AUTOFAGIA

PROCESSO DI DEGRADAZIONE CATABOLICA CELLULARE ATTRAVERSO CUI

PROTEINE, ORGANELLI E CITOPLASMA SONO ACCUMULATI, DIGERITI E
RICICLATI PER SOSTENERE IL METABOLISMO CELLULARE, IN RISPOSTA AL
DEFICIT DI NUTRIENTI O ALLO STRESS
Yoshinori Ohsumi premio Nobel per la fisiologia e la medicina per la sua 1
scoperta dei meccanismi dell’autofagia
 2

NEGLI ORGANISMI INFERIORI IL RUOLO FONDAMENTALE DELL’AUTOFAGIA

È QUELLO DI PRESERVARE GLI ESSERI VIVENTI DAL DEFICIT DI NUTRIENTI

MOLTI GENI AUTOFAGICI SONO ALTAMENTE CONSERVATI

NELL’EVOLUZIONE DELLA SPECIE, COMPRESI I MAMMIFERI

NEI MAMMIFERI È STATO DIMOSTRATO CHE ALLA NASCITA, LA CADUTA DI

APPORTO NUTRIZIONALE PROVOCATO DAL DISTACCO DI PLACENTA ATTIVA
L’AUTOFAGIA IN DIVERSI ORGANI DEL NEONATO, TRA CUI CUORE,
POLMONE E PANCREAS. L’IMPORTANZA DI QUESTO MECCANISMO NELLA
SOPRAVVIVENZA DEL NEONATO E’ SOTTOLINEATA DALL’OSSERVAZIONE
CHE TOPI KNOCKOUT PER IL GENE AUTOFAGICO ATG-5 NON
SOPRAVVIVONO ALLA NASCITA
 3
Sono descritti tre tipi di autofagia nelle cellule di mammiferi

Parzych. 2014 Antioxid Redox Signal

 AUTOFAGIA= PROGRAMMED CELL DEATH DI TIPO II

SEBBENE IL CATABOLISMO AUTOFAGICO ABBIA COME SCOPO QUELLO

DI PROMUOVERE LA SOPRAVVIVENZA CELLULARE IN ASSENZA DI
NUTRIENTI, TUTTAVIA, QUANDO L’AUTOFAGIA DISTRUGGE ELEMENTI
VITALI E SUPERA LA CAPACITA’ DI RE-SINTESI DELLA CELLULA, SI HA LA
MORTE CELLULARE
I GENI AUTOFAGICI (ATG) CODIFICANO PER PROTEINE NECESSARIE PER

Dikic & Elazar .Nature Reviews Molecular Cell Biology 2018; 19:349
 Dikic & Elazar .Nature Reviews Molecular Cell Biology 2018; 19:349

Cargo sequestration
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Dikic & Elazar .Nature Reviews Molecular Cell Biology 2018; 19:349
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Le vie di segnalazione attivate da stress

conducono alla formazione del complesso
chinasico ULK1

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Il complesso I è costituito da PI3K di classe

III che comprende tra gli altri Beclin 1

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Insieme i complessi ULK1 e PI3Kc3
promuovono la produzione locale di
fosfatidilinositolo-3-fosfato (PI3P) presso
una caratteristica struttura del ER
chiamata omegasoma

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Da qui, PI3P quindi recluta

nell'omegasoma le proteine effettrici che
interagiscono con i fosfoinositidi come
WIP12 e DFCP1, contenente il dominio
FYVE a dito di zinco, tramite l'interazione
con i loro domini di legame PI3P

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WIPI2 recluta a sua volta il

complesso ATG12 - ATG5 coinvolto
nella coniugazione ATG3-mediata
delle proteine della famiglia ATG8,
per l’elongazione della membrana

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Le proteine ATG8:
• attraggono ulteriormente
componenti del macchinario
autofagico che contengono una
regione interagente con LC3
(LIR)
• sono necessarie per
l'allungamento e la chiusura della
membrana del fagoforo
• sono anche coinvolte nel
sequestro di cargo in
autofagosomi attraverso recettori
di cargo contenenti LIR

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La sigillatura della membrana

autofagosomica dà origine a una
vescicola a doppio strato o
autofagosoma, che matura e si
fonde con il lisosoma

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 Fusione con il lisosoma
Gli ATG8 reclutano il complesso delle cosiddette «Homotypic fusion
and protein sorting (HOPS)», fattori di tethering (collegamento) che
agiscono tra l'autofagosoma e il lisosoma

