poi alcune vanno a contattare il pronucleo femminile e poi si organizza il fuso e si passa dagli aster ai
centrioli e quindi in queste strutture ci sono centrioli che si formano su tutta la superficie dell’ovocito che è attivato
passando attraverso l’ovidutto. 2 o 3 aster a un certo punto si muovono verso il centro e affiancano il pronucleo
femminile e organizzano il primo fuso. Tutti gli aster in + spariscono ma non si sa come.

In Drosophila c’è una partenogenesi accidentale casuale in cui il ceppo è partenogenetico ma su 100 uova se ne
sviluppano 9 e quindi è casuale e allora la mosca produce tantissime uova così che si ha maggiore probabilità che
nascano femmine. In un altro ceppo della stessa specie però avviene fecondazione. Ci sono gli aster, che si
allungano, i microtubuli contattano il pronucleo femminile che si muove nei microtubuli e contatta il pronucleo
maschile.

Nel ceppo partenogenetico, l’ovocito non fecondato non muore, ma nella parte anteriore compaiono le stelle di
aster come negli imenotteri e alcune sono doppie. Alcune stelle contattano il pronucleo femminile e si forma il primo
fuso zigotico e l’embrione si sviluppa. Il processo è casuale perché il contatto degli aster con pronucleo è casuale e la
duplicazione è casuale. Le mosche quando nascono sono diploidi e quindi alla prima divisione ci deve essere
duplicazione del DNA senza separazione dei 2 nuclei. Le stellette a un certo punto sembra che si duplicano e
all’interno hanno centrioli e quindi quando si attivano si formano tanti centrioli all’improvviso. L’ovocito quindi
quando passa nell’ovidutto riprende la meiosi e assembla aster con centrioli e alcuni contattano il pronucleo e
organizzano il primo fuso zigotico. Nell’uovo quindi ci sono precursori per costruire i centrioli, ma questo richiede un
centriolo madre che non c’è perché non c’è un centriolo preesistente e quindi si assemblano ex novo e quindi l’uovo
ha tutte le possibilità di costruire centrioli e svilupparsi senza la necessità dello spermio e quindi l’uovo degli insetti è
partenogenetico di default, quindi potrebbe svilupparsi per partenogenesi ma alcuni controlli lo impediscono, ma
quando i controlli saltano, fa partenogenesi.
Afidi
Tra gli afidi ce ne sono pochi che depongono le uova, mentre la maggior parte sono vivipari e quindi depongono
piccoli afidi che si sviluppano negli ovarioli della madre. Quindi nonostante non ci sia l’attivazione dell’ovocito
nell’ovidutto si formano aster che vanno a formare il primo fuso zigotico e quindi determinano il primo passo della
segmentazione e quindi dello sviluppo. Ma non si sa come gli aster vengono eliminati.

La partenogenesi nei casi studiati che sono insetti, è legata al processo in cui i centrioli compaiono ex novo perché si
altera il controllo. Ma si può indurre la formazione di centrioli ex novo alterando la concentrazione di proteine legate
alla formazione di centrioli. Se faccio overesprimere Plk-4 si formano tutte le stellette che contengono centrioli e
quindi se altero la proteina che regola la duplicazione dei centrioli ottengo centrioli che nascono ex novo ma non si
sviluppa l’embrione.

Un altro esempio è che Plk-4 è richiamato da Asterless che è una proteina, e se io faccio overesprimere Asterless si
formano tanti centrioli ex novo. Quindi se ho overespressione di proteine legate al controllo di duplicazione dei
centrioli ho la formazione di centrioli ex novo. In queste uova però lo sviluppo neanche inizia.

CLEAVAGE

Dopo la fecondazione c’è il cleavage, ovvero il pronucleo maschile si fonde con quello femminile, si assembla il fuso
e inizia il cleavage.

Il cleavage è un processo in cui l’embrione si divide molte volte e man mano che l’embrione si divide le cellule
diventano sempre + piccole e questa è una grande differenza con la divisione delle cellule somatiche, perché un
controllo in fase G1 è la dimensione del citoplasma perché la cellula non entra in fase S se non ha determinate
dimensioni del citoplasma, quindi le 2 cellule figlie devono essere di dimensioni simili alla cellula madre che quindi
prima di dividersi deve aumentare di dimensioni. Nel cleavage invece i blastomeri che si formano sono sempre +
piccoli. La divisione continua e i blastomeri sono sempre + piccoli e nel caso + semplice formano la blastula cava
dove i blastomeri formano il contorno della cavità interna detta blastocele, e a questo si arriva con il cleavage.
Quindi il cleavage è una successione rapida di divisioni ad eccezione che nel topo e nell’uomo. Il numero delle cellule
aumenta rapidamente nel cleavage a cui segue la gastrulazione dove aumenta il numero ma in maniera – veloce. La
massa dell’embrione non cresce durante la divisione e quindi i blastomeri sono + piccoli. Il processo di mitosi è molto
rapido in confronto al tempo che la cellula rimane in fase G1 e G2, nell’embrione succede che G1 e G2 scompaiono e
quindi rimane fase M e sintesi del DNA e quindi le divisioni sono molto rapide. Nel topo e nell’uomo tra la prima e la
seconda divisione passa 1 giorno perché l’embrione ha la fase G1 e quindi il primo cleavage impiega + tempo.

Se non ho fasi G1 e G2 non posso avere la trascrizione del genoma, la traduzione e sintesi proteica, quindi in quasi
tutti gli organismi la trascrizione del genoma avviene solo dopo completata la segmentazione. Nel topo la
trascrizione di alcuni geni avviene alla seconda divisione in cui c’è fase G1 quindi ho cleavage lento perché c’è la G1
ma c’è trascrizione di alcuni geni.

La divisione dei blastomeri avviene allo stesso modo delle cellule somatiche cioè si separano per la presenza di un
anello contrattile di actina e miosina e ciò porta al restringimento della zona che poi porta alla separazione delle 2
cellule. Quando 2 cellule si dividono si forma il mid body in cui avviene la separazione delle cellule in 1 dei 2
restringimenti grazie all’ESCRT.

L’anello contrattile è regolato dai microfilamenti e dalla miosina citoplasmatica. L’anello contrattile porta alla
formazione del mid body ma non alla separazione delle cellule che è data invece dall’ESCRT. Nell’assemblaggio
dell’anello contrattile è importante la miosina 2 citoplasmatica, infatti se non c’è questa, la cellula non si divide e si
forma una struttura con + nuclei.

Alla base delle divisioni delle cellule c’è MPF che regola la prima divisione, la seconda ecc. l’MPF è la chinasi legata
alla ciclina. La miosina ha una catena leggera che ha un sito inibitorio e uno di attivazione che è acceso e funzionante
e quindi è sempre presente ma fino alla metafase l’MPF fosforila il sito di inibizione che quindi non funziona e la
catena leggera della miosina è inibita fino alla metafase in cui si attiva APC che lega l’ubiquitina alla molecola target
che fa riformare il nucleo, ecc. e viene ubiquitinata la ciclina B che va nel proteasoma e viene degradata e la chinasi
da sola non funziona + e quindi il sito di inibizione della catena della miosina 2 non è fosforilato e quindi la miosina è
attiva e interagisce con i microfilamenti e si forma l’anello contrattile e la strozzatura.

Tipologia di uova e cleavage

Non tutte le uova sono uguali, quindi il fatto che ho l’uovo che si divide in blastomeri sempre + piccoli non vale per
tutte le uova perché alcune sono molto piccole e altre grandi in quanto le grandi sono ricche di tuorlo che non è
facile da dividere. L’anfiosso ha un uovo piccolo con un cleavage che porta ad una blastula, poi l’uovo della rana ha
segmentazione totale, l’uovo del pollo è enorme perché il nucleo sta in una struttura discoidale ma il resto è tuorlo.

Ci saranno tipi diversi di cleavage in base alla quantità di tuorlo e sono:

 Oloblastico: completo e quindi tutto l’uovo si divide ed è tipico di uova piccole con poco tuorlo e sono uova
isoleticiche. Le uova mesolecitiche hanno tuorlo e sono degli anfibi, hanno una parte gialla che è il polo
vegetativo e quella + scura che è animale e non ha tuorlo, tutto il resto si. Queste uova con + tuorlo hanno
cleavage diverso. L’uovo della rana fecondato fa cleavage che inizia nella parte pigmentata e il solco si
approfonda ma quando arriva nel tuorlo rallenta e parte uno perpendicolare al primo e poi arrivano in fondo ma
nel frattempo ne partono altri quindi l’emisfero animale con solo citoplasma si divide + velocemente e si
formano micromeri, mentre la parte con tuorlo si divide + lentamente. Quindi il blastocele non è nella pallina
cava, ma qui il blastocele sta in maniera eccentrica nel polo animale e questo condiziona la gastrulazione. Ci sono
anche uova a segmentazione spirale che hanno poco tuorlo e fanno parte di anellidi, molluschi e vermi piatti. In
mammiferi e nematodi hanno segmentazione rotazionale e la segmentazione è totale.
 Meroblastico: lo fanno le uova ricche di tuorlo dei pesci, degli uccelli e degli insetti. Le uova con tanto tuorlo
possono avere un cleavage solo da una parte dell’uovo e si chiamano uova telolecitiche in cui il tuorlo sta tutto
in una regione. Quindi si ha la prima divisione in un senso e la seconda nel senso opposto, ma le prime divisioni
sono incomplete perché i blastomeri sono uniti al tuorlo e si dividono fino a che non si isolano al polo dell’uovo
perché di la c’è tutto il tuorlo che il pesce usa per la crescita. Le meroblastiche centrolecitiche hanno tuorlo
all’interno e nella parte periferica sottile c’è solo citoplasma quindi la segmentazione avviene all’interno e poi in
superficie.

La disposizione del fuso mitotico influenza la formazione dei blastomeri e la loro forma. L’orientamento di un fuso in
meiosi è perpendicolare alla superficie e quindi il piano di divisione fa in modo di dividere le cellule in maniera
asimmetrica, se il fuso è parallelo e asimmetrico rispetto al centro ho la formazione di 2 blastomeri che non sono
completamente separati ma il loro citoplasma è in comunicazione e quindi si forma un sincizio e ciò si ha in uova
ricche di tuorlo.

Il posizionamento del fuso è quindi importante perché in un uovo con poco tuorlo, il fuso è disposto in modo tale che
il solco tagli in 2 lo zigote iniziale e poi il fuso rimane parallelo e quindi il piano divide i 2 blastomeri in 4. Il fuso poi si
gira di 90° e il successivo piano di divisione è equatoriale, quindi i primi 2 sono meridiani e il terzo equatoriale e si
formano 8 blastomeri con fuso orientato diversamente perché i blastomeri alla successiva divisione, quelli superiori
si dividono per formare cellule di uguali dimensioni, mentre quelli inferiori formano blastomeri + grandi e altri +
piccoli perché il fuso va in direzione obliqua. Quindi ho 3 tipi di blastomeri:
1) Grandi nella parte vegetativa
2) Micromeri piccoli
3) Mesomeri medi
La segmentazione va avanti e si forma la blastula cava con blastocele.

Si hanno 3 tipi di uovo in base al tuorlo:

1. Isolecitiche poco tuorlo

2. Mesolecitiche medio

3. Telolecitiche tanto tuorlo

La segmentazione nelle prime 2 è totale e quindi la quantità di tuorlo non impedisce la segmentazione mentre le
telolecitiche hanno segmentazione parziale.
Uova isolecitiche

Le uova isolecitiche hanno poco tuorlo e quindi si dividono completamente. Sulla base della quantità di tuorlo quindi
distinguo modelli di cleavage, queste uova isolecitiche possono avere segmentazione:

 Radiale: una stella di mare è un esempio e ha blastomeri fino alla fine della segmentazione in cui si forma la
blastula con parete di blastomeri. Quindi qui la blastula è una palla cava vuota con parete fatta da blastomeri e
all’interno c’è la cavità che è il blastocele. Durante il cleavage non c’è crescita delle cellule, e infatti le
dimensioni dell’ovocito all’inizio e quelle della blastula sono uguali e ciò dimostra che man mano che le cellule
si dividono sono sempre + piccole perché non ci sono le fasi GAP. Il cleavage radiale implica la presenza di piani
di divisione ordinati e messi a 90° l’uno con l’altro. Il piano iniziale è meridiano e taglia lo zigote in 2, poi ce n’è
un altro meridiano che taglia i blastomeri in 4 e poi il fuso ruota di 90° e quindi il piano sarà equatoriale e si
formano 8 cellule e si riconosce una metà animale e una vegetativa perché i nuclei della regione vegetativa
hanno informazioni diverse dal polo animale. La divisione continua fino a formare appunto la blastula cava
tipica di uova piccole con poco tuorlo. Dopo la terza divisione e quindi 8 blastomeri, quelli nella parte
vegetativa si dividono in modo tale che 1 rimane grande e l’altro + piccolo con macromeri e micromeri perché
il fuso appunto va in direzione obliqua e quindi la divisione implica una ripartizione diversa del citoplasma. Dal
basso infatti nella struttura a 8 si vedono fusi obliqui e questo comporta il fatto che si abbia una ripartizione
asimmetrica del citoplasma e quindi si formano 4 cellule grandi e 4 piccole.
Quando ho la formazione dell’involucro di fecondazione nel momento in cui arriva lo spermio che contatta
l’uovo e protegge la polispermia, l’ultima componente secreta dai granuli corticali è la ialina che si mette a
contatto con la membrana dell’uovo. Il cleavage avviene all’interno dell’involucro che protegge l’embrione e si
forma la blastula con cavità interna. Quindi la segmentazione radiale porta alla formazione della blastula cava
 Spirale: anche questa sta nelle uova con poco tuorlo e non da origine a blastula cava ma ad una struttura
compatta. All’inizio si ha lo zigote che si divide con piano meridiano e si formano 4 blastomeri e ora il fuso che
si orienta a 45° e quindi ho 1 cellula che si forma in modo sfalsato rispetto a quelle inferiori e questo
orientamento persiste nelle segmentazioni successive e quindi dall’alto di ha una specie di spirale. È tipica dei
Molluschi e allo stadio di 8 blastomeri si nota che i blastomeri superiori stanno nel punto di contatto dei
blastomeri inferiori, poi la segmentazione continua e si forma la spirale.
Quindi nella radiale i blastomeri sopra stanno in asse con quelli sotto, mentre nella spirale si posizionano nel punto
di attaccatura e quindi è come se ruotassero, quindi la prima fila sarà disposta come la terza e la seconda come la
quarta e così via.

Nella Limnea che è una chiocciola c’è l’apertura destrorsa o sinistrorsa geneticamente determinata e l’orientamento
è legato alle prime divisioni, ovvero dall’orientamento del fuso alle prime divisione che può andare in senso
destrorso o sinistrorso.

La segmentazione radiale è tipica di Echinodermi e dei Cordati, mentre quella spirale si ha nei Protostomi con gli
Spiralia che sono Molluschi, Anellidi e Platelminti.

Il C. elegans ha un processo di sviluppo veloce così come il cleavage e l’uovo è piccolo che però ha un tipo di
segmentazione particolare, essendo piccolo mi aspetterei una segmentazione radiale, invece si ha segmentazione
rotazionale che è una specie di segmentazione radiale variata. Ho i 2 pronuclei che si formano e poi si ha la divisione
e formazione delle cellule. Questa segmentazione consiste nel fatto che ho orientamento diverso tra i 2 fusi che si
formano alla 2° divisione. Lo zigote si divide 1 volta e si formano 2 blastomeri, nella segmentazione radiale mi
aspetterei un solco che mi divide in 4 le 2 cellule, ma osservo che i poli dei 2 fusi sono orientati in modo strano, il
polo del fuso del blastomero di sx ha già organizzato il fuso, mentre nel blastomero di dx non è ancora successo.
Quello di dx si dispone perpendicolarmente a quello di sx e quindi a sx già si forma ma a dx siamo indietro perché gli
aster sono migrati e si sono spostati di 90° e ciò corrisponde alla formazione nel blastomero di sx un solco
equatoriale e un solco di dx meridiano e quindi 2 solchi perpendicolari e ciò definisce una segmentazione rotazionale
perché il fuso ha ruotato. Il blastomero di sx si divide prima dell’altro che ancora deve organizzare il fuso e ciò
comporta la formazione di blastomeri dispari mentre di solito sono pari. Ho uno stadio con blastomeri dispari e ciò è
particolare e si ritrova nei mammiferi come il topo, l’uomo che hanno la stessa segmentazione di C. elegans.
La rotazione avviene perché ad un estremo della cellula ci sono delle proteine localizzate che catturano microtubuli
astrali. Sulla superficie del blastomero in regione equatoriale ci sono proteine che si trovano al di sotto della
superficie cellulare nella parte equatoriale e fanno da ancora per i microtubuli astrali che interagiscono con queste
proteine grazie ad una proteina motrice che è la dineina che si muove dal + al – e allora ancorata alla regione c’è
dineina che tende ad andare da + a – ma non può muoversi perché è ancorata alla membrana e quindi succede che il
polo della cellula va verso la regione e quindi è come se ci fosse una calamita che tira questi. Questo spiega come
avviene la rotazione, se le proteine stanno in una determinata regione ho interazione con i microtubuli e ciò fa sì che
ilo fuso ruoti perché catturato tramite la dineina citoplasmatica e quindi ruota fino a quella posizione che è
perpendicolare all’asse longitudinale dell’altro blastomero quindi avrò un blastomero che si divide un po’ prima e
uno con ritardo perché il fuso deve ruotare, organizzarsi e poi si divide e quindi all’inizio ho un numero dispari di
blastomeri.

Uova mesolecitiche
L’uovo degli anfibi ha diversa densità, c’è una parte detta del polo animale con pigmento e quella del polo vegetativo
gialla perché ha tuorlo e quindi ho un uovo in una massa gelatinosa perché deposte in acqua. La parte scura ha
citoplasma, poco tuorlo e nucleo, mentre la parte opposta contiene tuorlo. Questo uovo deve segmentare. Arriva lo
spermio che contatta l’uovo e ora la parte pigmentata si sposta e lo spermio contatta l’uovo con angolo di 30°
rispetto alla regione equatoriale. Quando lo spermio entra nell’uovo si vede che la regione pigmentata si muove in
senso antiorario e scopre uno spicchio di colore diverso che è uno spicchio che misura un angolo di 30° ed è detto
semiluna grigia perché ho la regione pigmentata, quella gialla e quando il pigmento si sposta rimane una struttura
meno densa. Il pigmento corticale del polo animale si sposta di 30° ma non tutto il pigmento si sposta, in parte sta
fermo e quindi vedo una colorazione intermedia tra le 2 parti e quindi vedo la semiluna grigia.
Meccanicamente la rotazione avviene quando entra lo spermio che porta i centrioli che organizzano un aster che
contatta con i suoi microtubuli la regione e grazie a proteine motrici fanno spostare granuli di pigmento di 30°.

Quando avviene la prima divisione del primo cleavage avviene in modo tale che la semiluna grigia sia divisa in modo
equo tra i 2 blastomeri e se li separo ottengo nella rana 2 girini vitali. Ma se io induco un altro tipo di cleavage in
modo che lo zigote si suddiviso in modo tale che i 2 blastomeri contengano 1 la semiluna e 1 no, il blastomero che
contiene la semiluna forma il girino, mentre l’altro si divide e da un ammasso di cellule informe quindi la semiluna
contiene informazioni fondamentali per lo sviluppo.

