TOSSICITA’

INNATA

REITERAZIONE PATOLOGIA
restitutio ad integrum

GENERALE
ASCESSO

RAPPORTI TRA
TOSSICITA’ / PERSISTENZA DEL PATOGENO
E RISPOSTA FLOGISTICA
 INDAGINE DIAGNOSTICA DELLE
MALATTIE EMORRAGICHE

Il riconoscimento di una “diatesi emorragica” e/o

la valutazione della “capacità emostatica” di un
paziente si basa su:

• Accurata anamnesi

• Esame obiettivo

• Indagini di laboratorio
 Criteri clinici di orientamento diagnostico delle malattie emorragiche
difetti plasmatici difetti vasculo-piastrinici

- Petecchie + +++
- Ecchimosi ++ +++
- Ecchimosi vaste +++ ++
- Ematuria +++ ++
- Epistassi ++ +++
- Gengivorragia + ++++
- Emartri ++++ +
- Ematomi profondi ++++ +
- Emorragie cerebrali + +
- Sanguinamenti apparato digerente ++ +
- Altre emorragie ++ ++
-Precocità dell’emorragia post-operatoria
o post-traumatica + ++++
- Sanguinamento da ferite superficiali + +++
-Effetto sul sanguinamento della
compressione e della sutura + ++++
-pazienti di sesso: maschile +++ ++
femminile ++ +++
- storia familiare +++ +
 INDAGINI DI LABORATORIO

Test di laboratorio specifici indagano le funzioni

emostatiche fondamentali, restringono progressivamente
le possibili cause dell’alterazione dell’emostasi
ed orientano il clinico verso la diagnosi definitiva

-studio della funzione vascolare

-studio delle piastrine: numero e funzionalità

-studio della coagulazione e della fibrinolisi

 STUDIO DELL’EMOSTASI PRIMARIA

1. FASE VASCOLARE
prove di fragilità vascolare

2. FASE VASCULO-PIASTRINICA
tempo di sanguinamento (TS) o di emorragia (TE)

3. FASE PIASTRINICA
- conta piastrinica

- studi di funzionalità piastrinica

STUDIO DELLA FASE VASCOLARE
(prove di fragilità vascolare)

Studia la resistenza delle strutture vascolari nei

confronti di sollecitazioni meccaniche indotte sui
vasi, con varie manovre, dall’operatore.
Sono difficili da standardizzare.

- petecchiometria
- prova del martello
- test del pizzicotto di Juergens
- prova del laccio

Viene valutata la comparsa di manifestazioni

emorragiche superficiali
 STUDIO DELLA FASE VASCULO-PIASTRINICA

TEMPO DI SANGUINAMENTO (TS)

O TEMPO DI EMORRAGIA (TE)

Test che valuta globalmente la fase vasculo-piastrinica e rappresenta

un indice dell’emostasi primaria nel suo insieme:
In seguito ad una ferita cutanea standardizzata viene cronometrato il tempo
di arresto del sanguinamento, espressione della formazione del tappo piastrinico

TEST DI IVY
Valore normale: 3 -6 minuti

PUNTURA NEL LOBO DELL’ORECCHIO

Valore normale: 3-5 minuti
 STUDIO DELLA FASE PIASTRINICA
STUDI QUANTITATIVI
- conta piastrinica
valori normali: 150.000-350.000/mm3

- piastrinopenia = numero inferiore a 100.000/mm3

- “rischio emorragico” = numero 50.000/mm3
- emorragie spontanee = numero inferiore a 20.000/mm3

STUDI QUALITATIVI : studi di funzionalità piastrinica

- adesività piastrinica : viene sfruttata la capacità delle piastrine di aderire a superfici

estranee (ridotta in: malattia di von Willebrand, sindrome di Bernard-Soulier)
- aggregazione piastrinica
- agglutinazione in presenza di ristocetina: determinazione del vWF (diminuita nella
malattia di von Willebrand e nella Sindrome di Bernard-Soulier)
- reazione di liberazione del contenuto dei granuli: indica attivazione
intravascolare piastrinica (CID di stati di ipercoagulabilità)
- retrazione del coagulo: contrazione degli pseudopodi piastrinici attaccati ai tralci
di fibrina (ridotto quando il numero delle piastrine è inferiore a 50.000/mm3- negativo nella
tromboastenia di Glanzman - normale nella maggior parte delle piastrinopatie)
- sopravvivenza piastrinica:7-13 giorni (diminuita in: -piastrinopenie da aumentata distruzione
o perdita, nella malattia di Glanzmann e di Bernard-Soulier)
 ADESIVITA’ PIASTRINICA

