Corso di Biochimica

4 luglio 2010

Anno Accademico 2009-2010

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Indice

I Marchetti 5
1 Aminoacidi 5
1.1 Aminoacidi comuni . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
1.2 Aminoacidi modificati . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6

2 Proteine 7
2.1 La struttura proteica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
2.1.1 Il legame peptidico e la struttura primaria . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
2.1.2 La struttura secondaria . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
2.1.3 La struttura terziaria . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
2.1.4 La struttura quaternaria . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
2.2 Denaturazione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
2.3 Il collagene . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
2.3.1 Principali patologie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
2.4 L’emoglobina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
2.4.1 Struttura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
2.4.2 Funzione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
2.4.3 Prevenzione dell’ossidazione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
2.4.4 Genetica e principali patologie dell’emoglobina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
2.5 Proteasi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
2.5.1 La coagulazione del sangue . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

3 DNA 19
3.1 Struttura chimica del DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
3.1.1 Stabilità della struttura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
3.2 Organizzazione del DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
3.2.1 Dati quantitativi e superavvolgimento del DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
3.2.2 La cromatina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
3.3 La replicazione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
3.3.1 La replicazione nei batteri . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
3.3.2 La replicazione negli eucarioti . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
3.4 Mutazioni e riparazione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
3.4.1 Mutazioni . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
3.4.2 Riparazione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27

4 RNA 28
4.1 Trascrizione nei procarioti . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
4.1.1 Controllo trascrizionale (E.Coli) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
4.2 Trascrizione negli eucarioti . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
4.2.1 Controllo dell’espressione genica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
4.2.2 Maturazione dell’RNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
4.2.3 RNA interference . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35

5 Sintesi proteica 36
5.1 tRNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
5.2 Il ribosoma . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
5.2.1 Fase di iniziazione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
5.2.2 Fase di allungamento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
5.2.3 Terminazione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
5.3 Controllo della traduzione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
5.3.1 Controlli generali . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
5.4 Modifiche post-traduzionali . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
5.4.1 Trasporto . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42

2
 5.4.2 Modifiche . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
5.4.3 Degradazione intracellulare . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44

6 Biosegnalazione - ormoni 45

II Dallocchio 52
7 Enzimi 52
7.1 Cinetica enzimatica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
7.1.1 Equazione di Michaelis-Menten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54
7.1.2 Inibizione enzimatica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55

8 Glicolisi 56
8.1 Visione d’insieme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56
8.2 Passaggi della glicolisi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56
8.3 Guadagno netto e riassunto . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
8.3.1 Vie di rifornimento della glicolisi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
8.4 Condizioni anaerobie: fermentazione del piruvato . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60

9 Gluconeogenesi 62
9.1 Passaggi della gluconeogenesi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62
9.2 Riassunto ed equazione netta . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64

10 Via dei pentosi fosfati 65

11 Controllo di glicolisi e gluconeogenesi 67

12 Metabolismo del glicogeno 69

12.1 Glicogenolisi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69
12.2 Glicogenosintesi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69
12.3 Regolazione del metabolismo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70

13 Ciclo di Krebs 71
13.1 Piruvato e PDH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
13.2 Reazioni del ciclo di Krebs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72
13.3 Bilancio energetico e riassunto . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73
13.4 Regolazione del ciclo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74

14 Metabolismo degli acidi grassi 75

14.1 Accumulo e mobilitazione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75
14.2 Ossidazione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75
14.2.1Shuttle della carnitina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75
14.2.2Ossidazione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76
14.2.3Ossidazione degli acidi grassi insaturi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77
14.2.4Ossidazione degli acidi grassi a catena dispari . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78
14.3 Corpi chetonici . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78

15 Metabolismo degli aminoacidi 80

15.1 Transaminazione, deaminazione e trasporto . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80
15.2 Ciclo dell’urea . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81
15.2.1Controllo del ciclo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82
15.3 Vie di degradazione degli aminoacidi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82
15.3.1Aminoacidi degradati a piruvato . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83
15.3.2Aminoacidi degradati ad acetil-CoA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84
15.3.3Aminoacidi degradati ad alfa chetoglutarato . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85
15.3.4Aminoacidi degradati a succinil-CoA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86
15.3.5Aminoacidi a catena ramificata . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86

3
 15.3.6Schema complessivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86

16 Catena respiratoria e fosforilazione ossidativa 87

16.1 Complessi della catena respiratoria . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88
16.1.1Complesso I: da NADH ad ubiquinone . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88
16.1.2Complesso II: da succinato ad ubiquinone . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88
16.1.3Complesso III: da ubiquinone a citocromo “c” . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88
16.1.4Complesso IV: da citocromo “c” all’ossigeno . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89
16.1.5Movimenti netti e riassunto . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89
16.2 Sintesi di ATP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89
16.2.1Regolazione della fosforilazione ossidativa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90

17 Biosintesi dei lipidi 91

17.1 Biosintesi degli acidi grassi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91
17.1.1Regolazione della biosintesi degli acidi grassi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93
17.1.2Acidi grassi a catena lunga . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93
17.1.3Acidi grassi insaturi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93
17.1.4Eicosanoidi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93
17.2 Biosintesi dei trigliceridi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94
17.2.1Regolazione della sintesi dei trigliceridi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94
17.3 Biosintesi dei fosfolipidi di membrana . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95
17.3.1Fosfolipidi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95
17.3.2Sfingolipidi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96
17.4 Biosintesi del colesterolo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97

18 Biosintesi degli aminoacidi non essenziali 100

18.1 Aminoacidi derivati dall’alfa chetoglutarato . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100
18.2 Aminoacidi derivati dal 3-fosfoglicerato . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101
18.3 Aminoacidi derivati da ossaloacetato e piruvato . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 102

19 Biosintesi dell’EME 103

20 Biosintesi dei principali neurotrasmettitori 104

21 Biosintesi e degradazione dei nucleotidi 105

21.1 Sintesi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 105
21.1.1Sintesi ex-novo delle purine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 105
21.1.2Sintesi ex-novo delle pirimidine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 106
21.1.3Sintesi dei nucleosidi trifosfati . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107
21.1.4Sintesi dei desossiribonucleotidi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107
21.2 Degradazione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 108
21.2.1Degradazione purinica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 108
21.2.2Degradazione pirimidinica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 109
21.3 Riciclo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 109

22 Metabolismo tessuto specifico 110

22.1 Fegato . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 110
22.1.1Zuccheri . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 110
22.1.2Aminoacidi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 110
22.1.3Lipidi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111
22.2 Tessuto adiposo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 112
22.3 Tessuto muscolare . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 112
22.4 Tessuto nervoso . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113

4
Parte I
Marchetti
1 Aminoacidi
1.1 Aminoacidi comuni
Le proteine sono polimeri di aminoacidi, con ciascuno dei residui legato covalentemente agli altri da
un legame specifico. Venti sono gli aminoacidi comunemente ritrovabili nelle proteine e sono tutti di
tipo α, presentano cioè un gruppo carbossile e uno aminico legati allo stesso atomo di carbonio definito
appunto carbonio α. Le differenze tra gli aminoacidi sono legate alle loro catene laterali, o gruppi R,
che differiscono in struttura, dimensioni e carica elettrica, il che influenza la solubilità in acqua delle
varie molecole.
Per tutti gli aminoacidi ad eccezione della glicina, il carbonio α è legato a quattro differenti gruppi:
1. Il gruppo carbossile (−COOH)
2. Il gruppo aminico (−N H3 )
3. Il gruppo R

4. Un atomo di idrogeno
Il carbonio α è dunque un centro chirale e ,poichè le due possibili configurazioni non sono sovrapponi-
bili, ogni aminoacido esiste sotto forma di enantiomeri, una sottoclasse degli stereoisomeri. Virtual-
mente tutti i composti biologici che possiedono un centro chirale vengono riscontrati in una sola delle
due forme possibili, sia essa D o L: gli aminoacidi delle proteine sono esclusivamente aminoacidi di
tipo L. La discriminazione della cellula di una forma o dell’altra avviene a causa degli enzimi, i cui siti
attivi sono fortemente asimmetrici e possono catalizzare le loro reazioni solo in presenza del corretto
enantiomero.
Gli aminoacidi possono essere classificati in cinque classi principali sulla base delle proprietà del
loro gruppo R, in particolare della polarità.

Gruppi R alifatici non polari All’interno di questro gruppo convergono sette aminoacidi: glicina,
alanina, prolina, valina, leucina, isoleucina e metionina. Le singole particolarità possono essere così
elencate:
• Alanina, valina, leucina e isoleucina tendono a raggrupparsi insieme alle proteine stabilizzando la
struttura della proteina stessa grazie ad interazioni idrofobiche.
• La glicina è l’aminoacido più semplice, l’unico a non possedere un centro chirale e non fornisce
un contributo significativo alle interazioni idrofobiche.
• La metionina è uno dei due aminoacidi contenenti zolfo (il secondo è la cisteina) e il suo gruppo R
contiene un gruppo tioetere non polare (CH2 − S − CH3 )

• La prolina ha una struttura ciclica particolare che riduce la flessibilità strutturale del polipeptide
nelle regioni in cui essa è presente

Gruppi R aromatici Tre sono gli aminoacidi che presentano gruppi R aromatici: fenilalanina, tirosina
e triptofano. Tutti possono partecipare nelle interazioni idrofobiche, e il gruppo −OH della tirosina può
in aggiunta formare legami idrogeno, funzionalmente importanti per alcuni enzimi. La fenilalanina è
l’aminoacido meno polare del gruppo per via del fatto che il suo anello aromatico non è modificato da
gruppi funzionali.

5
Gruppi R polari non carichi Questo gruppo è il secondo più numeroso e contiene cinque aminoacidi:
serina, treonina, cisteina, asparagina e glutamina. La polarità è derivata per serina e treonina da un
gruppo −OH, per la cisteina dal gruppo −SH, per asparagina e glutamina dai loro gruppi amminici
−N H2 .
• Asparagina e glutamina sono gli amidi di due aminoacidi di base: aspartato e glutamato.

• La cisteina può velocemente ossidarsi per formare un dimero aminoacidico chiamato cistina, che
grazie al suo ponte disolfuro stabilizza moltissimo la struttura di parecchie proteine.

Gruppi R carichi positivamente Tre sono gli aminoacidi carichi positivamente: lisina, arginina e
istidina. L’unico tra questi ad avere una catena laterale ionizzabile con un pKa vicino alla neutralità è
l’istidina, che a pH7.0 è presente sia in forma protonata che in forma neutra.

Gruppi R carichi negativamente (acidi) Due sono gli aminoacidi carichi negativamente a pH7.0:
aspartato e glutamato, entrambi dotati di un secondo gruppo carbossile.

