4

Fluorescenza in stato
stazionario
 Condizioni fotostazionarie
α kr N0+hν’
N0+hν N1
knr N0

𝑑𝑑 𝑁𝑁1
= 𝛼𝛼 − 𝑘𝑘𝑟𝑟 + 𝑘𝑘𝑛𝑛𝑟𝑟 𝑁𝑁1 = 0
𝑑𝑑𝑑𝑑
𝛼𝛼
𝑁𝑁1 𝑠𝑠𝑠𝑠 = = 𝛼𝛼𝜏𝜏
𝑘𝑘𝑟𝑟 + 𝑘𝑘𝑛𝑛𝑛𝑛
𝐹𝐹𝑠𝑠𝑠𝑠 ∝ 𝑘𝑘𝑟𝑟 𝑁𝑁1 𝑠𝑠𝑠𝑠 = 𝛼𝛼𝑘𝑘𝑟𝑟 𝜏𝜏 = 𝛼𝛼Φ
•Si raggiunge (in pochi ns) una condizione di equilibrio, in cui è eccitata una frazione costante di
fluorofori.
•Con le normali intensità delle lampade, questa frazione è sempre prossima a 0 (kA dipende dal
flusso di fotoni)
•L’intensità di fluorescenza è costante e proporzionale alla resa quantica.
•Nota: l’espressione dell’eccitazione come kA[N0] è approssimata (vedi dopo)
 Il fluorimetro
Lampada Beam splitter
Campione
λecc.

λem.
Lente
Monocromatore
di eccitazione Lente

Monocromatore
Computer di emissione

PMT PMT
“riferimento” “segnale”
 Osservabili: intensità
Dipende da:
•Concentrazione di fluoroforo
•Efficienza dell’assorbimento di radiazione (ε)
•Efficienza dell’emissione radiativa (resa quantica)
fotoni emessi
F ∝ fotoni emessi = (fotoni assorbiti) ⋅ Φ = Φ=
fotoni assorbiti
= ( I 0 '− I ' ) ⋅ Φ = ( I 0 '− I 0 '10 − A' ) ⋅ Φ = I 0 ' Φ ⋅ (1 − 10 − A' )
′
𝐹𝐹 = 𝑆𝑆 𝐼𝐼0 ′Φ 1 − 10−𝐴𝐴
per A'<< 1
 d   d ln(10− A )  (1− 10−A ' ) ≅ A'ln10
10−A ≅ {10−A }A = 0 +  (10− A ) A = 1+ A ⋅ 
 dA  A= 0  dA
e[ ] 
 A= 0
=

 d − A ln10 
= 1+ A ⋅  [e ] = 1+ A ⋅ {− ln10⋅ e −A ln10}A = 0 = 1− A ⋅ ln10
1− 10−A ≅ A ln10
 dA A= 0
F ∝ Φ ⋅ A = Φ ⋅C ⋅ε ⋅l
 Filtro interno
Fluorescence (a.u.) 15

10

0
0 0.5 1 1.5 2 2.5

A
 Filtro interno
δ
Ecc. Ecc.

Campione diluito Campione concentrato

50

′ 𝐴𝐴 𝛿𝛿
− −𝐴𝐴
𝐹𝐹 = 𝑆𝑆 𝐼𝐼0 ′Φ 1 − 10−𝐴𝐴 ≅ 𝑆𝑆 𝐼𝐼0 10 2 Φ 1 − 10 𝑙𝑙
40

Fluorescence (a.u.)
30
A ( λecc . )
− Measured
F ∝ I(centro cella ) ≅ I0 10 2
20
Inner-filter corrected

10
0.03
−
A( λ ecc. ) ≤ 0.03 10 2 = 0.97 0
0 0.5 1 1.5 2 2.5

A
Filtro interno in emissione
Attenzione!
Si vedono concentrazioni sub nM,
fino alla singola molecola.
Applicazioni analitiche!
 Assorbanza…

Inoltre: l’assorbimento è un processo istantaneo, la fluorescenza no

•sensibilità molto maggiore all’ambiente del cromoforo (processi non radiativi)
•Sensibilità alla dinamica.
 Intensità: applicazioni
• Misure di concentrazione
(fino a nM, ma anche singola molecola)
• Ambiente ed interazioni molecolari del
fluoroforo, tramite Φ

F ∝ Φ ⋅C ⋅ε ⋅l
 Partizione acqua membrana
KP

Apparent membrane-bound peptide fraction

Fluorescence intensity (a.u.)

Lipid
F10 1.1 µM
concentration
F10 11 µM
0.5 F10 30 µM

0
300 320 340 360
0 0.001
Wavelength (nm) Lipid (mM)

Stella et al., Biophys . J. 2004 86: 936–945.