Viene sfruttata la capacità delle piastrine

di aderire a superfici estranee:

- palline di vetro (test di Hallem)

-tessuto sottoendoteliale dell’aorta di coniglio

L’adesività piastrinica risulta ridotta:

-malattia di von Willebrand
-sindrome di Bernard-Soulier
 AGGREGAZIONE PIASTRINICA

Viene impiegato l’AGGREGOMETRO DI BORN:

Spettrofotometro modificato che registra in continuo le
modificazioni della trasmittanza , correlate a variazioni della
torbidità, di un campione di plasma ricco di piastrine (PRP),
mantenuto a temperatura costante di 37° C, sotto agitazione.

Il PRP ha un valore di trasmittanza di base che viene registrato.

In seguito all’aggiunta di sostanze aggreganti, si formano
aggregati piastrinici che precipitano sul fondo della provetta
riducendo la torbidità e quindi aumentando
la trasmittanza del plasma in esame.

L’entità dell’aggregazione viene espressa come

variazione percentuale della trasmittanza
in funzione del tempo

Sostanze usate: ADP, adrenalina, collagene, serotonina, trombina

Test di aggregabilità piastrinica
(G.V.R. Born)

Agente aggregante

Registrazione
 AGGLUTINAZIONE IN PRESENZA
DI RISTOCETINA
Test usato per la determinazione
del fattore di von Willebrand (F vW)

L’antibiotico ristocetina reagisce con recettori specifici della

membrana piastrinica (GP 1b e GP IIb/IIIa) e, in presenza
del fattore di von Willebrand, provoca agglutinazione piastrinica

La ridotta agglutinazione da ristocetina con normale aggregazione

da parte di altri agenti induttori è tipica di:
-Malattia di von Willebrand
-Sindrome di Bernard-Soulier
 REAZIONE DI LIBERAZIONE DEL
CONTENUTO DEI GRANULI

a) Misurazione indiretta mediante test di aggregazione

piastrinica con induttori che determinano una curva
di aggregazione bifasica: la mancanza della seconda
onda di aggregazione è indice di mancata reazione di
rilascio del contenuto dei granuli

b) Misurazione diretta con metodiche radioimmunologiche

Vengono dosati fattori contenuti nei granuli:
beta-tromboglobulina, FP4 e serotonina

La presenza di questi fattori nel plasma indica

attivazione intravascolare piastrinica ed è
indicativa di CID o di stati di ipercoagulabilità
 RETRAZIONE DEL COAGULO

In provetta il coagulo si ritrae a circa la metà del volume originale,

entro un’ora dall’inizio della coagulazione. Questo processo è dovuto a
contrazione degli pseudopodi piastrinici attaccati ai tralci di fibrina

Questo test risulta :

- ridotto quando il numero delle piastrine è
inferiore a 50.000/mm3.
- negativo nella tromboastenia di Glanzman.
- normale nella maggior parte delle piastrinopatie
 SOPRAVVIVENZA PIASTRINICA
Si esegue mediante l’impiego di piastrine autologhe e/o da
donatore compatibile marcate con isotopi radioattivi ed
iniettate nel paziente. A intervalli definiti si prelevano
campioni di sangue dei quali si misura la radioattività.

Valori normali: 7-13 giorni

Risulta diminuita in:

- piastrinopenie da aumentata distruzione o perdita.
(nelle piastrinopenie da difetto piastrinico intrinseco la sopravvivenza
delle piastrine di donatore sano è normale, mentre nelle piastrinopenie
da causa estrinseca risulta sempre diminuita,).
- malattia di Glanzmann e di Bernard-Soulier.
 STUDIO DELLA COAGULAZIONE

Per lo studio delle alterazioni dell’emostasi dovute

a deficit della fase della coagulazione si
effettuano 3 tipi di test:

-test globali

-test di fase o di gruppo

- test fattoriali
 STUDIO DELLA COAGULAZIONE
TESTS GLOBALI

Valutano il tempo che impiega il sangue intero o il plasma

a coagulare in provetta: forniscono una prima rapida
informazioni sulla eventuale esistenza di un deficit
di uno o più fattori della coagulazione.

