Antranoidi

Analiza antranoida
z

z
z
z

Antranoidi su sekundarni metaboliti biljaka, derivati 1,8dihidroksiantracena, koji ispoljavaju laksantno delovanje
(prisustvo hidroksilnih grupa u poloaju C-1 i C-8 je uslov za
delovanje).
Na osnovu hemijske strukture, antranoidi su podeljeni u vie
klasa. Razlikuju se:
antrahinoni
antroni i antranoli (predstavljaju keto-enolne tautomere). U
kiseloj sredini prisutan je antronski, a u baznoj antranolni oblik.
Antroni oksidacijom prelaze u antrahinone.
diantroni (biantroni): nastaju C10 C10' kondenzacijom 2
molekula antrona.

Osnovne klase antranoida, njihova biogenetska povezanost

i tip supstitucije

OH

OH

OH-

10

R2

H+

R1

HO
H3CO

OH

10

R1

R2

X2
OH

[]

OH

ANTRANOL
(ENOLNI OBLIK)

ANTRON
(KETO OBLIK)

R2

OH

OH

OH

10

ANTRAHINON

OH

10

R2
R2

10

R1
R1

R1
CH3
CH2OH
COOH

OH

DIANTRON

OH

IDENTIFIKACIJA ANTRANOIDA
(KVALITATIVNA ANALIZA)
Dokazivanje antranoida vri se:

HEMIJSKIM REAKCIJAMA
HROMATOGRAFSKI: TLC.

DOKAZIVANJE HEMIJSKIM REAKCIJAMA

A. BORNTRGER-OVA REAKCIJA: antrahinoni (uti,

liposolubilni) grade sa bazama (KOH, NaOH, NH3), crvene,
hidrosolubilne fenolate, koji su mezomerno stabilizovani.

H
OH

OH

OH
R2

R1
O
ANTRAHINON
(UT, LIPOSOLUBILAN)

R2

R1
O
FENOLAT
(CRVEN, HIDROSOLUBILAN)

Antroni i diantroni (napr. senozidi), koji su uti i

liposolubilni, grade sa bazama ute, hidrosolubilne
fenolate, koji su mezomerno stabilizovani. Pozitivnu
Borntrger-ova reakciju daju tek posle oksidacije do
antrahinona (npr. stajanjem u prisustvu kiseonika iz
vazduha ili zagrevanjem)!
Reakcijom se, zavisno od propisa, dokazuju:

-slobodni aglikoni

-aglikoni osloboeni kiselom ili baznom hidrolizom

-aglikoni izolovani mikrosublimacijom na 200-220C.

OH

OH

OH

R2

ANTRON
(UT, LIPOSOLUBILAN)

R1

R2

FENOLAT
(UT, HIDROSOLUBILAN)

R1

z
z

Prema savremenim farmakopejama, dokazivanje

antranoidnih droga (osim u Aloe capensis i Aloe
barbadensis), vri se Borntrger-ovom reakcijom
(najznaajnija reakcija).
Primeri:
-dokazivanje Frangulae cortex, Rhamni
purshiani(ae) cortex, Rhei radix, Sennae folium,
Sennae fructus acutifoliae i Sennae fructus
angustifoliae prema Ph.Eur. 6.0 i Ph. Jug. V.

