TOSSICITA’

INNATA

REITERAZIONE PATOLOGIA
restitutio ad integrum

GENERALE
ASCESSO

RAPPORTI TRA
TOSSICITA’ / PERSISTENZA DEL PATOGENO
E RISPOSTA FLOGISTICA
 COAGULAZIONE

La cascata della coagulazione costituisce la terza fase del processo

emostatico: consiste in una serie di reazioni enzimatiche che porta alla
conversione di proenzimi dalla forma inattiva in enzimi e culmina nella
formazione del coagulo insolubile di fibrina a partire dal fibrinogeno

Come tutti i grandi sistemi multi-proteasici dell’organismo (sistema del

complemento, sistema fibrinolitico), anche il sistema della coagulazione si
“organizza” spazialmente e funzionalmente su “fasi solide” rappresentate
dalle superfici cellulari, dove gli ioni Ca hanno la funzione di favorire
l’interazione tra enzima, eventuale cofattore e fosfolipidi.

Agendo a cascata queste proteasi possono notevolmente amplificare

l’effetto complessivo.
La risposta del processo coagulativo è limitata al sito del danno
vasale ed è direttamente proporzionale al grado e all’estensione
del danno. La localizzazione dei processi coagulativi è ottenibile
grazie alla capacità dei fattori della coagulazione di legarsi in
maniera reversibile alle cellule endoteliali danneggiate, al
sottoendotelio leso e alle piastrine.
 Nomenclatura Denominazione e sinonimi sintesi Vitamina p.m. (kDa)
internazionale K-dipendenza
Fattore I Fibrinogeno FEGATO 340

Fattore II Protrombina, FEGATO 70

+
Pretrombina
Fattore III Tromboplastina tissutale, tissue factor TESSUTI 46

Fattore IV Ioni calcio

- -
Fattore V
I componenti plasmatici della FEGATO,
Proaccelerina, fattore labile, Ac globulina
coagulazione 330
-
hanno in comune importanti caratteristiche che li MEGACARIOCITI
Fattore VI Forma attivata della proaccelerina
rendono atti a lavorare in reazioni biochimiche -
Fattore VII Proconvertina, fattore stabile,autoprothrombin I FEGATO 48
sequenziali finalizzate ad un unico scopo: cioè +
Fattore VIII
una rapida generazione
platelet cofator I di trombina nel sito di
Fattore von Willebrand+Fattore antiemofilico A,
globulina antiemofilica,
FEGATO, RES - 300

Fattore IX danno vasale

Fattore con
antiemofilico successiva
B, Chistmas factor,
autoprothrombin II, platelet cofator II
trasformazione
FEGATO
+del 54

Fattore X fibrinogeno
Stuart-Prower factor, autoprothrombin III in fibrina.
FEGATO
+ 59

Fattore XI Fattore antiemofilico C, Rosenthal factor, plasma FEGATO 160

thromboplastin antecedent (PTA)
-
Fattore XII Fattore Hageman FEGATO 80
-
Fattore XIII Fattore stabilizzante della fibrina (FSF), fibrinoligasi FEGATO, 320
MEGACARIOCITI
-
PK Precallicreina, fattore Fletcher FEGATO ? 86
-
HMWK Chininogeno ad alto peso molecolare, fattore FEGATO ? 120
Flaujac, fattore Fitzgerald, fattore Williams
-
 Tutti i fattori sono normalmente presenti nel plasma in forma
inattiva. La maggior parte di essi sono zimogeni ® proenzimi
in grado di esplicare la propria attività enzimatica solo previa
attivazione.

molecole a singola catena e la loro trasformazione a forma attiva

necessita un taglio proteolitico parziale.

La forma attiva è composta da due catene polipeptidiche (catena A e

catena B), tenute insieme da ponti S-S.

La catena B, è altamente conservata nelle serino-proteasi di origine più

disparata, esprime il sito catalitico (sito attivo) caratterizzato dalla
presenza dell’ aa serina (da cui il nome di proteasi seriniche o serino-
proteasi), la cui presenza è critica per l’attività enzimatica.