Cleavage Xenopus

L’uovo è ricco di vitello nella parte vegetativa e ne ha poco nel polo animale. Il nucleo e quindi i pronuclei stanno
nella regione in cui c’è citoplasma e quindi quando avviene la divisione si deve tener conto del solco di divisione. Il
primo solco procede velocemente dove c’è citoplasma ma quando incontra il tuorlo nel vegetativo rallenta perché
c’è tanto tuorlo. questo è un processo graduale, il solco va velocemente dove c’è solo citoplasma e poi rallenta e
questo comporta che quando il solco sta attraversando il polo vegetativo e quindi si trova il tuorlo, compare il 2°
solco di divisione al polo animale che è perpendicolare al 1°. Quindi io ho il 1° ma anche il 2° che si forma. Nessuno
dei 2 solchi ha completamente suddiviso l’uovo. Quindi poi si hanno altri tuorli e quindi nella regione animale si
formano cellule + piccole perché si dividono + facilmente mentre nel polo vegetativo sono + grandi perché si
dividono + difficilmente.
Alla fine del cleavage ho una blastula con blastocele disallineato e quindi asimmetrico perché sta solo nel polo
animale, ma il polo vegetativo non ha blastocele. Il blastocele è quindi una cavità non uniforme ma spostata nel polo
animale quindi le uova sono mesolecitiche e hanno cleavage completo ma la blastula è peculiare. Il blastocele è
circondato da blastocele pluristratificato con cellule + numerose nel polo vegetativo e grandi.

Le cellule del polo animale sono unite da giunzioni tight strette che impediscono il passaggio di liquido nello spazio
intracellulare come se le cellule avessero membrane fuse tra loro e quindi non passa liquido da esterno a interno e
infatti le blastule stanno in acqua. Il liquido però deve entrare nella cavità del blastocele ma in modo controllato.
L’acqua entra dall’esterno nelle cellule del blastoderma quindi blastomeri e viene fatta entrare nel blastocele grazie
a canali Na che viene pompato all’interno del blastocele e l’acqua entra secondo gradiente.

Uova telolecitiche

Le uova telolecitiche hanno segmentazione particolare. Lo Zibrafish è ricco di tuorlo e il nucleo sta all’estremità
dell’uovo perché l’uovo è pieno di tuorlo tranne un’area con nucleo. Il piano di cleavage non divide l’uovo in 2 ma
procede e si arresta dove contatta il tuorlo quindi le 2 cellule sono in contatto tramite la parte basale, poi c’è un altro
piano di divisione e si arresta anch’esso. La prima divisione taglia le cellule in 2 e il piano si arresta e le cellule
comunicano con il tuorlo e poi intervengono piani orizzontali che cellularizzano le strutture e la blastula quando si
forma non è cava ma un insieme di cellule che sta sopra la massa del tuorlo. Alla fine si ottiene una massa di cellule
che sovrastano la regione del tuorlo che non viene toccata dai solchi. Quando il pesce dopo la gastrulazione nasce si
porta dietro in un sacchetto, la parte di tuorlo che formava la parte vegetativa perché gli serve per svilupparsi
successivamente. Una segmentazione simile ce l’ha il pollo.

Pollo

Nel pollo l’uovo è ricco di tuorlo tranne una piccola regione. L’uovo del pollo segmenta ed è ricco di tuorlo e ha un
cleavage discoidale che somiglia a ciò che avviene nei pesci perché avviene a livello del blastodisco che sarebbe il
citoplasma con pronucleo femminile.

Il solco di divisione non suddivide l’uovo ma si forma sul blastodisco un taglio e poi altri tagli e poi se guardo le
cellule in sezione trasversale sono in formazione perché comunicano tramite la parte basale e poi c’è un solco
trasversale basale che separa le cellule dal tuorlo. si avranno solchi orizzontali e quindi tante cellule che formano uno
strato che sovrasta una cavità perché quando iniziano a dividersi sotto si forma la cavità subgerminale che separa le
cellule del blastodisco dal tuorlo. Con la prima fase di segmentazione si formano tante cellule e si forma l’epiblasto
che sovrasta la cavità subgerminale che si forma quando le cellule cellularizzano grazie ad accumulo di liquido.
Dall’alto, la struttura ha un disco chiaro che corrisponde all’area pellucida e le cellule si trovano in corrispondenza di
una cavità e trovo struttura discoidale che si chiama area pellucida intorno alla quale ho cellule dell’epiblasto che
stanno in corrispondenza alla regione del tuorlo. dall’alto ho un disco scuro che circonda l’area chiara quindi
l’epiblasto sovrasta la cavità subgerminale e sono traslucide mentre le periferiche sono scure e quindi ho una
regione grande traslucida circondata da anello di cellule scure che formano area opaca. Nella parte posteriore della
struttura discoidale c’è accumulo maggiore di cellule e parte di queste proliferano nella cavità subgerminale
andando nella parte anteriore e quindi tante cellule che stanno su un piano vanno in avanti e quelle che staccano
dall’epiblasto si sommano a queste cellule che migrano. Mentre queste cellule migrano proliferano ed altre
dell’epiblasto ci si uniscono e si forma un piano. Poi queste cellule formano un piano continuo che divide la cavità
subgerminale in 2 e queste cellule dell’ipoblasto formano questo piano e hanno 2 componenti, quelle che vanno
dalla parte posteriore a quella anteriore e quelle dell’epiblasto. Si forma un piano che separa lo spazio
subgerminativo in 2 quello compreso tra epiblasto e ipoblasto forma il blastocele. Il blastocele è fatto quindi da
cellule di ipoblasto ed epiblasto. Quelle dell’epiblasto formeranno poi l’ectoderma.

Sotto rimane il residuo della cavità subgerminale.

Drosophila

Il moscerino ha cleavage che dura 3 ore ed è una segmentazione particolare perché l’uovo è piccolo ma ha tanto
tuorlo quindi non segmenta completamente ma ha segmentazione superficiale ovvero l’uovo è estremamente ricco
di tuorlo e quindi nell’uovo c’è tanto tuorlo mentre il citoplasma sta nella parte periferica. All’inizio il nucleo sta
all’interno, si divide e i nuclei migrano in superficie nell’area citoplasmatica e i nuclei non sono separati da
membrane quindi c’è un sincizio e alla fine si forma la membrana cellulare.

Ci sono 13 divisioni successive e l’uovo è molto ricco di tuorlo, la parte citoplasmatica è periferica. Inizialmente i
nuclei stanno all’interno dell’uovo e quindi non popolano la periferia e non sono circondati da membrane. Alla 9°
divisione alcuni nuclei migrano al polo posteriore e sono quelli che cellularizzano per primi e sono i precursori della
linea germinale. Alla 10° migrano anche nuclei che stavano all’interno ma alcuni rimangono all’interno e formano i
vitellofagi che sono i nuclei usati per la digestione del tuorlo nello sviluppo e formano l’epitelio intestinale. I nuclei in
superficie vanno incontro a 3 divisioni successive e c’è sempre sincizio perché i nuclei non sono separati. Alla 13°
divisione avviene la cellularizzazione.

Quando ho tutti i nuclei in superficie si devono dividere e questa è supportata da fusi mitotici e se sono troppo vicini
ho collisioni. Se ho una fusione ho fusi anomali e l’embrione muore, ma nonostante io abbia il sincizio non c’è
fusione perché c’è un guscio di microfilamenti che circonda i fusi mitotici. I fusi non si contattano tra loro perché
stanno all’interno di strutture fatte da microfilamenti. Quindi sembra che i filamenti impediscono l’interazione. Se io
però altero i microfilamenti e li distruggo, ho fusi che si toccano e interagiscono e questo implica che la presenza di
microfilamenti eviti le collisioni e faccia sviluppare l’embrione. Questa condizione sinciziale persiste fino alla 13°
divisione.

Alla 13° divisione i nuclei sono in un sincizio e a un certo punto contemporaneamente in tutti i nuclei si ha
introflessione della membrana plasmatica che separa i nuclei che si allungano. Questo perché i nuclei sono circondati
da un manicotto di microtubuli in cui si allungano. L’introflessione va dalla superfice apicale a quella basale. C’è un
processo acto-miosinico che fa prolungare introflessioni fino all’interno nel tuorlo. è come se ci fosse un anello
intorno al nucleo che è actomiosinico e scorre dalla parte apicale verso la base e quindi la membrana si può
introflettere, aumenta le sue dimensioni e l’anello scorre verso la parte basale in cui si chiude e separa
completamente i nuclei tra loro. Se io prendo mutanti in cui gli anelli non ci sono la cellularizzazione è incompleta.
Confronto tra cleavage del pollo, rettili, pesci e Drosophila
Sono tutti incompleti, nel pollo si formano i solchi di divisione e inizialmente il cleavage è incompleto come in
Drosophila che ha nuclei nel sincizio fino alla 13° divisione. In Drosophila dopo la 13° divisione inizia la
cellularizzazione perché se guardiamo un mutante, si parte dal presupposto che il timing della cellularizzazione sia
legato a rapporto tra nucleo e citoplasma vicino. Quando ci sono 6000 nuclei e citoplasma dell’uovo inizia la
cellularizzazione.
Ciò lo dimostro con mutante mathernal haploid che ha embrioni che muoiono ma alcuni arrivano in gastrulazione
aploidi e quindi se considero il rapporto i nuclei dell’embrione normale sono diploidi, ma nel mutante alla 13°
divisione ho 6000 nuclei aploidi quindi è come se il rapporto fosse dimezzato quindi mi servono 12000 uova aploidi e
quindi una divisione in +. Infatti il mutante cellularizza dopo 14 divisioni perché così c’è il corretto rapporto. Ciò
dimostra che il sensore che da il via alla cellularizzazione è il preciso rapporto tra citoplasma e nuclei.

CLEAVAGE NEI MAMMIFERI

Nell’uomo lo spermio porta i centrioli, mentre il topo è un’eccezione. Quindi alla fecondazione i 2 pronuclei si
fondono poi alla prima divisione lo zigote si divide in 2 cellule, poi 4 e così via fino a formare la morula e poi la
blastocisti per cavitazione. La blastocisti è fatta da uno strato di cellule esterne, una parete di cellule del trofoblasto
e la massa cellulare interna che sono le staminali embrionali da cui derivano tutti i tipi cellulari che caratterizzano
l’individuo. La blastocisti ha intorno la zona pellucida, la cavità, la massa cellulare interna e le cellule del trofoblasto.

Negli organismi visti il processo di cleavage che porta alla blastula è molto veloce, mentre nei mammiferi la
blastocisti si forma in 4/5 giorni e quindi il processo è molto lento. Le caratteristiche del cleavage nei mammiferi
sono:

 È lento perché la prima divisione avviene dopo circa 1 giorno, cioè lo zigote si divide in 2 blastomeri dopo circa
1 giorno. La mitosi è caratterizzata da una lunga interfase e una piccola finestra di tempo con la divisione della
cellula. La lunghezza dell’interfase è determinata dalla presenza di G1 e G2 in cui avviene la trascrizione del
genoma e la sintesi proteica e ciò è necessario perché la cellula quando si deve dividere deve sottostare ai ceck
point che individuano anche la dimensione della cellula e quindi il controllo definisce il punto in cui la cellula
deve crescere con trascrizione e sintesi. Le divisioni embrionali in tutti gli organismi tranne nei mammiferi,
sono veloci perché non ci sono G1 e G2. Nell’uomo c’è G1 e questo rallenta molto il processo. Ciò comporta un
altro aspetto, in mitosi c’è trascrizione dei geni in G1 e G2 e anche nel topo e uomo c’è G2 e infatti nel topo la
trascrizione avviene allo stadio di 2 cellule e ciò è un’eccezione perché durante lo sviluppo embrionale si dice
che la trascrizione non avviene perché G1 e G2 sono assenti.
 Cleavage di tipo rotazionale come nel C. elegans e anche qui è molto simile. La conseguenza di questo cleavage
è che le prime divisioni sono asincrone e ho blastomeri dispari
  Compattazione: è un processo che è controllato in modo molto preciso

Divisione rotazionale

La divisione rotazionale è tipica dei mammiferi e si trova anche nel C. elegans. La differenza tra cleavage radiale e
rotazionale è che nel radiale il piano meridiano taglia lo zigote in 2 e poi un altro meridiano che taglia in 4 blastomeri
e i 2 piani sono perpendicolari. Nel rotazionale ho un piano che taglia lo zigote in 2 blastomeri poi 1 piano ruota e
diventa equatoriale e siccome questa rotazione impiega tempo a un certo punto avrò 3 blastomeri. Nel topo quindi
nei primi stadi ho numeri dispari.

La compattazione
Le cellule allo stadio di 8 blastomeri sono a contatto tra loro ma in modo minimo, mentre la compattazione nel topo
avviene allo stadio di 8 cellule. L’embrione prima della compattazione ha cellule con sporgenze che sono microvilli e
la superficie di contatto è limitata. Dopo la compattazione ci sono ancora 8 cellule ma sono compattate e
praticamente irriconoscibili in quanto è aumentata la superficie di contatto e non hanno + forma sferica.
La superficie di contatto aumenta perché si formano giunzioni. I primi complessi giunzionali che determinano una
prima adesione sono le giunzioni aderenti che sono modulate da proteine di adesione dette E-caderine che vengono
espresse allo stadio di 8 cellule e sono proteine Ca dipendenti che vengono espresse dai blastomeri e caderine
opposte si contattano tra loro e le cellule stabiliscono un’adesione.

Poi + all’interno si formano giunzioni GAP e TIGHT quindi le cellule prima esprimono le caderine che fanno
aumentare la superficie di contatto tra cellule e poi si formano le giunzioni GAP in basso e TIGHT in alto nella parte
apicale e sono strette che non fanno passare nulla, mentre le GAP stanno in basso e sono fatte da proteine che
costruiscono dei canali piccoli che servono per la comunicazione tra cellule.

L’adesione quindi avviene per l’espressione di caderine allo stadio di 8 cellule e ciò si verifica inibendo l’espressione
delle caderine, o interferisco con anticorpi anti-Ecaderine noto che, nell’embrione ad 8 cellule non compattato ha un
controllo dove se è wild type si esprimono le caderine e le cellule si compattano, mentre nel mutante le caderine
sono inibite e l’embrione non compatta. Questo esperimento dice che è sufficiente alterare le caderine per far sì che
non avvenga la compattazione.
Dopo la compattazione si forma la blastocisti con trofoectoderma e massa cellulare interna.
Il processo di compattazione è importante perché allo stadio di 8 cellule non compattate e compattate non c’è
grande differenza ma quando si passa a 16, 32 cellule si identificano 2 gruppi di cellule:

1. Periferiche
2. Centrali
Le cellule periferiche sono quelle che formeranno il trofoblasto che origina la placenta e quindi annessi
extraembrionali, mentre le cellule centrali formano la massa cellulare interna.

Cavità interna

All’inizio ho le cellule che si dividono ma la massa è compatta e si ha la morula che appunto non è cava e il blastocele
che contiene liquido si forma perché appunto si accumula liquido tra le cellule e questo va a determinare il
blastocele e quindi la segregazione della massa cellulare interna ad un polo. L’ingresso del liquido nel topo avviene in
modo simile che nell’anfibio, questi stanno nell’amnion che ha liquido che entra tra le cellule della blastocisti iniziale
e tramite pompe Na si crea gradiente e quindi l’acqua entra all’interno secondo gradiente e va nella cavità del
blastocele. Anche qua le cellule nella parte apicale hanno giunzioni tight che impediscono il traffico di liquido perché
deve entrare solo una certa quantità di liquido. Quindi entra acqua che finisce nella cavità del blastocele che si
allarga.
Lo sviluppo dei mammiferi segue un processo misto, ovvero la segmentazione è rotazionale, si esprimono geni
zigotici prima della fine del cleavage, la blastocisti è particolare. Le cellule periferiche formano il trofoectoderma che
poi nell’embrione si trasforma in placenta mentre le cellule della massa cellulare interna formano l’embrione e il
sacco del tuorlo. All’inizio ho 2 gruppi di cellule diverse come già detto e la differenza sta nella localizzazione. Le
cellule della massa interna formano ectoderma, mesoderma ed endoderma, mentre quelle del trofoblasto formano il
sacco del tuorlo e il corion. Le cellule + interne sanno che devono diventare della massa cellulare interna secondo dei
segnali.

Nell’embrione a 8 cellule si vede che le cellule sono polarizzate, ovvero hanno un margine, una parte apicale e una
basale, la parte apicale guarda all’esterno e questa regione apicale rimane quando le cellule si dividono. Ad 8 cellule
tutte le cellule hanno regione apicale e basale perché tutte guardano all’esterno, ma quando si dividono se ne
formano alcune isolate nella parte interna e alcune che guardano all’esterno. Quindi le cellule periferiche hanno
regione apicale e basale, mentre quelle interne non hanno la parte apicale e non sono polarizzate e quindi formano
la massa cellulare interna.

Dagli studi fatti nel C. elegans si è scoperto un complesso apicale di almeno 3 componenti, cioè 3 proteine PAR3,
PAR6 e fosfochinasi che caratterizzano il dominio apicale. Queste 3 proteine sono state ritrovate anche in Drosophila
dove sono importanti perché nei neuroblasti quando si dividono è fondamentale per l’orientamento ma si sono
trovate anche nella massa di cellule compattate. Nel topo si segregano 2 linee cellulari, 1 esterna con complesso
apicale e 1 interna senza complesso apicale. Lateralmente sono presenti le caderine perché le cellule si contattano
ma apicalmente c’è il complesso che indica la regione apicale e quindi indica polarizzazione quindi queste cellule
sono polarizzate.

Le cellule si dividono secondo un piano orizzontale e quindi il fuso è perpendicolare perché il complesso apicale ha la
capacità di catturare i microtubuli astrali e quindi può orientare il fuso. Questo piano di cleavage trasversale porta a
una divisione asimmetrica e quindi a 2 cellule diverse dove 1 ha il complesso apicale e l’altra no. Le cellule
polarizzate formano il trofoectoderma quelle non polarizzate la massa cellulare interna.
La prima informazione che si scopre è l’espressione del gene Cdx2 che viene trascritto solo in cellule polarizzate,
mentre in quelle non polarizzate della massa cellulare interna il gene è spento. Il controllo dell’espressione del gene
è data da 2 teorie principali: Le cellule + interne che avevano + punti di contatto tra loro e quindi + caderine
spegnevano Cdx2, mentre quelle polarizzate accendevano quel gene.

La polarizzazione determina lo spegnimento di un gene Hippo. Nelle cellule apicali e quindi con polarità HIPPO è
spento mentre in quelle interne è acceso. Sia le cellule interne che esterne sono legate da giunzioni aderenti. Le
caderine hanno un dominio citoplasmatico con cui interagiscono con le Catenina in particolare alfa e beta. La beta fa
da ponte tra caderine e microfilamenti. Ci sono anche la alfa catenina che interagiscono con Merlin. Il complesso
apicale serve anche per stabilizzare microfilamenti apicali a cui è legata Amot e quando è legata Hippo è spento.
Nella regione + interna le cellule non sono polarizzate, non hanno microfilamenti e quindi Amot si sposta, si lega a
Merlin che fosforila Amot che così fa accendere Hippo.

Se Hippo è spento si attiva nel nucleo il gene Yap la cui attivazione è responsabile della formazione del
trofoectoderma. Nelle cellule non polarizzate Amot invece si lega a Merlin che fosforila Amot che si lega alla
proteina Lats e ciò porta alla fosforilazione di Yap che sta nel citoplasma e questo non può entrare nel nucleo e
quindi Hippo viene trascritto. Nelle cellule apicali Yap entra nel nucleo e spegne Hippo.
Quando Yap entra nel nucleo si lega ad una proteina Tead4 e queste fanno da fattori di trascrizione per geni specifici
del trofoectoderma come Cdx2, mentre se YAP non entra vengono trascritti i geni tipici della massa cellulare interna
come Oct3/4, Nanog, Sox2 ecc. I fattori di trascrizione sono proteine che controllano altri geni.

