“Le Emoglobinopatie: dal Fenotipo al Genotipo” - Palermo 21-25 Novembre 2005 M.

Vinciguerra

LE VARIANTI EMOGLOBINICHE
Margherita Vinciguerra
U.O. Ematologia II – Laboratorio per lo Studio e la Diagnosi Molecolare Prenatale di Talassemia
A.O. “V. Cervello”, Palermo.

Tra le emoglobinopatie possiamo distinguere difetti di sintesi dell’emoglobina, che danno

luogo alle talassemie o microcitemie, e difetti di struttura
che danno luogo alle varianti emoglobiniche. In seguito
agli studi di Max Perutz sulla struttura dell’emoglobina
ossigenata e deossigenata è stato possibile interpretare e
prevedere in termini stereochimici e conformazionali gli
effetti prodotti dalle sostituzioni amminoacidiche.
L’analisi cristallografica ha consentito di definire la
struttura terziaria e quaternaria dell’emoglobina che è
rappresentata da uno sferoide con un singolo asse di
simmetria. Esiste una notevole omologia strutturale tra le
catene globiniche, anche tra specie diverse, in quanto
alcuni amminoacidi sono conservati perchè critici per la stabilità e la funzionalità della molecola
(tasca dell’eme, amminoacidi idrofobici interni e idrofilici superficiali).
L’emoglobina va incontro a notevoli modificazioni
Modificazioni della struttura dell'emoglobina indotte dal legame con l' O 2
conformazionali in rapporto allo stato di ossigenazione. Il
legame con l’ossigeno è influenzato dall’interazione con
altre molecole, quali il 2-3 DPG, e da modificazioni del
pH (effetto Bohr); ciò è essenziale perché l’emoglobina
possa svolgere la sua funzione. a 1 ß1? 15°
15°

Le modificazioni conformazionali sono rese possibili a 1ß2 / a 2ß1

?
dalla presenza di amminoacidi specifici nei punti di ossi/deossi
ossi/ deossi

contatto tra dimeri ed eventuali sostituzioni di questi

amminoacidi possono avere drastiche conseguenze
funzionali.

NOMENCLATURA:
Le varianti emoglobiniche vengono indicate con lettere dell’alfabeto (es. Hb C), con il luogo
codone d’origine (es. Hb Cagliari) o con il
DEFINIZIONE SCIENTIFICA cognome del probando (es. Hb
catena posizione Lepore) oppure con definizioni
coinvolta nell’elica Sostituzione sostituzione N
aa singolari (es. Hb Constant Spring).
se definita
La definizione scientifica deve
HbC=β6(A3) glu→lys GAG→ AAG riportare la catena coinvolta, il
numero sequenziale nella catena
polipeptidica e nell’elica dell’amminoacido anomalo e la sostituzione amminoacidica; se
definita, viene riportata anche la sostituzione nucleotidica nel gene.

PREVALENZA:
50 80
Il numero di varianti emoglobiniche osservate e
β
α
caratterizzate è in continuo aumento (più di 900), grazie
300 450 δ anche alle tecniche di identificazione sempre più
γ affinate
( http://globin.cse.psu.edu).

18

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

 “Le Emoglobinopatie: dal Fenotipo al Genotipo” - Palermo 21-25 Novembre 2005 M. Vinciguerra

La prevalenza varia considerevolmente in rapporto alla posizione geografica ed al gruppo