La catena A presenta invece un grado di variabilità “controllata” in quanto

è formata dalla unione o dalla ripetizione di uno o più moduli molecolari. La
diversa associazione di tali moduli determina la specificità della catena A
di ogni serino-proteasi.
 La giustapposizione di vari moduli molecolari crea singolari
conformazioni steriche di ogni catena A.
Sembra che questa variabilità serva per permettere alle diverse
serino-proteasi di interagire con specifici recettori o con sequenze del
substrato diverse da quella che contiene la sequenza che deve essere
idrolizzata, in modo che il sito catalitico venga orientato sulle sequenze
di consenso secondo la posizione e la conformazione più opportune.

B
A
 FATTORI VITAMINA K-DIPENDENTI (II, VII, IX, X)

Sono caratterizati da almeno due principali tipi di domini proteici.

Gla-domain ® nella regione NH2-terminale: 9-14 residui di acido
g-carbossiglutammico (Gla); questi residui sono indispensabili per il
normale funzionamento di questi fattori. Gla
Glu
EGF-domain (epidermal growth factor-like domain) è presente in
doppia copia ed ha la funzione di formare proteino-complessi per
facilitare le interazioni molecolari durante la coagulazione
(Kringle-domain ® protrombina e FXII).
Zymogen-domain (dominio serino-proteasico) nella regione COOH-
terminale sul quale inserzioni di materiale polipeptidico addizionale
sono responsabili della specificià del fattore nel riconoscere sia il
proprio substrato sia il proprio cofattore. CARBOSSILAZIONE
POST-TRASCRIZIONALE

la reazione di carbossilazione vitamina K-dip.

converte il glutammato (un debole chelante del Glu Gla
Ca2+), ing-carbossiglutamato un chelante molto più
forte.
Sistema microsomiale di cellule
epatiche:
Va II II IIa
Vitamina K ridotta, CO2 e O 2.
Ca2+ -NH2 I residui g-carbossilici hanno una doppia
carica negativa a pH fisiologico
FOSFOLIPIDI
importante per il legame con Ca2+ che
fanno da ponte tra i fosfolipdi di
membrana carichi negativamente e i
fattori vitammina K-dip.
 VECCHIA VISIONE

Semplice “meccanismo a cascata” che interessava in modo ordinato e sequenziale

l’attivazione di vari fattori della coagulazione da una forma inattiva ad una forma
enzimaticamente attiva.
VIA INTRINSECA VIA ESTRINSECA
ATTIVAZIONE DEL F.X

VIA COMUNE

non tutti i fattori si comportano come enzimi una volta attivati.

molte reazioni implicano la formazione di complessi multimolecolari
piuttosto che l’interazioni di singoli fattori plasmatici.
vari fattori enzimatici possono esercitare la loro azione
enzimatica anche su substrati diversi da quelli considerati come
loro substrati tradizionali.

sono attivi meccanismi di feedback e interazioni (cross-over) tra le

varie fasi ed i vari fattori del processo enzimatico.
 NUOVA VISIONE

VIA INTRINSECA VIA ESTRINSECA

FATTORI GENERATI NELLA VIA ESTRINSECA ATTIVANO FATTORI E

COMPLESSI DELLA VIA INTRINSECA.
La convergenza di evidenze cliniche e sperimentali indica che fisiologicamente, all’interno di
un vaso, l’attivazione del fattore tissutale (TF) (via estrinseca) riveste un ruolo preminente,
anche se la coagulazione inizia simultaneamente all’attivazione del sistema plasmatico
attivabile da contatto (via intrinseca)

Joseph Lister (1863)

Il termine “attivazione da contatto” descrive un fenomeno che si verifica in vitro quando il

plasma prelevato fresco viene esposto ad una superficie carica negativamente (vetro,
caolino, celite), si sviluppa un’attività proteolitica per cui fattori quali PK, XII, XI passano
dalla fase di zimogeno a quella di proteasi, in questa fase è implicato anche il HMWK che
agisce come cofattore nell’accelerare l’attivazione dei tre fattori citati.