1- Tempo di coagulazione del sangue intero

Valori di riferimento : 5-10 minuti

2- Tempo di ricalcificazione del plasma

Valori di riferimento : 80-120 secondi.
 STUDIO DELLA COAGULAZIONE
TESTS DI FASE O DI GRUPPO
Indicano in quale fase della coagulazione (intrinseca, estrinseca o
comune) esiste un difetto. Vengono effettuati su plasma.
Valutano il tempo necessario per la formazione del coagulo di
fibrina quando il plasma viene incubato con sostanze in grado
di attivare specificamente la via intrinseca, estrinseca o
comune della coagulazione.

Si distinguono 3 tests di gruppo:

1- Tempo di tromboplastina parziale attivata (APTT)

2- Tempo di protrombina (PT) o tempo di Quick

3- Tempo di trombina (TT)

1- Tempo di tromboplastina parziale attivata (APTT).
Valuta la via intrinseca di attivazione del fattore X (oltre ai fattori
della via comune V, II e fibrinogeno)
Il plasma viene incubato con caolino (attivazione da contatto), e
cefalina (equivalente dei fosfolipidi piastrinici). Al termine del tempo
di attivazione si effettua la ricalcificazione e si misura il tempo
di coagulazione.

Valori normali : 28 - 40 secondi

Valori aumentati si riscontrano in varie condizioni:

- difetti isolati o combinati dei fattori della via intrinseca e/o comune,
- terapia eparinica;
- elevata concentrazione dei prodotti di degradazione del fibrinogeno
- sostanze inibenti (ad es. anticorpi acquisiti contro fattori della
coagulazione)
 2- Tempo tempo di protrombina (PT) o tempo Quick
Valuta la via estrinseca di attivazione del fattore X, oltre ai fattori
della via comune.
Il plasma viene preincubato a 37°C con un estratto tissutale
(generalmente cervello di coniglio), quindi si ricalcifica e
si registrano i tempi di coagulazione.

Valori normali : 12-14 secondi

Valori aumentati:
- diminuzione del fattore VII o dei fattori della via comune;
deficit di vitamina K o danni epatici; deficit di fibrinogeno
- terapia con anticoagulanti orali
- presenza di prodotti di degradazione del fibrinogeno;
 INR (International Normalized Ratio)

I valori di PT dipendono dal tipo di reattivo utilizzato e quindi possono variare da

laboratorio a laboratorio. Il metodo INR serve per standardizzare i valori di PT
e mette in relazione la preparazione tromboplastinica usata in un laboratorio
con un reattivo standard.
È stata istituita una tromboplastina di riferimento, da cervello umano
e a questa vengono confrontate le tromboplastine del commercio assegnando loro
un indice di sensibilità internazionale denominato ISI (International Senstivity Index).
Alla tromboplastina di riferimento è stato assegnato un valore di ISI uguale a 1
e più una tromboplastina del commercio è sensibile più il suo
valore ISI si avvicina a 1.

L’INR viene calcolato misurando il rapporto fra il PT del paziente ed il valore

medio di riferimento dei plasmi normali di quel laboratorio ed elevando questo
rapporto ad una potenza pari al valore dell’ISI della tromboplastina impiegata
ISI
PT (paziente)
INR =
PT (media dei controlli)
3- Test di trombina (TT).
Misurazione del tempo di coagulazione del plasma citratato
in presenza di una quantità standard di trombina.
Questo test permette quindi di esplorare la fibrinoformazione.

Valori normali: 17-24 secondi

In ambito terapeutico valori diversi:di terapia eparinica, valori 2-3 volte

maggiori rispetto alla norma; terapia trombolitica, valori 3-4 volte.