etnico e per talune varianti è spesso sottostimata per l’assenza di pubblicazioni al riguardo.
Le emoglobine S (Africa equatoriale, Turchia Meridionale, Arabia Saudita, India Meridionale),
C (Africa Occidentale) ed E (Sud Est Asiatico) raggiungono frequenze polimorfiche grazie
anche ad un vantaggio selettivo dell’eterozigote in ambiente malarico; costituiscono, pertanto, un
problema sanitario.
Alcune delle varianti meno comuni si riscontrano in popolazioni specifiche, gruppi etnici o
razze (1%) e possono essere considerate come dei veri e propri marcatori antropologici.
I flussi migratori rendono, tuttavia, il quadro di distribuzione delle varianti variegato;
l’associazione di nuove mutazioni dà luogo a fenotipi sempre più complessi.
Inoltre, la coeredità di varianti emoglobiniche e di forme di talassemia diverse causa una
varietà di quadri clinici. In Italia la variante più comune è l’emoglobina S (Sicilia Orientale).
Il minor numero di varianti α globiniche identificate rispetto alle β è probabilmente dovuto alla
presenza di due geni α, oltre al fatto che i geni α globinici sono stati studiati meno del gene β. Il
numero ridotto di varianti δ è legato alla quantità ridotta di HbA2 che ne rende difficile
l’identificazione e che determina l’assenza di manifestazioni cliniche; la loro determinazione è
tuttavia importante perché, se associate (in cis o in trans) ad una β talassemia, possono
mascherarla in quanto riducono la quantità di Hb A2.
Le varianti γ possono essere identificate prevalentemente in corso di screening neonatali,
tranne HbF Poole [Gγ 130 (H8) trp→ gly] e FM Osaka [Gγ 63 (E7) his→ tyr] che determinano
anemia emolitica neonatale clinicamente evidente.

PATOLOGIA MOLECOLARE:
Il difetto molecolare che più comunemente è responsabile delle varianti emoglobiniche
consiste in una singola sostituzione nucleotidica in
una tripletta codificante in uno dei geni globinici (es. Background genetico delle
Hb C). emoglobine varianti
Alcune varianti presentano due sostituzioni Disordini ereditari (leggi di Mendel); talvolta fenotipo dominante
nucleotidiche nella stessa catena globinica (es. HbC-
Harlem). Meccanismo
Casi de novo
autosomico
Diverse varianti, per lo più instabili, presentano una
Mosaicismo Mutazioni somatiche
catena globinica accorciata a causa della delezione nella linea germinale negli eritrociti

di una o più triplette (es. Hb Leiden); altre presentano •Mutazioni puntiformi

•Modificazioni post-traduzionali
una catena globinica allungata in seguito a singola •Inserzioni o delezioni
•Meccanismi di crossing-over
sostituzione nucleotidica (es. Hb Constant Spring),
frameshift o inserzione di una o più triplette.
Le emoglobine ibride da fusione di catene globiniche diverse derivano da crossing-over
ineguali fra i geni delle catene coinvolte (es. Hb Lepore Boston).

CLASSIFICAZIONE:
Le varianti emoglobiniche possono essere distinte in varianti comuni e varianti rare.
Le varianti emoglobiniche comuni interessano milioni di persone; sono state per lo più
selezionate dalla malaria per il vantaggio selettivo dei portatori in ambiente malarico (es. HbS e
C). Tale gruppo comprende anche varianti limitate ad alcune popolazioni, all’interno delle quali
raggiungono un livello polimorfico; per questo motivo possono essere considerate come
marcatori genetici. Le varianti emoglobiniche comuni sono generalmente silenti, ma possono
interagire con altri difetti molecolari più severi; pertanto, la loro corretta identificazione non può
essere sottovalutata.
Le varianti emoglobiniche rare risultano da mutazioni private, cioè da mutazioni che
interessano singoli gruppi o famiglie; sono clinicamente silenti e vengono riscontrate attraverso
19

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

 “Le Emoglobinopatie: dal Fenotipo al Genotipo” - Palermo 21-25 Novembre 2005 M. Vinciguerra

screening di popolazione o per interferenza con altri test biologici. Alcune di esse sono
emoglobine instabili e possono determinare difetti ematologici severi, quali anemia emolitica
cronica, variazioni nell’affinità per l’ossigeno, cianosi e policitemia.
È possibile anche fare una classificazione in base al tipo di catena mutata; il livello di
espressione allo stato eterozigote è diverso a seconda della catena:
§ Catene β varianti stabili → 40 – 45%
§ Catene α2 varianti → 25 – 30%
§ Catene α1 varianti → 10 – 15%
§ Catene γ varianti → dipende dal gene coinvolto (Gγ oppure A
γ) ed è
condizionato condizionato dallo switch feto-adulto
§ Catene δ varianti → 1,2 – 1,5%

Riguardo la FISIOPATOLOGIA delle varianti, possiamo distinguere:

§ varianti asintomatiche;
§ varianti con alterata affinità per l’O2 ;
§ varianti instabili e con fenotipo simil-talassemia
per:
a. riorganizzazione del cluster (Hb Lepore);
b. modifica regione di splicing (Hb E).
§ varianti falcizzanti (Hb S);
§ metemoglobina (Hb M).