Anche nella massa cellulare interna ci sono 2 classi di cellule con destini diversi, ce ne sono alcune che danno origine
all’embrione vero es proprio e altre originano il sacco del tuorlo e quindi anche nella massa cellulare interna
inizialmente ci sono 2 tipi di cellule con destini diversi.
Le cellule della massa cellulare interna danno origine all’epiblasto da cui derivano tutti i foglietti embrionali, mentre
le cellule della massa a contatto con la cavità danno origine all’ipoblasto che forma il sacco del tuorlo che è un
annesso embrionale. Io ho quindi 2 gruppi di cellule molto diversi in funzione e le cellule dell’ipoblasto esprimono il
gene Gata mentre quelle dell’epiblasto esprimono Oct4 e Nanog. L’espressione diversa mi porta a parlare di destini
diversi.
Ci sono informazioni posizionali che indicano che le cellule a contatto con il blastocele, ovvero con la cavità,
esprimono il gene Gata e formeranno l’ipoblasto. Oppure altri autori dicono che le cellule a caso esprimo Gata o
Nanog e quindi inizialmente ne ho un mix e poi dovranno andare a costituire l’ipoblasto e altre l’epiblasto. E quindi si
dovrebbe avere una scelta ben precisa e quindi le cellule che esprimono Gata si riunirebbero tutte nella regione
vicina al blastocele e altre morirebbero per apoptosi, le + interne, e così si avrebbe la separazione spaziale.

La teoria sale e pepe dice che ho il trofoectoderma e cellule che esprimono Gata e Nanog e hanno adesione
differenziale, all’inizio sono sparpagliate e poi questa adesione fa sì che le cellule che esprimono Nanog si
riconoscono e così quelle che esprimo Gata e poi ci sarebbe un segnale che dice alle cellule che esprimono Nanog di
raggrupparsi con il trofoectoderma e le cellule che esprimono Gata rimangono a contatto con la cavità.

Zona pellucida
La zona pellucida rimane a proteggere l’embrione e la fecondazione avviene nelle alte vie genitali e poi l’embrione
rotola e fa la divisione e poi la blastocisti arriva nella parete uterina ancora circondata dalla zona pellucida e quindi
ne deve uscire per impiantarsi nella parete uterina e lo fa perché le cellule della blastocisti secernono proteasi che
digerisce la zona pellucida e la blastocisti esce da questa zona e si lega all’endometrio.
Trofoblasto
Nella blastocisti ci sono quindi 2 gruppi di cellule e il trofoblasto ha funzioni importanti, favorisce l’impianto nella
parete, secerne embrioni, e poi l’embrione potrebbe essere riconosciuto come non self e quindi ridotto e allora il
trofoblasto fa da immunosoppressore di eventuali reazioni non self da parte dei tessuti della madre. Inoltre il
trofoblasto si trasforma in varie componenti extraembrionali.

L’impianto avviene dopo 5/6 giorni dalla fecondazione, la zona pellucida contatta l’endometrio con una posizione
precisa dalla parte dove si trova la massa cellulare interna e così le cellule del trofoblasto proliferano e producono
enzimi e così si ha il sincizio trofoblastico e la blastocisti entra nell’endometrio e l’embrione si sviluppa. La parte che
forma l’embrione si cavita e si forma la cavità amniotica.

Gli amnioti hanno uova amniotiche e i rettili, gli uccelli, i mammiferi + primitivi depongono uova all’esterno che
devono avere un contenitore in cui ci sono liquidi dove si sviluppa l’embrione e questo è l’ammion che è un
sacchetto che protegge l’embrione da danni fisici. Le uova degli amnioti contengono 4 membrane extraembrionali
che sono:
1) sacco del tuorlo che contiene le sostanze per lo sviluppo
2) l’allantoide che serve da sacco in cui sono raccolti i prodotti di scarto, ma anche come struttura che media
gli scambi di gas
3) Il corion che circonda la parte interna del guscio e racchiude membrane extraembrionali.
4) Membrane extraembrionali
Nei mammiferi i Monotremi depongono uova e hanno uova molto grandi e quando i mammiferi hanno acquisito la
viviparietà le uova si sono ridotte e quindi lo sviluppo embrionale dovrebbe essere diverso e invece non è così. La
formazione del sistema nervoso ricorda quello degli uccelli perché le uova dei mammiferi primitivi erano grandi e si
sviluppavano come quelle degli uccelli e poi hanno perso il tuorlo e sono diventate piccole e quando si arriva in
gastrulazione il processo è simile.

I marsupiali hanno embrioni che nascono a uno stadio non completo e infatti i canguri per esempio sono messi nella
tasca e poi ci sono i placentati che hanno evoluto la placenta che è la struttura che serve per la comunicazione tra
embrioni e tessuti della madre.

Nell’uovo del pollo ho l’embrione che sta nel sacchetto con ammion, sacco del tuorlo con sostanze di riserva,
allantoide che è il sacchetto in cui sono accumulati materiali di scarto e il corion che circonda membrane
extraembrionali. Nei mammiferi ho il sacco del tuorlo ridotto perché gli scambi sono tra placenta ed embrione,
l’allantoide rimane e si trasforma nel cordone ombelicale. L’ammion contiene cellule liberate dall’embrione, e poi c’è
il sacco del tuorlo ridotto e il corion che circonda tutte le altre membrane.

Gestazione multipla, gemelli

Nello sviluppo dell’uomo c’è la possibilità che nascano i gemelli e la loro formazione è legata ad una ripartizione dei
blastomeri in stadi precoci dello sviluppo. I gemelli possono essere:

 Dizigotici: 2 ovociti fecondati da 2 spermi diversi e quindi sono diversi tra loro. I gemelli possono essere 1
maschio e 1 femmina. Siccome le blastocisti sono separate anche i gemelli hanno la placenta separata, 2
ammion e 2 corion.

 Monozigotici: c’è lo spermio che feconda l’uovo e inizialmente si ha una separazione dei blastomeri in 2
gruppi per cui ottengo 2 gemelli identici ed hanno in comune la placenta. Questi gemelli sono uguali con
differenze che derivano solo dall’ambiente.

I MZ si formano in stadi precoci dello sviluppo, il 35% di gemelli MZ si forma allo stadio di 2/8 cellule e quindi
l’embrione si divide in 2 e questo è spesso trasmissibile geneticamente. Il 65% si origina dalla divisione dei
blastomeri dopo circa 1 settimana. La differenza è che nel primo caso ho gemelli che hanno il proprio ammion, 2
corion e 2 placente che possono fondersi. Quando i gemelli si formano + tardi sviluppano 2 ammion ma hanno 1 solo
corion e 1 solo placenta in comune. quando la separazione è + tardiva posso avere lo stesso ammion.

Si ha in tutti i casi uno sviluppo corretto.

C’è 1 possibilità su 100.000 per cui la separazione e quindi la formazione di gemelli avviene + tardi e quindi si
formano 2 individui uniti per parti del corpo e sono gemelli siamesi e questo può succede quando la separazione
avviene dopo 2 settimane dalla fecondazione. In alcuni casi gli individui possono essere separati in altri no.

PROCESSO DI GASTRULAZIONE

La gastrulazione è il processo che porta alla formazione dei 3 foglietti embrionali. Quando si organizza l’organismo si
parte da una massa di cellule ottenute dopo la segmentazione che hanno delle posizioni non precise tra loro. La
gastrulazione serve per cambiare la posizione delle cellule così che possano interagire tra loro per il differenziamento
dei tessuti. La trascrizione avviene a partire dalla blastula, si sviluppa l’embrione con una quantità di proteine che
vengono tradotte con la traduzione in relazione ad mRNA. Se blocco la trascrizione vedo che inizialmente durante la
segmentazione ho incremento di proteine e lo vedo con incorporazione di valina, questo perché durante la
segmentazione l’embrione sfrutta mRNA materni e quindi c’è forte incremento della traduzione. Alla fine della
segmentazione inizia la trascrizione del genoma dello zigote e aumenta l’incorporazione della valina e quindi le
proteine. Se metto in acqua actinomicina che impedisce la trascrizione vedo che dopo lo stadio di blastula
l’incorporazione di valina decresce e quindi indica che inizia la trascrizione del genoma dopo la blastula. Il Mid
Blastula transition è il passaggio da blastula a gastrula dove inizia la trascrizione di DNA zigotico e compaiono mRNA
trascritti dal DNA dello zigote.

Il ciclo cellulare di un embrione è molto veloce perché non ci sono le fasi G ma c’è solo S dove non c’è trascrizione e
quindi dopo ho la mitosi dove non c’è trascrizione e quindi in questi embrioni l’unica traduzione che può avvenire
avviene a livello di mRNA fornito dalla madre. Quando finisce il cleavage e inizia la gastrulazione compaiono le fasi G
durante le quali c’è trascrizione di DNA e quindi le cellule dell’embrione possono trascrivere il loro DNA.

La gastrulazione porta alla formazione dei 3 foglietti embrionali:

1. Ectoderma: strato esterno che forma epidermide, sistema nervoso e melanociti
2. Mesoderma: strato intermedio che forma notocorda, ossa, muscoli e sangue
3. Endoderma: strato + interno che origina parte dell’apparato respiratorio, tubo digerente e suoi annessi

Quindi c’è movimento di cellule che si spostano l’una con l’altra. La blastula dell’anfibio è diversa dalla gastrula
perché si formano strati di cellule.

Le cellule germinali si localizzano indipendentemente da tutti i foglietti.

La gastrulazione è un processo con nome che deriva da stomaco, gastric, perché la gastrulazione inizialmente forma
il sistema digerente. Siccome la gastrulazione richiede il movimento di cellule ci sono meccanismi alla base del
movimento. Le cellule si devono muovere e poi si devono riconoscere, ci deve essere segnalazione e adesione
selettiva, quindi questo processo di gastrulazione è una pallina cava che ha un epitelio monostratificato e da questo
deve formare 3 foglietti embrionali. Ogni cellula della pallina al massimo ne contatta 6 e quindi per avere la
formazione dei foglietti le cellule si devono muovere e quindi da pallina cava assume conformazione diversa e quindi
le cellule si muovono con vari sistemi:

 Invaginazione: le cellule modificano la loro forma e si introflettono all’interno per formare l’intestino primitivo
nelle uova + semplici. Il ripiegamento richiede un cambiamento di forma e quindi da una cellula a
parallelepipedo ne ottengo una a trapezio

 Involuzione: si ha all’inizio un ingresso di cellule tipo l’invaginazione ma poi le cellule si muovono e vanno a
formare uno strato interno e quindi ho già cellule che hanno aumentato la loro possibilità di interazione tra loro
perché ho 2 strati.

 Estensione convergente: le cellule cambiano la posizione. Si ha un monostrato di cellule e si intercalano tra loro
e si espande la superficie

 Epibolia: si trova negli anfibi e si hanno 2 ordini di cellule, ci sono cellule della regione vegetativa e altre del polo
animale che si espandono a racchiudere le altre

 Migrazione: le cellule si muovono

 Ingressione: si trova nei mammiferi ed uccelli in cui le cellule si staccano dall’epitelio e vanno verso l’interno. Si
ha la lamina basale e le cellule per sfuggire dall’epitelio in cui si trovano devono attraversare la lamina basale e
perdere l’adesione tra cellule vicine e con la lamina basale.

 Apoptosi: morte cellulare programmata che porta all’eliminazione di membrane interdigitali

Il processo di gastrulazione nell’anfiosso

Si ha la blastula come pallina cava e quindi si ha invaginazione e quindi l’epitelio si piega e le cellule cambiano la loro
forma, la parte apicale è + stretta e la basale è + larga. Quindi si ha introflessione e formazione di archenteon o
intestino e rimane del blastocele una porzione sottile e l’apertura verso l’esterno è il blastoporo e quindi questo è il
processo + semplice.
Le cellule che formano la base dell’archenteon saranno dell’endoderma e quelle del tetto del mesoderma.
Nel riccio di mare si ha la blastula con uno strato di cellule, ma il suo ciclo vitale implica fecondazione,
segmentazione e blastula che fa gastrulazione e si forma il pluteo e quindi ho fase larvale intermedia e poi il pluteo si
trasforma in adulto che è il riccio di mare. La blastula è la pallina cava ma la gastrulazione è diversa dall’anfiosso.

La blastula ha un monostrato e il blastoporo e poi si forma l’archenteon. All’inizio si ha l’introflessione iniziale che
avviene con 2 meccanismi e ci sono cellule del mesenchima primario che finiscono all’interno. Si appoggiano sulla
lamina basale e la ialina circonda l’apice microvillato. All’inizio della gastrulazione le cellule della parte vegetativa
vanno verso l’interno e sono le cellule del mesenchima primario. All’inizio della gastrulazione alcune cellule
dell’epitelio hanno trasformazione epitelio-mesenchima quindi perdono il contatto che sono le giunzioni e perdono
anche l’affinità con la lamina basale. Queste si muovono e si staccano e vanno nel blastocele e quando si muovono le
cellule vicine si riavvicinano e riformano le giunzioni, quindi ho questo movimento verso l’interno. Queste cellule
poltre alle giunzioni hanno anche giunzioni aderenti che sono particolari per cui hanno una parte extracellulare Ca
dipendente che riconosce le stesse proteine delle cellule vicine che sono le Caderine che quando sono unite
mandano un messaggio alle catenine terminali e bloccano i filamenti. Quando le caderine si staccano e il contatto
cessa arriva un messaggio ai microfilamenti e c’è movimento della cellula in modo polarizzato perché perdono
affinità con lamina basale e contemporaneamente la regione apicale delle cellule epiteliali si deve riavvicinare e si
forma uno strato di cellule che stanno nel blastocele e hanno migrato quindi sono quelle del mesenchima primario
che formano il mesoderma. Quindi inizialmente c’è questo movimento verso l’interno. Poi si forma il blastoporo con
2 meccanismi che collaborano insieme:

1) Costrizione apicale: inizialmente ho la blastula, l’apice delle cellule dove si forma il blastoporo si restringe e
quindi siccome le cellule contengono acqua, se costringo la parte apicale la cellula si allarga basalmente e quindi
inizia il ripiegamento. Ma ciò non è sufficiente per formare il blastoporo.
2) Gel swelling model: La ialina è il 4° prodotto che viene rilasciato dai granuli corticali per prevenire polispermia.
L’epitelio ha cellule microvillate e la ialina ha 2 densità diverse. C’è uno strato esterno e uno interno. Le cellule
della regione vegetativa producono vescicole con proteoglicano che viene secreto in uno spazio e richiama acqua
che entra all’interno, ma lo strato + esterno della ialina è indeformabile e l’acqua aumenta lo spessore e
determina incurvamento e quindi sia la costrizione apicale che l’acqua che entra e aumenta lo spessore
determina un cambiamento della struttura dell’apice delle cellule e quindi si ripiegano quindi c’è incurvatura
dell’epitelio.

I 2 processi sono fondamentali e anche il proteoglicano perché se non viene secreto non si forma il blastoporo. Il
blastoporo è fatto da molte cellule e in sezione si ha un piccolo tubo fatto da diverse cellule, se faccio una sezione
nell’archenteon vedo che le cellule che formano il tubo sono meno e ciò da il suggerimento sul meccanismo che
porta all’archenteon. Il numero di cellule è lo stesso e da prismatiche si allungano e diventano strette e quindi si
forma un tubo + allungato, oppure posso avere intercalazione ovvero le cellule si intercalano e quindi il numero è lo
stesso ma diminuisce lo spessore dell’archenteron. All’inizio ho tante cellule e poi poche perché si intercalano e
aumentano la lunghezza del tubo. Quindi o le cellule si allungano e si stringono oppure si intercalano. Ma
l’archenteron si deve allungare ancora e infatti in alto ci sono cellule che hanno prolungamenti che arrivano a
toccare la regione opposta all’apice dell’archenteron. I filamenti contattano la lamina basale dell’epitelio opposto e i
filamenti contengono microfilamenti e quindi i filamenti si possono accorciare contraendosi ed esercitano una forza
traente che favorisce l’allungamento finale dell’archenteron verso la parte opposta.

Quindi la blastula inizia la migrazione delle cellule del mesenchima primario, si forma il blastoporo e poi l’archenteon
si allunga a toccare la parte opposta.
Cleavage nello Xenopus
Nello Xenopus si ha un blastocele dislocato rispetto al centro e non c’è l’epitelio monostratificato, ma tante cellule
piccole all’apice mentre nella parte vegetativa sono molto grandi e hanno il tuorlo e la gastrulazione deve usufruire
della cavità del blastocele.

Nel tetto del blastocele ci sono le cellule che formeranno l’ectoderma, quelle che fanno la cintura equatoriale, quelle
del mesoderma e quelle del polo vegetativo danno origine all’endoderma con lo spostamento delle cellule. Il primo
passo è la formazione del blastoporo che avviene nella regione opposta a quella di ingresso dello spermio.

Il blastoporo si forma per cambiamento della forma delle cellule con regione apicale stretta e basale allargata. Le
cellule a bottiglia modificano la loro porzione apicale e quindi si incurvano e si forma l’introflessione che da origine
al blastoporo.
Le cellule vanno nella regione apicale che diventa incomprimibile e quindi c’è introflessione. La parte apicale cambia
grazie a microfilamenti in cui le cellule sono unite da giunzioni e apicalmente ci sono le giunzioni aderenti che sono
complessi giunzionali che sono determinati dalle Caderine e il COOH terminale contatta le catenine che fanno da
intermedio per l’interazione con microfilamenti quindi nella parte apicale c’è una cintura di microfilamenti che in
seguito a segnali iniziano a contrarsi e quindi se la parte apicale si contrae cambia la sua dimensione e diventa stretta
e poi la parte basale si allarga. L’epitelio entra all’interno dell’embrione, nella blastula. Il polo animale ha cellule che
si spostano e si introflettono perché si ha un ripiegamento dell’epitelio e queste spingono le cellule a bottiglia verso
l’interno. Io ho le cellule del polo animale che spingono le cellule a bottiglia e dalla parte del blastoporo si forma
l’archenteon e questa regione ruota in senso antiorario e inizialmente le cellule che formano il polo animale sono
limitate alla parte superiore e man mano che va avanti la gastrulazione le cellule del polo animale ricoprono
completamente l’embrione.

Quindi con la gastrulazione le cellule del polo animale rivestono quelle del tuorlo con processo di epibolia, ovvero le
cellule aumentano la loro superficie tramite intercalazione tra cellule, ovvero inizialmente si ha un epitelio fatto 4-5
strati di cellule che si intercalano e quindi l’epitelio diventa di 2 cellule. Se io diminuisco lo spessore facendo in modo
che le cellule si intercalino tra loro la superficie aumenta nel polo animale e in parte va a ricoprire la parte vegetativa
e in parte si ha introflessione e le cellule vanno all’interno nel blastoporo e si ha rotazione in senso antiorario che
porta alla chiusura di ciò che sarà l’endoderma. Quindi se prima ho uno spessore di 5 cellule che poi diventa di 2 e
l’area di superficie raddoppia e ciò porta a cellule che vanno a circondare completamente o quasi il polo vegetativo
che formerà l’endoderma e rimane solo il tappo vitellino.
Io ho quindi un aumento di area del polo animale e quando aumenta c’è epibolia e quindi aumenta l’area di
superficie e fa sì che le cellule quando arrivano nel blastoporo entrano all’interno e quindi c’è movimento antiorario
grazie all’intercalazione. Il processo porta alla formazione dell’ectoderma, l’endoderma invece sono le cellule che
contengono il tuorlo che formavano la regione vegetativa e tra i 2 strati proliferano le cellule del mesenchima e
quindi sono quelle del mesoderma.

Gastrulazione nei Pesci

I pesci hanno uova ricchissime di tuorlo e il cleavage è limitato alla regione che contiene poco tuorlo e quindi si
forma la blastula definitiva. Il cleavage ha cellule che migrano, la blastula ha una cavità abbozzata, le cellule del polo
animale sono dell’epiblasto e poi ci sono quelle dell’ipoblasto. L’area di superficie dell’epiblasto aumenta grazie
all’intercalazione e l’epiblasto avrà solo 2-3 cellule e quindi c’è aumento di superficie dell’epiblasto che non ricopre il
polo vegetativo, ma le cellule quando arrivano a contatto con cellule che hanno tuorlo si ripiegano e migrano
all’interno e quindi si forma l’epiblasto esterno e l’ipoblasto interno. Dall’epiblasto si forma l’endoderma.
Gastrulazione nel pollo
Nel pollo c’è un processo di gastrulazione che assomiglia a quello dei mammiferi e quindi la gastrulazione del pollo è
un modello di riferimento. Anche nel pollo la segmentazione non è velocissima, il cleavage inizia nel blastodisco, c’è
segmentazione incompleta, e ho un sincizio con area pellucida e area opaca. La blastula degli uccelli è simile a quella
degli anfibi. La blastula del riccio di mare, la blastula della rana con blastocele ridotto ad un polo e la blastula del
pollo ha grande quantità di tuorlo ed è simile a quella della rana schiacciata.