1.2 Aminoacidi modificati

In aggiunta ai venti aminoacidi di base, le proteine contengono residui creati modificando aminoacidi
di base. Tra i più rappresentati sono da elencare:
• 4-idrossiprolina
• 5-idrossilisina

• Ornitina e citrullina, che rappresentano intermedi (metaboliti) sia della biosintesi dell’arginina che
del ciclo dell’urea

6
2 Proteine
L’arrangiamento spaziale degli atomi in una proteina è definito conformazione; una conformazione è
un qualsiasi stato ottenibile senza dover spezzare un legame covalente. Ogni proteina possiede teori-
camente centinaia di conformazioni tuttavia in condizioni biologiche una o più comunemente alcune
vengono selezionate poichè più stabili dal punto di vista termodinamico: le proteine che si trovano in
una di queste conformazioni sono definite native.
Nell’ambito strutturale, il termine stabilità di una proteina indica la tendenza a mantenere una
conformazione nativa; ciò che fa tendere una proteina alla conformazione nativa è il risultato di due
interazioni: legami disolfuro e interazioni deboli non covalenti, cioè legami a idrogeno e ionici. Molte
proteine non presentano legami disolfuro, soprattutto grazie al fatto che l’ambiente intracellulare è
quasi sempre molto riducente e quindi la formazione del legame −S − S− è sfavorita; per le proteine
intracellulari di molti organismi le interazioni deboli sono dunque le forze principali nel folding di una
catena polipeptidica. In generale è possibile affermare che molti dei pattern strutturali delle proteine
seguono due regole piuttosto semplici:
1. I residui idrofobici sono in gran parte sepolti all’interno della proteina e dunque lontano dall’acqua
2. Il numero di legami a idrogeno e interazioni ioniche è il massimo possibile in modo tale da ridurre
il numero di gruppo ionici e idrofilici che mancano di un partner

2.1 La struttura proteica

2.1.1 Il legame peptidico e la struttura primaria
La struttura primaria di una proteina è data dalla semplice sequenza lineare dei suoi aminoacidi tra
loro legati covalentemente dal legame peptidico. Il legame covalente è un elemento di peso notevole
nella limitazione delle strutture possibili per una proteina. I due atomi di carbonio α di due residui
successivi sono separati da tre legami covalenti differenti secondo il pattern Cα −C −N −Cα e studi sulla
diffrazione dimostrano che il legame C −N nei peptidi è più corto dello stesso legame nelle ammine e che
gli atomi del legame peptidico sono complanari. Una caratteristica fondamentale del legame peptidico
è dunque la coesistenza sullo stesso piano di sei atomi: tre di carbonio, uno di azoto, uno di ossigeno
e uno di idrogeno; l’atomo di ossigeno è in posizione trans rispetto a quello di idrogeno. Sulla base
degli esperimenti il legame C − N peptidico è stato definito parzialmente doppio e quindi limitato nella
rotazione: nel legame peptidico possono ruotare solo i due legami covalenti esterni, cioè Cα −N e Cα −C.
La conformazione del peptide è definita da due angoli diedri, detti φ (phi) e ψ (psi), che indicano la
rotazione compiuta dagli unici due legami liberi di farlo nel piano del legame peptidico. Teoricamente i
due angoli potrebbero presentare qualsiasi valore tra −180° e +180° tuttavia la maggior parte dei valori
sono proibiti per via dell’interferenza sterica tra gli atomi: gli angoli concessi sono raccolti nel grafico
di Ramachandran.

2.1.2 La struttura secondaria

Il termine struttura secondaria si riferisce a una qualsiasi porzione della catena polipeptidica e de-
scrive l’arrangiamento spaziale locale della porzione principale della catena, senza alcun interesse nella
descrizione delle catene laterali o delle interazioni tra la porzione in esame e le altre. Poche sono le
strutture secondarie che si presentano stabili e che vengono spesso evidenziate nelle proteine: le più
importanti sono l’α − elica e il β − f oglietto.

L’alfa elica La struttura più semplice che una catena polipeptidica può assumere è una struttura
ad elica in cui lo scheletro della proteina è strettamente avvolto intorno ad un asse longitudinale
immaginario che passa per il centro dell’elica; in questa struttura i gruppi R protrudono verso l’esterno.
L’unità ripetuta è un singolo giro dell’elica che si estende per circa 5.4Å lungo l’asse e comprende
3.6 residui aminoacidici. In generale, circa un quarto di tutti i residui presenti nelle proteine sono
impegnati in α − eliche ma la proporzione varia grandemente tra le varie proteine.
La formazione ad elica è grandemente favorita poichè fa un uso ottimale dei legami idrogeno interni
che stabilizzano grandemente la struttura: i legami si formano infatti tra un idrogeno legato ad un

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azoto e l’ossigeno legato ad un carbonio a quattro residui di distanza; nell’elica dunque tutti i residui,
con l’eccezione di quelli molto vicini agli estremi della molecola, sono coinvolti in legami idrogeno e
dunque stabilizzati. Teoricamente l’alfa elica è in grado di formarsi sia con aminoacidi della serie D che
della serie L, tuttavia non può essere formata da un mix di enantiomeri; inoltre possono formarsi sia
eliche ruotate verso destra che verso sinistra ma queste ultime sono meno stabili e non si osservano
nelle proteine.
Non tutte le catene polipeptidiche possono formare facilmente eliche stabili. Ogni residuo all’interno
della catena ha una propensione intrinseca nella formazione dell’elica, soprattutto in funzione dei
gruppi R, ed inoltre le interazioni tra residui vicini giocano un ruolo importante. Gli aminoacidi che
meno favoriscono la formazione di un’elica solo la prolina e la glicina. Nella prolina l’atomo di azoto
non è disponibile poichè fa parte di unanello rigido e dunque non vi è alcuna rotazione sul legame
N − Cα . La glicina si trova di rado nelle eliche per un motivo diverso: è molto più flessibile degli altri
aminoacidi e i polimeri contenenti glicina tendono a formare strutture spiralizzate diverse dall’α − elica.
Riassumendo sono cinque gli elementi che limitano la formazione di un’elica:
1. Propensione intrinseca dell’aminoacido
2. Interazioni tra i gruppi R, specialmente quelli distanti tre o quattro residui

3. Ingombro sterico del gruppo R

4. Frequenza di prolina e glicina
5. Interazioni agli estremi dell’elica

Il beta foglietto La seconda struttura comunemente ritrovabile nelle proteine è più vasta e complessa
dell’elica. In un β −f oglietto la catena polipeptidica è arrangiata in una struttura a zigzag anzichè in una
ad elica e i legami a idrogeno si formano tra segmenti adiacenti della catena stessa; le regioni di catena
che formano un foglietto sono solitamente vicine, ma possono essere anche parecchio distanti o addirit-
tura in catene polipeptidiche diverse. Le catene polipeptidiche adiacenti possono essere in posizione
parallela o antiparallela, cioè presentare la stessa direzione carbossiterminale o quella opposta.

Il beta giro Nelle proteine globulari è particolarmente comune l’elemento β − giro dove gli aminoacidi
formano giri o anelli che fanno cambiare direzione alla catena polipeptidica. Questi giri sono elementi
di connessione tra porzioni di elica o di foglietto. A stabilizzare il giro vi è un legame idrogeno tra
l’ossigeno del primo residuo e l’idrogeno del quarto, mentre i due residui centrali non contribuiscono
con alcun legame. Glicina e prolina, che erano elementi di fortissimo disturbo per l’alfa elica, sono
invece comunissimi a livello del beta giro.

2.1.3 La struttura terziaria

L’arrangiamento tridimensionale di tutti gli ato-
mi di una proteina è definito struttura terziaria
e comprende aspetti più complessi della catena Tabella 1: Le due maggiori classi proteiche
aminoacidica: residui lontanissimi tra loro che Fibrose Globulari
non influenzano la struttura secondaria possono Struttura II un solo tipo più tipologie
sconvolgere quella terziaria. Nel considerare le Struttura III semplice complessa
strutture di livello più elevato è utile dividere le Funzione supporto regolazione/enzimi
proteine in due grandi classi: le proteine fibrose,
le cui catene formano lunghi filamenti o foglietti,
e le proteine globulari, le cui catene sono ripiegate in forme sferiche.
Le caratteristiche ricorrenti nelle varie strutture terziarie sono:

• Gruppi R polari esterni

• Gruppi R apolari interni
• Stabilizzazione grazie a ponti disolfuro −S − S− (→cisteina)

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2.1.4 La struttura quaternaria
La struttura quaternaria non è sempre presente nelle proteine in quanto è legata alla presenza di più
catene polipeptidiche separate che concorrono a formare la proteina e che possono essere identiche
o differenti. Questo tipo di struttura è funzionalmente vitale poichè è la sede dell’allosterismo, cioè
l’interazione tra le varie subunità con conseguenze sulla funzione dell’intera proteina. Esempio tipico
di proteina con struttura quarternaria è l’emoglobina umana, formata da quattro subunità (tetramero)
definite alfa e beta.

2.2 Denaturazione
Il processo di denaturazione di una proteina comporta la perdita della struttura tridimensionale a causa
di variazioni ambientali quali pH, temperatura o presenza di solventi anche deboli; si riconoscono due
tipologie di processi denaturanti:
• Processi reversibili, in cui la rimozione della variazione ambientale riporta la proteina al suo stato
tridimensionale originario. Da notare che alcune proteine possono ricompletare il folding solo in
ambiente intracellulare per via della presenza di proteine secondarie, i chaperoni, che guidano il
processo.
• Processi irreversibili, in cui la proteina ha perso la capacità di tornare allo stato originario
Considerazione banale ma fondamentale: una proteina denaturata non funziona, in quanto la funzion-
alità è legata indissolubilmente alla configurazione tridimensionale.
Il fatto che una proteina denaturata possa, in alcuni casi, tornare alla configurazione tridimen-
sionale definitiva implica che sia solo ed esclusivamente la sequenza aminoacidica a determinare ogni
struttura superiore assunta dalla molecola.