z
z

Dokazivanje hidroksiantracenskih derivata u kori kruine,

Frangulae cortex (Ph. Jug. IV)
Princip: zagrevanjem antrahinonski heterozidi hidrolizuju, osloboeni
1,8-dihidroksiantrahinoni sublimuju i dokazuje se Borntrger-ovom
reakcijom. Napomena: antroni se pod ovim uslovima oksiduju do
antrahinona koji sublimuju.
Dokazivanje hidroksiantracenskih derivata u kori kruine,
Frangulae cortex i korenu rabarbare, Rhei radix (Ph. Eur. 6.0; Ph.
Jug. V)
Princip: antrahinonski heterozidi podvrgnu se kiseloj hidrolizi
(zagrevanjem sa hlorovodoninom kiselinom). Osloboeni liposolubilni
aglikoni preuzmu se etrom (etarski sloj je uto obojen). Etarski ekstrakt
izmuka se rastvorom amonijum-hidroksida. Vodeni sloj oboji se
crvenoljubiasto od nagraenih hidrosolubilnih crvenih fenolata
(Borntrger-ova reakcija).
Dokazivanje hidroksiantracenskih derivata listu sene, Sennae
folium, plodu tinevelijske sene, Sennae angustifoliae fructus i
plodu aleksandrijske sene, Sennae acutifoliae fructus (Ph. Eur. 6.0;
Ph. Jug. V)
Princip: diantronski heterozidi ekstrahuju se iz droge vodom i podvrgnu
kiseloj hidrolizi. Osloboeni antronski aglikoni preuzmu se etrom. Sa
rastvorom amonijaka razvija se uta ili narandasta boja (fenolati
antrona). Posle zagrevanja na vodenom kupatilu (oksidacija antrona do
antrahinona), boja prelazi u crvenoljubiastu od fenolata antrahinona
(Borntrger-ova reakcija).

B. MODIFIKOVANA BORNTRGER-OVA REAKCIJA: antrahinoni (uti)

grade sa magnezijum-acetatom crvene, hidrosolubilne, estolane helate,
koji su mezomerno stabilizovani. Crveni Mg-helati stabilniji su od crvenih
fenolata!

Antroni i diantroni (uti) grade sa magnezijum-acetatom ute helate.

Mg

OH

OH

OH

Mg(CH3COO)2

R2

R1
O
ANTRAHINON
(UT, LIPOSOLUBILAN)

R1

R2
O
HELAT
(CRVEN, HIDROSOLUBILAN)

C. SHOUTETEN-OVA REAKCIJA: antroni u prisustvu

natrijum-tetraborata (slabo bazna sredina), prelaze u
antranole, koji fluoresciraju ukastozeleno.
Primer: dokazivanje Aloe capensis (izvor A. ferox) i Aloe
barbadensis (izvor A. barbadensis) prema Ph. Eur. 6.0 i
Ph. Jug. V.
OH

OH

OH

OH

OH

Na2B4O6

R2

ANTRON

Aloe ferox

R1

R1

R2
ANTRANOL
(FLUORESKUJE UTOZELENO)

Aloe barbadensis

z
z

z
z

z
z

z
z

D. REAKCIJA SA BROMNOM VODOM: antranoidi grade sa bromnom

vodom smeeut talog.
Primer: dokazivanje Aloe capensis i Aloe barbadensis prema Ph. Eur.
6.0 i Ph. Jug. V. Reakcija istovremeno slui i za njihovo meusobno
razlikovanje: u sluaju Aloe barbadensis supernatant je ljubiast (7hidroksialoin).
Dokazivanje antrona u Aloe capensis (Kap aloja) i Aloe barbadensis
(Barbados aloja) i meusobno razlikovanje droga
Priprema ispitivanog rastvora: izmuka se 1 g spraene droge sa 100 ml
kljuale vode R. Ohladi se, doda 1 g talka R i filtrira.
Dokazivanje antrona: Shouteten-ova reakcija
Princip: antroni u baznoj sredini (natrijum-tetraborat) prelaze u antranole,
koji fluoreskuju ukastozeleno.
Razlikovanje droga: reakcija sa bromnom vodom (Ph. Eur. 6.0; Ph.
Jug. V)
Princip: sa bromnom vodom antranoidi grade smeeut talog. U sluaju
Aloe barbadensis suprenatant se boji ljubiasto od 7-hidroksialoina. Boja
izostaje u sluaju Aloe capensis, koji sadri 5-hidroksialoin.
E. DOKAZIVANJE ANTRONA SA C-10 NESUPSTITUISANOM
METILENSKOM GRUPOM: sa nitrotetrazolium plavim grade ljubiasto ili
sivoplavo obojene proizvode.