Si ha uno strato esterno, il blastocele e uno strato di cellule interne che guardano il tuorlo quindi ipoblasto,
epiblasto e blastocele. La segmentazione termina quasi con formazione di epiblasto che ricopre lo spazio
subgerminale. Dalla parte posteriore proliferano le cellule a formare la lamina e le cellule si staccano dall’epiblasto e
si sommano a quelle che proliferano. Alla fine della segmentazione si forma epiblasto e ipoblasto e la cavità che è il
blastocele.

La gastrulazione è diversa perché si forma un’introflessione dalla regione posteriore che va in avanti ed è la stria
primitiva, un solco dal quale migrano le cellule, quindi al centro dell’area pellucida l’epiblasto forma il solco il cui
margine interno è il punto di introflessione di cellule verso l’interno. Le cellule dell’epiblasto migrano all’interno e
alcune di queste cellule migrano e spostano le cellule dell’ipoblasto e formano il sacco del tuorlo. Le cellule
dell’epiblasto che spostano quelle dell’ipoblasto formano l’endoderma. Ma ci sono anche cellule che rimangono nel
blastocele e formano il mesoderma. Le cellule cambiano quindi di forma per formare l’introflessione e a livello del
solco migrano le cellule all’interno e si forma mesoderma ed endoderma. La stria primitiva si allunga
progressivamente e poi si interrompe nel nodo di Hensen. La stria primitiva potrebbe essere rapportata al
blastoporo e il nodo di Hensen al labbro dorsale del blastoporo della rana. La stria primitiva del pollo ha la stria
analoga al blastoporo e il nodo è simile al labbro dorsale del blastoporo.
La stria primitiva si allunga e si interrompe poi con il nodo di Hensen che si retrae e quando si retrae la stria si
richiude e richiudendosi rimane una struttura detta notocorda. Man mano che il nodo si ritrae e la stria si richiude,
nella parte anteriore si formano le strutture del pollo come la testa e inizialmente si forma la testa ma la parte
posteriore non è formata. Quindi è come una cerniera che si chiude e man mano che chiude si forma la corda
dorsale che induce la formazione del sistema nervoso e la testa.

La corda o notocorda si forma lì perché quando la stria primitiva si richiude rimane questa struttura cilindrica
mesodermica fatta da cellule vicine tra loro e queste cellule si localizzano lì man mano che il nodo va
posteriormente. Quindi nel pollo c’è questa asimmetria per cui all’inizio si forma la regione anteriore mentre la parte
posteriore deve ancora chiudersi.

Gastrulazione nei mammiferi (topo)

Nel topo la gastrulazione è simile a quella degli uccelli perché i primi mammiferi deponevano le uova e quindi
avevano sviluppo simile ad uccelli e rettili, ma i mammiferi + evoluti hanno una segmentazione rotazionale perché
non hanno + tuorlo, ma comunque la gastrulazione è rimasta quella degli antenati.

Nella massa cellulare interna ho epiblasto ed ipoblasto, l’epiblasto si cavita e si forma la cavità amniotica la cui base
da origine all’embrione stesso. La gastrulazione avviene a livello delle cellule dell’epiblasto.

Negli uccelli come detto si ha la stria primitiva e poi endoderma e mesoderma. Nei mammiferi ho sacco del tuorlo ed
epiblasto e si forma la stria primitiva tramite la quale le cellule dell’epiblasto migrano a formano mesoderma ed
endoderma. Le cellule ciliate del nodo dei mammiferi determinano la parte sx e dx del corpo e quindi c’è differenza
tra nodo di Hensen e nodo dei mammiferi. La stria primitiva dei mammiferi permette la migrazione di cellule
dell’epiblasto, ma la migrazione avviene ad 1 giorno di distanza quindi prima migrano quelle che formano
l’endoderma e dopo 1 giorno quelle del mesoderma. Il processo quindi è simile a quello del pollo, c’è solo uno
sfasamento di 1 giorno.
Il nodo quando si ritira lascia la notocorda che sta sotto l’epiblasto e induce nelle cellule superiori dell’epiblasto la
formazione del sistema nervoso.

La posizione della stria primitiva determina anche la polarità dell’embrione, la parte posteriore corrisponde alla
parte posteriore dell’embrione e quella del nodo corrisponde a quella anteriore.

Gastrulazione in Drosophila

Il moscerino ha uova ricche di tuorlo e centrolecitiche, qui la gastrulazione inizia con formazione di un solco ventrale
che poi si chiude, c’è il processo di formazione di intestino ecc. nella gastrulazione si ha introflessione dell’intestino e
si formano segmenti della larva. L’inizio della gastrulazione è segnato dalla formazione del solco ventrale in cui c’è
modificazione delle cellule che lo costituiscono. C’è l’espressione di un gene, inizialmente le cellule sono allungate e
poi si ripiegano a formare un solco che si chiude e le cellule vanno all’interno. Queste cellule formano il mesoderma.
Il processo è lo stesso, apicalmente le cellule si restringono e portano al solco. In Drosophila i nuclei delle cellule
rappresentano l’espressione del gene Twist che ha un’espressione massima in punti in cui c’è accensione di Miosina
che è attiva e quindi permette la contrazione delle cellule nella parte apicale. La miosina citoplasmatica è attivata da
twist in quel punto e basta, ovvero nella parte ventrale ma non dorsale. Quindi qui si sa perché la contrazione
avviene solo in quel punto.

COSTRUZIONE DEI TESSUTI

Ci si chiede come fa lo zigote a formare un organismo pluricellulare, come la cellula ne origini 200 tipi diversi e come
si organizzano in struttura 3D. Le prime fasi di sviluppo richiedono 3 processi:
1. Divisione cellulare: parto da 1 cellula e ho mitosi per ottenere organismo pluricellulare. Qui tutte le cellule
sono uguali
2. Differenziamento: è un processo che differenzia le cellule
 3. Morfogenesi: costruzione della forma
All’inizio ho la divisione con tante cellule uguali che poi si differenziano e infine si costruisce la forma del corpo
dell’embrione e ciò richiede di stabilire la polarità dell’embrione per sapere quale è la parte anteriore, posteriore,
laterale ecc. un processo della morfogenesi è la segmentazione. Quindi si richiede un cambiamento di forma,
posizione e adesione delle cellule.

Nel cleavage si ha la compattazione in cui le cellule modificano la loro adesione, prima della compattazione le cellule
sono sferiche con pochi punti di contatto ma man mano che aumentano con la compattazione le cellule diventano +
appiattite. In questo processo di adesione sono fondamentali le molecole di adesione in particolare le Caderine.

Nel momento in cui si forma il blastoporo le cellule cambiano forma grazie ai microfilamenti, le cellule sono unite tra
loro da giunzioni, punti di contatto che sono le zonule aderentes che hanno un contatto mediato da Caderine e a
livello delle regioni di contatto si forma una cintura di microfilamenti che corrono nella parte apicale e sono questi
che si contraggono grazie alla Miosina e che determinano il cambiamento di forma delle cellule. Inizialmente le
cellule sono disposte parallelamente e in seguito a particolari segnali nella gastrulazione, i microfilamenti grazie alla
Miosina si contraggono, la parte apicale si contrae, quella basale si allarga e si ha incurvamento. Questo processo è
estremamente importante perché si trova alla base della formazione del blastoporo nel riccio di mare in cui c’è
questa modificazione delle cellule a bottiglia.

Un processo importante nello sviluppo è la neurulazione, ovvero la formazione del sistema nervoso, un tubo neurale
formato dal ripiegamento dell’epidermide dorsale e questo avviene grazie al fatto che la parte apicale delle cellule si
contrae e la base si allarga e c’è incurvamento. In questa curvatura e quindi nel solco o doccia sono importanti i
microfilamenti, ma all’inizio le cellule sono cubiche e poi a parallelepipedo, quindi cambiano forma perché
polarizzano fasci di microtubuli paralleli che fanno allungare appunto le cellule e poi la superficie apicale si restringe
e si formano le cellule che hanno forma triangolare con il solco.
Un altro movimento delle cellule è quello che si ha durante l’epibolia degli anfibi e si tratta di un processo che fa
aumentare la superficie di ectoderma con l’intercalazione tra cellule. L’intercalazione avviene quando le cellule
inferiori vanno sopra e quindi aumenta la superficie e c’è epibolia.

Un aspetto importante sono le molecole di adesione perché quando queste si muovono devono perdere contatto
con le cellule vicine e quindi ci deve essere una modifica nell’espressione di cellule di adesione che mantengono
unite le cellule tra loro e sono importanti perché quando l’adesione cessa le cellule possono spostarsi.

Le cellule aderiscono tramite giunzioni cellulari o tramite molecole di adesione che possono essere:

- Cellula-cellule: tra 2 cellule

- Cellula-lamina basale: ci sono molecole che permettono l’adesione con il substrato.

Le giunzioni cellulari sono apicali e sono giunzioni strette che nell’intestino non fanno passare liquido dal lume allo
spazio intestinale. Gli artropodi hanno giunzioni che sono settate. Al di sotto della giunzione tight ci sono le zonules
aderentes dove si trova il belt di microfilamenti. Poi ci sono i desmosomi che sono placche sulle quali si ancorano
filamenti intermedi e poi le giunzioni GAP in cui le membrane delle 2 cellule si toccano e sono attraversate da canali
che permettono il passaggio di ioni e quindi determinano l’accoppiamento tra cellule vicine.

La cellula prima di stabilire le giunzioni, aderisce alla + vicina tramite proteine di adesione, e infatti se nella neurula
di un anfibio prendo l’epidermide di quella che sarà la piastra neurale e disaggrego le cellule con EDTA che è un
chelante del Ca e togliendo Ca disaggrego le cellule, si mischiano e poi si lasciano lì e si vede che si riaggregano
spontaneamente quelle che devono diventare epidermide così come quelle che dovranno formare il tessuto
nervoso. Queste cellule si riconoscono perché esprimono molecole di adesione che gli permettono il riconoscimento.
Le molecole di adesione hanno un dominio di riconoscimento che riconosce la molecola di adesione opposta, un
dominio transmembrana per l’ancoraggio e uno citoplasmatico che interagisce tra proteine e serve da ponte.
Le proteine di adesione cellulare sono:

- Cellula-cellula
- Cellula-matrice: stanno nella parte basale delle cellule

Le proteine di adesione che mediano l’adesione cellula-cellula sono Calcio dipendenti e quindi hanno bisogno di Ca
per funzionare. Le proteine Ca dipendenti sono le Caderine che sono dimeri e io ho una parte extracellulare con delle
parti ripetute e siti di legame per il Ca. Quindi le Caderine si attivano in presenza di Ca, la parte extracellulare con N
terminale ha ripetizioni, una regione intramembrana e 1 COOH all’interno del citoplasma e questa è la struttura di
caderine che possono essere:

- E caderine: epitelio
- N caderine: tessuto nervoso

Vari tessuti hanno caderine specifiche e quindi la diversa espressione di Caderine porta a riconoscimento diverso
delle cellule. Le cellule che dovranno formare l’epidermide esprimono le E caderine mentre quelle del sistema
nervoso esprimono N caderine e per questo le cellule si riconoscono tra loro.
La coda citoplasmatica interagisce con Catenine che mediano l’interazione tra caderine e microfilamenti. Le 3
catenine alfa, beta e gamma hanno quindi una funzione strutturale.

Quando io disaggrego un tessuto e faccio riaggregare le cellule si riconoscono per le caderine diverse che esprimono.
Ma le cellule si riconoscono anche se esprimono la stessa caderina in modo diverso. Le cellule che esprimono tutte E
caderine si riconoscono perché alcune esprimono + alti livelli e altre + bassi.
Le caderine sono legate ai microfilamenti grazie alle catenine, in particolare alfa catenina. Il COOH terminale
contatta con beta la alfa che a sua volta contatta i microfilamenti. Le caderine quindi sono in contatto con
microfilamenti grazie alle catenine. La beta catenina funge sia da proteina strutturale sia da fattore di trascrizione.
La relazione tra caderine e microfilamenti è importante perché se ho 2 cellule a contatto tra loro le 2 cellule si legano
grazie alle caderine e quando le caderine riconoscono caderine vicine i microfilamenti sono stabili, ma quando le
caderine si allontanano e non riconoscono quelle di cellule vicine, il legame tra COOH terminale catenina e caderina
si dissolve, i filamenti sono liberi di contrarsi e le cellule si possono muovere e migrare.

Le E caderine sono fondamentali perché regolano alcuni aspetti dello sviluppo embrionale come la compattazione in
cui se ne esprime un alto livello, e infatti se le elimino non avviene compattazione. Se elimino le E caderine nella
gastrulazione dello Xenopus non si ha + la gastrulazione.

L’altra classe di proteine che mediano l’adesione cellula-cellula sono immunoglobulin-like (Ig) ovvero molecole di
adesione con struttura che ricorda le immunoglobuline con dominio extracitoplasmatico che ricorda quello delle
immunoglobuline, hanno una parte intramembrana e una coda citoplasmatica.
Gli insetti hanno molecole di adesione ma non hanno immunoglobuline quindi si pensa che le immunoglobuline dei
vertebrati derivino da queste molecole di adesione.

La struttura delle CAM e in particolare N-CAM che formano il sistema nervoso vede il dominio che ricorda le
immunoglobuline e a questo segue sempre nella parte extracellulare, una regione detta PSA che ha un’estensione
variabile, cioè questa PSA è negativa e questa regione è molto grande e quindi ciò ci suggerisce che consente una
migrazione maggiore delle cellule, poi nell’adulto queste regioni si riducono perché le cellule non devono migrare. E
ho dominio citoplasmatico e COOH terminale.

Il legame avviene tra cellule vicine perché le anse interagiscono con anse simili della cellula opposta. Nel caso di
caderine invece serve il Ca.

Le molecole di adesione sono anche quelle che legano la cellula al substrato o matrice e sono le integrine. Ogni
integrina è fatta da un dimero alfa e beta. La catena alfa interagisce e ha siti di legame per Ca e Mg e quindi sono
attivate in loro presenza. Le integrine hanno il dominio extracellulare con slargo terminale che è la regione che
permette il contatto con la matrice. La parte interna delle integrine contatta proteine linker che interagiscono con i
microfilamenti quindi la situazione è simile alle caderine.
In questo caso però le integrine si legano alla matrice. Le proteine linker sono proteine associate ai microfilamenti
come actinina, filamina ecc. tramite queste proteine gli eterodimeri delle integrine contattano i microfilamenti. Le
cellule si muovono sui binari di componenti della matrice e sono le integrine a regolare il movimento grazie alla
relazione con i microfilamenti.
Le cellule si appoggiano sulla matrice extracellulare fatta da 2 tipi di componenti che sono:

1. Sostanza amorfa: simile a gel che assorbe acqua

2. Rete di fibre

Quindi ho gel all’interno del quale ci sono le fibre. In particolare le cellule epiteliali si appoggiano sulla lamina basale
che è la parte + densa della matrice e all’interno ci sono cellule mesenchimali.
Il gel è fatto da glicosamminoglicani che sono catene non ramificate di polisaccaridi come N acetilglucosammina e
queste lunghe catene formano il gel. I glocosamminoglicani sono acido ialuronico che unisce cellule follicolari e
quando lo spermio deve passare deve avere ialuronidasi. I proteoglicani sono glicosamminoglicani legati a proteine.
Quindi ho lunghe catene di zuccheri con proteine legate come acido ialuronico con proteine.

La matrice è fatta anche da strutture fibrose e ci sono 3 tipi di glicoproteine:

1. Collagene: molto abbondante

2. Fibronectina: è necessaria per il movimento delle cellule e fa da binario
3. Laminine: abbondanti in lamina basale e fanno aderire le cellule

La fibronectina dirige il movimento delle cellule che si muovono solo all’interno della strada creata dalla fibronectina.

Quindi la fibronectina rappresenta un binario per l’ancoraggio delle cellule che si muovono in gastrulazione dello
Xenopus per l’epibolia. Se prendiamo un pezzetto della regione animale e lo giriamo, la parte interna guarda
all’esterno e si vede che l’embrione non gastrula perché non c’è + movimento delle cellule perché lì c’erano le
glicoproteine che formano la matrice, ma girandole non ci erano + a contatto. Iniettando anticorpi contro la
fibronectina la neutralizzo, in un embrione in cui si neutralizza si forma una struttura che è tutt’altro che gastrula con
tappo vitellino. Quindi se la inibisco non avviene gastrulazione.

Un altro aspetto importante del primo sviluppo è la regolazione del movimento di cellule che diventeranno
mesenchimali nel riccio di mare. Le cellule migrano all’interno perché perdono affinità con la lamina basale, e
perdono il contatto con le cellule vicine perché inizialmente avevano zonule aderentes. Quindi si staccano dalle
cellule vicine e superano la lamina basale e vanno all’interno del blastocele. Nelle zonule aderentes è espressa la E-
caderina e la cellula che diventa mesenchimale perde il contatto con cellule vicine perché non esprime + E caderine.
La E caderina tramite le catenine contatta i microfilamenti e quando le caderine sono a contatto i microfilamenti non
si contraggono, ma quando si perde il contatto i microfilamenti hanno un segnale che dice che non sono + in
contatto e i microfilamenti si contraggono e la cellula si muove. Le cellule perdono anche contatto con lo strato
ialino. Inizialmente tutte le cellule contattano la laminina e quindi hanno un’interazione diretta con la laminina che
forma la lamina basale. Quando la cellula perde affinità con laminina, le integrine vanno a contattare la fibronectina
che sta + internamente in matrice e quindi questa cellula si muove perché non ha + contatto con cellule vicine, con la
laminina e contatta la fibronectina e quindi si muovono e vanno all’interno del blastocele e formano il mesenchima
primario.

Formazione del tubo neurale

Le molecole di adesione intervengono nella formazione del tubo neurale che consiste nel ripiegamento dato da una
modifica nella parte apicale delle cellule, prima si forma il solco e poi la doccia che si chiude e le cellule all’inizio sono
tutte dell’ectoderma e quindi si forma la piastra ma alla fine si separano quelle dell’epidermide, del tubo e della
cresta neurale. Le cellule della piastra neurale esprimono N-caderine, quelle vicine che formano epidermide
esprimono E caderine. Se io faccio esprimere in posizione non corretta le N caderine vedo che quelle cellule invece
di esprimere E caderine esprimono le N e il tubo neurale non si forma, quindi l’espressione di E-caderine è
fondamentale per la formazione del tubo neurale e dell’epidermide.

L’epidermide si separa dal tubo neurale e la separazione avviene in modo tale che le cellule si staccano e migrano, se
ne vanno e vengono dette cellule della cresta che sono importanti perché costituiscono parte di muscoli, osteoblasti,
adipociti, melanociti, neuroni, odontoblasti quindi hanno localizzazioni diverse. Le cellule smettono di produrre N
caderine durante la separazione e se non producono N caderine si staccano dal tubo neurale che invece le
producono e quindi si dissociano e iniziano a muoversi e si muovono anche sulla base dei componenti della matrice
come la fibronectina che abbiamo detto che guida il movimento delle cellule. La fibronectina è legata a cellule della
cresta neurale ed è la proteina fibrosa che garantisce la migrazione di cellule neurali che si staccano dal tubo neurale
che non producono + N caderine. L’allontanamento è garantito da fibronectine. Il tubo neurale è allungato con
regione craniale e caudale, le cellule della cresta neurale della parte craniale si muovono lungo la fibronectina
mentre quelle del tronco hanno proteine Nefrine di legame e quindi sembrano avere meccanismi di riconoscimento
diversi ma non si sa come finiscono nei punti precisi del corpo.
Apoptosi
L’apoptosi promuove la vita perché una cellula può morire per danneggiamenti subiti oppure quando è esposta a
sostanze tossiche o radiazioni, ma può morire anche per sua decisione per segnalazioni che arrivano da interno o
esterno per apoptosi. La cellula fa necrosi quando ci sono elementi esterni che la uccidono, mentre se decide lei si
parla di apoptosi. Le cellule in necrosi hanno citoplasma che si disintegra, le membrane si rompono, manca ATP, la
cellula fa lisi, il DNA si frammenta, mentre in apoptosi la cellula si compatta, le membrane sono intatte e il DNA si
frammenta in grandi frammenti facilmente riconoscibili, la cellula forma gemme che vengono fagocitate.