Secondo questa moderna teoria è il fattore tessutale, normalmente espresso sulla

membrana dei fibroblasti ed esposto ai fattori della coagulazione in seguito al danno
endoteliale, ad attivare in vivo la cascata coagulativa.
 LA CASCATA DELLA COAGULAZIONE
VIA INTRINSECA VIA ESTRINSECA

Superficie negativa Tromboplastina

SPAC * Tessutale
XII XIIa (Fattore tessutale)
HMWK Crossover
PK XI Ca
XIa
VII
Ca VIIa
IX IXa

Ca
X VIIIa X
fosfolipidi Xa
Ca/Va/fosfolipidi

VIA COMUNE II
IIa (trombina)

*= sistema plasmatico
attivabile da Fibrinogeno FIBRINA
contatto
 VARIE FASI DELLA COAGULAZIONE

La coagulazione può essere suddivisa in 3 fasi:

1) INIZIAZIONE: caratterizzata da una ridotta produzione di fattori

della coagulazione attivati. E’ riferita alla VIA ESTRINSECA della
coagulazione e inizia quando si verifica un danno vascolare e le cellule
del sottoendotelio (cellule muscolari lisce e fibroblasti) espongono il
TF che lega il fattore VII.
2) AMPLIFICAZIONE: in cui il livello dei fattori della coagulazione è
massimo
3) PROPAGAZIONE: in cui i fattori della coagulazione legano le
membrane altamente pro-coagulanti delle piastrine attivate e si
forma il coagulo di fibrina.
 VIA INTRINSECA VIA ESTRINSECA

CONTATTO (SPAC)
Ca++
HMWK FATTORE TISSUTALE
PK XII XIIa Ca++

XI XIa

VIIIa VIIa VII

P-Lipidi IX IXa
Ca++

V X Xa
I
A Va
IIa II P-Lipidi
C Ca++
O
M Fg Fn
: sono attivati
XIII XIIIa dalla trombina
U
: trombina
N
E Fn stabilizzata
 STRUTTURA MOLECOLARE E ATTIVAZIONE DEL FATTORE DI HAGEMAN

HFf (ßHFa)

SS

NH2
COOH
2 1
Regione
Peptide di catalitica
F GF F GF K connessione

CATENA A (52000 Da) 80000 Da CATENA B (28000 Da)

TAGLIO IN POSIZIONE 1 (klk) alfa-HFa (composto da due catene) COAGULAZIONE

TAGLIO IN POSIZIONE 2 HFf (precedentemente ßHFa) FOCOLAI INFIAMMATORI

VASODILATAZIONE
ATTIVAZIONE DEL FATTORE C1 DEL COMPLEMENTO
STRUTTURA MOLECOLARE E ATTIVAZIONE DEL CHININOGENO AD ALTO
PESO MOLECOLARE (HMWK)
Catena pesante Catena leggera

SS

+++++++++++
1 2
Bradichinina Regione ricca di istidina
 La via intrinseca della cogaulazione inizia quando il sangue viene a contatto con superfici
cariche negativamente, come in seguito a danno delle cellule endoteliali con conseguente
esposizione delle molecole trombogeniche del sottoendotelio.
La prima tappa di questa via è rappresentata dalla attivazione del cosiddetto “sistema
plasmatico attivabile da contatto”,

SEQUENZA DELLA ATTIVAZIONE DELLO SPAC

2 4

XIIa

PK K XI XIa
1

3 HMWK
HMWK HMWK
XII +++++
+++++ ++++++
----------------------------------------
Superficie carica negativamente
1= attivazione spontanea del XII a XIIa ??????
2= attivazione della PK a K da parte del XIIa
3= attivazione del XII a XIIa da parte di K (amplificazione attivazione XII)
4= attivazione del fattore XI a XIa da parte del XIIa
 Secondo il modello attuale la via intrinseca rappresenta un “loop di
amplificazione” del processo coagulativo iniziato nella via estrinseca