2.3 Il collagene
Il collagene è la (glico)proteina umana più abbondante, rappresentando il 25% del totale. Come tutte le
α − keratine, il collagene si è evoluto per fornire resistenza e si trova dunque in tessuto connettivo quale
la cartilagine, i tendini, la matrice ossea, la cornea e la pelle. La struttura chimica del collagene è quella
di un’elica formata da tre catene polipeptidiche a loro volta in conformazione ad elica: caratteristica
particolare è che la superelica è destrorsa mentre le singole eliche di base sono sinistrorse.
La sequenza aminoacidica del collagene presenta un’evidente abbondanza di glicina (∼ 35%) ed è cos-
tituita da un’unità tripeptidica ripetuta di tipo Gly-X-Y dove X è spesso prolina e Y spesso idrossiprolina
(uno dei più comuni aminoacidi modificati).
Formazione dell’idrossiprolina
La reazione netta di formazione dell’idrossiprolina è:

P ro + O2 + α − chetoglutarato → HyP ro + CO2 + succinato

L’enzima catalizzante la reazione è la prolil-idrossilasi e perchè la reazione avvenga è necessaria la

presenza di F e++ e di acido ascorbico (vitamina C).
Un enzima analogo alla prolil-idrossilasi è la lisil-idrossilasi, che catalizza la reazione che porta alla for-
mazione della 5-idrossilisina che spesso prende il posto dell’idrossiprolina nella tripletta del collagene.
Entrambi questi enzimi, facenti parte della classe delle diossigenasi, hanno la funzione di trasferire
entrambi gli atomi di O2 su molecole diverse e sono entrambi sito-specifici.

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 Il collagene è sintetizzato in due fasi, una intracellulare ed una
extracellulare. Per la fase intracellulare i passaggi fondamentali Tabella 2: Principali tipologie di
sono: collagene
Tipologia Sede
1. Trascrizione del DNA I Pelle, tendini, ossa
2. Formazione delle catene II Cartilagine
III Pelle, muscolo
3. Idrossilazione della prolina IV Cristallino
V Tessuto interstiziale
4. Glicosilazione (per conferire rigidità al collagene, passaggio
più o meno presente a seconda delle destinazioni)
5. Formazione delle supereliche

Terminata la sintesi intracellulare si ha una molecola di pro-

collagene che viene secreta dalla cellula e subisce ulteriori
trasformazioni:
1. Proteolisi di C ed N terminali ad ottenere tropocollagene

2. Impaccamento delle molecole neoformate

3. Formazione delle fibrille definitive
La ragione delle due fasi della sintesi è dovuta al fatto che le fibre definitive sono più grandi della cellula
che le sintetizza: è dunque necessario produrre un precursore in grado di assemblarsi in ambiente
extracellulare.
A livello extracellulare avviene anche la degradazione del collagene, processo cui sono legate varie
tipologie di molecole: la collagenasi in primis, ma anche le proteasi lisosomiali. Un monitoraggio
dell’attività di demolizione del collagene è ottenibile grazie alla presenza di idrossiprolina nelle urine in
quanto non è metabolizzabile dall’organismo e il suo utilizzo è esclusivo.

2.3.1 Principali patologie

Le patologie del collagene possono essere distinte in base alla sede del problema.
La patologia con sede di origine più “a monte” è nota come osteogenesis imperfecta ed è legata
ad una struttura molecolare anomala: comporta fondamentalmente fragilità ossea. Nelle sindromi di
Ehlers Danlos si hanno difetti posttraduzionali su catene alfa perfettamente sane: queste patologie
sono legate a debolezza intrinseca del collagene. In entrambe queste sindromi l’origine del problema
è la sostituzione della glicina con un aminoacido dotato di un gruppo R più ingombrante: la glicina è
talmente importante che non può essere sostituita senza danneggiare la struttura del collagene stesso.
Lo scorbuto è caratterizzato da un insufficiente apporto di vitamina C e dunque da una mancanza di
un substrato per la reazione di formazione dell’idrossiprolina: si hanno così fragilità vascolari, difficoltà
a riparare le ferite, danni all’epidermide.
La più frequente malattia del collagene è la sindrome di Marfan, con un’incidenza pari a 1 : 5000. La
patologia, a trasmissione autosomica dominante, è legata alla mutazione della fibrillina, una proteina
legata alla struttura del connettivo in particolare della parete dei vasi e del cristallino; i sintomi sono
lussazione del cristallino, dilatazione-aneurismi dell’aorta e difetti valvolari cardiaci (prolasso mitrale).

2.4 L’emoglobina
2.4.1 Struttura
L’emoglobina fa parte del gruppo delle globine che presentano caratteristiche relativamente costanti:
• Catena aminoacidica singola con circa 150 residui
• α − elica molto rappresentata, fino al 75% del totale

• Struttura terziaria quasi sferica

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 • Alta solubilità
• Ogni globina contiene un gruppo EME legato non covalentemente
La seconda globina legata all’ossigeno è la mioglobina. Strutturalmente le due molecole sono molto
diverse, innanzitutto la mioglobina è una singola struttura mentre l’emoglobina è un tetramero di due
subunità alfa e due beta, inoltre vi sono differenze funzionali legate al fatto che la mioglobina serve per
il deposito mentre l’emoglobina per il trasporto.

2.4.2 Funzione
L’emoglobina, insieme alla mioglobina, è deputata al trasporto dell’ossigeno attraverso il sangue: solo gli
animali unicellulari possono far affidamento ad un assorbimento diretto dell’ossigeno. Questa proteina
lega a se il 98% dell’ossigeno totale presente nel sangue, mentre il rimanente 2% si presenta disciolto
nel plasma: se non fosse presente il sangue sarebbe costretto a generare un flusso almeno cento volte
maggiore. La funzione della mioglobina è diversa in quanto rappresenta una sorta di deposito di O2 per
il tessuto muscolare.
La base funzionale dell’emoglobina e della mioglobina è data dal gruppo EME, che pertanto è definito
gruppo prostetico. l’EME consiste di un complesso anello organico, la protoporfirina IX, che lega un
atomo di ferro nel suo stato ferroso, cioè F e++ : l’atomo di ferro ha sei legami, quattro complanari per la
protoporfirina e due perpendicolari ad esso per legare da un lato un residuo di istidina presente sulla
globina e dall’altro una molecola di ossigeno.
Il gruppo EME all’interno della globina è legato covalentemente ad una tasca idrofobica piuttosto
nascosta e una caratteristica importante è che il legame con l’ossigeno induce cambiamenti nella con-
formazione quaternaria della proteina: l’emoglobina tende a proteggere l’ossigeno al suo interno. I
cambiamenti di conformazione dell’emoglobina permettono di individuare due forme stabili di questa
proteina: la forma T e la forma R. L’ossigeno si lega ad entrambe le forme ma ha un’affinità maggiore
con l’emoglobina in forma R e quando vi si lega la stabilizza. In assenza di ossigeno la forma T è la più
stabile ed è dunque la conformazione della deossiemoglobina; quando l’ossigeno si lega all’emoglobina
T ne causa la mutazione in forma R. Uno dei risultati della variazione di forma dell’emoglobina è la ca-
pacità di questa di funzionare da carrier dell’ossigeno: ha bassa affinità nei tessuti dove cede ossigeno
e alta affinità nei polmoni dove lo cattura.
L’ossigeno Il legame con l’ossigeno del ferro del gruppo EME è piuttosto particolare: è molto debole
e facilmente reversibile, inoltre poichè il legame avviene con ossigeno molecolare si dice che l’EME si
ossigena invece che ossidarsi. Riassumendo il ferro all’interno del gruppo EME è così posizionato:
• Quattro legami complanari con atomi di azoto derivanti dalla protoporfirina IX
• Un legame perpendicolare con un atomo di azoto di un residuo di istidina della globina

• Un legame perpendicolare con, a seconda dei casi, ossigeno (ossiglobina), monossido di carbonio
(carbossiglobina) o altre molecole
Importante clinicamente è il fatto che il monossido di carbonio presenti un’affinità per l’EME trecento
volte superiore a quella dell’ossigeno: in presenza di monossido dunque diminuisce la quantità di
Hb disponibile per il trasporto di ossigeno e senza una terapia di ventilazione al 100%O2 il decesso è
inevitabile.

Confronto tra emoglobina e mioglobina Molte delle differenze nel comportamento delle due proteine
sono legate al fatto che la reazione di legame tra mioglobina e ossigeno è di tipo bimolecolare, mentre i
quattro gruppi EME dell’emoglobina si riempiono in sequenza.
Il primo risultato di questa differenza è evi-
dente nelle curve di saturazione: a basse pres-
sioni parziali di ossigeno la mioglobina è co- Figura 1: Variazioni P50 con la temperatura
munque satura, mentre l’emoglobina è ancora
lontana da questo stato; il valore di P50 per la
mioglobina è di 3mmHg mentre per l’emoglobina è
di 26 − 28mmHg. I diversi valori di P50 evidenziano

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come le due proteine rispondano a due compi-
ti diversi: la mioglobina si satura subito e cede
difficilmente ossigeno, dunque è perfetta per il
deposito, mentre l’emoglobina si satura lenta-
mente e cede facilmente, dunque è perfetta per
il trasporto.
Il valore di P50 non è fisso, ma è influenzato da
parecchi fattori, tra cui la temperatura, il pH e la
presenza di biomolecole. Le variazioni di pH a rapporto con il trasporto di O2 sono alla base dell’effetto
Bohr; un’importante fonte di variazione del pH è l’idratazione della CO2 con produzione netta di H + .
Due sono le considerazioni di questo effetto, esprimibili entrambe con un’equazione:

• HbO2 + H + → HHb+ + O2
quindi la diminuzione del pH (→acido lattico) favorisce il rilascio di ossigeno
• HHb+ + O2 → HbO2 + H +
quindi l’aumento del pH rallenta il rilascio di ossigeno
Il principale contributo per la realizzazione
dell’effetto Bohr è dato dall’istidina 146, l’unico
aminoacido che a pH fisiologico è scambiatore di Figura 2: Variazioni di P50 con il pH
protoni: quando questo residuo è protonato for-
ma una coppia con l’aspartato 94 e stabilizza la
forma deossigenata (forma T). L’effetto Bohr si
basa sul fatto che l’ossigeno e lo ione H + sono en-
trambi legati all’emoglobina, ma in siti diversi e
con affinità inversa: è dunque comprensibile che
se aumenta il pH e dunque la concentrazione di
H + si avrà un rilascio di O2 e il protone acquis-
tato verrà stabilizzato dall’istidina 146 tramite il
legame con l’aspartato 94.

Trasporto dell’anidride carbonica L’emoglobi-

na non è legata solamente al trasporto dell’os-
sigeno, ma è anche un trasportatore dell’anidride
carbonica dai tessuti ai polmoni. L’anidricde carbonica prodotta nei processi ossidativi viene idratata
a formare bicarbonato nella reazione promossa dall’anidrasi carbonica:

CO2 + H2 O
H + + HCO3−
La ragione di questa reazione si trova nel fatto che la CO2 è poco solubile nel sangue: se non fosse
trasformata in bicarbonato si avrebbero bolle di anidride carbonica nel sangue.
Quando la concentrazione di CO2 è elevata, come accade in periferia, una quantità di anidride
si legherà all’emoglobina riducendone l’affinità per O2 e causandone il rilascio; viceversa quando la
concentrazione di O2 è alta come nel polmone, il semplice gradiente promuove il legame di ossigeno e il
rilascio di anidride carbonica.