L’apoptosi è caratterizzata anche dalla formazione di gemme con processo di blebbing che forma gemme e la cellula
elimina gradualmente le vescicole. In necrosi la cellula diventa sempre – compatta perché assorbe acqua perché le
membrane si frammentano e non c’è + il controllo della concentrazione di acqua, mentre in apoptosi l’acqua è
eliminata e la cellula condensa.

L’apoptosi è necessaria e fondamentale per uno sviluppo corretto come il riassorbimento della coda del girino. Nel
caso delle dita, il feto ha membrane interdigitali che vengono perse perché le cellule muoiono per apoptosi e la
morte cellulare programmata si ha anche nei neuroni. L’apoptosi è importante per la protezione dell’organismo, le
cellule infettate possono andare in contro ad apoptosi. In fase G1 c’è un checkpoint che controlla che il DNA non sia
difettoso e se l’errore non viene corretto ci deve essere apoptosi.

L’apoptosi non avviene in cellule cancerose che sono aneuploidi e proliferano in modo incontrollato.

L’apoptosi può avere ruoli importanti in patologie perché se c’è troppa poca apoptosi ci possono essere cellule
tumorali, l’alterioscleresi è anch’essa determinata da poca apoptosi, mentre se c’è troppa apoptosi può degenerare il
sistema nervoso, oppure ci può essere pelle molto sottile.

L’apoptosi è stata studiata e scoperta nel Caenorhabditis perché è venuta fuori una sequenza che si trova anche
nell’uomo. Il C. è eutelico con numero di cellule particolari delle 1090 somatiche, 131 sono programmate per morire
e vanno in apoptosi. Nel C. 1 delle 131 cellule ha un recettore di morte e nel citoplasma ha una proteina Ced9 attiva
quando il recettore è inattivo. Ced9 è attivo e inibisce Ced4. Ced9 sta nel mitocondrio e quando arriva il segnale di
morte si attiva il recettore e inattiva Ced9, quindi non può + inibire Ced4 che attiva un’altra proteina Ced3 e si hanno
una serie di attivazioni che attivano nucleasi che frammentano DNA e proteasi e si formano le gemme.
Nell’uomo ho una proteina Bcl2 che è antiapoptotica perché quando è attiva impedisce che si formino dei canali
sulla membrana esterna del mitocondrio che sarebbero dovuti alla dimerizzazione di Bax e Bac e da questi canali
uscirebbe citocromo. Nel caso in cui arriva uno stimolo di apoptosi questo fa attivare un recettore che inattiva Bcl2
che non impedisce la formazione dei canali e quindi si formano monomeri Bax e Bac con canali da cui escono
proteine e citocromo C. Bcl2 è legato ad un’altra proteina APAF e quindi questo dimero impedisce di solito la
dimerizzazione ma quando arriva lo stimolo apoptotico Bcl2 è neutralizzato, APAF si stacca e si formano canali sulla
membrana ed esce citocromo C.

Apaf si stacca da Bcl2 inattivo e quindi nel citoplasma c’è Apaf da solo e citocromo C e questi si legano e ora queste
strutture si assemblano a formare rosette che sono gli apoptosomi. L’apoptosoma richiama la procaspasi 9 che sta
nel citoplasma ma non funzionale. Quindi la procaspasi 9 viene reclutata dall’apoptosoma e quando si legano la
procaspasi viene in parte tagliata ed attivata. A questo punto la caspai 9 richiama altre caspasi e questo porta al
taglio delle lamine nucleari e poi anche al taglio di proteine citoplasmatiche e si formano le gemme.

L’apoptosi serve per rimuovere la coda del girino, ma anche le cellule che formano la membrana interdigitale, il
processo è legato anche alla composizione dello scheletro. L’apoptosi viene mediata da BMP4 la cui espressione
determina l’inizio dell’apoptosi.
La zampa del pollo ha dita isolate, mentre quella del papero ha una membrana. Nell’embrione del pollo c’è apoptosi,
mentre nel papero non c’è apoptosi nonostante ci sia BMP, infatti ha Gremlin che inibisce BMP e quindi esprime
Gremlin nelle regioni dove dovrebbe esserci apoptosi che non avviene.

Si prende la zampa di un pollo e si fa esprimere Gremlin e si vede che rimane la membrana interdigitale.
Se overesprimo BMP si ha la crescita di dita nuove, mentre se overesprimo Gremlin si perdono segmenti di dita.
Nell’uomo 41 giorni dopo la fecondazione inizia l’apoptosi e dopo 2 settimane le dita sono formate. Se questo
processo è sbagliato, può accadere che 2 dita si fondono insieme oppure rimane membrana interdigitale.

ORGANOGENESI

L’organogenesi è un processo per cui i 3 foglietti embrionali si trasformano in organi interni e ciò richiede vari
meccanismi:

 Proliferazione con mitosi

 Migrazione
 Differenziamento
 Riconoscimento
Tutto ciò porta alla formazione di un organo, in particolare il primo organo che si forma è il tubo neurale che poi
origina il sistema nervoso.

Negli anfibi il cleavage determina la formazione di blastula con blastocele disassato, gastrulazione con gastrula che
ha archenteron e la parte dorsale è leggermente appiattita rispetto a quella ventrale con tuorlo.

Qui avviene la formazione del tubo neurale in cui l’ectoderma che circonda completamente la gastrula è ispessito
nella parte dorsale e questo ispessimento fa una piastra che si piega e forma la doccia che si chiude a formare il
tubo, le cellule che uniscono il tubo con l’ectoderma si separano e formano le cellule della cresta. La piastra dorsale
si piega e si forma la doccia che poi si chiude. Dorsalmente si ha la doccia che si sta chiudendo e a un certo punto i
margini si toccano e si forma il tubo. La chiusura avviene partendo dalla regione centrale, i margini aderiscono nella
parte centrale e poi in quella anteriore e posteriore.
Quando i margini si toccano si formano le cellule della cresta neurale. Alla base della doccia c’è una struttura
compatta allungata che è la corda che si forma in gastrulazione. Si ha quindi ectoderma con le cellule che daranno
origine all’epidermide e sopra alla notocorda ho cellule che formano il tubo neurale e la cresta. Sotto c’è mesoderma
parassiale che forma somiti e l’endoderma che forma ghiandole e sistema digerente.

La notocorda sta sotto la piastra neurale e invia dei segnali che determinano il ripiegamento della piastra neurale e
quindi l’inizio della formazione della piastra e poi del tubo neurale. Dalla notocorda partono segnali, la piastra si
ispessisce, si ripiega e si chiude. Quindi alla fine ho tubo neurale, notocorda e creste neurali. Il maggior segnale
inviato dalla notocorda alla piastra neurale è il ligando Sonic Edgieug e questo segnale fa sì che le cellule che lo
ricevono si ispessiscono e si piegano per formare la piastra, la doccia e il tubo. Quelle cellule che rimangono
epidermide ricevono segnali della famiglia Bmp coinvolto anche nell’apoptosi. La notocorda negli uccelli ha
formazione simile ai mammiferi, si ha la stria primitiva, un solco che prolifera e nel margine anteriore forma il nodo
di Hensen e il nodo torna indietro, la stria si richiude e al di sotto rimane la corda. Negli uccelli man mano che il nodo
torna indietro la corda indica alle cellule superiori di diventare sistema nervoso che negli uccelli inizia a formarsi
anteriormente e quindi nell’embrione nella parte anteriore ho già testa, cuore e somiti mentre nella parte posteriore
si deve ancora chiudere.

Se si seziona l’embrione del pollo allo stadio con stria completa e nodo, le cellule anteriori sono a forma di
parallelepipedo ma il piano di sezione fa vedere cellule disposte orizzontalmente, nel caso di una sezione a livello
della stria quando si sta richiudendo, quando il nodo si è spostato e ha formato la notocorda vedo che la notocorda
induce il ripiegamento della piastra neurale e quindi la formazione del solco neurale e poi questo si chiude e si forma
il tubo neurale con ectoderma che lo ricopre.
In un esperimento si prende un pezzetto del tubo neurale del tronco dell’embrione di pulcino e si trasporta nella
stessa regione di un embrione ospite, ottengo che se il mio pezzetto viene da un donatore che dovrebbe essere
pigmentato, quando le trasferisco nell’ospite che non è pigmentato, vedo che in realtà ottengo un pulcino con ali
scure perché le cellule della cresta neurale formano anche i melanociti quindi se trapianto le cellule della regione del
tronco in un embrione di pulcino chiaro ottengo un pulcino con ali o parti scure e ciò dimostra che le cellule sono
migrate e formano i melanociti.

C’è un gradiente di sviluppo nell’embrione di pollo perché la chiusura della stria è graduale e va dalla parte anteriore
a quella posteriore e il nodo di Hensen corrisponde al rilascio della corda che induce la formazione del sistema
nervoso che si forma prima anteriormente che posteriormente.

Neurulazione nei mammiferi

Nei mammiferi il mesoderma e l’ectoderma si formano per migrazione dall’epiblasto ma negli uccelli la migrazione
dalla stria avviene contemporaneamente e nei mammiferi è sfalsata di 1 giorno. Anche nei mammiferi la corda
induce la formazione del tubo inviando segnali che fanno ispessire la parte sopra per formare piastra, doccia e tubo
neurale. Il ripiegamento implica che cellule in posizione diversa modificano la loro parte apicale per formare il
ripiegamento e poi la chiusura.
L’embrione si sviluppa nella cavità amniotica e c’è il sacco del tuorlo e la notocorda che induce ispessimento
dell’ectoderma sovrastante, poi il ripiegamento, il solco e poi la chiusura simile a ciò che avviene negli anfibi e uguale
agli uccelli perché le uova dei mammiferi derivano da uova grandi degli uccelli.

Quindi il tubo nei mammiferi si forma in 4 fasi:

1. Ispessimento piastra neurale con cellule che si allungano

2. Riarrangiamento cellule perché quelle centrali formano il tubo e quelle periferiche la cresta neurale e quindi
si deve stabilire l’identità delle cellule
3. Formazione della doccia che si chiude e si forma il tubo neurale
4. Formazione del tubo neurale
Quando il tubo si chiude la chiusura non avviene come negli uccelli in cui parte dalla parte anteriore verso la
posteriore, ma la chiusura è prima centrale e poi va in avanti e indietro come nei mammiferi. Quindi ho una fusione
centrale dei margini della doccia e poi c’è propagazione ma non si chiude completamente nella parte anteriore e
posteriore in cui rimane il neuroporo che è un’apertura che poi si chiude successivamente. Nella parte anteriore
intanto già si può riconoscere telencefalo, romboencefalo, mesencefalo e diencefalo del cervello.
La chiusura del neuroporo è fondamentale, nella parte anteriore si forma il cervello e in quella posteriore il tubo
neurale si deve chiudere. Se i neuropori non si chiudono, se non si chiude quello anteriore, si ha un cervello
incompleto o addirittura non c’è il cervello, se non si chiude il posteriore si forma la spina bifida. I 2 neuropori si
chiudono in tempi diversi, prima l’anteriore e il posteriore.
La spina bifida si può classificare in 2:

1. Spina bifida occulta: chi ce l’ha non si accorge di averla. Gli archi vertebrali di 1 vertebra non si chiudono e
siccome le vertebre proteggono il midollo spinale, se gli archi non si chiudono il midollo è esposto all’esterno ma
la vertebra è uno spazio ridotto quindi anche se il midollo è leggermente esposto non crea problemi. L’unica
manifestazione è un ciuffo di peli in corrispondenza di quella vertebra.

2. Spina bifida cistica: ci sono 2 o + vertebre che non si chiudono e il midollo spinale esce fuori dal suo alloggio e
preme e crea l’ernia, e questo può portare a problemi di deambulazione, dolore. Questa da fastidio e si può
eliminare chirurgicamente operando il bambino appena nato o dopo poco.

3. Spina bifida severa: questa porta alla mancanza di una parte di cervello e quindi morte dell’embrione. Questa
non può essere curata. Alla comparsa di questa possono contribuire fattori genetici e ambientali e si sa che la
somministrazione di acido folico diminuisce l’incidenza della spina bifida.

Oltre a fattori genetici contribuiscono anche fattori ambientali che possono contribuire anche alla comparsa di altre
patologie come la Talidomide che portava a deformazioni nei bambini appena nati e ci sono fattori teratogeni che
portano alla nascita di neonati con difetti e tra i teratogeni ci sono raggi X, prodotti chimici, microrganismi come la
rubella che è la rosolia e la rubella può portare a problemi nell’organizzazione del corpo.
I momenti + sensibili in cui l’embrione si sviluppa, per la formazione del sistema nervoso il periodo critico è precoce,
mentre per esempio il palato si forma + tardi e quindi ci sono periodi e quindi organi + soggetti ad influenze esterne.
Il sistema nervoso per esempio è soggetto precocemente a fattori esterni che possono dare anomalie.,

Formazione sistema nervoso

Il sistema nervoso si forma a partire dal tubo neurale con parete fatta da monostrato di cellule che dividono perché
devono proliferare e queste mitosi sono veloci durante la vita embrionale e ciò spiega la sensibilità del sistema nervoso
perché una divisione veloce può dare errori.
Il tubo neurale ha quindi questo strato di cellule allungate, nell’embrione a poche settimane si riconoscono parte
anteriore, mediana e posteriore del sistema nervoso centrale.

Se facciamo una sezione della parte anteriore del cervello studio la proliferazione cellulare. Vedo una cavità interna
detta ventricolare e poi la regione esterna e lo spessore dell’epitelio in cui le cellule si dividono. L’epitelio secondo
alcuni era pseudostratificato con vari strati di cellule e infatti si vede che i nuclei si trovano a vari livelli e quindi
penso che ci siano cellule a livelli diversi. Ma in realtà a seconda del ciclo cellulare questi nuclei sono disposti in
modo diverso. Di solito una cellula epiteliale ha la parte apicale sopra ma nel sistema nervoso è al contrario. In fase
G1 il nucleo è nella parte apicale, poi va basale alla duplicazione e poi va di nuovo in apicale e la cellula si divide e il
nucleo si sposta quindi in relazione al ciclo cellulare. In realtà lo strato è pseudostratificato perché i nuclei si
muovono ma comunque ho solo spessore con 1 cellula. Le cellule aderiscono tra loro con giunzioni aderenti.

Il sistema nervoso non è fatto da epitelio, si parte da esso ma poi è fatto da un ispessimento di tante cellule come
neuroni, astrociti, oligodendrociti ecc.

inizialmente nei primi stadi di sviluppo le cellule del tubo neurale proliferano, aumentano in numero con mitosi
sincrone e simmetriche perché ogni cellula da 2 cellule uguali a sé, il piano di divisione è perpendicolare alla
superficie. Quindi le prime divisioni sono simmetriche perché proliferative ma non portano alla formazione di cellule
nervose. Le cellule hanno polarità apicale determinata da complesso Par e una basale legata a un prolungamento
per cui le cellule vanno dalla parte apicale alla lamina basale. la proliferazione simmetrica non garantisce il
differenziamento ma ho cellule tutte uguali quindi non si formano le cellule del sistema nervoso.
Ad un certo punto quando il numero di cellule di neuroepitelio è sufficiente si trasformano le cellule neuroepiteliali
in cellule staminali nervose che si dividono in modo asimmetrico per formare la linea neuronale. La transizione tra
cellule neuroepiteliale e staminale avviene perché la mitosi cessa. Alla base della trasformazione ci sono fattori di
trascrizione della famiglia Hes che sembrano regolare la transizione.

Queste cellule neuroepiteliali si trasformano in staminali che si dividono in modo asimmetrico e danno origine a sé
stesse, 1 rimane staminale e 1 da origine a cellule che si differenziano in cellule nervose. La neurogenesi può essere
diretta o indiretta perché la divisione asimmetrica avviene:

▪ Diretto: 1 cellula rimane tale e 1 si differenzia in neurone

▪ Indiretta: si forma 1 staminale e 1 progenitore intermedio che è una cellula che fa mitosi e poi le cellule si
differenziano in nervose

Nel primo caso ho solo 1 cellula nervosa, nel 2° ne ho tante.

Io ho la staminale e mi chiedo come possa dividere in questi 2 modi, tutto si basa sull’orientamento del fuso perché
se è parallelo alla regione apicale delle cellule si ha neurogenesi diretta, se il fuso è obliquo si ha divisione indiretta.

C’è inoltre 1 ciglio primario tipico di quasi tutte le cellule dei vertebrati e quello è una sorta di antenna che serve per
percepire informazioni dall’ambiente. Il ciglio primario si trova in G0 e G1 e viene riassorbito alla divisione.

Quando una cellula si divide, all’inizio ha un centrosoma con centriolo madre e figlio, alla duplicazione i 2 centrioli
duplicano e il centriolo madre + vecchio rimane in 1 delle 2 cellule.
Il centriolo madre che formerà il ciglio primario rimane nella staminale, mentre il figlio che forma il ciglio + tardi va in
un neurone. Quindi la ripartizione è asimmetrica. Il centriolo madre organizza per prima il ciglio primario. Quando
una cellula si divide le 2 figlie ereditano 2 centrosomi con centrioli madre di età diverse, il + vecchio quando
riassorbe il ciglio rimane una vescicola che permette la formazione del ciglio primario in tempi + veloci. La cellula
organizza il ciglio primario verso la cavità ventricolare, mentre l’altra figlia costruisce il ciglio in ritardo e questo viene
orientato nello spessore tra cellule. Quindi i 2 cigli hanno informazioni diverse perché hanno localizzazione diversa e
sembra che contribuiscano al differenziamento del neurone. Il ciglio primario quindi rimane nella staminale.

Alla fine della neurogenesi che si conclude con la divisione asimmetrica, le staminali si trasformano in
oligodendrociti, astrociti e cellule pendimali.

Le staminali hanno lunghi prolungamenti usati da cellule che si differenziano in neuroni per spostarsi verso la parte
basale e ciò è importante perché ciò implica 2 cose: la neurogenesi diretta e indiretta dipendono dall’orientamento
del fuso, lo spostamento dipende dalla presenza di microtubuli quindi se ci sono errori nella costruzione di
centrosomi, o fuso o microtubuli, si ha un cervello ridotto detto microcefalia che è un disordine a livello nervoso che
porta a riduzione dello spessore della corteccia e ciò corrisponde al fatto che mancano neuroni.
Un difetto è l’orientamento nel fuso perché se ho un fuso che non è obliquo, allora la neurogenesi indiretta non c’è.
Se i neuroni non migrano si ha un numero di neuroni ridotto. Se ho un problema nel ciglio che serve per ancorare e
ricevere segnalazioni, allora se non si forma la staminale non funziona bene. Nel caso in cui non si formano o si
formano in modo sbagliato i microtubuli ho lissencefali, se non si forma il ciglio primario ho una microcefalia detta
sindrome di Joubert per cui ovviamente c’è rene policistico e tutto ciò che è collegato al ciglio. Ci sono anche
anomalie dell’orientamento del fuso perché ho una riduzione del numero di neuroni. L’orientamento del fuso si lega
a tante proteine che sono legate a 2 aspetti: o alla costruzione del centrosoma o alla polarizzazione della cellula. La
parte apicale della cellula ha complesso Par quindi se hanno difetti la cellula perde il suo orientamento e ciò riduce la
corretta regolazione della divisione.
Alterazioni nel fuso, nel citoscheletro comportano danni importanti.