z
z
z

z
z

HROMATOGRAFSKO DOKAZIVANJE: TLC

Savremene farmakopeje propisuju za identifikaciju svih oficinalnih
antranoidnih droga hromatografiju na tankom sloju (TLC).
Antranoidni heterozidi ekstrahuju se etanolom ili metanolom i razdvajaju
na tankom sloju silikagela. Kao poredbene supstance koriste se isti
antranoidi (npr. aloin, emodin) ili autentini ekstrakti (npr. sena ekstrakt
HRS).
Posthromatografska derivatizacija vri se pomou kalijum-hidroksida Borntrger-ova reakcija.
Hromatogram se posmatra na dnevnoj svetlosti (boja zona) i pod UV
svetlou na 365 nm (fluorescencija zona), posle ili pre i posle
derivatizacije. Nekada se hromatogram zagreva na 100-105 C, pri emu
se antroni oksiduju do antrahinona.
Tabela. Boja i fluorescencija zona antranoida pre i posle derivatizacije
bazom (KOH)

Antranoid

Antrahinon
Antron

Pre prskanja

KOH

Dnevna svetlost

UV (365 nm)

Dnevna svetlost

UV (365 nm)

utonarandasta

narandasta

crvenoljubiasta

crvenoljubiasta

uta

crvena

uta

uta

Dokazivanje hidroksiantracenskih derivata u kori kruine,

Frangulae cortex (Ph. Eur. 6.0; Ph. Jug. V)

Princip: antrahinonski heterozidi ekstrahuju se iz droge etanolom i

razdvajaju na tankom sloju silikagela. Dokazivanje se vri pomou
rastvora kalijum-hidroksida (Borntrger-ova reakcija). Hromatogram
se posmatra na dnevnoj svetlosti. Zone antrahinona obojene su
crvenosmee.

Dokazivanje hidroksiantracenskih derivata u listu sene,

Sennae folium (Ph. Eur. 6.0; Ph. Jug. V)
Princip: hidroksiantracenski heterozidi ekstrahuju se iz droge
etanolom i razdvajaju na tankom sloju silikagela. Kao poredbena
supstanca koristi se autentini ekstrakt sene (ne koriste se isti
senozidi, jer ih je teko izolovati!). Zatim se, na tankom sloju, izvri
hidroliza heterozida i oksidacija antrona do antrahinona pomou
azotne kiseline uz zagrevanje. Dokazivanje se vri pomou
rastvora kalijum-hidroksida (Borntrger-ova reakcija). Hromatogram
se posmatra na dnevnoj svetlosti. Zone antrahinona obojene su
crveno.

Napomena: s obzirom da je list sene bogatiji u senozidu C i D u

odnosu na plod obe sene, zone senozida C i D na hromatogramu
lista su jasno uoljive, dok su na hromatogramu plodova samo
slabo vidljive (razlikovanje lista od plodova sene!).

z
z
z
z

z
z

z
z

ODREIVANJE ANTRANOIDA (KVANTITATIVNA ANALIZA)

Odreivanje antranoida moe da se vri:
SPEKTROFOTOMETRIJSKI (prema farmakopejama)
HROMATOGRAFSKI: HPLC.
SPEKTROFOTOMETRIJSKO ODREIVANJE
Za kvantitativnu analizu antranoidnih droga farmakopeje propisuju
spektrofotometrijski postupak. S obzirom da droge sadre sloene smee
antranoidnih sastojaka (razlikuju se po stepenu oksidacije i nainu
glikozilovanja), rezultati ovih odreivanja odstupaju od realnih vrednosti, koje se
mogu dobiti HPLC metodom. Meutim, tanost spektrofotometrijske metode
zadovoljava potrebe prakse, zbog ega ga propisuju i najsavremenije
farmakopeje.
Cilj farmakopejskih metoda jeste da se utvrdi sadraj glikozidno vezanih
antranoida. Slobodni antranoidi se ne odreuju, jer nisu bitni za delovanje.
Princip: hidroksiantracenski heterozidi ekstrahuju se iz droge metanolom
ili vodom. Slobodni aglikoni se uklone organskim rastvaraem (npr.
petroletrom, hloroformom ili smeom etra i heksana).
Zatim se izvri oksidacija antronskih heterozida do antrahinonskih
pomou gvoe(III)-hlorida. Antrahinonski heterozidi (nativni i nastali
oksidacijom antronskih), podvrgnu se kiseloj hidrolizi (zagrevanje sa HCl).
Osloboeni antrahinonski aglikoni preuzmu se organskim rastvaraem
(etrom ili smeom etra i heksana). Viak gvoe(III)-jona ukloni se
izmukavanjem organskog rastvaraa vodom. Odreivanje se vri
spektrofotometrijskim postupkom.