La via intrinseca è attivata più o meno in parallelo con la via estrinseca

3 INNESCHI FISIOLOGICI:

-1) COLLAGENO
-2) POLIMERI LINEARI DI FOSFATO: POLIFOSFATI
I polifosfati cellulari e piastrinici sono in grado di legare e attivare il
Fattore XII, portando conseguentemente all’attivazione della callicreina
e del fattore XI. L’attivazione del Fattore XII dipendente dai polifosfati
non conduce ad una più rapida formazione del coagulo ma ad una maggiore
stabilità del coagulo di fibrina.
-3) TRAPPOLE EXTRACELLULARI DEI NEUTROFILI (NETs)
Nel processo di attivazione del sistema da contatto si possono distinguere 4 fasi:

iniziazione: le proteine del sistema plasmatico attivabile da contatto si legano alla

superficie carica negativamente del sottoendotelio e si attivano

amplificazione: l’attivazione reciproca dei componenti del sistema plasmatico attivabile da

contatto amplifica il sistema stesso. Inoltre, si ha liberazione di sostanze attive in senso
infiammatorio, come βFXIIa, callicreina e chinine. Sia la callicreina che il fattore XIa
possono liberare chinine da HMWK. Il legame alla superficie carica negativamente dei
componenti del sistema serve a mantenere un orientamento spaziale ottimale per PK, fattore
XII e fattore XI.

disseminazione: rilascio il fase fluida dei componenti attivi che si liberano nella reazione
di attivazione da contatto, ad azione pro-infiammatoria
-βFXIIa: aumento della permeabilità vascolare; attivazione del complemento
-callicreina: chemiotassi e vasodilatazione per azione sulla frazione C5 del
complemento, con formazione del frammento C5a;
attivazione della pro-urochinasi ad urochinasi attiva;
-chinine: aumento della permeabilità vascolare; vasodilatazione; dolore

regolazione: il sistema attivabile da contatto viene tenuto sotto controllo da una serie di
inibitori specifici dei singoli componenti.
FXIIa (HFa): C1-inibitore (oltre il 90%) ed antitrombina III (ATIII)
Callicreina: C1-inibitore (circa il 50%) ed α2-macroglobulina (circa il 50%)
Fattore XIa: α1-antitripsina (70%) ed ATIII
 VIA INTRINSECA
XIa
VIIIa
P-Lipidi IX IXa
Ca++
VIA COMUNE X Xa

FATTORE VIII: glicoproteina a singola catena (p.m. 330 kD) sintetizzata nel fegato.
Presente in circolo legata non covalentemente al fattore di von Willebrand. La sua attivazione
da parte della trombina richiede una idrolisi rapida di tre legami (Arg-Ser) e una più lenta di
un singolo legame. Mutazioni a carico di questo specifico sito rendono la molecola ancora
attivabile dalla trombina ma resistente alla degradazione della APC. Il FVIII è costituito da
una catena pesante e da una catena leggera tenute insieme da ponti Ca2+.
Attività cofattoriale non enzimatica sul FIXa che in presenza di fosfolipidi e Ca2+ attiva
il fattore X.
Il gene del FVIII mappa sul braccio lungo del cromosoma X; la deficienza di FVIII è nota
come emofilia A classica, un disordine recessivo X-linked.

Il fattore X (Vit.K-dip.); attivazione

mediante due scissioni proteolitiche
ad opera del COMPLESSO
TENASICO
 VIA ESTRINSECA DELLA COAGULAZIONE
Quando il sangue viene direttamente a contatto con il tessuto danneggiato viene
attivata la via estrinseca della coagulazione, ad opera di un fattore tessutale, TF
(tromboplastina tessutale o fattore III) presente nei tessuti e da questi
esposto in seguito ad un danno cellulare

- INIZIATORE FISIOLOGICO DELLA CASCATA COAGULATIVA

- “RECETTORE” AD ALTA AFFINITA’ PER IL F.VII
- ESPRESSO SULLE SUPERFICI CELLULARI IN FORMA ATTIVA

Ca++ VIA ESTRINSECA

VIA INTRINSECA FATTORE TISSUTALE
XIa Ca++
VIIIa
VIIa VII
P-Lipidi IX IXa
Ca++

VIA COMUNE X Xa

Va
IIa II P-Lipidi
Ca++
 RUOLO E ATTIVAZIONE DEL TF
• TF: Tromboplastina o CD142
• Proteina integrale di membrana, espressa nei tessuti extravascolari particolarmente
in fibroblasti e cellule muscolari lisce. Normalmente essa non è esposta alla
circolazione sanguigna, ma cellule endoteliali e i leucociti possono esprimere una forma
attiva di TF in risposta al danno o a stimoli di natura infiammatoria come endotossine,
chemochine o citochine.