Effetti del 2-3-bisfosfoglicerato Il 2-3-bisfosfoglicerato è presente in concentrazioni relativamente

alte negli eritrociti: questa molecola è nota per ridurre grandemente l’affinità dell’emoglobina per l’os-
sigeno, tanto da avere una relazione inversa tra affinità e concentrazione; si può definire il legame tra
l’affinità e la presenza di bisfosfoglicerato con un equazione:

HbBP G + O2
HbO2 + BP G
Il BPG si lega in un sito distante da quello dell’ossigeno (e a differenza di quest’ultimo si lega una
sola molecola di BPG per tetramero di emoglobina) e la sua azione è una regolazione allosterica della
funzionalità di Hb: la presenza di BPG stabilizza la forma T della proteina, cioè quella a bassa affinità

12
per l’ossigeno; normalmente il BPG è presente in modo tale da garantire che la quantità di O2 trasporta-
ta ai tessuti sia circa il 40% di quella massima. Il vantaggio di spostare la curva di saturazione a destra
è quello di un immediato aumento del rilascio di O2 in periferia senza cambiare di molto la situazione a
livello polmonare; variazioni nella concentrazione di BPG sono legate all’adattamento corporeo a grandi
altitudini.
Il BPG ha ruolo anche durante la vita fetale. L’emoglobina prodotta dal feto è diversa da quella
adulta: vengono infatti sintetizzate subunità γ invece di subunità β e la proteina così formata, detta
α2 γ2 , ha un’affinità minore per il BPG rispetto a quella materna. Grazie a questo accorgimento il sangue
del feto lega meglio l’ossigeno rispetto a quello materno (P50F etale = 19mmHg; P50M aterna = 27mmHg) e
dunque si ricava una posizione di vantaggio.

2.4.3 Prevenzione dell’ossidazione

Per il corretto funzionamento dell’emoglobina è necessario mantenere costante lo stato di ossidazione
del ferro. Se in vivo si realizza il passaggio da ione ferroso F e++ a ione ferrico F e+++ si parla di metae-
moglobina, che non è più in grado di legare l’ossigeno e dunque non è più funzionante. Normalmente
l’ossidazione dell’EME è impedita sia dalla struttura della globina stessa sia da complessi enzimatici
riducenti di cui è dotato il globulo rosso.
Uno dei principali elementi in gioco nella prevenzione dell’ossidazione è il glutatione. Questa moleco-
la è un tripeptide formato da acido glutammico, cisteina e glicina e ha principalmente la funzione di
riducente ma è anche legato alla diffusione dei farmaci, al trasporto degli aminoacidi e alla formazione
dei ponti disolfuro nelle proteine.
Formazione del glutatione
La formazione del glutatione prevede due passaggi: la reazione di glutamato e cisteina e la reazione
della γ − glutamilcisteina con la glicina.
Nel globulo rosso il metabolismo del glucosio segue fondamentalmente due vie: la glicolisi per la pro-
duzione di ATP e la via dei pentosi per ottenere NADPH con il fine ultimo di riconvertire il glutatione
ossidato in glutatione ridotto.

2.4.4 Genetica e principali patologie dell’emoglobina

L’emoglobina, così come la mioglobina, è una proteina particolarmente suscettibile alla variazione della
sequenza aminoacidica che è rimasta quasi invariata in molte specie e che presumibilmente deriva da
uno stesso gene ancestrale. La formazione di molecole di Hb anomale è alla base delle emoglobinopatie,
dovute al fatto che l’evoluzione di questa sequenza è ancora attiva ed esistono centinaia di varianti. Le
patologie su base molecolare possono essere suddivise in varie tipologie:
• Sostituzione dei residui in superficie: sono solitamente mutazioni silenti ad eccezione di HbS,
l’anemia falciforme.
• Sostituzione dei residui interni: risulta nella mancata stabilità della struttura quaternaria con
rischio di formazione di precipitati, di interazioni con la membrana e di anemia emolitica.
• Modifiche che stabilizzano la metaemoglobina: la formazione dell’ossiemoglobina è ostacolata e il
trasporto di ossigeno fortemente compromesso.
• Sostituzioni nell’interfaccia α/β: impediscono le transizioni tra forma carica e scarica dell’e-
moglobina, aumentano l’affinità per O2 con conseguente ipossia periferica

Anemia falciforme L’anemia falciforme è stata la prima malattia di cui è stata riconosciuta una base
molecolare: un solo aminoacido, un glutamato, viene sostituito da una valina; la valina extra si adatta
nella tasca della molecola di Hb adiacente, particolarmente se essa non ha legami con l’ossigeno, e
questo favorisce la formazione di aggregati insolubili di fibre. Il globulo rosso omozigote per HbS assume
una caratteristica forma allungata a falce che ostruisce il deflusso ematico nel capillare e diventa fragile
con il rischio di rilascio di Hb nel circolo e conseguente infiammazione. Una caratteristica particolare
dell’anemia falciforme è la sua limitata estensione territoriale alle aree tropicali, le stesse legate alla
malaria: gli eterozigoti hanno un vantaggio su omozigoti e non portatori in quanto non risentono della
malattia ma hanno condizioni difficili di crescita per il Plasmodium Falciparum.

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Talassemie Le talassemie sono difetti quantitativi, cioè mancate espressioni di una delle due catene
dell’emoglobina: esiste dunque una α-talassemia e una β-talassemia. Questi difetti genetici, così come
l’anemia, forniscono all’eterozigote un vantaggio evolutivo nei confronti della malaria.
La talassemia β è letale nell’omozigote e caratterizzata dall’espressione anche postnatale per alcuni
anni della catena γ, quella fetale. Le β-talassemie sono di solito il risultato di mutazioni puntiformi.
La talassemia α è legata alla produzione di emoglobine β4 o γ4 che sono in qualche modo funzionanti
ma non presentano regolazione allosterica o effetto Bohr: il quadro clinico va da leggere anemie ad
aborto. Le α-talassemie sono di solito il risultato di delezione genica.

2.5 Proteasi
Alla classe delle proteasi, cioè degli enzimi in grado di degradare le proteine, appartengono quattro
biomolecole:
• Serina - proteasi
• Metallo - proteasi

• Cisteina - proteasi
• Aspartil - proteasi
Tutte catalizzano lo stesso tipo di reazione, che complessivamente può essere scritta come

P roteina + H2 O → P eptide1 + P eptide2

ma che conta in realtà due fasi separate:

P roteina + E → P eptide1 + E − P eptide2

1) Si ha la rottura del legame peptidico e la formazione di un estere tra il carbonio carbonilico del
peptide e l’enzima.

E − P eptide2 + H2 O → E + P eptide2
2) Si ha l’idrolisi dell’estere e l’enzima non acetilato viene ripristinato.
L’attivazione delle serina proteasi avviene
mediante modificazione post-traduzionale irre-
versibile. La proteolisi specifica è una comune
modalità di attivazione di enzimi ed altre proteine,
ad esempio gli enzimi digestivi, le proteine del-
la cascata della coagulazione, gli ormoni proteici,
i processi di sviluppo e l’apoptosi. La selezione
evolutiva della famiglia degli enzimi proteasici ha
richiesto la parallela evoluzione di proteine in gra-
do di controllarli: l’incapacità di controllo, maga-
ri a causa di un deficit degli inibitori, può essere
fonte di patologie; una classe di inibitori delle se- Figura 3: Esempio di attivazione proteolitica
rina proteasi dette serpine sembra si sia evoluta
in modo da presentare strutture ad esse correlate e poterle meglio controllare. Importante ricordare
che alcuni importanti farmaci, tra cui alcuni legati al trattamento dell’AIDS, sono inibitori dell’attività
di varie proteasi.

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 Un ruolo fondamentale delle proteasi è quello digestivo: le proteine ingerite con la dieta vengono
degradate nello stomaco da parte di proteasi specifiche che nella maggior parte dei casi vengono
prodotte in forma inattiva, cioè in forma di zimogeni. Fondamentale in questo processo è la secrezione
pancreatica, la cui componente proteica contiene enzimi proteolitici (tripsina, chimotripsina, elastasi,
carbossipeptidasi), enzimi glicolitici ed enzimi lipolitici, tutti secreti come proenzimi ed attivati a livello
del lume intestinale soprattutto grazie alla tripsina.

2.5.1 La coagulazione del sangue

Figura 4: Le due vie di coagulazione

Sotto il termine di emostasi viene indicato il sistema finalizzato a limitare la perdita di sangue, sistema
suddiviso in quattro fasi successive:
1. Fase vascolare: vasocostrizione periferica, contrazione della muscolatura del vaso.
2. Fase piastrinica: formazione del tappo piastrinico, adesione, cambiamento morfologico, aggregazione.
3. Fase coagulativa: formazione del coagulo di fibrina, cascata delle reazioni enzimatiche.
4. Fase fibrinolitica: dissoluzione del coagulo.
Le piastrine sono le principali cellule legate al fenomeno della coagulazione, e le loro caratteristiche
salienti sono:
• Cellule discoidi prive di nucleo, Ø2 − 3µm, vita media 9 − 12gg.
• Livello normale: 150000 − 400000/µl
• Attivate da: ADP, epinefrina, collagene, trombina, PAF (platelet activating factor), complessi antigene-
anticorpo
• A seguito di attivazione:

– aderiscono al collagene tramite il fattore di Von Willebrand

– cambiano conformazione diventando sferiche

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 – polimerizzano
– aggregano
– rilasciano fattori quali ADP, trombossano, fattori coagulanti, serotonina e fattori di crescita

Le proteine della coagulazione, facenti parte delle proteine plasmatiche, quantitativamente presenti per
3mg/ml vengono principalmente sintetizzate nel fegato, molte sono serina proteasi e circolano costan-
temente sotto forma di zimogeni. Oltre alle proteine esistono anche degli enzimi o fattori coagulativi,
simili alle proteasi digestive tripsina e chemotripsina; i fattori coagulativi vengono indicati tramite un
numero romano (I, II, V,VII, VIII, IX, X, XI, XII e XIII, mancano il terzo, il quarto e il sesto) e sono spesso
vitamina K - dipendenti (II, VII, IC e X). In generale è possibile affermare che la coagulazione è effettuata
da una cascata di attivazione di zimogeni: la forma attiva di un fattore catalizza l’attivazione di quello
successivo, e ciascuna di queste tappe è legata alla catalisi da parte di un enzima.