Mutazioni a carico di amminoacidi apolari interni causano alterazioni nei contatti con l’eme
e l’ingresso di acqua, con instabilità e precipitazione dell’emoglobina; si formano corpi inclusi
intraeritrocitari (Corpi di Heinz) con conseguente danno di membrana e, quindi, emolisi.
Delezioni degli amminoacidi nelle zone di contatto tra subunità modificano la struttura
sterica della molecola, dando luogo ad emoglobine instabili.
Sotituzioni ammioacidiche nelle regioni ad α-elica con la prolina causano instabilità, dal
momento che questo amminoacido non è in grado di partecipare a tale struttura secondaria.
Le sostituzioni negli amminoacidi esterni sono, in genere, innocue perché non modificano la
struttura terziaria, la tasca dell’eme o l’interazione tra le catene globiniche. In alcuni casi, però,
come l’Hb S e C, le sostituzioni superficiali determinano un’interazione tra tetrameri adiacenti
con formazione di polimeri o cristalli all’interno del globulo rosso e conseguente diminuzione
della deformabilità, alterata circolazione nei piccoli vasi ed emolisi.
Sostituzioni amminoacidiche nei punti di contatto α1β2 che alterano l’interazione eme-eme o
nella zona C-terminale della catena globinica, essenziale nell’effetto Bohr e nel legame con 2-3
DPG, portano a varianti con Varianti Hb clinicamente rilevanti
alterata affinità per l’ossigeno. Hb Posizione sostituzione aa Quadro clinico Alterazione
La sostituzione delle istidine funzionale
HbS superficie crisi falcemiche e anemia aggregazione e
prossimale e distale (E7/F8) con emolitica (omozigoti) ? solubilità
lieve anemia emolitica con ?solubilità e
tirosina stabilizza il ferro eminico HbC superficie
splenomegalia (omozigoti) cristallizzazione

nello stato ossidato non HbE superficie lieve anemia emolitica (omozigoti)
talassemia major o intermedia
? sintesi, leggera
instabilità
(interazione con ß talassemia)
funzionale, dando luogo a Hb instabili tasca eme anemia emolitica (eterozigoti) instabilità e
precipitazione
varianti M responsabili di (oltre 100 varianti) siti associazione subunità
intraeritrocitaria
Alterato trasporto di O :
metemoglobinemia. Aumentata affinità (70)
2
contatto a ß , regione C term
1 1
eritrocitosi familiare aumentata affinità per
O2
siti di legame 2-3 DPG
Ridotta affinità contatto a 1ß2
cianosi familiare
QUADRI CLINICI: prossimità tasca eme
? affinità per O2

HbM (9 varianti) His prox e dist (tasca eme) metemoglobina ferro eminico in forma
Le varianti emoglobiniche ossidata (Fe3+)

Hb con fenotipo tal: talassemia major-intermedia ? sintesi

clinicamente rilevanti danno Hb Lepore Hb ibrida dß
(omozigoti o interazione con ß
talassemia)
iperinstabilità,
precipitazione in
Hb iperinstabili (20) variabile talassemia major-intermedia precursori eritroidi
Hb Constant Spring catena a allungata (eterozigoti) ? sintesi
microcitosi, A2 normale

20

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

 “Le Emoglobinopatie: dal Fenotipo al Genotipo” - Palermo 21-25 Novembre 2005 M. Vinciguerra

luogo a quadri clinici molto variabili per tipo e gravità.