 Equilibrio a due stati
A B
𝐹𝐹 ∝ 𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓 𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒 =
= 𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓 𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝐴𝐴 � Φ𝐴𝐴 +𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓 𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝐵𝐵 � Φ𝐵𝐵 =
= 𝐴𝐴 � 𝜀𝜀𝐴𝐴 � Φ𝐴𝐴 + 𝐵𝐵 � 𝜀𝜀𝐵𝐵 � Φ𝐵𝐵 =
= 𝑥𝑥𝐴𝐴 � 𝑇𝑇𝑇𝑇𝑇𝑇 � 𝜀𝜀 � Φ𝐴𝐴 +𝑥𝑥𝐵𝐵 � 𝑇𝑇𝑇𝑇𝑇𝑇 � 𝜀𝜀 � Φ𝐵𝐵

𝐹𝐹 = 𝑥𝑥𝐴𝐴 � 𝐹𝐹𝐴𝐴 + 𝑥𝑥𝐵𝐵 � 𝐹𝐹𝐵𝐵 = 𝑥𝑥𝐴𝐴 � 𝐹𝐹𝐴𝐴 + 1 − 𝑥𝑥𝐴𝐴 � 𝐹𝐹𝐵𝐵

F FA

𝐹𝐹 − 𝐹𝐹𝐵𝐵
𝑥𝑥𝐴𝐴 = F
𝐹𝐹𝐴𝐴 − 𝐹𝐹𝐵𝐵
FB
Processi di associazione

BSA bound
Free

Fluorescence (arbitrary units)

400 450 500 550 600

λ (nm)
 Curva di associazione dell'ANS alla BSA
1

0,8

0,6
β

0,4

0,2

-6 -6 -6 -6 -5 -5 -5
0 2 10 4 10 6 10 8 10 1 10 1,2 10 1,4 10
Cf (M)
pH
 Variazioni
dell’ambiente
del fluoroforo

Chem. Commun., 2011, 47, 994-996

ESICT=excited state
intramolecular charge transfer
ESIPT=excited state
intramolecular
proton transfer
0,012

0,01 BSA Nativa

0,008

BSA
0,006

BSA Denaturata
BSA+GCL

0,004

0,002

0
300 320 340 360 380 400 420 440 460
lambda (nm)
Altri esempi quando parleremo del
quenching
 Osservabili: intensità e resa quantica
L’intensità di fluorescenza è una misura relativa, perché
dipende anche da:

•Intensità della lampada

•Efficienza dei monocromatori
•Banda passante utilizzata
•Sensibilità del tubo fotomoltiplicatore

Ossia dipende dallo strumento con cui è stata determinata

Al contrario,
•l’assorbanza è una misura assoluta [A=log(I0/I)]
•la resa quantica è una misura assoluta [Φ=kr/(kr+knr)]
 Osservabili: resa quantica
misura diretta
• Bisogna raccogliere i fotoni emessi in
tutte le direzioni
• Sfera integratrice
• Materiale altamente riflettente
(es. teflon)

• Alternativa: misura calorimetrica

 Osservabili: resa quantica
misure per confronto
Fst
F ∝ Φ⋅ A Φ st = S
Ast
F
Φ∝ F
A S
Φ A F Ast
F = = ⋅
Φ=S Φ st S Fst A Fst
A
Ast

F Ast
Φ = Φ st ⋅
Fst A
 Osservabili: resa quantica
misure per confronto
S dipende da λexc e λem:
standard e campione devono avere spettri simili.
 Osservabili: resa quantica
misure per confronto
Se standard e campione sono in solventi differenti:
2
F Ast  n 
Φ = Φ st ⋅  
Fst A  nst 

La frazione di luce
raccolta dal rivelatore
θi
dipende dagli n
θo
Angolo solido in coordinate sferiche

A
ω=
r2
L’intero angolo solido è 4π

dA 1
dω = 2
= 2
rdθ ⋅ r sin θ dϕ
r r
dω = sin θdθdϕ
2π π
ω=
∫ ∫
0
dϕ sin θdθ
0
A causa del diverso indice di rifrazione tra cuvetta ed esterno viene
rivelata una frazione della luce pari a

2π θi θi θi
θi2
ωi
∫ dϕ ∫ sin θdθ 2π ∫ sin θdθ ∫θdθ  θi 
2
= 20π 0
= θ 0
≅θ 02
= 2 =  
θo
ωo o o
θo  θo 
∫ dϕ ∫ sin θdθ 2π ∫ sin θdθ ∫θdθ 2
0 0 0 0

θi

θo
 Legge di Snell
no sin θi θi
= ≅
ni sin θ o θ o

2 2
ωi  θi   no  1
=   =   ≅ 2
ωo  θ o   ni  ni

2
F 2 F F Ast  n 
Φ = S = S'n Φ = Φ st ⋅  
A A Fst A  nst 
Indice di rifrazione a 500 nm
Aria: 1
Acqua: 1.337 Per acqua-cicloesano, il
fattore di correzione è
Metanolo: 1.345
(1.431/1.337)2=1.14
Etanolo: 1.365
Cicloesano: 1.431

N.B.:
dipendono da λ!
refractiveindex.info
• In realtà gli spettri di standard e campione non
sono identici
• Per tenere conto di tutti i fotoni emessi (come
prevede la definizione di resa quantica) si usa
l’integrale spettrale e non l’intensità ad una sola
lunghezza d’onda
• L’integrale va calcolato in λ!

∫ F ( λ ) dλ
0