Fattore Nome Forma attiva Tipologia Via

I Fibrinogeno Fibrina Proteina Comune
II Protrombina Trombina Serina proteasi Comune
III Fattore tissutale Cofattore Estrinseca
IV Calcio Ione Comune
V Proaccelerina Cofattore Comune
VI Accelerina Cofattore Comune
VII Proconvertina Convertina Serina proteasi Estrinseca
VIII Fattore antiemofilico A Cofattore Intrinseca
IX Fattore di Christmas Serina proteasi Intrinseca
X Fattore di Stuart Serina proteasi Comune
XI Antecedente plasm. della tromboplastina Serina proteasi Intrinseca
XII Fattore di Hageman Serina proteasi Intrinseca
XIII Fattore stabilizzante la fibrina Enzima Comune

La vitamina K La vitamina K gioca un ruolo di spicco nel-

la coagulazione, in quanto molte molecole procoagulanti o
anticoagulanti sono dipendenti da essa. Un’importante pro-
cesso legato a questa vitamina è l’γ − carbossilazione dell’aci-
do glutamico a formare l’acido γ − carbossiglutammico, un
aminoacido modificato che si trova nella protrombina e che
ha la funzione di legare lo ione Ca++ nelle interazioni con le
membrane fosfolipidiche. La reazione di γ − carbossilazione
è una modificazione post traduzionale.
La vitamina K è una molecola liposolubile che non passa
attraverso la placenta; sotto il nome di vitamina K vengono
indicate tre molecole diverse: K1 , presente nei vegetali ver-
di, K2 , sintetizzata da batteri intestinali a partire da K1 , e
K3 , un preparato industriale. I rari deficit di vitamina K sono legati al malassorbimento dei grassi,
soprattutto in infanti malnutriti o in soggetti legati a lunghe cure antibiotiche.
Una seconda via d’uscita per quello che prende il nome di ciclo della vitamina K è la conversione
in epossido della vitamina KH2 che in segutio viene convertita in vitamina K chinone grazie all’enzima
vitamina K epossido-reduttasi (VKOR). A partire dal vitamina K chinone l’enzima chinone reduttasi
chiude il ciclo catalizzando la formazione della vitamina di partenza, pertanto il chinone è una sede
di deposito della vitamina K. Alcuni farmaci anticoagulanti hanno come principio d’azione l’inibizione
dell’enzima chinolone reduttasi e quindi l’inibizione del riciclo della vitamina K.

Fibrinogeno e fibrina Il fibrinogeno, molecola presente in concentrazione di 3g/l nel plasma, viene
sintetizzato dal fegato e ha un’emivita di circa quattro giorno in circolo. Questa molecola solubile
viene convertita in fibrina insolubile grazie all’azione della trombina cui segue un’azione stabilizzante
da parte del fattore di coagulazione XIII: la conversione avviene per distruzione dei ponti disolfuro da
parte della trombina e la conseguente riduzione in monomeri di fibrina.

16
 L’effetto di conversione del fibrinogeno in fibrina non è l’unico della trombina nell’uomo, in partico-
lare a questa proteina possono essere ricondotte le azioni di:
• Attivazione dei fattori V, VIII e XI
• Attivazione della transglutaminasi

• Attivazione del fattore C

• Stimolazione alla crescita dell’endotelio e stabilizzazione delle pareti dei vasi

Meccanismi anticoagulanti Il processo coagulativo è inibito sia in modo aspecifico che in modo
specifico. Le vie inibitorie aspecifiche sono la diluizione, la rimozione epatica e l’assorbimento della
trombina dalla fibrina. L’inibizione specifica è legata a tre molecole: antitrombina, proteina C e TFPI;

• Il TFPI ha come target inibitorio il fattore VII, che dal TF veniva attivato
• L’antitrombina, con cofattore eparina, ha come target quasi tutti i fattori coagulativi attivati: II,
VII, IX, X, XI e XII.
• La proteina C ha come target i cofattori attivati VIII e V

Figura 5: Vie inibitorie della coagulazione

L’antitrombina appartiene alla famiglia delle serpine, inibitori delle serin proteasi; la sua azione
inibitoria è potenziata dall’interazione con il suo cofattore eparina, che viene prodotta e rilasciata dai
mastociti associati all’endotelio e che ha azione anticoagulante diretta. In assenza di eparina l’azione
dell’antitrombina è lenta, mentre in sua presenza l’inibizione è molto rapida; una volta formato il
complesso con l’enzima coagulante l’eparina si dissocia per poter essere riutilizzata: fondamentalmente
l’eparina presenta siti attivi sia per legare la trombina che l’antitrombina, e le fa dunque avvicinare
grazie a un meccanismo a template.
Il sistema della proteina C prevede la presenza di altre due molecole: la trombomodulina (TM) e la
proteina S. TM è un recettore endoteliale per la trombina, mentre la proteina C è uno zimogeno legato
alla membrana. Un eccesso di trombina va a legarsi a TM e dunque attiva la proteina C che va ad
associarsi con la proteina regolatrice S.

17
Dissoluzione del coagulo: fibrinolisi All’interno del coagulo è presente plasminogeno, che viene con-
vertito in plasmina dal fattore tPA (Tissue Plasminogen Activator) e dall’enzima urokinasi; la plasmina,
che è una serina proteasi, degrada la fibrina per proteolisi. La conversione da plasminogeno a plasmina,
e dunque la dissoluzione del coagulo, è inibita da una molecola che prende il nome di α2 -antiplasmina
Esistono farmaci fibrinolitici, usati nell’infarto miocardico, che mimano l’azione del tPA e dell’uroki-
nasi.

Figura 6: Dissoluzione del coagulo

Patologie della coagulazione La più comune patologia della coagulazione è l’emofilia A o emofilia
classica, un deficit nel fattore VIII X-linked che comporta frequenti emorragie con mancata coagu-
lazione: il trattamento è principalmente legato all’infusione del fattore mancante.

18
3 DNA
Il DNA è la molecola che conserva e trasmette l’informazione genetica. Il flusso canonico dell’infor-
mazione è diviso in tre passaggi: replicazione, cioè sintesi del DNA, trascrizione, cioè sintesi dell’RNA,
e traduzione, cioè sintesi delle proteine. Nell’analisi degli effetti genetici è opportuno ricordare la dif-
ferenza tra genotipo, cioè la costituzione genetica dell’organismo, e fenotipo, cioè l’insieme delle carat-
teristiche osservate nell’individuo stesso e che è il risultato dell’interazione tra background genetico ed
ambiente.

3.1 Struttura chimica del DNA

Un singolo mattone di DNA è costituito da tre elementi distinti: un gruppo fosfato, un pentosio e una
base azotata; l’intera struttura del DNA ruota attorno a quattro basi, due purine e due pirimidine, che
sono le uniche varianti dell’intero genoma e la cui sequenza costituisce in ultima analisi l’informazione
genetica da trasmettere. Le basi puriniche, dotate di due strutture ad anello fuse insieme, sono l’aden-
ina (A) e la guanina (G), mentre le basi pirimidiniche, costituite da un solo anello, sono la timina (T)
e la citosina (C). Poche sono le particolarità del DNA non legate alle basi; una di queste è il fatto che
l’anello del pentosio non è planare ma si sviluppa in tre dimensioni. Ogni nucleotide è legato a quello
successivo da un ponte fosfodiesterico che si realizza tra il carbonio 5 di uno zucchero e il carbonio 3
di quello successivo: conseguenza di questo schema è che da un’estremità vi sarà uno zucchero con
un C5 libero (estremità 5’) mentre dall’altra ve ne sarà uno con un C3 libero (estremità 3’).
La complementarietà delle basi fa si che la struttura del DNA sia quella di un’elica con dieci paia
di basi per giro nella configurazione non superavvolta; da notare che ciascuna delle quattro basi può
legarsi solamente ad una delle altre tre che sarà sempre della tipologia opposta: una purina con una
pirimidina o viceversa. La costanza assoluta degli accoppiamenti del DNA è alla base della regola di
Chargaff, che recita:
“Il contenuto di A è uguale a quello di T e il contenuto di G è uguale a quello di C nella doppia
elica di DNA di una qualsiasi specie vivente”1
La doppia elica è una struttura molto stabile e costante nei suoi diametri, con un interno idrofobico
legato alle basi azotate e uno scheletro esterno costituito dagli zuccheri e dai gruppi fosfato. L’appa-
iamento interno delle basi implica la formazione di legami a idrogeno, per la precisione se ne formano
tre per la coppia C-G e due per la coppia T-A, che è dunque meno stabile e più facilmente divisibile. I
due filamenti di DNA sono tra di loro complementari, il che significa che la sequenza di uno determina
la sequenza dell’altro: questa proprietà è il fondamento per almeno tre processi, cioè replicazione e
riparazione del DNA e sintesi dell’RNA.
La classe di enzimi legata alla degradazione del DNA è quella delle nucleasi; questi enzimi attaccano
i legami interni della molecola (endonucleasi) oppure quelli terminali (esonucleasi).
La forma ad elica del DNA non è soggetta a grandi discussioni, ma esistono vari tipi di elica che
possono essere formati; le tipologie di elica più facilmente riscontrabili prendono il nome di forma A, B
e Z. Le prime due tipologie sono legate a differenze dei ripiegamenti dell’anello di ribosio: quattro dei
cinque atomi dell’anello sono complanari, mentre il quinto è esterno; se il quinto atomo è dallo stesso
lato di C5 la conformazione è endo, se è dal lato opposto è eso: la forma B possiede la conformazione
endo su C2, la forma A su C3
1A volte all’interno delle regole di Chargaff vengono inserite altre affermazioni:
• La composizione in basi del DNA di specie diverse è diversa
• Specimen di DNA isolati da tessuti diversi della stessa specie hanno la stessa composizione in basi
• La composizione in basi del DNA non varia con età, stato nutrizionale o cambiamenti ambientali

19
 Figura 7: Conformazioni endo ed eso

Il DNA in forma Z è totalmente diverso dalle forme A e B in quanto è dato da un’elica sinistrorsa
anzichè destrorsa, ma non è così raro come si potrebbe pensare: è infatti sulla presenza di DNA in
forma A nella cellula che si hanno dubbi, mentre la forma Z è sicuramente presente sia nei batteri che
negli eucarioti. Le caratteristiche delle tre forme del DNA possono riassumersi in:

Forma Coppie/giro Rotazione Diametro

B 10.4 34.6 (destrorsa) 19
A 11 32.7 (destrorsa) 23
Z 12 -30 (sinistrorsa) 18

Tabella 3: Differenze tra le forme di DNA

Alcune sequenze di DNA presentano motivi particolari che meritano di essere menzionati. Un primo
motivo è la curva che avviene quando la sequenza è composta da almeno quattro adenosine: a partire
dalla quarta adenosina più se ne aggiungono maggiore è il grado di piegatura della molecola. Un
secondo motivo comune è la sequenza palindromica del tipo TAAT T AGCAC−GT GCT AA
CGT G−CACGAT T : questo genere di
sequenze è autocomplementare e genera la possibilità di formare strutture cruciformi o a forcina. Una
variante della sequenza palindromica è la sequenza specchio: si ha in questo caso il palindromo sullo
stesso filamento, ad esempio una struttura TAGC-CGAT è una struttura a specchio; a differenza dei
palindromi veri, le strutture a specchio non possono formare forcine o croci.