Gli ATG8 guidano la maturazione collegando l'autofagosoma alle

kinesine attraverso adattatori di kinesine specifici per l'autofagia
 11
Fusione omotipica mediata da SNARE

VAMP8 sul lisosoma

STX17, SNAP29
sull’autofagosoma
 12
Lo stimolo più caratterizzato per l'induzione dell'autofagia è la privazione
di aminoacidi, che provoca l'inibizione di mTOR, la principale
serina/treonina chinasi coinvolata nella regolazione della crescita cellulare
Anche il reclutamento del complesso HOPs nell'autofagosoma è
regolato negativamente da mTORC1: la gamma di attività
mTORC1 si estende, pertanto, anche agli eventi tardivi del
processo autofagico
 13

Opposti effetti di isoforme di PI3k sull’induzione di

autofagia
 14
L'autofagia può anche essere indotta dalla diminuzione dei livelli di
energia cellulare (basso rapporto ATP/AMP) rilevata attraverso AMPK
 15
Cargo sequestration

Nelle cellule sane, le proteine che non sono adeguatamente ripiegate sono
”taggate” con Ub e degradate dal proteasoma. Se la capacità degradativa del
proteasoma viene sovraccaricata, il sistema autofagico si attiva per rimuovere
gli aggregati accumulati e gli organelli che sono irreparabilmente danneggiati
da proteine aggregate e non funzionali
 Difetti nell’autofagia

La causa più comune di morte in modelli animali con deficit di

autofagia è la neurodegenerazione provocata dall'accumulo di
aggregati proteici

Nelle malattie neurodegenerative umane, sono state identificate

mutazioni di numerose proteine che sono implicate nell'autofagia o
nella funzione lisosomiale

L’analisi di trascrittomi che utilizzano campioni di pazienti con

malattia neurodegenerativa ha rivelato alterazioni nel pathway di
segnalazione autofagico
Oltre agli aggregati proteici potenzialmente tossici, i mitocondri
disfunzionali sono stati identificati come un’altra principale
causa di neurodegenerazione

I mitocondri danneggiati rappresentano una considerevole

minaccia per le cellule perché aumentano i livelli di ROS
cellulari che potrebbero a loro volta danneggiare sia il
proteoma che il genoma
 16

Per mantenere l'omeostasi mitocondriale, le cellule circoscrivono i

mitocondri danneggiati e li rimuovono mediante autofagia selettiva
(definita mitofagia)

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Autofagia e neurodegenerazione

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 L’autofagia nella tumorigenesi: azione di tumor suppressor

Nonostante il suo ruolo nella sopravvivenza cellulare, l’autofagia

ha effetto tumor suppressor. Infatti mutazioni e delezioni del gene
BECN-1 sono frequenti nei tumori ovarico, mammario e prostatico.
Questo effetto, apparentemente paradosso, può essere spiegato
col fatto che il deficit di autofagia conduce ad accumulo di danno
cellulare, in particolare danno genomico provocato da accumulo di
ROS e di proteine mal ripiegate
 Autofagia nel cancro:
tumor suppressor e tumor promoter

L'autofagia è spesso attivata nei tumori per superare gli stress derivanti
da una crescita rapida e una bassa disponibilità di nutrienti all'interno
della massa tumorale. Grazie all’attivazione di questo processo, la cellula
tumorale sopravvive allo stress metabolico e proliferativo

Alcune terapie antitumorali attivano l’autofagia che contribuisce allo

sviluppo della resistenza

L'autofagia sembra avere un effetto inibitorio sulla transizione epitelio-

mesenchimale (EMT), poiché diversi fattori di trascrizione che
promuovono l'EMT sono downregolati in modo autofagia-dipendente
 18
L’autofagia ha effetti divergenti sulla migrazione cellulare
Pro-tumor migration

Anti-tumor migration

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 Autofagia e apoptosi

L’autofagia rappresenta una risposta cellulare allo stress

metabolico

Se lo stress metabolico non è risolto dall’autofagia si

attiva l’apoptosi

La molecola “BH3-only” puma è indotta in corso di stress

metabolico, insieme a bim (altra molecola bh3-only)
concorre nell’attivare l’apoptosi