L’emoglobina S (β Cd 6 A3: GAG > GTG glu>val) è responsabile della caratteristica forma a
falce degli eritrociti che li rende
3D position:
HbS external

RBC 5,02
Hb 15,8
Hct 45,4
MCV 90,5
MCH 31,4
RDW 14,1
HbF 0,3
HbA2 3,7
Hb Anomale banda patologica in
zona Sw=39,1%

estremamente fragili; in ß Cd 6 (A3): GAG > GTG glu>val

carenza di ossigeno, essa va incontro a

polimerizzazione in lunghe fibre. La
valina, che sostituisce il glutammato, si inserisce nella tasca idrofobica del gomito EF di una
catena β di un'altra molecola di emoglobina; la tasca idrofobica in EF è accessibile solo nelle
forme deossigenate ed è per questo che
v ß /ß clinicamente silente
C A

3D position: ß /ß o ß /ß lieve anemia

i portatori eterozigoti vanno incontro a
external HbC vemolitica C C C tal

con splenomegalia. crisi falcemiche in carenza di ossigeno.

v ß /ß manifestazioni cliniche
C S
Nei casi di doppia eterozigosità con
ad esordio tardivo
un’altra mutazione si può avere un
RBC 4,00 effetto neutrale, un effetto inibitore
Hb 12,5 sulla polimerizzazione (HB Korle Bu) o
HCT 34,9
MCV 92
un effetto addizionale (Hb O-Arab, Hb
MCH 32,9 C).
RDW 12,3
HbF 0
Per quanto riguarda l’emoglobina C,
HbA 2 3,1 lo stato eterozigote è clinicamente
Hb Anomale Banda patologica in silente; gli omozigoti e i doppi
zona Cw=40,2%
eterozigoti HbC/β-tal presentano una
ß Cd 6 (A3): GAG>AAG glu>lys lieve anemia emolitica con
splenomegalia. In associazione con Hb
S si ha lieve anemia falciforme ad esordio tardivo.
L’eterozigote per emoglobina E è 3D position:
v βE/βA clinicamente silente
(lieve microcitosi ed ipocromia)
external
clinicamente silente, con lieve
microcitosi ed ipocromia; nello stato
HbE v βE/βE lieve anemia emolitica
con spiccata microcitosi
microcitosi;; a volte
modesta splenomegalia.
omozigote si presentano lieve anemia v βE/βtal quadri clinici variabili
emolitica con spiccata microcitosi e, a RBC 6,13
volte, modesta splenomegalia. Hb 15,3

L’interazione con β-talassemia HCT

MCV
44,6
72,7
determina quadri clinici variabili da una MCH 24,9
RDW 13
lieve talassemia intermedia ad una HbF 1,9
HbA2 29,6
talassemia major. Hb Anomale Banda patologica in zona
A2 =29,6%

β Cd 26 (B8): GAG>AAG glu>lys

Elettroforesi (pH alcal.) tra HbA ed HbS
Elettroforesi pH acido: co-migra HbA

21

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

 “Le Emoglobinopatie: dal Fenotipo al Genotipo” - Palermo 21-25 Novembre 2005 M. Vinciguerra

VARIANTI EMOGLOBINICHE INSTABILI:

Sono degradate in pochi minuti dopo la loro biosintesi; a seconda del grado di instabilità,
determinano un quadro clinico
3D position:
caratterizzato da emolisi cronica con Hb Acharnes external
anemia, ittero e splenomegalia di instabile
RBC 4,52
diverso grado. I sintomi clinici nei casi Hb 12,8
gravi si manifestano fin dal primo HCT 36,6

anno di vita, mentre nelle forme lievi MCV 81,1

MCH 28,4
si manifestano nell’adolescenza o, RDW 12,6
addirittura, nell’età adulta; le forme HbF 0,5
più lievi vengono, per lo più, HbA 2 3,2
Hb Anomale Assenza
evidenziate solo nel corso di screening
per emoglobinopatie. Le varianti
instabili provocano spesso colelitiasi e
l’emissione intermittente di urine scure
per dipirroli; in più della metà dei casi ß Cd 53 (D4): GCT>ACT ala>tyr
si riscontra una storia familiare di
anemia emolitica. L’emolisi cronica può essere aggravata da emolisi acuta a seguito di infezioni
o a seguito dell’assunzione di farmaci ossidanti (es. Hb Hasharon, J-Cosenza); l’anemia diventa
più grave e si verifica cianosi se è alterata anche l’affinità per l’ossigeno (es. Hb Hope, Seattle)
o Hb M (es. Hb St. Louis). A livello ematologico, si riscontrano punteggiature basofile,
reticolocitosi, iperbilirubinemia indiretta, diminuzione di aptoglobina e corpi di Heinz;
l’ipersplenismo può aggravare l’anemia.