3.1.1 Stabilità della struttura

La stabilità della doppia elica del DNA è legata a vari tipi di forze, riassumibili in:
• Interazioni idrofobiche, stabilizzanti: l’interno della molecola è idrofobico, l’esterno idrofilico.

• Interazioni da impilamento, stabilizzanti: sono molto deboli e legate all’impilamento dei vari
nucleotidi.
• Legami a idrogeno, stabilizzanti: sono piuttosto deboli ma gli effetti si sommano e facilitano
l’impilamento.

• Interazioni elettrostatiche, destabilizzanti: principalmente derivanti dai fosfati carichi negativa-

mente, affliggono sia le interazioni all’interno del singolo filamento che tra i due filamenti. Questa
repulsione intrinseca può essere neutralizzata da cariche positive derivanti da ioni o proteine.
La stabilità della struttura si riflette nel suo comportamento durante la denaturazione. Estremi in pH
o temperature molto alte permettono al DNA di denaturare e questo processo inizia dalle regioni ricche
in accoppiamenti A-T, dotati di due soli legami ad idrogeno. La transizione da doppia elica a catena
singola è monitorabile grazie alle variazioni di assorbimento della luce ultravioletta. Esiste un valore di
temperatura medio Tm raggiunto il quale si ha il 50% di DNA a doppia elica e il 50% di singole catene:
questo valore è funzione del contenuto di coppie C-G e grazie a questa relazione è possibile stimare la
proporzione di basi conoscendo Tm ; per il DNA di E.Coli, che contiene il 50% di coppie G-C, il valore di
Tm è 69°C.

20
3.2 Organizzazione del DNA
Lo studio della cinetica di riassociazione del DNA fornisce informazioni sia sulle dimensioni che sulla
complessità del genoma; i due concetti non sono sinonimi in quanto la complessità è il numero di
coppie di basi in una sequenza unica di DNA mentre la lunghezza comprende anche sequenze molto
ripetute. Si può affermare che non esiste una correlazione tra la quantità di DNA e la complessità di
un organismo e nemmeno tra il numero di geni e la complessità dell’organismo.
Il processo di riassociazione segue il processo di denaturazione e digestione del DNA: quando la
molecola viene divisa in pezzi da qualche centinaio di basi e denaturata a singole catene, questa tenderà
a riassociarsi con le stringhe complementari in un periodo di tempo più o meno lungo. Il valore di C0 T1/2
è il tempo, espresso in secondi, necessario alla riassociazione del 50% del DNA totale: alti valori di CoT
indicano una grande complessità del genoma in esame. Quando viene condotto un esperimento di
cinetica di riassociazione del DNA è possibile classificare il numero di frammenti ripetuti nel genoma:
le strutture più ripetute saranno le prime a ricombinare, seguite da quelle mediamente ripetute e da
quelle uniche, con un andamento simile al grafico:

Figura 8: Riassociazione del DNA

Le tre tipologie di stringhe contenute nel DNA sono rappresentate in proporzioni abbastanza costanti
nel DNA dei mammiferi:
• Le stringhe altamente ripetute rappresentano il 10−15% del totale e riassociano molto rapidamente.
• Le stringhe moderatamente ripetute rappresentano il 25 − 40% del totale e riassociano ad una
velocità intermedia.
• Le stringhe uniche o rare rappresentano il 50 − 60% del totale e sono le più lente a riassociare.
Scendendo nel particolare del genoma umano, in base alla cinetica di rinaturazione si può affermare
che:
• Meno del 50% del genoma è formato da sequenze uniche o rare: 5% di geni unici, il resto sono
famiglie geniche, pseudogeni e DNA spaziatore.
• Circa l’1% è formato da geni ripetuti in tandem: istoni, rRNA, tRNA
• Più del 50% del genoma è formato da DNA ripetitivo. All’interno del DNA ripetitivo:

– Il 30 − 40% è costituito da elementi mobili detti trasposoni.

– Circa il 15% è costituito da DNA satellite: sequenze di 5 − 7 nucleotidi ripetute in tandem molte
volte e non codificanti.
– Sono presenti inoltre sequenze ripetute intersperse formate da 300 nucleotidi e presenti in
centinaia di migliaia di copie singole e con funzione ignota.

Una caratteristica notevole è che nell’uomo il numero di geni è molto minore a quello che ci si aspet-
terebbe: poichè solo l’1% delle sequenze codifica qualcosa, il genoma contiene 30000 − 40000 geni che,
per via dello splicing alternativo, possono produrre 50000 − 60000 proteine.

21
3.2.1 Dati quantitativi e superavvolgimento del DNA
Il genoma umano contiene circa 3 · 109 paia di basi e si pensa contenga tra i trenta e i quarantamila
geni. La lunghezza totale del DNA è di circa 1.8m che devono essere compressi in un nucleo di diametro
mediamente inferiore ai dieci micron. Per ovviare al problema delle dimensioni si ricorre al superavvol-
gimento, cioè all’avvolgimento di una struttura già avvolta: questo processo non è casuale ma avviene
se la molecola viene sottoposta a una forma di tensione meccanica. Una prova a favore del super-
avvolgimento del DNA è data dal numero di basi per giro dell’elica: se ne aspetterebbero dodici ma se
ne ritrovano mediamente di meno. Nello studio del superavvolgimento del genoma viene introdotto il
concetto di numero di legame, cioè del numero di volte in cui un filamento si avvolge intorno all’altro
nel contesto di un DNA chiuso e circolare.

Numero di legame Prendendo ad esempio un DNA circolare chiuso composto da 3000 coppie di basi,
il numero previsto di giri dell’elica sarà

3000/10.5 = 285, 7 = Lk0

Lk0 indica il numero di legame quando la molecola non è sottoposta ad alcuno stress meccanico.
Qualora questa venisse sottoposta a stress, ad esempio superavvolgendo la molecola quattro volte, la
variazione sarà

∆Lk = Lk1 − Lk0 = 289.7 − 285.7 = +4

4/285.7 = 1.4%
La molecola risulterà contenere al termine del superavvolgimento 1.4 giri in più ogni cento a parità di
spazio occupato.
Il superavvolgimento può essere di due tipologie. La prima tipologia è un superavvolgimento reale,
che comporta dunque un aumento dei giri e pertanto viene definita superavvolgimento positivo; la
seconda tipologia, il superavvolgimento negativo, è in realtà un parziale disavvolgimento e comporta
una diminuzione del numero di giri rispetto allo stato rilassato: il superavvolgimento negativo può
tradursi in una separazione locale delle due stringhe di genoma.

Le topoisomerasi Il controllo dell’avvolgimento del DNA è legato a una classe di enzimi che prende il
nome di topoisomerasi e che svolge entrambi i ruoli possibili: aumentano o diminuiscono l’avvolgimento
del DNA e catalizzano dunque variazioni nel numero di legame. Esistono due tipologie di topoisomerasi:
tipo I e tipo II.
Le topoisomerasi di tipo I agiscono su un singolo filamento alla volta: legano il bersaglio, lo tagliano,
fanno passare quello intatto attraverso il gap creato e infine lo richiudono. Il risultato dell’attività delle
topoisomerasi di tipo I è la variazione del numero di legame di una unità.
Le topoisomerasi di tipo II agiscono su due filamenti alla volta: il funzionamento è simile a quello
del tipo I, ma a passare nel gap, creato questa volta spezzando due filamenti, non è una catena singola
ma una doppia elica. Il risultato dell’attività delle topoisomerasi di tipo II è la variazione del numero di
legame di due unità.
Le topoisomerasi umane sono in grado solamente di aumentare il numero di legame del DNA, mentre
esistono topoisomerasi batteriche in grado di introdurre superavvolgimenti negativi.

3.2.2 La cromatina
Il DNA degli eucarioti unito alle proteine strutturali costituisce la cromatina. Per arrivare allo stadio di
cromatina è necessario attraversare tre livelli di compattamento:
• Nucleosomi:11nm, riduzione x7

• Filamenti: 30nm , riduzione x100

• Anse radiali

22
I nucleosomi sono costituiti da DNA avvolto a strutture ottameriche di proteine istoniche: un numero
variabile da 146 a 200bp vengono avvolte attorno ad ogni istone. Gli istoni umani sono suddivisi in
quattro tipi: H1, H2, H3 e H4. L’istone H2 è in realtà un dimero composto da H2A e H2B. Queste
proteine sono suscettibili a reazioni chimiche reversibili, quali metilazione, acetilazione e fosforilazione,
che influenzano l’assemblaggio della cromatina, la replicazione e la trascrizione. L’ottamero attorno a
cui si avvolge il DNA è formato da un tetramero H32 + H42 e da due dimeri H2A + H2B. L’istone H1
interviene esternamente al nucleosoma e una volta associato ad esso prende il nome di cromatosoma.
Il compattamento totale a questo livello è di circa sette volte.
Il secondo livello di compattamento è la formazione dei filamenti da 30nm, che richiede la presenza
dell’istone H1 come stabilizzatore e che non è presente per l’intero cromosoma: a questo livello si ha
una riduzione dell’ingombro di circa cento volte.
Un terzo livello di compattamento è dato dall’interazione tra il filamento e la matrice nucleare,
costituita dalla lamina nucleare e dalle proteine della matrice interna: si creano in questo modo le anse
radiali.

3.3 La replicazione
3.3.1 La replicazione nei batteri
Il DNA è la sede dell’informazione genetica e in quanto tale deve poter essere riprodotto fedelmente in
un elevato numero di copie. Buona parte della fedeltà di copiatura è legata alla geometria delle coppie di
basi, che non possono essere scambiate e dunque ognuna lega solamente il suo bersaglio sul secondo
filamento. Un secondo elemento che aumenta la fedeltà è l’attività 3’-5’ esonucleasica, che permette di
eliminare i nucleotidi eventualmente errati durante la fase di replicazione.
La famiglia di enzimi legati alla replicazione del DNA è quella delle polimerasi. Esistono tre tipologie
di polimerasi:
• Polimerasi di tipo I, l’unica con attività esonucleasica 5’-3’ (diversa dal proofreading 3’-5’) e quindi
legata a ruolo di enzima riparatore
• Polimerasi di tipo II

• Polimerasi di tipo III, che è l’enzima replicatore principale

Tutte le tipologie di polimerasi necessitano un primer con un’estremità 3’ libera e catalizzano la reazione
in direzione 5’-3’ basandosi sulle regole di appaiamento delle basi stilate da Watson e Crick.