Un esempio è la mutazione della proteina che sta intorno ai centrioli e organizza il centrosoma, la pericentrina. Il
fuso è quindi disorganizzato e ciò crea problemi non solo al sistema nervoso. La mutazione di pericentrina può
portare a tante anomalie, nel caso del sistema nervoso si può avere una difettosa migrazione dei neuroni, non si
formano le ciglia, oppure non si ha divisione asimmetrica corretta, ci possono essere fusi multipolari con aneuploidia
ecc.
Studio del sistema nervoso

Il sistema nervoso dei mammiferi è complesso da studiare perché l’embrione ha sviluppo interno. Quindi si
costruiscono piccoli cervelli in vitro che sono organoidi cerebrali che si costruiscono a partire da cellule staminali
pluripotenti indotte che sono fibroblasti e quindi differenziati che vengono sdifferenziate facendogli esprimere geni
embrionali e poi quelle cellule trasformate in staminali pluripotetnti vengono tramite meccanismi di induzione ed
espansione vengono coltivate per formare strutture rotonde che sono organoidi. Sugli organoidi si possono seguire i
primi stadi di sviluppo perché hanno cavità interna delimitata da cellule staminali e quindi si può seguire cosa accade
in patologie. Sugli organoidi si può studiare la formazione degli occhi perché tramite trattamenti compaiono
strutture pigmentate che quando si vanno a vedere sono fatte da cellule pigmentate che sono presenti nell’occhio e
le cellule + allungate formano coni e bastoncelli di cui si può seguire lo sviluppo. Quindi con gli organoidi si può
capire cosa una mutazione determina.
Come si arriva ad organismo multicellulare da un uovo

Ci si chiede come da una singola cellula che è lo zigote si possa arrivare ad un corpo in cui si hanno molti tessuti e
cellule diverse tra loro. Il primo passo è il processo di divisione cellulare. La struttura inizialmente ha cloni e poi le
cellule si differenziano perché serve una specializzazione in quanto se consideriamo l’ameba unicellulare, questa ha
nel citoplasma organuli che fanno sì che si possano svolgere funzioni diverse come la respirazione tramite la parete, i
vacuoli digestivi, i mitocondri che danno energia, gli pseudopodi permettono il movimento e quindi in questo caso
l’organismo unicellulare ha organuli per svolgere le varie funzioni.

Ma quando l’organismo determina pluricellulare 1 sola cellula non può soddisfare tutte le necessità dell’organismo e
quindi si formano tessuti per trasportare sostanze nutrienti, O e sostanze di scarto e quindi gli organismi
pluricellulare organizzano tessuti in quanto le cellule si differenziano e formano tessuti diversi che si organizzano in
organi poi sistemi e infine l’organismo.

Nell’uomo da 1 cellula iniziale si sviluppano 200 tipi cellulari diversi. Alla fine del 1800 c’erano 2 teorie per spiegare il
differenziamento che portava da 1 cellula a 200 tipi diversi:
1. Sviluppo a mosaico: era un concetto che presupponeva che all’interno del nucleo ci fossero dei determinanti,
ovvero informazioni che alla prima divisione dello zigote formano 1 blastomero con 2 determinanti e l’altro altri
2 e questo indicherebbe che i blastomeri sono già diversi tra loro. L’esperimento che suddivide l’embrione di una
rana allo stadio di 2 blastomeri i 2, in modo tale che 1 veniva ucciso e l’altro rimaneva dimostra ciò. Il destino dei
2 blastomeri era diviso ma questi rimanevano uniti tra loro e vedeva che si sviluppava solo il blastomero che non
era stato ucciso e ciò portava a una rana solo per metà e questo significava per lui che il concetto di sviluppo a
mosaico era corretto perché se ho 2 blastomeri e 1 lo uccido si forma solo metà embrione e quindi nel
blastomero rimasto c’erano solo metà informazioni.

2. Sviluppo regolativo: Un altro esperimento fu fatto nel riccio di mare e dimostra che l’esperimento precedente
non è vero perché prende l’embrione a 4 blastomeri, li separa e vede che da quelli nascevano plutei normali e
quindi dice che non esistono i determinanti separati ma tutti i blastomeri sono uguali. Se io separo i blastomeri
allo stadio di 8 vedo che gli embrioni non hanno sviluppo corretto quindi lo sviluppo regolativo vale solo nelle
prime divisioni.

In realtà nessuna delle 2 idee è completamente corretta.

La blastula poi fa gastrulazione in cui le cellule si spostano e si formano i 3 foglietti: ectoderma, endoderma e
mesoderma. I 3 foglietti corrispondono a cellule somatiche che si differenziano in vari tessuti che sono epiteliali,
muscolare, connettivo e nervoso dove l’epitelio ha cellule ciliate, le cellule del sangue hanno globuli rossi privi di
nucleo, le cellule nervose hanno assoni e dendriti. Quindi sono molto diversi tra loro, i globuli rossi sono concavi con
enorme flessibilità importante perché questi devono passare nei capillari molto stretti e curvati. Ci sono dei globuli
rossi che invece mutano e formano fasci che danno rigidità e quindi questi globuli non riescono a passare e
provocano coaguli pericolosi.

La linea germinale include i gameti e segrega precocemente come uovo e spermio.

Lo sviluppo è un insieme di processi che sono determinati dall’attivazione e spegnimento di certi geni. Lo sviluppo è
diviso in:

- Divisione cellulare
- Differenziamento cellulare
- Formazione del pattern: l’embrione deve sapere quale è la parte anteriore, posteriore ecc.
- Morfogenesi: cambiamento di forma per dare la forma definitiva
Differenziamento

Il differenziamento porta una cellula a specializzarsi. All’interno di tutti i tessuti ci sono comunque cellule
indifferenziate che sono le cellule staminali che stanno anche negli embrioni. Tutte le cellule all’inizio sono uguali
perché hanno la stessa origine. Il differenziamento avviene in 3 fasi:

1. Specificazione: l’identità della cellula può cambiare

2. Determinazione: il destino della cellula è determinato
3. Differenziamento: riconosco la cellula differenziata in funzione e forma

Determinazione

Se prendo 1 quadrato e lo trapianto nella regione con quadrati gialli dell’embrione diviso appunto in 2 regioni, vedo
che se lo faccio all’inizio il quadrato verde da esagoni perché sta nella regione dove si formavano esagoni. Ma se il
quadrato ce lo trapianto dopo un certo periodo vedo che questa cellula trapiantata, nonostante sta nell’ambiente
degli esagoni, origina rettangoli come fa la regione verde. Quindi questa cellula aveva già l’informazione ed è
irreversibile anche se cambio posizione nell’embrione e quindi si dice cellula determinata.
Se ho una gastrula all’inizio dello sviluppo ho tubo neurale ed epidermide, prende 1 cellula di epidermide e la
trapianto nel tubo neurale vedo che quella cellula diventa del tubo neurale, ma se lo stesso trapianto lo faccio + tardi
nello sviluppo vedo che mantiene la su identità perché ha informazione irreversibile ed è una cellula determinata.

Le cellule sono quindi determinate progressivamente con un processo graduale.

Se io prendo, in una gastrula di un anfibio, 1 regione che origina l’occhio e la trapianto in una posizione di neurula
ospite vedo che non si forma l’occhio, ma se io prendo le cellule di quella regione in un momento + tardivo e lo
trapianto sempre in neurula ospite si forma una specie di occhio quindi inizialmente le cellule non sono determinate
ma poi acquisiscono l’informazione + tardi.

La determinazione avviene prima del differenziamento. Se la cellula determinata viene posta in un’altra posizione
dell’organismo ricevente si differenzia comunque come se fosse posizionata inizialmente.
Il differenziamento ha alla base l’espressione di geni diversi. Lo zigote riceve il 50% di materiale genetico da padre e
50% da madre quindi tutte le cellule hanno lo stesso materiale genetico ma hanno destini diversi.

Una cellula ha 2 classi di geni:

1. Housekeeping: sono necessari per il normale sviluppo e quindi sono attivati in maniera generale nelle cellule
2. Specialized: sono specializzati e determinano il differenziamento. I geni del cristallino sono per esempio
attivati solo nella lente ma spenti nelle cellule epiteliali.

Tutte le cellule somatiche quindi hanno stessa informazione ma funzione e forma diverse. La gastrulazione fa sì che
le cellule si dispongano in modo diverso per aumentare le interazioni quindi il posizionamento nell’embrione è un
aspetto che contribuisce al differenziamento. Il pattern dei geni cambia nelle cellule. L’accensione e lo spegnimento
dei geni fa sì che le cellule diventino diverse tra loro. I segnali che portano ad accensione e spegnimento sono fattori
di crescita ma anche informazioni rilasciate da gruppi di cellule dell’embrione e sono informazioni che influenzano le
cellule + vicine al gruppo di cellule dette organizzatori.
Le cellule muscolari derivano da precursori indifferenziati che sono i mioblasti dove ci sono proteine diverse e un
sincizio. 1 gene fondamentale è Myo D che codifica per 1 fattore di trascrizione e ha 1 COOH e 1 NH2 terminale e la
parte centrale ha una regione basica e un dominio Helix-loop che si lega al DNA in precise regioni e quindi serve per
il binding con il DNA, ovvero riconoscere e legarsi a regioni specifiche. La regione basica si lega a un gruppo di
proteine che inducono il differenziamento del muscolo. Al contrario alla regione basica possono anche legarsi
proteine che prevengono il differenziamento per non farlo avvenire.

Si ha la cellula embrionale precursore, il mioblasto che ha Myo D spento e quindi anche gli altri geni sono spenti
perché lui è un gene regolatore. Dopo la ricezione di segnali il Myo D si accende e trascrive per l’mRNA tradotto nella
proteina. Questo mioblasto diventa così determinato e non può tornare indietro perché Myo D è acceso. La proteina
è prodotta da un master e fa da fattore di trascrizione che serve per determinare la trascrizione di altri geni, questa
proteina si lega al DNA delle proteine che sono muscolo-specifiche. Quindi Myo D si lega a geni che trascrivono per
mRNA di proteine muscolo-specifiche come la miosina. Quindi così si ottiene la fibra muscolare differenziata.
Master gene

Il master gene è un gene il cui prodotto quindi mRNA e proteina può attivare o spegnere altri geni a cascata.

Controllo

Il gene viene trascritto per formare mRNA che viene trasportato nel citoplasma e tramite i ribosomi viene tradotto in
una catena di amminoacidi ovvero in proteine. Quindi siccome queste cellule sono tutte uguali con lo stesso genoma
ci deve essere un sistema per regolare l’espressione dei geni. L’espressione dei geni può essere regolata a vari livelli.
La trascrizione viene attivata tramite la decondensazione della cromatina, l’eucromatina corrisponde a DNA che viene
trascritto mentre l’eterocromatina è impacchettata e non permette la trascrizione. L’impacchettamento coinvolge la
metilazione o acetilazione. Quindi il primo controllo si ha nell’impacchettamento della cromatina. poi il DNA viene
trascritto e da mRNA con esoni ed introni che vengono tagliati e poi l’mRNA viene trasportato nel nucleo e per fare ciò
si forma una coda e una testa che fa trasportare l’mRNA nel citoplasma dove viene tradotto in proteine che poi a volte
devono essere processate per attivarle.
I controlli sono:

1. Alla trascrizione
2. Al processamento
3. Alla traduzione
4. Al differenziamento delle proteine

Controllo trascrizionale
Si hanno circa 30.000 geni. Ciò che determina l’espressione dei geni è l’impacchettamento grazie agli istoni e poi
alcuni geni possono essere controllati da fattori di trascrizione. Quando c’è eterocromatina impacchettata i geni non
possono essere trascritti e quindi la struttura della cromatina interferisce sull’espressione. La cromatina è il DNA che
è avvolto su istoni e ciò è importante perché in mitosi ho la condensazione grazie alla compattazione degli istoni.
Ci sono 2 meccanismi per la compattazione:
1. Metilazione: ho eucromatina con DNA rilassato e la metilazione fa avvicinare i nucleosomi e c’è
compattazione. La metilazione è un processo per cui si aggiunge 1 metile a 1 Citosina tramite
metiltransferasi. Questa è importante perché i nucleosomi si avvicina e quindi si ha compattazione della
cromatina e quindi blocco della trascrizione. La replicazione sappiamo che è semiconservativa, quando la
catena si apre si forma 1 stampo, ma la seconda catena sarà con citosine non metilate mentre la prima le ha
metilate. Alla seconda divisione si perderebbe tutta la metilazione. Ci sono enzimi che riconoscono le
citosine e le metilano anche dopo la duplicazione.

2. Acetilazione: gruppi acetile sono legati agli istoni e ciò porta ad una cromatina meno condensata perché gli
istoni si allontanano dato che gli istoni sono carichi + e DNA – e si attraggono, ma quando ho il gruppo acetile
neutralizzo la carica + degli istoni e quindi ho decompattazione e ora il DNA può essere trascritto.

Alla base della metilazione c’è l’eredità epigenetica che sono tratti ereditari trasmessi da meccanismi che non
coinvolgono DNA come l’imprinting genomico per cui 1 allele non viene espresso perché metilato. Ho 1 uovo con
allele non metilato e spermio con allele metilato e quindi inattivo.
Se considero growth factor per insulina nel topo, quando l’allele per questo fattore è metilato nella madre e si trova
solo quello paterno si ha crescita normale, se sono entrambi deleti la crescita non avviene, se sono espressi entrambi
ho una crescita eccessiva quindi 1 allele deve essere metilato per avere sviluppo corretto.
Non è necessario che la trascrizione sia eucromatina, ma ci sono anche elementi di controllo per la trascrizione. Il
gene ha una regione che viene trascritta, il promotore per l’aggancio di RNA polimerasi al tata-box, regioni distali o
prossimali al promotore che sono enhancer di controllo che possono interagire con proteine che fanno da attivatori.
Se all’enhancer si legano fattori di trascrizione, si ha ripiegamento della catena, si richiama RNA polimerasi e inizia la
trascrizione del gene. Se tutte le cellule hanno gli stessi geni il problema è come alcuni possono essere attivati in
posizione diversa. Le cellule del fegato dovrebbero produrre albumina, e quelle della lente devono attivare il gene
per il cristallino, entrambe hanno gli stessi geni ma nel fegato agli enhancer del gene per albumina si legano
attivatori specifici che stanno solo nel fegato, mentre nella lente si legano agli enhancer fattori presenti solo lì.

Ciò spiega perché certi geni sono accesi e altri spenti.

L’inizio della trascrizione richiede proteine per attivare il gene che sono i fattori di trascrizione che sono elementi di
controllo e sono di 2 tipi: fattori di trascrizione basali e attivatori o repressori della trascrizione. Quindi ho il gene
controllato da promotore a sua volta controllato da enhancer, intervengono proteine attivatori che fanno da
intermediari per fattori di trascrizione basali e si forma un complesso che richiama la Polimerasi e si lega al
promotore e inizia la sintesi.
Ci sono però fattori di trascrizione o proteine che fanno da attivatori o repressori quindi questi fattori possono sia
attivare e velocizzare la trascrizione di un gene legandosi agli enhancer, oppure possono legarsi a sequenze dette
silencer e quindi qui si legano i repressori che bloccano la trascrizione. Ciò spiega come certi geni sono accesi e altri
spenti. Alla base di questo controllo ci sono i fattori di trascrizione che sono proteine con dominio di attivazione e
dominio per il riconoscimento di siti sul DNA da regolare.

Si hanno 4 classi di fattori di trascrizione che corrispondono a varie proteineche hanno in comune la regione per il
binding:

1. Zinc fingers proteine: si legano al DNA grazie a dita di zinco. Zinc fingers hanno alfa eliche e zinco e le alfa eliche
sono messe in modo tale da interagire con punti precisi di DNA.

2. Helix-turn-helix: ci sono eliche che interagiscono con DNA. Hanno alfa eliche e nelle ¾ eliche c’è una regione che
fa da riconoscimento per il DNA. A questa appartengono geni omeotici con omeodominio con 60 amminoacidi
che fanno 3 alfa eliche di cui la terza serve per il riconoscimento, ha 3 amminoacidi che interagiscono con le basi
azotate. I geni omeotici sono fattori di trascrizione e regolano altri geni quindi basta che sia mutato 1 gene che
determina la formazione delle ali e queste scompaiono o sono in numero maggiore.
3. Leucine zipper: interagiscono, avendo 2 eliche che si avvolgono, grazie all’N terminale con il solco + largo del DNA

4. Helix-loop-helix

Queste sono le famiglie + importanti dei fattori di trascrizione che si legano ad enhancer.

Ora il gene trascrive RNA che va processato.

Controllo nel processamento

L’enhancer è attivato e i fattori di trascrizione accendono il gene che è la sequenza con esoni e introni che vengono
trascritti, e ho 5’ e 3’ opposto al DNA. Quindi il pre-RNA ha esoni e introni ma questo viene processato e vengono
eliminati gli introni. Rimangono gli esoni e al 5’ c’è codone di start e codone di STP e 3UTR non tradotta. Poi viene
aggiunta una coda e un CAP. Gran parte dell’mRNA viene eliminato perché gli introni sono tagliati grazie a particelle
ribonucleiche che si legano all’introne e tagliano e ricuciono, ovvero ripiegano gli introni e li tagliano fondendo gli
esoni. Tutto ciò avviene senza errori quindi è molto preciso.
Il taglio di introni è un meccanismo di processamento ma c’è anche lo splicing alternativo, ovvero la stessa molecola
di mRNA può dare trascritti diversi come durante la determinazione del sesso del moscerino dove trasformer taglia
Double-sex e si usano solo certi esoni mentre nel maschio l’mRNA viene usato interamente perché trasformer è
inattivo.

Un altro esempio è quello in cui la tiroide e i neuroni hanno lo stesso mRNA ma nella tiroide vengono selezionati
esoni, mentre nei neuroni altri e quindi nella tiroide la serie di esoni fa produrre calcitonina, mentre nei neuroni
l’altra porta al neuropeptide quindi 2 proteine diverse che originano dallo stesso gene tramite splicing alternativo.
Inoltre l’mRNA si trascrive nel nucleo ma deve uscire tramite un processo che lo fa passare nei pori nucleari. L’mRNA
oltre allo splicing ha il capping al 5’ e poli-A al 3’. Al 5 si aggiunge metilguanosina che forma il cap, mentre al 3 si
aggiunge poli-A quindi tante adenine e questo mRNA dopo questo processamento può essere trasportato tramite il
nucleo attraverso i pori nucleari che sono complessi perché sono cestelli attraverso i quali deve passare l’mRNA.

Le proteine di piccole dimensioni possono attraversare tranquillamente i pori per diffusione, mentre quelle + grandi
e quindi anche mRNA hanno bisogno di un trasporto attivo.

Le proteine entrano tramite l’Importina che si lega a duna GTP e porta il cargo ai pori e quando arriva nel nucleo,
l’Importina rilascia il cargo. L’esportina lega il suo cargo e grazie a energia lo porta all’esterno. L’idrolisi di RANGTP in
RANGDP fa liberare il cargo dall’esportina.
L’mRNA quindi va all’esterno grazie all’Esportina e quando arriva all’esterno nel citoplasma c’è la sintesi proteica.

Si sa che le proteine sono rilasciate di solito nel reticolo ergastoplasmico e per questo serve una parte per il
riconoscimento del reticolo. Poi le proteine possono essere modificate con aggiunta di zuccheri e trasportate come
vescicole nel Golgi. Quindi i ribosomi si avvicinano al reticolo, una parte di proteina ha un segnale che riconosce il
sito del reticolo e la proteina si allunga e forma un polipeptide rilasciato nel reticolo. La sequenza segnale viene
rimossa, si aggiungono zuccheri e la proteina entra in vescicole prodotte nel reticolo e queste si possono fondere con
il Cis-Golgi dove può essere parzialmente modificata e poi va nel Trans-Golgi e poi nel citoplasma oppure nella
superficie come vescicole di secrezione.