• Il TF maturo è costituito da:

-REGIONE EXTRACELLULARE ACIDA (219 aa)
-REGIONE IDROFOBICA TRANSMEMBRANA
-CORTA CODA INTRACELLULARE (21 aa)
Agendo come cofattore per il fattore VII, il TF promuove la proteolisi e l’attivazione
del fattore VII.

• L’ attività pro-coagulante del TF è controllata da un meccanismo cellulare che porta il

TF in uno stato inattivo o “mascherato” (“encrypted”) e lo “smascheramento” avviene
in seguito ad un appropriato stimolo.
Diversi sono i meccanismi di “smascheramento” dell’attività pro-cougulante:
1) Distribuzione dei fosfolipidi di membrana: esposizione della fosfatidilserina (PS)
2) Ossidazione e riduzione del ponte Cys186-Cys209 COOH-terminale del TF
3) Formazione di dimeri di TF
4) Localizzazione del TF a livello dei lipid raft.
 RUOLO E ATTIVAZIONE DEL TF
TF IN MICROPARTICELLE:

MICROPARTICELLE:vescicole di membrana di 50-1.000 nm che vengono

rilasciate da vari tipi cellulari, capaci di mediare segnali intracellulari
e regolare il processo emostatico.
Microparticelle di TF possono essere rilasciate in particolari stati patologici:
-sepsi
-infiammazione
-tumori
Tale aumentata attività del TF correla con un aumentato rischio di trombosi
venose e ,in caso di tumore, con un progressione della neoplasia stessa.

Fonti cellulari di microparticelle: monociti, piastrine, cellule endoteliali e cellule

emopoietiche.
Le microparticelle rilasciate dai monociti mostrano attività dopo fusione con la
membrana piastrinica dopo esposizione della PS (e non con le piastrine a riposo)
Il TF risulta infatti attivo dopo fusione con le piastrine attraverso il meccanismo
di smascheramento PDI-dipendente.
Le microparticelle piastriniche invece divengono pro-coagulanti in seguito all’
associazione con i neutrofili attivati.
 ATTIVAZIONE DEL FATTORE X MEDIANTE LA VIA ESTRINSECA

a-trombina
XIa,Xa,VIIa, VII TF
XIIa

IX
VIIa

IXa
Ca
VIIIa
fosfolipidi

Complesso
tenasico
X Xa
Il fattore VII si attiva dopo interazione col TF. Il F-VIIa attiva direttamente il F-X a
F-Xa. Inoltre, il VIIa attiva il IX (crossover con la via intrinseca). Il VIIa ed il Xa
possono attivare ulteriore fattore VII legato al TF.
 LA CASCATA DELLA COAGULAZIONE
VIA INTRINSECA VIA ESTRINSECA

Superficie negativa Tromboplastina

SPAC * Tessutale
XII XIIa (Fattore tessutale)
HMWK Crossover
PK XI Ca
XIa
VII
Ca VIIa
IX IXa

Ca
X VIIIa X
fosfolipidi Xa
Ca/Va/fosfolipidi

VIA COMUNE II
IIa (trombina)

*= sistema plasmatico
attivabile da Fibrinogeno FIBRINA
contatto
 LA VIA COMUNE DELLA COAGULAZIONE

trombina
Xa

V
protrombina
FIBRINOGENO

Xa TROMBINA FIBRINA
Va Ca++ Ca++

Superficie fosfolipidica

Complesso
Pro-trombinasico
Il fattore V viene attivato da piccole quantità di trombina a fattore Va, il quale
“adatta” sui fosfolipidi di membrana il fattore Xa, accelerando la reazione. Il Xa
viene “ancorato” ai fosfolipidi dagli ioni Ca. Xa+Va+Ca+fosfolipidi = complesso
pro-trombinasico, che attiva la protrombina a trombina. La trombina attiva il
fibrinogeno a monomero di fibrina, mattone di costruzione del polimero finale.
Nel processo di coagulazione la trombina è un enzima che potremmo definire
“multi-purpose”: infatti, oltre a determinare la fase successiva di fibrino-
formazione per attivazione del fibrinogeno a monomero di fibrina, è in grado di
attivare il fattore V, il fattore VIII ed il fattore XIII della coagulazione,
APC.
Va
VIIIa IIa II P-Lipidi
Ca++