23
 DNA polimerasi III La DNA polimerasi III è la molecola responsabile di buona parte del lavoro di
replicazione del DNA. Tra la classe delle polimerasi è di gran lunga l’enzima più complicato in quanto
contiene dieci tipi diversi di subunità.

Subunità (E.Coli) Quantità per enzima Funzione

α 2 Polimerizzante (sintesi)
ε 2 Esonucleasica (proofreading)
θ 2 Stabilizza la subunità ε
τ 2 Lega stabilmente lo stampo
γ 1 Carica la pinza enzimatica
δ 1 Apre la pinza
0
δ 1 Carica la pinza enzimatica
χ 1 Interagisce con SSB
ψ 1 Interagisce con γ e χ
β 4 Costituisce la pinza enzimatica

Una serie di proteine accessorie sono richieste per far funzionare l’apparato replicativo e quindi
soprattutto la polimerasi III:

Proteina Quantità per enzima Funzione

DNAa 1 Riconosce la sequenza start
DNAb (elicasi) 6 Separa il DNA
DNAc 6 Richiesta per il funzionamento di DNAb
HU 2 Stimola l’inizio del processo
FIS 2 Stimola l’inizio del processo
IHF 2 Stimola l’inizio del processo
DNAg (primasi) 1 Sintetizza i primers
SSB 4 Lega il DNA a singola elica
DNA girasi 4 Allevia lo stress meccanico
Dam metilasi 1 Metila la sequenza di origine
La replicazione ha inizio quando viene riconosciuta dalla polimerasi una sequenza consenso di start
che si presenta come ricca in accoppiamenti A-T e che viene definita elemento di svolgimento del DNA
(DUE, DNA unwinding element); il riconoscimento avviene in realtà grazie ad una proteina facente parte
del complesso, cioè la proteina DnaA. Avvenuto il riconoscimento tra polimerasi e DNA, si crea, grazie
all’attività dell’enzima DNA elicasi (DnaB), quella che viene definita forcella di replicazione: questo
enzima infatti è in grado di separare i due filamenti di DNA svolgendo la molecola. La forcella a questo
punto è costituita da un segmento veloce in direzione 5’-3’ e da un segmento lento in direzione 3’-5’.
Il primo frammento viene definito veloce o leader perchè viene letto nella stessa direzione in cui viene

24
sintetizzato e quindi la polimerasi può operarvi sopra in modo continuo; il secondo filamento viene letto
in direzione contraria a quella di sintesi e pertanto non può essere processato in modo continuo ma
è necessario passare per i frammenti di Okazaki: questi frammenti lunghi 100-1000bp permettono di
non rallentare troppo la sintesi creando delle piccole porzioni su cui lavorare in senso contrario. Da
notare che la sintesi del frammento veloce e di quello lento prevedono l’azione di due polimerasi diverse
che lavorano insieme come un singolo complesso.
La separazione delle due catene a livello della forcella di replicazione ad opera della DNA elicasi in-
duce stress meccanico davanti a se causando un superavvolgimento positivo; un enzima facente parte
delle topoisomerasi II, la DNA girasi, spezza e richiude il DNA antistante la forcella introducendo un su-
peravvolgimento negativo bilanciando gli effetti. Gli antibiotici legati al fluoroquinolone (ciprofloxacina,
levofloxacina) hanno come target le DNA girasi di molti batteri gram negativi.
La replicazione termina quando la forcella di replicazione incontra una regione di stop detta Ter e
che nel caso di E.Coli ha una lunghezza di circa 20bp.

3.3.2 La replicazione negli eucarioti

Le cellule degli eucarioti sono molto complesse e presentano un ciclo particolare di replicazione che
viene diviso in quattro fasi non equivalenti:
• Nella fase S si ha la sintesi del DNA e degli istoni
• Nella fase G2 si ha la crescita e la preparazione alla divisione cellulare
• Nella fase M si ha la mitosi e dunque la divisione cellulare
• Nella fase G1, la più lunga, si ha rapida crescita e preparazione alla sintesi del DNA
• Esiste una fase G0 in cui cadono le cellule quiescenti e che è una sorta di stop al ciclo della cellula
Le ragioni di questa complessa via di replicazione del DNA e della cellula sono parecchie, riassumibili
in una tabella di contronto tra procarioti ed eucarioti:

Procarioti Eucarioti
Dimensioni genoma 4, 8 · 106 bp 3 · 109 bp
Forcelle di replicazione Singola Multiple
Cromosoma Circolare singolo Lineari multipli
Velocità della forcella 30µm/min 3µm/min
Velocità della polimerasi ∼ 850nucl/sec 90nucl/sec

L’eccessiva lentezza di sintesi del DNA negli eucarioti impone di iniziare il processo da parecchi punti
diversi, in particolare ogni 150000 basi in media si ha una forcella replicativa che, con il procedere della
sua attività, andrà a fondersi con quelle che la seguono o la precedono.
Per quanto riguarda l’apparato enzimatico l’uomo è dotato di cinque polimerasi diverse, in generale
più specifiche nelle loro azioni rispetto a quelle di E.Coli:

α β γ δ ε
Sede Nucleo Nucleo Mitocondrio Nucleo Nucleo
Replicazione SI NO SI SI SI
Riparazione NO SI NO SI SI
Esonucleasi 3’-5’ NO NO SI SI SI
Primasi SI NO NO NO NO

Nell’uomo la situazione può essere riassunta così:

• La polimerasi α sintetizza i primers per i frammenti di Okazaki e li consegna poi alla polimerasi δ
• La polimerasi δ è l’equivalente umano della polimerasi III di E.Coli
• La polimerasi ε è analoga alla polimerasi I di E.Coli

25
3.4 Mutazioni e riparazione
3.4.1 Mutazioni
Le mutazioni del DNA possono essere classificate in vari modi. Le mutazioni che riguardano un singolo
nucleotide o paia di basi vengono dette puntiformi e includono:
• Transizioni: da T-A a C-G o viceversa, scambio di una purina con l’altra o di una pirimidina con
l’altra
• Trasversioni: da T-A a G-C o viceversa, scambio di una purina con una pirimidina

• Delezioni: eliminazione di una coppia

• Inserzioni: aggiunta di una coppia
Le singole mutazioni vengono poi fissate nel genoma alla successiva replicazione del DNA. Gli effetti
delle sostituzioni di base possono essere divisi in tre categorie in base ai risultati della successiva
codifica:
• Le mutazioni silenti non modificano il prodotto genico e sono le più frequenti
• Le mutazioni missenso generano un prodotto genico diverso e possono essere conservative se esso
è simile all’originale o non conservative se è completamente diverso

• Le mutazioni non senso generano un codone di stop e sono le più rare

A causa della struttura a codoni del DNA, l’inserimento o la delezione di un singolo nucleotide genera
un totale slittamento del frame di lettura mentre l’inserimento o delezione di una tripletta comporta la
perdita di un singolo aminoacido ed è dunque “preferibile”.
Altre tipologie di mutazioni sono quelle che vanno a cambiare la struttura chimica delle basi azotate;
mutazioni di questo tipo sono le deaminazioni dovute all’acido nitroso e le depurinazioni. Le variazioni
prodotte da queste mutazioni sono:
• Da citosina ad uracile: questo accade spontaneamente al ritmo di 100 nucleotidi al giorno per
ogni cellula umana

• Da adenina ad ipoxantina
• Da guanina a xantina
Le mutazioni della citosina sono particolari. La deaminazione della citosina può essere facilmente
riparata ma la deaminazione della 5-metilcitosina no: più del 30% delle malattie genetiche sono legate
a siti che contengono la 5-metilcitosina.
I radicali liberi dell’ossigeno conducono il DNA a danni ossidativi, in particolare la modifica della
guanina a 8-ossiguanina: esiste una proteina detta MTH1 che degrada questa base modificata la cui
assenza o mutazione è associata ad un rischio maggiore di tumore.
I raggi UV sono anch’essi fonte di mutazione in quanto promuovono la formazione di dimeri di
timina.
Il fumo di sigaretta contiene benzopirene, una sostanza innocua che diventa carcinogena se ossidata
all’interno della cellula: se questo accade diventa capace di legarsi alla guanina del DNA interrompendo
la regolarità dell’elica.
Riassumendo le principali fonti di mutazione sono:
• Acidi e temperatura

• Radicali liberi dell’ossigeno

• Radiazione ultravioletta
• Fumo di sigaretta
• Agenti chimici

26
3.4.2 Riparazione
La riparazione del DNA avviene a più livelli e privilegia i geni più attivi dal punto di vista trascrizionale.
Un dato interessante è che l’aspettativa di vita di un organismo sembra essere legata direttamente alla
capacità del DNA di auto ripararsi. Difetti nei sistemi di riparazione del DNA sono spesso associati a
predisposizioni tumorali, in particolare alle leucemie.
Il primo livello di controllo è il proofreading delle DNA polimerasi (pol I oppure pol ε), cui segue
un controllo postreplicativo legato soprattutto all’eliminazione di nucleotidio di coppie di basi. Il ciclo
cellulare è sede di controllo anch’esso in quanto se vengono riscontrati troppi errori viene arrestato
prima della replicazione del DNA.
Il test di Ames misura il potenziale di un certo composto chimico di promuovere certe mutazioni
facilmente identificabili.
Il funzionamento del test è questo: delle colonie di Salmonella con una mutazione che inattiva l’enzima
della via metabolica di sintesi dell’istidina vengono coltivate in un terreno privo di questo aminoacido.
Le poche colonie che si sviluppano avranno una mutazione spontanea che permette in qualche modo
alla via metabolica di funzionare ugualmente. Ogni coltura a questo punto riceve una dose progres-
sivamente calante di mutageno il cui effetto è di aumentare di molto il tasso di mutazioni e quindi di
colonie; immediatamente intorno alla sede di inoculazione la concentrazione di mutageno sarà troppo
alta per permettere la vita delle colonie, ma in periferia diventerà una dose subletale con il solo effetto
di promuovere la mutazione. Le sostanze mutagene possono così essere confrontate in base ai loro
effetti sul tasso di mutazione: più colonie si sviluppano, più è efficace il mutageno.

Correzione dei mismatch L’accoppiamento incorretto delle basi viene quasi sempre risolto rileggen-
do le informazioni dal filamento di origine e pertanto è necessario distinguere il vecchio dal nuovo:
questo si realizza grazie alla metilazione del filamento stampo che risulta quindi diverso dal filamento
appena sintetizzato. Una volta superato il controllo di mismatch anche il filamento neosintetizzato
viene metilato e diventa indistinguibile da quello usato come stampo.