z
z

Starije farmakopeje, npr, Ph. Jug. IV,

propisivale su odreivanje zasnovano
na Borntrger-ovoj reakciji, , tj. na
graenja crvenih fenolata sa
bazama.
Prema savremenim farmakopejama
(Ph. Eur. 6.0; Ph. Jug. V)
spektrofotometrijsko odreivanje
zasniva se na modifikovanoj
Borntrger-ovoj reakciji (graenje
crvenih helata sa magnezijumacetatom). Metoda je modifikovana
jer su crveni Mg-helati stabilniji od
crvenih fenolata!
Primeri:
-odreivanje antranoida u Frangulae
cortex, Rhei radix, Sennae folium,
Sennae fructus acutifoliae i Sennae
fructus angustifoliae prema Ph. Eur.
6.0 i Ph. Jug. V.

EKSTRAKCIJA DROGE (H2O ILI MeOH)

RASPODELA HETEROZIDA I
AGLIKONA IZMEU POLARNE I
NEPOLARNE FAZE

NEPOLARNA FAZA SA
AGLIKONIMA SE ODBACUJE !

RASTVOR HETEROZIDA
OKSIDACIJA POMOU FeCl3
ANTRAHINONSKI HETEROZIDI
KISELA HIDROLIZA (HCl, T)
ANTRAHINONSKI AGLIKONI

PREUZIMANJE AGLIKONA ETROM

VIAK FeCl3 UKLONI SE VODOM
SPEKTROFOTOMETRIJSKO
ODREIVANJE (NA 515 nm)

Slika . Shema ekstrakcije antracenskih derivata prilikom spektrofotometrijskog odreivanja

HROMATOGRAFSKO ODREIVANJE: HPLC

z
z
z

U savremenoj strunoj literaturi za odreivanje

antranoida u drogama navodi se HPLC metoda.
Ona omoguava razdvajanje sloene smee
antranoida i odreivanje pojedinanih sastojaka.
Meutim, kao to je ve reeno, farmakopeje
propisuju spektrofotometrijski postupak, ija tanost
zadovoljava potrebe prakse.

Veba V
Dokazivanje i odreivanje antrahinona
z

1a. Dokazivanje hidroksiantracenskih derivata

(Ph. Jug. V i Ph. Eur. 6.0)
Oko 50 mg spraene droge (180) prelije se sa 25 ml
razblaene hlorovodonine kiseline (7,3%) i zagreva
oko 15 minuta na vodenom kupatilu. Posle hlaenja
izmuka se sa 20 ml etra i vodeni sloj odbaci.
Etarski ekstrakt izmuka se sa 10 ml amonijaka
(10%). Vodeni sloj oboji se crvenoljubiasto
(Borntregerova reakcija).
Droge: Frangulae cortex, Rhei radix.

1b. Dokazivanje hidroksiantracenskih

derivata mikrosublimacijom (Ph. Jug. IV)
Frakcionom mikrosublimacijom pri 200-220 C
nastaju narandaste iglice, koje se u amonijumhidroksidu ili rastvoru alkalnih hidroksida
rastvore tamnocrvenom bojom (Borntregerova
reakcija).
Droga

Frangulae cortex

Gentianae radix

T (C)

200-220

200-210

Mikrosublimat
ukaste kapljice ili iglice
(1,8-dihidroksiantrahinoni:
frangula-emodin)
ukaste kapljice ili iglice
(gentizin)