: sono attivati
Fg Fn dalla trombina
XIII XIIIa
: trombina

Fn stabilizzata

La formazione di fibrina avviene attraverso 3 tappe sequenziali:

-scissione proteolitica delle molecole di fibrinogeno in monomeri di fibrina e

fibrinopeptidi (FPA, FPB) da parte della trombina

-polimerizzazione spontanea dei monomeri di fibrina in un gel di fibrina

- stabilizzazione della fibrina ad opera del fattore XIIIa.

 Il fibrinogeno (fattore I) è una glicoproteina solubile ad alto peso molecolare (340.000
Da) formata da due unità, ognuna costituita da tre catene peptidiche α β γ.
Le regioni amino-terminali delle catene alfa e beta sono responsabili della solubilità del
fibrinogeno, in quanto, a causa della repulsione di cariche elettriche, tengono separate le
singole molecole di fibrinogeno.

La trombina taglia i gruppi

terminali liberando così 4
fibrinopeptidi a basso PM (2
fibrinopeptidi A, FPA e due B,
FPB) ed un monomero di fibrina

I monomeri di fibrina così formati hanno una struttura molto simile a quella del precursore
nativo fibrinogeno, ma avendo perso le cariche negative presenti sulle terminazioni tagliate
dalla trombina, interagiscono fra loro con legami non covalenti. La polimerizzazione dei
monomeri di fibrina è quindi una reazione spontanea che avviene per tappe
intermedie.Questo processo dà origine al coagulo morbido di fibrina, ancora fragile, non
stabilizzato da interazioni intermolecolari covalenti.
 FORMAZIONE DELLA FIBRINA - 1
TROMBINA
FPA

FPB

B-beta
FIBRINOGENO

gamma A-alfa

Conversione del fibrinogeno a monomero di fibrina. Il fibrinogeno è composto da tre

catene, arrangiate come eterodimero, A-alfa2-B-beta2-gamma2. La conversione del
fibrinogeno a monomero di fibrina (alfa2-beta2-gamma2), richiede il taglio del legame
peptidico che rilascia il fibrinopeptide A (FPA), ed il B (FPB)
 Il coagulo morbido solubile viene quindi stabilizzato e reso insolubile
(coagulo stabilizzato o definitivo) per azione di un altro fattore
plasmatico, il fattore XIIIa. Il fattore XIII è una transglutaminasi,
presente in forma inattiva nel sangue, che viene attivata dalla trombina.
Il FXIIIa determina la formazione di legami peptidici interni fra le
catene dei monomeri di fibrina (legami del tipo γ-glutamil-ε-lisina),
rendendo stabile il polimero.
 FORMAZIONE DELLA FIBRINA - 2

a) Organizzazione in “domini” del fibrinogeno e monomero di fibrina:

Dominio E: punto di distacco di FPA e FPB

Dominio D D E D Dominio D

b) Formazione della fibrina:

Fibrinogeno
trombina FPA/FPB D E D
Monomero di fibrina D E D D E D
D E D

1- POLIMERO DI FIBRINA “INSTABILE”

Con interazioni latero-laterali e termino-terminali
non covalenti tra monomeri di fibrina

2- POLIMERO DI FIBRINA “STABILE”

Fattore XIII XIIIa
(catalizza il legame covalente tra monomeri
di fibrina)
 LA CASCATA DELLA COAGULAZIONE
VIA INTRINSECA VIA ESTRINSECA

Superficie negativa Tromboplastina

SPAC * Tessutale
XII XIIa (Fattore tessutale)
HMWK Crossover
PK XI Ca
XIa
VII
Ca VIIa
IX IXa

Ca
X VIIIa X
fosfolipidi Xa
Ca/Va/fosfolipidi

VIA COMUNE II
IIa (trombina)

*= sistema plasmatico
attivabile da Fibrinogeno FIBRINA
contatto