Valori aumentati:
- anomalie del fibrinogeno (sia qualitative che quantitative)
- esaltata attività antitrombinica nel plasma
- presenza in circolo di anticoagulanti (ad esempio eparina) o di
sostanze che sono in grado di inibire la polimerizzazione
dei monomeri di fibrina, come gli FDP
APTT allungato
deficit via intrinseca
TP normale

APTT normale
deficit via estrinseca
TP allungato

APTT allungato
deficit via comune
TP allungato

deficit
normale fattori
II, V o X

TT

anomalie del
allungato fibrinogeno

presenza di
anticoagulanti
 STUDIO DELLA COAGULAZIONE
TESTS FATTORIALI

Sono tests in grado di dosare i singoli fattori della

coagulazione, sia della via estrinseca che di quella intrinseca,
ed anche di valutare la presenza di eventuali inibitori
dei fattori stessi.

a- dosaggio dei singoli fattori della coagulazione

Dopo che nel plasma di un paziente è stata osservata un’alterazione a carico di TP, di APTT
o di entrambi si esegue di nuovo il test alterato mescolando il plasma del paziente con:
1- plasma carente di un singolo fattore (che presenterà sicuramente l’allungamento del test
di fase) ® viene valutata la capacità del plasma aggiunto del paziente di correggere il deficit
coagulatorio del plasma carente
2- preparazioni contenenti concentrazioni note di singoli fattori della coagulazione ® viene
valutata la capacità o meno dei singoli fattori aggiunti di correggere il valore alterato del
plasma del paziente

I risultati si esprimono come percentuale della norma mediante comparazione

con una curva di taratura effettuata con un pool di plasma normale.
b- dosaggio del fibrinogeno
1- metodo classico ® il plasma citratato viene mescolato con una quantità in eccesso
di trombina = il tempo di formazione del coagulo è inversamente proporzionale al
contenuto di fibrinogeno.

I tempi di formazione del coagulo vengono trasformati in concentrazione di fibrinogeno

per mezzo di tabelle specifiche per lotto e strumento di misura o per comparazione con
una curva di taratura ottenuta con concentrazioni di fibrinogeno standard.

2- metodo immunologico ® test ELISA

Valori normali: 200-450 mg/dl

c- dosaggio del fattore XIII

Lisi del coagulo di fibrina con acido monocloroacetico 1%. Solo i coaguli non stabilizzati
dal fattore XIII si sciolgono in tali condizioni.

d- dosaggio di inibitori
Test della correzione con plasma normale ® si effettua mescolando (1:1) il plasma del
paziente che presenta un test di fase alterato (TP o APTT) con plasma normale: se nel
plasma del paziente è presente un inibitore il test di fase alterato non si normalizza.

Per individuare verso quale fattore della coagulazione è rivolto l’inibitore presente nel
plasma del paziente, a tale plasma vengono aggiunti i singoli fattori e viene quindi valutata
la capacità o meno di questi di correggere il test di fase alterato
Screening emostatico
 STUDIO DELLA FIBRINOLISI (1)
1-Tempo di lisi del coagulo di sangue totale
tempo di lisi di un coagulo ottenuto, per azione della trombina, da sangue intero

tempo normale di lisi : 36-72 ore

2- Tempo di lisi del coagulo delle euglobuline

tempo di lisi di un coagulo ottenuto, per azione della trombina, della frazione euglobulinica del sangue
(la frazione euglobulinica del plasma, che viene separata mediante precipitazione contiene attivatori del plasminogeno,
plasminogeno, plasmina e fibrinogeno, mentre nel sopranatante rimangono le cosidette pseudoglobuline,
fra cui gli inibitori della fibrinolisi).

tempo normale di lisi : 3-6 ore

In presenza di fibrinolsi subacuta o acuta il tempo di lisi del coagulo di sangue totale
è di qualche ora, mentre il tempo di lisi del coagulo delle euglubuline è di qualche minuto.