EMOGLOBINE CON ALTERATA AFFINITA’ PER L’OSSIGENO:

Le varianti con affinità per l’O2 aumentata rilasciano meno ossigeno alla PO2 tissutale; ciò
determina anemia e ipossia con
3D position:
conseguente secrezione a livello renale Hb Mc Kees Rocks a internal; ß contact;
di eritropoietina, la quale agisce a 1 1
increased O 2

livello midollare stimolando affinity

RBC 5,7
l’eritropoiesi: l’effetto che ne deriva è Hb 17,6
Ht 50,6
la policitemia, da non confondere con
MCV 88,5
la policitemia vera dove aumentano MCH 30,8
anche leucociti e piastrine. Nella RDW 12,9

maggior parte dei casi si riscontra HbF 6,2

HbA 2,8
un’eritrocitosi familiare associata a 2

Hb Anomale Banda in zona P 3

livelli elevati di emoglobina.
Sono per lo più asintomatiche e,
quindi, vengono identificate solo nel ß Cd145 (HC2): TAT > TAA tyr>his
corso di esami ematologici di routine
per la presenza di eritrocitosi.
Le varianti con affinità per l’O2 diminuita sono meno numerose; sono ben ossigenate nei
polmoni e rilasciano più facilmente l’ossigeno ai tessuti. Sono caratterizzate da cianosi fin dai
primi giorni di vita e da una leggera anemia, senza effetto funzionale.

EMOGLOBINE M:
Sono date da mutazioni a carico delle istidine strategiche della tasca dell’eme che vengono
sostituite da tiroxina, sia nella catena α che nella catena β; il gruppo fenolico della tiroxina forma
un legame covalente con il ferro eminico, stabilizzandolo nello stato ossidato non funzionale. I
soggetti con queste emoglobine anomale presentano esclusivamente cianosi, dovuta ad un
22

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

 “Le Emoglobinopatie: dal Fenotipo al Genotipo” - Palermo 21-25 Novembre 2005 M. Vinciguerra

eccesso di metemoglobina, senza anemia né altri sintomi; con le varianti α (es. M-Boston, M-
Iwate) la cianosi è presente fin dalla
nascita, con le varianti β compare nei Hb Iwate 3DProximal position: eme contact;
his 87 (F8)

primi mesi di vita. È importante la

?
diagnosi differenziale con la
RBC 5.46
metemoglobinemia da difetto di HB 13.4
metemoglobin reduttasi e con malattie HCT 40.0
MCV 73.2
da difetto di ossigenazione MCH 24.6
(cardiopatie, pneumopatie). I soggetti MCHC 33.6
RDW 19.3
con Hb M non necessitano di A 4.4% 2
HbX 25.4%
trattamento e possono sottoporsi ad
interventi chirurgici senza difficoltà.
ααIwate/αα
a 1 Cd 87 ( CAC ? TAC )
His ? Tyr
IVS I IVS II
DIAGNOSI: 5’UTR
Cd 1−31 Cd 32−99 Cd 100−142
3’UTR

Per le varianti emoglobiniche

clinicamente evidenti il sospetto diagnostico si basa sulla presenza di sintomi quali anemia
emolitica, cianosi ed eritrocitosi; nella maggior parte dei casi in HPLC si evidenzia la presenza
di un picco anomalo. La diagnosi di varianti emoglobiniche clinicamente silenti, invece, può
essere occasionale nel corso di screening di massa per la prevenzione di emoglobinopatie; si
tratta, in genere, di varianti funzionalmente normali ed asintomatiche.
Esistono, comunque, varianti, sintomatiche o asintomatiche, non rilevabili in HPLC o in
elettroforesi; questo può accadere o in seguito ad una sostituzione amminoacidica neutra o in
seguito ad elevata instabilità con
precipitazione nei precursori eritroidi; Emocromo
in tal caso è utile la ricerca di corpi HPLC
inclusi, la conta dei reticolociti, i test
di instabilità, l’esame morfologico
Conta reticolociti Test specifici:
dello striscio di sangue periferico e Studi funzionali:
Corpi inclusi § falcizzazione
affinità per O2
l’elettroforesi su vari substrati. Test isopropanolo §metemoglobina
Le varianti con alterata affinità per Stabile/instabile