L’autofagia, tuttavia, può anche aumentare la soglia

cellulare all’apoptosi
I TUMORI SONO FREQUENTEMENTE SOTTOPOSTI A
STRESS METABOLICO, PER DIVERSI MOTIVI:

• Deficit di apporto di sangue

• Glicolisi inefficiente

• Elevata richiesta energetica a causa del rate

proliferativo incontrollato
Gli eventi mutazionali che
iniziano la tumorigenesi,
come l’attivazione di
oncogeni, promuovono la
proliferazione cellulare, ma
anche l’apoptosi, che limita
la crescita tumorale
in seguito ad acquisizioni di
difetti di apoptosi, la
proliferazione cellulare
aumenta
Inizialmente, l’assenza di adeguato apporto
ematico provoca un deficit di nutrienti e
quindi stress metabolico che attiva
l’autofagia soprattutto nelle zone più
ipossiche del tumore, cioè quelle centrali
 Successivamente l’attivazione di
angiogenesi, risolvendo il problema
ipossico, contribuisce alla crescita delle
cellule sopravvissute allo stress metabolico
grazie all’autofagia
 19

In tumori con difetti genetici dell’apoptosi e

dell’autofagia, lo stress metabolico provoca
necrosi, la necrosi a sua volta provoca
infiammazione, danno del DNA, angiogenesi
e progressione tumorale
La necrosi attiva l’infiammazione ed i processi riparativi cellulari

I tumori con necrosi ed infiammazione cronica presentano un abnorme

attivazione dei processi riparativi che sostengono la progressione tumorale

la necrosi altera i rapporti tra tumore e microambiente favorendo la metastasi

Inibitori farmacologici del processo autofagico
Metodi per il monitoraggio del numero di autofagosomi e del flusso
autofagico
(A) Rilevazione di
autofagosomi e
autolisosomi
mediante
microscopia
elettronica
convenzionale

Mizushima. Cell. 2010; 140: 313

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Morfologia dell'autofagosoma e dell'autolisosoma
TEM, microscopia elettronica a trasmissione

Mizushima. Cell. 2010; 140: 313

Metodi per il monitoraggio del numero di autofagosomi e del flusso 21
autofagico

(B) Il test di
formazione puncta
GFP-LC3 (o LC3
endogena)

Mizushima. Cell. 2010; 140: 313

Metodi per il monitoraggio del numero di autofagosomi e del flusso 22
autofagico

(C) Rilevazione
della conversione di
LC3-I (forma
citosolica) in LC3-II
(forma lipidata
legata alla
membrana)
mediante
immunoblotting.

Mizushima. Cell. 2010; 140: 313

Trattamenti e reagenti che modulano l'autofagia
il litio può anche inibire l'autofagia attraverso l'attivazione di mTOR

3-MA 3-methyl adenine inibitore di PI3k piu specifico per la classe III di wortmannin
Metodi per il monitoraggio del numero di autofagosomi e del flusso
autofagico in presenza di inibitori
 Argomenti trattati

• Tipi di autofagia nelle cellule di mammiferi

• Geni autofagici Atg
• Fase di iniziazione e formazione del fagoforo (complesso ULK,
complesso I PI3kclass III, beclina e VPS34)
• Espansione del fagoforo (proteine zinc-finger: WIP12 e DFCP1,
omegasoma)
• Formazione del cargo (ubiquitina, p62)
• Chiusura della membrana
• Maturazione dell’autofagosoma (rimozione degli Atg8 dalla
superficie della membrana e legame alle kinesine)
• Fusione con i lisosomi (complesso HOPs, proteine SNARE)
• Regolazione da mTOR e AMPk
• Autofagia e neurodegenerazione, ruolo dei ROS, dei mitocondri
e delle proteine mal ripiegate
• Autofagia e cancro, azioni pro- e anti-tumor
• Inibitori farmacologici dell’autofagia
• Alcuni metodi di studio dell’autofagia
Letture consigliate

Dikic & Elazar Mechanism and medical implications of

mammalian autophagy Nature Reviews Molecular Cell
Biology 2018; 19:349

Kriegenburg. Coordination of Autophagosome-Lysosome Fusion

by Atg8 Family Members. Curr Biol. 2018; 28:R512

Mathew Role of autophagy in cancer. Nature Reviews Cancer

2008; 7:961

Mizushima. Methods in Mammalian Autophagy Research Cell.

2010; 140: 313