Nella modificazione delle proteine si possono formare ponti disolfuro, tagliare sezioni, combinare con altre subunità,
ripiegamento, processi post-traduzionali. Se io coloro la tubulina acetilata che è una forma + stabile della tubulina
non c’è la rete di microtubuli ma assonemi perché sono molto + stabili che in tutti gli altri microtubuli e quindi sono
visibili anche dopo trattamenti con farmaci. quindi anche la tubulina può andare incontro a un processo successivo
alla traduzione.
L’insulina è prodotta come pre-pro-insulina e ci sono gruppi SH, si rimuove la sequenza segnale, si ha ripiegamento
grazie ai ponti disolfuro e ancora però la proteina non è definitiva e si ha taglio con formazione di insulina definitiva
quindi serve questa modificazione successiva.

La struttura quaternaria è tipica di emoglobina.

Le proteine non vivono all’infinito ma sono degradate a livello di un complesso che sono i proteasomi e quindi
queste proteine sono legate all’ubiquitina che è un segnale che indica che devono essere degradate e quindi entrano
nel proteasoma e vengono degradate formando peptidi che vengono riusati.
RNA

Esistono vari RNA:

 mRNA: catena di nucleotidi che rappresenta la trascrizione dei geni quindi trasferisce l’informazione

 tRNA: è l’RNA a singola catena ripiegato e che trasporta amminoacidi basandosi sulla presenza di un
anticodone nella struttura

 rRNA: è abbondante ed è coinvolto nella traduzione di mRNA per cui ha dei siti di legame e ce l’ha anche per
il tRNA
l’idea è che l’RNA sia fondamentale nel differenziamento della cellula perché porta le informazioni dei geni e le fa
tradurre in proteine. L’inizio della traduzione di mRNA può essere regolata in momenti diversi, o dopo la
fecondazione che inizia il cleavage e si attivano simultaneamente gli mRNA. L’mRNA viene poi degradato, infatti la
sua aspettativa di vita risiede nel 3UTR ovvero nel 3’ non trascritto. Oltre a mRNA, tRNA e rRNA, ricerche + recenti
hanno identificato anche altri RNA coinvolti direttamente nel differenziamento cellulare. Gli RNA scoperti possono
essere coinvolti in un processo di ritardo o annullamento della traduzione o nella degradazione di altri mRNA e
questo processo è l’RNA interference. Questi RNA sono non codificanti e la maggior parte del genoma è coinvolto
nella trascrizione di questi RNA non codificanti con funzioni importanti. Ci sono 2 tipi di RNA non codificanti:
1. microRNA: sono molto corti, si trovano fin dall’inizio nelle piante e animali anche se questa presenza può far
pensare ad un’origine comune in realtà si pensa alla convergenza evolutiva. I microRNA interagiscono con mRNA
in 2 modi: si legano a mRNA e li possono degradare o possono bloccarne la traduzione. I microRNA sono trascritti
nel nucleo da appositi geni, si formano i pre-microRNA e poi attraversano i pori e vanno nel citoplasma con
l’esportina e lì interviene l’endoribonucleasi che taglia l’ansa terminale e quindi così ho un RNA a doppio strand e
ora l’elicasi taglia le 2 catene e le separa, 1 viene degradata e l’altra forma il complesso RISC che tramite enzimi si
può legare o a mRNA corrispondente impedendone la traduzione o può portare alla sua degradazione. Ciò indica
che nel genoma ci sono mRNA ma anche microRNA che hanno una sequenza che corrisponde a quella di molti
mRNA. Il segmento usato è complementare all’mRNA che si vuole controllare e questo segmento controlla l’mRNA
in 2 modi andando a determinarne la degradazione o un ritardo o un blocco nella traduzione.

Si ha il gene che trascrive per mRNA e l’mRNA viene portato nel citoplasma e di solito tradotto, ma nel nucleo c’è
anche 1 gene che trascrive micro-RNA con sequenza complementare al gene precedente, quindi ho 1 gene che deve
funzionare per trascrivere e 1 micro-RNA che lo controlla. Il micro-RNA viene ora esportato e poi con endonucleasi ed
elicasi rimane la singola catena complementare ad mRNA che dovrebbe tradurre una proteina, ma quando si forma il
complesso RISC degrada o inibisce l’mRNA. Il trascritto primario del microRNA è abbondante ma poi si usa solo una
piccola catena a forma di forcina. Tutto ciò controlla la traduzione perché l’mRNA viene silenziato.

2. Small interfiring RNAs: si basano sulla presenza di RNA double strand che di solito arriva da fuori dalla cellula e
quindi possono essere RNA virali che entrano nella cellula tramite endoribonucleasi la doppia elica viene tagliata
e ridotta a singola catena dall’elicasi e la singola catena è complementare ad 1 mRNA che viene degradato
perché nel complesso c’è endonucleasi ergonauta. Questo sistema viene usato in laboratorio per formare RNA
interference per impedire la traduzione di certi mRNA e controllare i fenotipi che determinano.

la differenza tra i 2 RNA è che siRNA è esogeno cioè a doppia catena esogeno, mentre miRNA è a singola catena.
Questi 2 RNA quindi si riconoscono non tanto per le dimensioni, ma la prima è una doppia elica e la seconda singola.
Poi il siRNA è esogeno ovvero arriva dall’esterno e poi l’endonucleasi riduce le catene in piccole catene che tramite
elicasi si separano, mentre miRNA è prodotto nel nucleo e quindi è endogeno. L’siRNA è importante perché
dovrebbe mantenere l’integrità del genoma anche se entrano molecole esterne, i mammiferi non ce l’hanno ma ce
l’hanno le piante e gli animali + bassi. Mentre i miRNA ci sono sia in animali che piante.
Come fanno le cellule a sapere quali geni e quando devono essere attivati durante il loro sviluppo?
Di solito gli organismi usano 2 sorgenti di informazioni:
1. Diretta: viene dalla cellula che si divide
2. Informazione che viene dalle regioni circostanti all’organismo

Diretta

La cellula si divide e da origine a 2 colonie di cellule e quindi ci si chiede cosa rende diverse le 2 cellule così da fargli
originare figlie diverse. L’idea è che ci siano determinanti citoplasmatici che indicano il destino cellulare.

L’idea dei determinanti citoplasmatici non è valida in generale ma in alcuni casi si. Si considera la cellula madre che si
divide con i determinanti all’interno e queste informazioni prima che la cellula si divide si distribuiscono in modo
asimmetrico e quindi quando si divide ho 1 cellula che ha certe informazioni e l’altra no. Le informazioni sono
proteine o mRNA. Si ha l’uovo non fecondato con ripartizione diversa di determinanti citoplasmatici e quando si
forma lo zigote esso si divide e parte delle informazioni rimangono in cellula A mentre nella B ce ne vanno altre e
quindi queste 2 sono diverse. Queste informazioni sono importanti perché ci sono geni che determinano la polarità
dell’embrione, alcune informazioni localizzate in un punto determinano la parte anteriore e altre quella posteriore e
queste informazioni sono distribuite secondo gradiente di concentrazione.

Si considera una cellula all’inizio del cleavage negli anfibi dove si ha la semiluna grigia e durante lo sviluppo normale
la semiluna grigia è tagliata in 2 parti uguali dal solco di divisione e se tagli questo embrione a 2 blastomeri nascono
2 girini uguali. Ma se io sposto il solco e faccio in modo che solo 1 blastomero riceve la semiluna, si nota che solo da
esso nasce 1 girino normale l’altro è informe quindi già nella semiluna ci sono informazioni essenziali pewr lo
sviluppo embrionale.
L’esperimento di Foundrish diceva che le informazioni sono ripartite in modo asimmetrico e separando i blastomeri
superiori da quelli inferiori ottengono larve anomale mentre se li lascio in relazione ottengo uno sviluppo normale.
Le ascidie hanno nella parte basale i muscoli e se all’inizio dello sviluppo tolgo 1 blastomero vedo che i muscoli si
formano solo lì perché lì c’è l’informazione per i muscoli. I granuli P sono un altro esempio perché alla fecondazione
vanno nella regione posteriore e poi rimangono isolati nei precursori della linea germinale. La stessa localizzazione
asimmetrica di informazioni si ha nel moscerino con VASA che determina la formazione di precursori della linea
germinale, infatti sta al polo posteriore e quelle cellule si sviluppano solo lì.

La localizzazione asimmetrica delle proteine fa pensare a come fanno a localizzarsi così. Gli mRNA possono essere
trasportati tramite elementi citoscheletrici. Si prende un uovo con distribuzione di mRNA nella parte vegetativa dopo
la fecondazione. Questa distribuzione è legata alla polarità del citoscheletro perché i microtubuli hanno un + dove
crescono per addizione di dimeri, e – dove i microtubuli si accorciano. La stessa cosa per i microfilamenti di actina
con + e -. Alcune proteine si muovono sfruttando la polarità e trasportano mRNA che hanno regione non trascritta a
3’, il 3UTR che si lega a proteine adattatrici e se è legato a 1 proteina che lo associa alla miosina, l’mRNA si può
spostare da – a +.

Questi meccanismi sono intrinseci.

Ambiente extracellulare
I meccanismi estrinseci si riferiscono a molecole che determinano il destino cellulare e stanno nello spazio
extracellulare fuori dalle cellule. Questi meccanismi possono essere raggruppati in 2 processi:
 1) Ci sono segnali che vengono secreti da altre cellule e quando la cellula si divide le 2 figlie sono uguali ma 1
riceve segnali e attiva o reprime geni
2) Interazione cellulare che porta ad accensione o spegnimento di geni

Quindi le informazioni possono arrivare dall’esterno e quindi le 2 figlie hanno 2 destini diversi in base alle
informazioni che ricevono.

Un esperimento è quello di Spemann e Mangold che usano l’embrione di anfibio molto grande. Loro presero
all’inizio di una gastrula un pezzetto di tessuto sopra al blastoporo, quindi nel labbro dorsale e lo trasferiscono in
un’altra gastrula ma in posizione diversa e videro che si formava un 2° tubo neurale. Questo è importante perché
sottolinea che le cellule inviano segnali ad altre cellule e determinano il cambiamento del loro destino.

Quindi ci si chiede se sono le cellule trapiantate che si trasformano o quelle della gastrula che ricevono segnali e
cambiano il loro destino. Si prende il labbro dorsale del blastoporo da gastrula non pigmentata e vedo che
l’embrione che ottengo ha un tubo neurale normale e 1 indotto e vedo che la notocorda ha cellule non pigmentate
mentre il tubo è fatto da cellule dell’ospite quindi è l’ospite che trasforma cellule in seguito al ricevimento di
informazioni e quindi si adatta. Ciò indica che la corda emana dei segnali, ovvero induce la formazione del sistema
nervoso. Questo processo è stato detto di induzione da parte dell’organizzatore che è il labbro dorsale del
blastoporo.

Questi risultati ottenuti con lo Xenopus si ottengono anche con gli uccelli. Se prendo embrioni di papero e pollo so
che il nodo di Hensen è analogo al labbro, se lo trapianto nel pollo ottengo l’induzione di un altro tubo neurale e
quindi ha la stessa capacità del blastoporo. Il tubo neurale non è formato dal tessuto trapiantato ma quello forma la
notocorda che induce la formazione del 2° tubo neurale nell’ospite.

Induzione

L’induzione è un processo centrale per lo sviluppo perché induce l’accensione o spegnimento di geni target.
L’induzione fa sì che i geni possano attivare o disattivare la loro funzione e questa induzione è mediata da molecole
che influiscono sul destino cellulare e sono prodotte a livello di altre cellule che sono gli induttori.i ligandi si legano al
recettore che attivano una serie di segnali. Ma la cellula può anche non avere il recettore quindi se ne ho 2 solo
quella con recettore viene attivata. Poi anche la cellula indotta può fare a sua volta da induttore e quindi questi
passaggi portano al differenziamento di + cellule. B invia segnali ad A e le cellule + vicine a B ricevono sgenali e
attivano geni e formano cellule C che producono segnali in 2 sensi opposti e interessano sia A che B che si
trasformano in D ed E e quindi ottengo 5 tipi di cellule diverse tramite interazione e scambio di segnali.

L’induzione può essere:

 Sequenziale

 Istruttiva
  Ha specificità genetica e regionale

È sequenziale perché il blastomoro e nodo di Hensen inducono la formazione della notocorda che induce la
neurulazione e quindi l’induzione è in sequenza.

La specificità regionale si spiega pensando alle penne dell’uccello che si formano dall’epitelio delle ali e quindi ci si
aspetta che l’epitelio delle ali dia sempre le penne ma non è così perché se prendo il mesenchima che sta sotto
l’epitelio delle ali ottengo le penne, ma se prendo il mesenchima che sta sotto l’epidermide che sta nelle zampe e lo
metto a contatto con l’epitelio delle ali si formano le unghie tipiche delle zampe. Quindi è l’epidermide delle ali che
forma le penne ma i segnali devono arrivare dal mesenchima che sta sotto all’epitelio delle ali e se io cambio questo
mesenchima infatti non ottengo penne. Quindi è importante anche il tipo di segnalazione della regione considerata.

La specificità genetica si spiega trapiantando una regione della gastrula della rana in quella di un tritone e viceversa.
Quando trapianto questa regione della gastrula della rana che dovrebbe dare l’ectoderma della parte orale, ovvero i
bilancieri, ma se prendo questa regione e la trapianto nella stessa area che dovrebbe dare ectoderma orale del tritone
ottengo un tritone con delle ventose che sono tipiche dei girini quindi questo pezzo di tessuto trapiantato si trasforma
in regione orale ma mantiene l’informazione del donatore quindi nella parte orale del tritone si formano le ventose.
Se faccio l’operazione inversa ottengo nella rana i bilancieri, quindi un girino con bilancieri del tritone e quindi l’identità
genetica della struttura viene mantenuta e quindi il tessuto origina la regione orale ma in un caso quella della rana e
nell’altro del tritone. Quindi la specificità genetica indica che i segmenti danno l’informazione per la regione orale ma
la formano in base alla loro provenienza.

L’induzione è poi istruttiva. Siamo nell’occhio e all’inizio ho la vescicola otica che induce la formazione di lente e
cristallino e poi si piega per formare la retina. Quindi viene istruito il tessuto che sta difronte alla struttura che induce
a formare la lente. Se io vado a vedere osservo il cervello e la vescicola otica che induce la formazione della lente,
quindi se tolgo la vescicola la lente non si forma, ma se la sposto e la metto posteriormente non si forma la lente
perché le cellule dell’ectoderma non sono in grado di rispondere alle informazioni della vescicola ottica.
Le informazioni alla base dell’induzione

Nell’embrione c’è un passaggio di informazioni, la cellula secerne molecole segnale che hanno recettori e quindi ho
l’induttore che è il ligando che si lega al recettore, il complesso attiva la trasduzione del segnale che fa accendere o
spegnere geni. Le cellule possono comunicare per diffusione del segnale oppure per diretto contatto, oppure per
giunzioni GAP fatte da strutture con gruppi di proteine che formano canali tra cellule vicine. Alcuni piccoli ioni
possono passare attraverso i canali.

La segnalazione può avvenire con vari modelli:

 Autocrina: la cellula stessa produce il segnale e lo recepisce

 Paracrina: è la + diffusa con cellula secernente che produce un segnale recepito da cellula target tramite
recettori di superficie. Questa non è a lungo raggio

 Endocrina: è a lungo raggio perché avviene con la secrezione di ormoni che viaggiano nel circolo sanguigno e
interessano anche cellula molto distanti

Le segnalazioni hanno 2 modi per entrare nella cellula che dipendono dalla tipologia di molecola:

1. Molecole idrofiliche: non attraversano il doppio strato liberamente ma si devono legare a recettori di superficie
che se attivati determinano la trasduzione del segnale e la produzione di secondi messaggeri che entrano nel
nucleo.

2. Molecole idrofobiche: attraversano il doppio strato e quindi non gli servono recettori. Entrano nel citoplasma
dove trovano il recettore, ovvero proteine che fanno da recettori per ormoni, la proteina si combina con
l’ormone, il complesso dimerizza e entra nel nucleo dove attiva la trascrizione di certi geni.
Un fattore paracrino è idrofilico e non può entrare quindi si lega al recettore che si attiva e determina la trasduzione
del segnale ovvero il passaggio dal recettore al nucleo tramite passaggi intermedi. Si ha il recettore a cui si lega il
ligando e quindi il recettore si attiva e di solito i recettori hanno la capacità di fosforilare altre proteine target nel
citoplasma e queste vengono attivate in sequenza fino a che l’ultima entra nel nucleo e fa esprimere il gene. Il
ligando si lega al recettore e questo legame fa attivare il recettore che può portare a fosforilazione, canali ioni,
complessi proteici, che determinano l’attivazione di fattori di trascrizione e la trascrizione o repressione dei geni.

Il recettore è fatto da 2 molecole, 1 dominio tirosinchinasico nella coda e quando arriva il ligando fa dimerizzare le 2
molecole e si attiva la tirosinchinasi e questo porta alla fosforilazione di proteine che prima erano inattive e quindi
vengono fosforilate in sequenza fino a che si attiva un gene nel nucleo.
White-spotting è una mutazione che codifica per un recettore di membrana. Quando il recettore è mutato succede
che la traduzione non c’è e quindi si assiste a un fenotipo con macchie con assenza di melanina.

Quindi i recettori sono di tipo diverso, alcuni non hanno attività tirosinchinasica e altri sono ripiegati nella membrana
plasmatica. Un tipico recettore lega il ligando, attiva la capacità tirosinchinasica che porta alla fosforilazione di
fosfolipasi C. Ma se il recettore non ha attività tirosinchinasica, la sua attivazione non porta alla fosforilazione ma si
ha legame diretto con DNA.
Poi c’è un recettore con 7 alfa eliche che si ripiegano e occupano la membrana plasmatica. Questi 3 tipi di recettori
sono molto diffusi.

Ligandi

I ligandi sono raggruppabili in 4 gruppi:

1. Fattori di crescita dei fibroblasti

2. Fattori della famiglia di hedgehog

3. La famiglia Wnt
4. Superfamiglia di TGF-B

Segnali justacrini
Sono segnali trasmessi tramite giunzioni Gap oppure segnali che si basano sull’interazione con la matrice
extracellulare.
Nel caso di interazione cellula matrice i fibroblasti tramite integrine contattano glicoproteine e vari tipi di strutture
fibrillari nella matrice stessa. Tramite le integrine le cellule dell’epitelio contattano la lamina basale. si ha una cellula
con integrine che sono molecole di adesione fatte da alfa e beta dimero e nella parte citoplasmatica contattano
proteine per il ponte con l’actina e nella parte extracellulare i dimeri contattano la fibronectina che serve per il
movimento delle cellule.
Se ho epitelio senza membrana basale, le cellule proliferano, poi questa si forma e le cellule contattano la laminina.
Quando non c’è membrana basale è attiva ciclina D che si lega alla chinasi Cdk per formare MPF e consentire la
divisione cellulare e quindi proliferano. Quando contattano la membrana basale la ciclina D non viene prodotta e le
cellule non si dividono ma si esprime lattoferrina e si forma una cavità che è il lume di un tubulo in cui viene secreto
latte. Questa è la dinamica della formazione della ghiandola mammaria del topo in cui il contatto è molto
importante.

Un modo di contatto sono anche le giunzioni GAP in cui le membrane di cellule adiacenti sono vicine e si formano
canali e si scambiano ioni. Se inietto in un embrione allo stadio di 8 cellule un anticorpo contro la connessina che
forma i canali, non si formano le GAP e si forma solo una parte di embrione perché le cellule non hanno +
l’informazione dovuta allo scambio. Le molecole segnale vengono secrete da cellule o regioni particolari
dell’embrione e si sviluppa la posizione informazionale, ovvero la cellula si sviluppa in base alla sua posizione
nell’embrione perché le molecole segnale controllano la posizione e sono rilasciate e si distribuiscono secondo
gradiente. Le molecole segnale sono morfogeni.