3- Lisi delle piastre di fibrina

su uno strato di fibrina viene posta una quantità nota del materiale in esame (plasma,frazione
euglobulinica) ed il tutto viene incubato a 37°C. Le sostanze con attività fibrinolitica eventualmente
presenti provocano aree di lisi circolare, il cui diametro proporzionale all’attività fibrinolitica presente.

valore quantitativo: si paragonano le aree di lisi dei campioni con

quelle dovute a quantità note di attivatori del plasminogeno o di plasmina.
 STUDIO DELLA FIBRINOLISI (2)
4- Dosaggio nel siero dei prodotti di degradazione del fibrinogeno
e della fibrina (FDP) e dimeri D-D.
Durante l’attivazione del sistema fibrinolitico il fibrinogeno ed il plasminogeno diminuiscono, mentre
aumentano i prodotti di degradazione del fibrinogeno e della fibrina che entrano in circolo,
vengono captati dal fegato e dal sistema reticolo-endoteliale e non sono quindi presenti normalmente
in circolo. I tests per la determinazione degli FDP vengono effettuati sul siero, mediante
metodiche immunologiche.

fibrinopeptidi D ed E ® prodotti terminali della degradazione del fibrinogeno, dei

monomeri di fibrina e del polimero di fibrina non stabilizzato
dimeri D-D ® prodotti terminali della degradazione della fibrina stabilizzata
per azione del F. XIIIa

Ambito di riferimento in una popolazione sana : 0-5µg/ml

Moderato aumento di FDP (10-15µg/ml): moderata fibrinolisi

Livelli elevati di FDP (> 15µg/ml): attivazione patologica della fibrinolisi e CID
Elevati livelli di D-D: attività fibrinolitica su fibrina stabilizzata in un processo
coagulativo localizzato o disseminato (CID)

fibrinopeptidi A e B ® derivati dall’azione della trombina sulle catene α e b

del fibrinogeno → sono indice di attività coagulativa
 PROFILO TROMBOTICO
DIAGNOSTICA DI LABORATORIO

La diagnosi di una DIATESI TROMBOTICA presenta ancora notevoli difficoltà,

in quanto la trombosi è un evento multifattoriale, in cui, oltre ai componenti ematici
dell’emostasi, hanno un ruolo fondamentale i fattori meccanici legati ad
alterazioni del flusso sanguigno e le lesioni endoteliali.
Il ruolo dell’endotelio e del flusso sanguigno sono difficilmente valutabili.
Da un punto di vista laboratoristico, quindi, diventa necessario individuare
i fattori di rischio dipendenti da alterazioni dei costituenti del sangue
che sono coinvolti nel processo emostatico

Le indagini di laboratorio vengono utilizzate per:

individuare i fattori di rischio dipendenti da alterazioni dei costituenti

del sangue, ereditari o acquisiti e seguire i pazienti ad alto rischio.
(STATO PRETROMBOTICO)

approfondire i sospetti diagnostici e verificare se il processo emostatico e/o

fibrinolitico è stato attivato.
(STATO TROMBOTICO E STATO POST-TROMBOTICO)
 STATO PRE-TROMBOTICO

Deficit di anticoagulanti naturali:

- antitrombina III
- proteina C/proteina S
- inibitore della via estrinseca della coagulazione (TFPI)

Alterazioni dei fattori della coagulazione:

- varianti molecolari dei fattori V (di Leiden), II e VII
- elevati livelli di fibrinogeno

Ridotta attività del sistema fibrinolitico:

- deficit di plasminogeno o di attivatori del plasminogeno
- eccesso di inibitori degli attivatori del plasminogeno (PAI)

Presenza di anticorpi anti-fosfolipidi:

- anticoagulante tipo lupus ( LAC) e anti-cardiolipina (ACA)

Iperomocisteinemia:
È un fattore lesivo per l’endotelio ® sbilanciamento in senso trombogeno
della bilancia emostatica endoteliale
TROMBOFILIE SU BASE EREDITARIA
STATO TROMBOTICO E POST-TROMBOTICO

attivazione della coagulazione:

- frammenti 1 e 2 della trombina
- complesso trombina/antitrombina
- fibrinopeptidi A e B
- presenza di monomeri di fibrina
- dosaggio di D-dimeri

inibitori fisiologici della coagulazione

- dosaggio della proteina C attivata

attivazione delle piastrine:

- dosaggio di β-tromboglobulina
- dosaggio del fattore piastrinico 4

fibrinolisi:
- presenza di FDP e/o D-D
- tempo di lisi delle euglobuline
TEST DI LABORATORIO PER LA VALUTAZIONE
DELLA TROMBOFILIA