l’ossigeno necessitano, invece, di studi Quantità

Studio per
HPLC globine
funzionali quali la curva di Sintesi
anemia emolitica
dissociazione dell’ossigeno.
Variante a/ß
Una variante Hb può presentarsi in Analisi DNA
percentuali e con quadri clinici molto Enzimi di restrizione
Reverse dot blot
differenti per tipo e gravità in sequenza

relazione alla presenza di fattori

concomitanti (tipo di catena mutata, gene coinvolto, stabilità della catena globinica e del
tetrametro, affinità con la catena omologa, affinità della variante con l’O2, effetto dell’eventuale
contemporanea presenza di un difetto talassemico, anemia); la valutazione di tali fattori può
contribuire alla corretta caratterizzazione del fenotipo emoglobinico e ad un’appropriata
consulenza genetica.

PROBLEMATICHE:
Sono legate alla necessità di una corretta identificazione cromatografica o elettroforetica di
varianti nuove o rare, seguita dalla conferma molecolare anche per le varianti comuni; inoltre,
spesso, non si hanno sufficienti informazioni sull’interazione tra varianti rare e mutazioni β-trait
o βS-trait. Il principale risvolto di tali problematiche è la difficoltà nella formulazione del referto
e nel fare un’adeguata consulenza genetica in coppie a rischio.

23

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

 “Le Emoglobinopatie: dal Fenotipo al Genotipo” - Palermo 21-25 Novembre 2005 M. Vinciguerra

EMOGLOBINA MARINEO (β70 (E 14) Ala →Val):

E’una nuova variante emoglobinica identificata nel nostro laboratorio.
La sostituzione nucleotidica (GCC>GTC) cade nel codone 70 che codifica per un
amminoacido situato all’interno della tasca dell’eme; a differenza delle altre tre mutazioni già
precedentemente riscontrate nello stesso codone, è stabile ed il fenotipo che ne risulta è
clinicamente silente. In HPLC non è possibile separare questa nuova variante (a parte un piccolo
incremento nella finestra P2 o P3 a seconda del tipo di sistema HPLC), ma in RP-HPLC si rileva
un picco del 40% circa.

Hb-Marineo[β70 (E14) Ala→Val]:

a silent hemoglobin variant with a mutation within the heme
pocket
Antonino Giambona1, Margherita Vinciguerra1, Filippo Cassarà1, Rita Li Muli1 ,
Filippo Leto1, Cristina Passarello1 , Henri Wajcman2, and Aurelio Maggio1.
1Azienda Ospedaliera Vincenzo Cervello, UO Ematologia II, Palermo, Italy
2Inserm U654, Hôpital Henri Mondor, Créteil, France.

P2=9.2 RBC 4.45

Hb 13.2
P3=7.8
Ht 39.4
MCV 88.4
MCH 29.5
RDW 12.4
A2 2.9

A B
Chromatograms of the propositus' hemolysate obtained by CE-HPLC . The arrows indicate the P2 (A)
and P3 (B) peaks, increased in the propositus.

β Cd 70 GCC > GTC

Ala > Val

Gly Ala? Val Phe

G G T G N C T T T

Fluorescent-based automated DNA sequence analysis of a PCR-amplified

fragment corresponding to exon 2 of the ß-globin gene. The arrow indicates the Chromatogram of the propositus' hemolysate obtained by RP-HPLC; the arrows indicate the β A and β Marineo globins.
nucleotide substitution GCC→GTC (Ala→Val); codons 69-70-71 with their
respective amino acid residues are indicated.

Per ulteriori informazioni consultare:

1. http://globin.cse.psu.edu
2. Cao A., Galanello R. Le emoglobinopatie. In Burlina A, ed. Piccin, 1994.
3. HuismanT.H.J., Carter M.F.H., Efremov G.D. A syllabus of hemoglobin variants. Augusta
GA, USA. The Sickle Cell Anemia Foundation, 1998.
4. Perutz M.F., FermiG., Luisi B., et al. Stereochemistry of cooperative mechanism in
hemoglobin. Cold Spring Harb Symp Quant Biol, 1987.
5. Wajcman H. Abnormal hemoglobins: general principles. Clinical Aspects and Therapy of
Thalassemia, 2004, SEE- Firenze editor.

24

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com