I morfogeni sono prodotti da cellule che secernono il ligando che va nello spazio extracellulare e cellule in posizione
diversa ricevono concentrazioni diverse del segnale, quelle + vicine ne ricevono di + e viceversa. Quindi questo
implica che le cellule vicine sono indotte a differenziarsi.
Alan Turing spiega matematicamente il morfogeno e poi Wolpert sviluppa il concetto di informazione posizionale
espressa come “il concetto della bandiera francese” perché dice che se si hanno 6 cellule con lo stesso potenziale per
diventare blu, bianche o rosse, ho concentrazione diversa del segnale perché questo parte dall’asta della bandiera e
quindi + ci si allontana e – lo ricevono. I coloro sono stabiliti perché il blu richiede una carta concentrazione di
morfogeno e poi + bassa in bianco e ancora + bassa il rosso. Quindi il gradiente di un morfogeno decresce a partire
dalla sorgente e determina l’info posizionale cioè le cellule hanno info in base alla loro posizione. Quindi la distanza
dalla sorgente è fondamentale per la determinazione del destino cellulare. Quindi l’informazione posizionale è
relativa alla distanza delle cellule dalla sorgente del morfogeno.
Se immaginiamo 3 cellule tutte hanno gli stessi geni, stessi recettori, ma la cellula 1 riceve tanto morfogeno, la 2 – e
la 3 quasi per niente. Quindi la 1 ha un grande numero di recettori occupato, la 2 – e la 3 quasi nessuno. Quindi un
alto livello di recettori occupati porta per es. all’attivazione di geni A, B, C mentre se ce ne sono meno si attivano solo
B, C e nell’ultimo caso solo C.
Si può interpretare la concentrazione del morfogeno perché nel moscerino c’è il gene Dorsale espresso di + nella
parte ventrale e assente nella regione dorsale, quindi le cellula della ventrale hanno tanto ligando, - in quelle
intermedie e per niente in quella dorsale. Nella regione ventrale si attiva 1 gene, nell’intermedia un altro, mentre in
altro si attiva un altro ancora.
Nel moscerino si ha regionalizzazione di campi morfogenetici in riposta alla concentrazione di certe informazioni.
Un altro esempio è quando si forma il tubo neurale perché c’è induzione dalla corda che produce anche segnali e
quindi le cellule del tubo neurale + vicine ai segnali hanno ligando > di quelle lontane e proprio questa
concentrazione di ligando recepito dalle cellule porta alla formazione di neuroni diversi tra loro. Dove ho tanto
ligando perché + vicino si formano neuroni diversi da altri che sono in alto.

Alla base del morfogeno c’è la sua diffusione verso le cellule target, infatti le cellule sorgente sono tutte unite tra
loro e quindi ci si chiede come avviene la diffusione del morfogeno. In studi + recenti hanno fatto pensare a
meccanismi alternativi. Wolpert è il teorico della diffusione del morfogeno ma nel lavoro successivo parla di
meccanismi in + o alternativi alla semplice diffusione, quindi meccanismi che danno informazione posizionale. Tutto
nasce dal moscerino con testa, torace, ali e bilancieri. Le strutture dell’adulto nascono da strutture indifferenziate
dette dischi immaginali, perché nella larva ci sono dischi che dopo la metamorfosi in pupa, in particolare quelli delle
ali hanno una polarità determinata dall’espressione di certi geni, nella parte posteriore è espresso Ingreiled che
attiva Edgeog rilasciando un segnale che va anche nel confine tra parte anteriore e posteriore e questo attiva Dpp
che a sia volta invia segnali sia nella parte posteriore che anteriore, ed essendo un segnale diffusibile si pensa che
venga diffuso ma i dischi sono appiattiti e compatti e per questo le cellule all’interno hanno lunghi prolungamenti
chiamati citonemi e l’idea per la diffusione è data da 4 possibilità:

1. Libera diffusione: Dpp si lega al recettore nelle cellule + vicine e attiva recettori in quelle intermedie ma non
attiva quelle + lontane

2. Transcitosi: il ligando viene internalizzato in vescicole che passano di cellula in cellula

3. Diffusione limitata alle cellule + vicine dalla presenza della matrice extracellulare, ovvero glicoproteine che
potrebbero limitare la diffusione del morfogeno che comunque si muove

4. Filamenti che sono citonemi hanno recettori per Dpp che quindi ci si lega e quindi i citonemi si dirigerebbero
verso la fonte del segnale captando il segnale stesso

Una semplice diffusione può mettere in comunicazione cellule, ma se voglio che la cellula riceva il segnale ma le altre
intermedie no, non ci può essere semplice diffusione. Se questa cellula ha il citonema, questo passa tutte le cellule
intermedie e interessa solo quella + lontana senza innescare reazioni a cellule + vicine. Ciò può spiegare il problema
di Edgeog e Dpp nel disco immaginale dell’ala perché Dpp è secreto nella parte anteriore e posteriore e ho citonemi
che rilasciano il Dpp. Edgeog è riversato nella parte anteriore e infatti le cellule che producono Edgeog hanno i lunghi
filamenti che interessano le cellule + vicine della parte anteriore. Quindi secondo questa idea sarebbero cellule con
protrusioni a dare l’interazione.

Ho 3 possibilità:

1. La cellula produce il segnale e viene trasportato dai citonemi e le cellule hanno il ligando
2. La cellula va a cercarsi il ligando perché ha lei il citonema con recettore

3. La cellula segnale riceve segnali con ligando e la cellula ricevente ha citonemi con il recettore

A differenza della semplice diffusione posso avere informazione indirizzata in modo + corretto.

La cellula produce il segnale perché attraverso il Golgi si assemblano i ligandi che poi vengono liberati con vescicole.
In un caso il segnale rimane ancorato alla membrana plasmatica quindi non è un ligando diffusibile. La cellula target
emette lunghi filamenti con il recettore che lega il ligando e poi il recettore torna a livello basale dell’estroflessione
con il ligando e si ha la segnalazione. Oppure la cellula che produce segnali ha citonemi che espongono il ligando, la
cellula ricevente ha citonemi con recettore, i 2 si legano. Oppure la cellula produce segnale e forma citonemi in cui
all’apice ci sono i ligandi e contattano il recettore nella cellula ricevente.

Il caso tipico è di Drosophila ma diverso è dei Vertebrati. Nei Vertebrati si ha la cellula che produce il segnale che
inizialmente ha il ligando nella sua superficie e forma il citonema che va a contattare il recettore specifico che sta
nella cellula ricevente.
In Drosophila la cellula che produce il segnale ha ligando ancorato e la ricevente crea citonemi su cui corrono i
recettori che contattano il ligando e trasportano attraverso un processo retrogrado alla cellula ricevente.
Il sistema di trasferimento del segnale è noto da poco tempo. I citonemi in realtà possono essere classificati a
seconda delle strutture citoscheletriche che ne determinano la protrusione:

- Citonemi che si allungano per la polarizzazione dei filamenti

- Citonemi che si allungano per polarizzazione di Tubulina

- Citonemi che sono come 2 cellule unite da un lungo ponte con Actina e Tubulina.

Nei primi 2 il trasporto è unidirezionale perché ci si sposta lungo microtubuli o microfilamenti e si va verso la polarità
dell’elemento citoscheletrico. Nel 3° caso è bidirezionale. I lunghi tubi a ponte sono nanotubi e sono grandi
estroflessioni che uniscono 2 cellule e permettono il passaggio di informazioni e mitocondri.

Nela parte apicale del testicolo c’è la nicchia staminale e il mantenimento della staminalità si deve a segnali rilasciati
da cellule dell’Hub che rilasciano segnale Dpp che si diffonde e ricevono + segnale le cellule + vikcine che rimangono
staminali perché inattivano bam mentre le + lontane si differenziano perché non gli arriva Dpp. + recentemente si
dimostra che le staminali hanno lunghi prolungamenti che entrano nel citoplasma di cellule Hu. I filamenti sono
necessari per lo scambio di segnalazione e quindi ricevere Dpp, perché le Hub producono Dpp e i prolungamenti
pescano questo Dpp in cellule Hub. Quindi ho una possibilità maggiore di ricevere in modo corretto il segnale.

I citonemi si trovano anche quando si ha la formazione dell’arto del topo che nasce da una gemma dell’altro, poi si
forma la zampa, le dita, e la loro separazione. La gemma ha una parte posteriore e una anteriore. Si produce Sonic
Hedgeog che si diffonde e come al solito la diffusione nel tessuto non è semplice e quindi si pensa che il segnale
venga rilasciato tramite citonemi. Le cellule target ricevono il segnale perché hanno lunghi citonemi dove espongono
il recettore.

Secondo un autore i nanotubi sono gli ancestori dei contatti tra cellule del sistema nervoso e quindi avrebbero
proprietà simili a quelle delle sinapsi.

Le cellule si differenziano in seguito alla presenza di segnali, ma il pattern può venir fuori anche da un processo di
competizione tra cellule con la stessa potenzialità e si ha inibizione laterale, ovvero ho 1 cellula centrale circondata
da 6 cellule e la centrale vince e induce le altre 6 a rimanere tali e non differenziarsi. Questa inibizione è stata
studiata in Drosophila e in particolare è interessante la formazione del sistema nervoso. Una gastrula ha cellule che
formeranno il mesoderma e poi si ripiegano e all’interno rimane il mesoderma. Lateralmente c’è neuroectoderma e
sopra epidermide quindi il neuroectoderma sono le cellule da cui origina il sistema nervoso. È chiaro che le cellule
necessitano di particolari informazioni e infatti Twist è il gene che con Snale determina il destino mesodermico,
mentre Romboid determina il destino di neuroepitelio.

I neuroblasti danno origine al sistema nervoso. I neuroblasti si staccano dal neuroepitelio e danno origine a cellule
che si differenziano in neuroni. Il neuroepitelio ha cellule che si staccano e diventano neuroblasti e sanno di essere
neuroblasti nonostante abbiamo la stessa potenzialità di quelle circostanti perché il neuroblasto quando si divide si
divide asimmetricamente e forma lui stesso e 1 figlia che per mitosi da figlie che si differenziano in neuroni. Per
arrivare al neuroblasto ho un neuroepitelio con cellule tutte con la stessa potenzialità e i neuroblasti si selezionano
con l’inibizione laterale. Alla base della selezione c’è il gene Notch e la segnalazione delta è fondamentale per
l’inibizione perché Notch è il recettore e delta è il ligando. La cellula che rimane neuroblasto espone delta che nelle
cellule vicine attiva Notch e impedisce di farle diventare neuroblasti.
Noth è un recettore con parte extracellulare e 1 intracellulare e quando è attivato una regione viene tagliata. Notch
è importante ma non presente in Drosophila mentre sta in tutti gli animali perché è una molecola segnale che
mantiene la staminalità e quindi può definire la decisione delle cellule e poi influisce sul differenziamento cellulare.
Io ho 2 cellule, la cellula A ha il ligando delta che attiva Notch che porta alla inattivazione dei geni che determinano la
formazione di delta. La cellula A dice a B che Notch deve essere attivato e quando B lo attiva si inattiva delta e quindi
A non ha + Notch attivo e questo fa sì che quella celula si trasformi in neuroblasto e quelle circostanti rimangono
staminali.
Ci sono 14 segmenti in Drosophila e il gene Segment polarity indica quale è la parte anteriore o posteriore di un
segmento. Ingreiled si trova nella regione posteriore dei segmenti e quindi ne ho 14 per cui ho 14 strisce. Tra una
striscia e l’altra nel segmento ci sono strutture dette clusters proneurali che esprimono un complesso di geni
acheate/scute che corrispondono a cellule. Quando è avvenuta inibizione naturale lo spot è limitato a 1 cellula.
All’inizio 7 esprimono acete e alla fine solo quella centrale che si sviluppa in neuroblasto. Se ho un mutante non si
formano i neuroblasti ma se ho un mutante nei geni neurogenici che determinano la formazione dei neuroblasti ho
troppi neuroblasti e si hanno tumori.

Il cluster proneurale ha tutti che esprimo Achete, la cellula centrale vince, si trasforma in neuroblasto, va all’interno
e si divide ed è detta gangliar mother cell. L’inibizione laterale è caratterizzata da un doppio segnale, delta che è il
ligando e Notch che è il recettore ma il ligando è ancorato alla membrana della cellula che lo produce e non è
diffusibile. All’inizio tutte le 7 cellule hanno la stessa potenzialità e producono segnale e hanno recettore, poi la
cellula centrale produce + delta e quindi induce la cellula ricevente a produrre + Notch che disattiva la produzione di
delta e quindi basta uno spostamento di equilibrio per avere 2 cellule diverse, 1 che produce delta detta neuroblasto
e l’altra che produce solo Notch rimane epiteliale.

Inizialmente tutte le 7 cellule hanno delta e Notch quindi sono tutte uguali. Poi c’è uno sbilanciamento e la cellula
centrale produce + delta e attiva + Notch che porta allo spegnimento di Achete alla base della produzione di delta e
quindi quella cellula non produce + delta e l’altra non ha + Notch e quindi diventa neuroblasto.

Notch ha una parte citoplasmatica che si stacca quando delta si lega a Notch. Questa regione va nel nucleo e attiva
un gene che è Suppressor di Airless che attiva enhancer e spit proteins che inibiscono achete. Quindi qui delta non
c’è e quindi Notch non è attivo e la cellula diventa neuroblasto e si divide simmetricamente per produrre neuroni
ecc.

Nei vertebrati nella piastra neurale si esprime la proteina Neurogenina correlata ad Achete di Drodophila e quindi
succede qualcosa di simile. Nello Xenopus si ha la cellula in equilibrio con le altre ma poi delta si lega a Notch, la
proteasi taglia la coda che va sul nucleo e attiva geni che impediscono la trascrizione della neurogenina che è
l’analogo di achete e non si forma delta e quindi quella cellula rimane del neuroepitelio, l’altra invece si differenzia in
staminale della cellula nervosa.

Differenziamento cellulare
ci si chiede come fanno le cellule a sapere cosa devono fare? Nell’Ascaris si perde cromatina e quindi rimangono tali.
Gli eritrociti derivano da eritroblasti che perdono il nucleo e quindi non possono cambiare la loro natura.

Ci sono 3 possibilità per mantenere il differenziamento:

- Stimolazione autocrina: il recettore attivato determina la trasduzione del segnale che porta l’enhancer ad
attivare il promotore e ciò porta alla trscrizione di un mRNA che viene traslato in una proteina, secreto all’esterno
dove si lega al recettore della stessa cellula e quindi il loop mantiene l’espressione dei geni che caratterizzano la
cellula.

- Il recettore attivato attiva l’enhancer che accende un gene che trascrive per un fattore di trascrizione che va
nel nucleo e si lega a un altro enhancer e attiva lo stesso promotore di partenza e così il promotre viene
mantenuto attivo e i geni sono tenuti attivi

- Loop paracrino: avviene tra 2 cellule e questo è tipico della polarità del segmento del moscerino con 2 geni
che determinano il mantenimento del differenziamento. La cellula produce un segnale che viene captato dal
recettore della seconda cellula e il recettore attiva un gene che produce un altro segnale che a sua volta viene
indirizzato alla prima cellula che attiva il recettore che a sua volta attiva il gene che fa sì che avvenga la produzione
del segnale captato dal recettore della seconda ecc. quindi ho un anello e se lo interrompo 1 delle 2 cellule non
può + rimanere differenziata nella cellula iniziale.
Regolazione genica eucarioti

Ciò che regola l’espressione e mantiene il differenziamento è l’impacchettamento. Un es. di condensazione estrema
si presenta nel bilanciamento del cromosoma X che nei mammiferi XX è bilanciato dall’inattivazione di 1X per
condensazione di cromatina tramite l’acetilazione o la metilazione. L’acetilazione determina la decompattazione
della cromatina.
In metilazione si hanno sistemi per mantenere inattivi alcuni geni. La metilazione è importante anche per lo sviluppo
perché si esprimono 2 geni per la globina trascritti in momenti diversi. Prima si trascrive quello per la epsilon globina
perché l’altro è metilato e poi dopo un po' avviene il contrario per la gamma globina quindi è importante per la
regolazione temporale per l’espressione genica.

Le cellule di un organismo, hanno lo stesso contenuto di DNA ma nel differenziamento solo una parte è trascritta in
cellule diverse. La sequenza non cambia ma cambia la struttura della cromatina. la potenzialità di un nucleo, nel
senso della possibilità di dare cellule diverse diminuisce all’aumentare del differenziamento.

Quindi ci si chiede se si possono inattivare geni, o se l’inattivazione è reversibile. Ci sono 2 processi:

1. Transdeterminazione: cellule determinate a dare una struttura ne danno una diversa

2. Transdifferenziamento: è il processo con cui cellule differenziate che già supportano una funzione cambiano
e diventano di altro tipo.
Transdeterminazione

In Drosophila gli organi si formano dai dischi immaginali della larva. È come se la struttura del disco simile a un
bersaglio, si allunga e i dischi concentrici scivolano l’uno sull’altro per dare per esempio la zampa. Le cellule sono
tutte uguali nei dischi ma se sono determinate, allora se prendo il disco di una zampa e lo trapianto in un’altra larva
dovrebbe darmi una zampa ed effettivamente è così.
Si arriva alla transdeterminazione ma non si capisce il meccanismo molecolare. L’esperimento è prendere il disco di
una zampa, tagliarlo a metà e metà lo metto nella parte addominale di una pupa e l’altra metà nell’addome di un
adulto. Quando metto il disco nella pupa c’è ecdisone e quindi le cellule proliferano e differenziano in zampa,
mentre nell’adulto le cellule proliferano ma non differenziano, allora questo da un terreno si coltura. Dopo un po' si
vede che il disco non da una zampa ma un’ala e ciò accade quando ho un certo numero di passaggi. Quindi faccio il
primo in cui taglio a metà il disco e lo metto nella larva e trovo la mosca con zampa in + e lo ripeto + volte e poi mi
compare un’ala, poi un occhione ecc. Quindi le cellule perdono il loro indirizzo iniziale e si scordano che dovevano
formare una zampa.

Sembra che alla base di questo processo ci sia l’espressione non corretta del gene wingless che potrebbe alterare
l’espressione di geni selettori che determinano la formazione di ala, zampa ecc. un gene selettore sa regolare
l’attività di altri geni. Si pensa che l’espressione alterata si wingless regola l’espressione di geni selettori come
eyeless ortologo di Pax6 che se lo faccio esprimere nella zampa lì ottengo un occhio.

Transdifferenziamento
Il differenziamento è stabile perché una cellula differenziata rimane tale, ma a volte si può tornare indietro con
transdifferenziamento. Si prende una cellula umana del fegato e una muscolare del topo e si fondono e si vede che
quella del fegato produce proteine muscolari e quindi significa che questa cellula messa in ambiente diverso, cambia
il suo differenziamento.

Si prendono cellule della retina del pollo si mettono in coltura per fare epitelio pigmentato con microvilli, poi si
cambiano le condizioni di coltura, i microvilli si ritraggono, le cellule si sovrappongono e si formano le cellule della
lente e quindi transdifferenziano.

In natura una condizione riguarda il tritone che sa costruire il cristallino, infatti se l’occhio perde il cristallino si ha che
l’iride ha cellule che proliferano e formano il cristallino andando a transdifferenziarsi, prima svolgono una funzione e
poi la cambiano.

Nell’uomo qualcosa che ricorda il transdifferenziamento è nel midollo osseo con staminali per tessuto emopoietico
quindi nel midollo ci sono staminali che formano elementi del sangue, ma raramente queste cellule danno cellule
epiteliali, del sistema nervoso, muscolari, del fegato e quindi transdifferenziano ma la base non si sa quale è.
Le cellule sono unipotenti o totipotenti? Una cellula può costruire un organismo o non può fare di + di quello per cui
è differenziata?