Reaktiv

alkoholni rastvor
KOH

Boja
tamnocrvena
(Borntregerova
reakcija)

uta

z
z
z
z
z

z
z
z
z
z
z
z
z
z
z
z
z

z
z
z

2. TLC analiza ekstrakta antrahinonskih droga

a. TLC analiza ekstrakta kore kruine, Frangulae cortex
(Ph. Eur. 6.0)
Priprema ekstrakta:
0,50 g spraene droge (180) ekstrahuje se sa 5 ml etanola (70%) zagrevanjem
uz povratni hladnjak na vodenom kupatilu do kljuanja. Supernatant se odlije i
odmah nanosi na TLC plou.
Rastvor za poreenje:
20 mg barbaloina ratvori se u 10 ml etanola (70%).
Stacionarna faza:
Gotove aluminijumske ploe sa tankim slojem silikagela i fluorescentnim
indikatorom (Silica gel 60 F254).
Mobilna faza:
Etilacetat metanol - voda (100: 17: 13).
Nanosi se 10 l rastvora, u obliku trake.
Front rastvaraa: 10 cm.
Detekcija:
A. Ploe se sue na vazduhu 5 minuta i prskaju rastvorom KOH (50 g/l) u
etanolu (50%) i zagrevaju 15 minuta na 100-105 C.
Rezultat:
Pod UV svetlom (365 nm) se u srednjem delu hromatogramu uoava
smeeuta zona koja odgovara barbaloinu. Na hromatogramu ispitivanog
rastvora se ne uoava nijedna intenzivno uto obojena zona, kao niti zona
narandaste ili crvenkaste fluorescencije na Rf vrednosti slinoj Rf
vrednosti barbaloina.
B. Ploe se odmah prskaju rastvorom nitrotetrazolijum-plavog u metanolu (5 g/l) i posmatraju na
dnevnom svetlu.
Rezultat:
Na hromatogramu ispitivanog rastvora ne pojavljuju se ljubiaste ili sivkastoplave zone.

3. Odreivanje sadraja antrahinonskih heterozida

u kori kruine, Frangulae cortex (Ph. Eur. 6.0)

Odmeriti 0,25 g droge u praku (180) u tarirani balon okruglog dna. Dodati 25 ml
metanola (70%), izmeriti ukupnu masu i zagrevati 15 minuta na vodenoj pari uz
povratni hladnjak. Kada se ohladi, dopuniti do prvobitne mase metanolom (70%) i
filtrirati.

5 ml filtrata pomea se u levku za odvajanje sa 50 ml destilovane vode i 0,1 ml (2

kapi) koncentrovane hlorovodonine kiseline i pet puta izmuka sa po 20 ml
petroletra. Vodeni sloj se prenese u odmernu tikvicu od 100 ml. Spojene
petroletarske frakcije se ispiraju dva puta sa po 15 ml destilovane vodom i vodene
frakcije prebace u odmernu tikvicu. U odmernu tikvicu dodati 5 ml rastvora natrijumkarbonata (50 g/l) i dopuniti vodom do 100 ml.

40 ml ovog rastvora se prebaci u balon okruglog dna od 200 ml, doda 20 ml rastvora
gvoe(III)-hlorida (200 g/l) i zagreva 20 minuta uz povratni hladnjak i ee
mukanje u kljualom vodenom kupatilu.
Zatim se doda 2 ml koncentrovane hlorovodonine kiseline i ponovo zagreva 20
minuta uz ee mukanje, da se nastali talog rastvori.

z
z

Kada se ohladi, smesa se izmuka u levku za odvajanje 3 puta sa po 25 ml etra.

Sjedinjeni etarski ekstrakti se ispiraju 2 puta sa po 15 ml destilovane vode,
profiltriraju preko suvog filter papira i bezvodnog natrijum sulfata i etarski sloj prebaci
u suvu odmernu tikvicu od 100 ml i dopuni etrom do oznake.

20 ml etarskog ekstrakta se paljivo upari do suva, ostatak

rastvori u 10 ml rastvora magnezijum-acetata u metanolu
(5 g/l) (ispitivani rastvor).

Apsorbancija rastvora se meri na 515 nm uz metanol kao

slepu probu.

Sadraj antrahinona se izraava kao sadraj (%)

glukofrangulina A, ija je specifina apsorbancija
A 1%/1cm= 204, prema formuli:

A 3,06
m

% antrahinona =

A = apsorbancija ispitivanog rastvora

m = masa droge u gramima