Correzione delle basi mutate Ogni cellula possiede vari enzimi detit DNA glicosilasi che hanno la
funzione di riconoscere lesioni particolarmente comuni del DNA e di rimuovere la base che le porta
spezzando il legame N-glicosidico. Questa eliminazione crea un sito apurinico o apirimidinico comune-
mente definito sito AP. Quando viene formato un sito AP un secondo tipo di enzima si occupa di riparare
la lesione: questa riparazione non avviene per inserzione di una nuova base ma viene invece rimosso il
ribosio 5’-fosfato e rimpiazzato con un nuovo nucleotide. Questo processo inizia quando un enzima che
prende il nome di AP endonucleasi taglia il filamento di DNA contenente il sito AP; quando la porzione
contenente AP viene rimossa la DNA polimerasi I rimpiazza il DNA e la DNA ligasi si occupa di risaldare
i filamenti.

Correzione dei nucleotidi mutati Le lesioni del DNA che causano gravi distorsioni all’elica del DNA
vengono generalmente riparate tramite escissione nucleotidica. In questo processo un enzima, l’excin-
ucleasi, idrolizza due legami fosfodiesterici, uno a valle e uno a monte della lesione: questo produce
un frammento di una trentina di nucleotidi da rimuovere. Una volta rimossa la porzione tagliata
dall’enzima la DNA polimerasi (I per E.Coli, ε per gli umani) riempie il buco che si è venuto a creare.

27
4 RNA
L’RNA è il secondo acido nucleico presente nelle cellule ed è strutturalmente e funzionalmente piuttosto
diverso dal DNA. Una delle differenze principali è la presenza di una diversa base pirimidinica: la
timina presente nel DNA è qui sostituita dall’uracile. Le basi modificate che possono essere rinvenute
nell’RNA sono molto più numerose in quanto questa molecola non ha la necessità di rimanere costante
e semplice per trasmettere l’informazione genetica:

La struttura secondaria dell’RNA presenta la caratteristica forma a tre braccia con un anticodone
frontale per il riconoscimento della sequenza di DNA.

4.1 Trascrizione nei procarioti

Il processo di trascrizione da DNA a RNA di solito inizia con un primo nucleotide ATP o GTP e procede in
direzione 5’-3’. La doppia elica del DNA presenta due filamenti con funzioni differenti per la trascrizione:
una catena stampo e una catena non stampo (codificante); dato importante è che in ogni cromosoma
geni differenti possono usare catene differenti come stampo.
Nei procarioti esiste un unico enzima deputato alla sintesi di molecole di RNA e prende il nome di
RNA polimerasi. L’RNA polimerasi è un enzima complesso composto da quattro subunità:

Subunità Funzione
α Incerta
β Forma i legami fosfodiesterici
0
β Lega il template di DNA
σ Riconosce il promotore

La trascrizione può essere suddivisa in almeno quattro fasi: assemblaggio della polimerasi al pro-
motore, inizio ed eliminazione del promotore, allungamento, terminazione e rilascio. Le regioni che
vengono trascritte sono varie in dimensioni e funzione: possono essere singoli geni o intere famiglie.

Assemblaggio della polimerasi al promotore L’RNA polimerasi nei procarioti si lega a specifiche
sequenze del DNA dette promotori che dirigonola trascrizione dei geni adiacenti. In E.Coli la regione
del promotore si estende tra le posizioni -70 e +30. Queste sequenze sono importanti siti di interazione
con la subunità sigma della polimerasi batterica. L’efficienza con cui la RNA polimerasi contentente il
fattore sigma si lega al promotore e dunque inizia la trascrizione è determinanta in larga misura dalle
sequenze promotrici, dagli spazi tra esse e dalla loro distanza dal sito d’inizio.
L’assemblaggio si divide in due fasi. Nella prima fase la polimerasi, diretta dal fattore sigma, si
lega al promotore e vengono formati in successione un complesso chiuso che lega il DNA intatto e

28
un complesso aperto che lega DNA intatto ma parzialmente svolto. Nella seconda fase la trascrizione
prende il via all’interno del complesso portando a un cambio conformazionale che converte il complesso
stesso nella forma di allungamento in un passaggio che vede anche l’allontanamento dell’apparato di
trascrizione dal promotore.

Allungamento L’inizio dell’allungamento è segnato dal distacco casuale del fattore sigma ora non più
richiesto: questo stesso fattore può ora legarsi ad un altra polimerasi per compiere un nuovo giro
di quello che viene definito ciclo sigma. L’allungamento procede in direzione 5’-3’ senza attività di
proofreading fino al raggiungimento di una sequenza di stop.

Terminazione e rilascio Quando viene incontrata una sequenza di stop la sintesi di RNA si ferma, la
proteina NusA (cofattore della polimerasi) si dissocia dalla polimerasi e questa si dissocia dal DNA.
E.Coli possiede almeno due classi di segnali di stop: una dipendente dalla proteina ρ (rho) e una
indipendente. I terminatori rho indipendenti hanno due caratteristiche: una regione che produce
trascritto di RNA autocomplementare e che genera quindi strutture a forcina, e una stringa conservata
di tre residui A vicini alla fine della forcina; quando la polimerasi raggiunge questa particolare struttura
si ferma e la formazione della forcina probabilmente facilita la dissociazione del trascritto. I terminatori
rho dipendenti mancano delle sequenze ripetute di A ma di solito includono regioni ricche in CA: la
proteina rho si associa all’RNA a siti specifici e migra in direzione 5’-3’ fino ad incontrare il complesso
di trascrizione che nel frattempo ha raggiunto un sito di stop. La proteina rho ha un’attività RNA-DNA
elicasica che promuove il distacco del trascritto e probabilmente anche quello della polimerasi.

4.1.1 Controllo trascrizionale (E.Coli)

I procarioti hanno la capacità di adattarsi molto velocemente alle condizioni ambientali, e questo è il
risultato di un veloce adattamento nell’espressione genica. La velocità con cui vengono trascritti i geni
di un procariote dipende in parte dalle concentrazioni relative delle varie subunità sigma della RNA
polimerasi.
L’espressione genica è spesso controllata da proteine regolatrici che si legano a sequenze specifiche
di DNA spesso passando attraverso il solco maggiore dell’elica; le proteine regolatrici possiedono spesso
dei motivi di legame al DNA caratteristici. I motivi di legame al DNA tipici sono quattro:
• Motivo elica-giro-elica
• Motivo omodominio
• Motivo zinc-finger
• Motivo della cerniera di leucina

Motivi di legame al DNA

1) Elica-giro-elica
Il motivo comprende circa 20 aa divisi in due piccole alfa eliche (ciascuna lunga 7-9 residui) separate da
un beta giro. Una delle due eliche è detta elica di riconoscimento perchè contiene molti degli aminoacidi
che interagiscono in modo specifico con il DNA: quando la proteina si lega l’elica di riconoscimento
risiede vicino o all’interno del solco maggiore del genoma.
2) Zinc-finger
In un motivo a zinc-finger circa 30 aa formano un anello allungato tenuto insieme alla base da un
singolo ione Zn2+ coordinato a quattro residui. Lo zinco non reagisce con il DNA ma la coordinazione
ha funzione stabilizzante. Lo zinc-finger può legarsi anche all’RNA ed in ogni caso l’interazione è debole
ma spesso le proteine presentano parecchi di questi motivi.
3) Omodominio
L’omodominio è un elemento di circa 60 aa che è legato funzionalmente ad un motivo elica-giro-elica
per la sua porzione interagente con il DNA.
4) Cerniera di leucina
La cerniera di leucina è costituita da un’alfa elica anfipatica (sia acida che basica) in cui una serie di
residui idrofobici sono concentrati da uno dei due lati ; ogni sette residui appare una leucina in modo
estremamente regolare.

29
 In generale il controllo della trascrizione può essere di due tipologie: controllo positivo, che aumenta
la trascrizione quando attivatori legano il DNA, oppure controllo negativo, che riduce la trascrizione
quando repressori legano regioni regolatrici del DNA dette operatori. Una caratteristica unica della
regolazione nei procarioti è che i geni legati ad una stessa via metabolica sono organizzati in oper-
oni, che possono essere indotti quando la via è richiesta o repressi quando non lo è. Un operone è
dunque definibile come un’unità funzionale contenente geni cotrascritti e coregolati e comprende un
gene regolatore, degli operatori e i geni strutturali veri e propri.

L’operone LAC in E.Coli La via metabolica del lattosio è, in E.Coli, collegata all’operone LAC: se attivo
questo produce l’enzima necessario a scindere il lattosio.

Quando il tetramero repressore si lega all’operatore il legame con la RNA polimerasi non è più possibile e
si ha repressione, anche se questa non è assoluta ma rimane un livello basale di trascrizione. Quando il
lattosio diventa disponibile nell’ambiente, la cellula lo assorbe e l’allolattosio, un intermedio dell’idrolisi,
viene prodotto: una molecola di allolattosio si lega ad ognuna delle subunità del repressore inducendo
un cambio conformazionale che determina un cambio di affinità al DNA e la conseguente dissociazione.
Non appena il repressore carico di allolattosio si dissocia dal DNA inizia la trascrizione, che tuttavia è ad
un livello basso per via dell’instabilità di legame DNA-RNA polimerasi. Il controllo positivo sull’operone
LAC avviene grazie a cAMP, secondo questo ragionamento:

1. Quando sono presenti sia lattosio che glucosio non ha senso scindere il lattosio, quindi operone
inattivo
2. In assenza di glucosio ma presenza di lattosio diventa vantaggioso poter scindere tale zucchero
3. In assenza di glucosio la cellula produce spontaneamente cAMP

4. cAMP è il regolatore positivo dell’operone LAC, in quanto lega il dimero proteico CAP (cAMP bind-
ing protein): il risultato è l’aumento dell’affinità di CAP per il promotore e di consequenza la
facilitazione del legame della RNA polimerasi.

4.2 Trascrizione negli eucarioti

La trascrizione è un passaggio molto più complesso negli eucarioti. Nei procarioti il passaggio da DNA
a mRNA e da mRNA a proteina è diretto, quindi per ottenere una proteina sono necessarie solo due
azioni; negli eucarioti per ottenere lo stesso risultato servono molti più passaggi e movimenti verso varie
porzioni della cellula.
I tipi di RNA nella cellula eucariote sono più numerosi che in quella procariote, si contano infatti:
• RNA ribosomiale (rRNA), come per i procarioti
• RNA transfer (tRNA) come per i procarioti
• RNA messaggero (mRNA), come per i procarioti
• RNA nucleare eterogeneo (hnRNA), precursore dell’mRNA
• piccoli RNA nucleari (snRNA: U1,U2,U3,U4,...)
• piccoli RNA citoplasmatici (scRNA)
Ad un aumentato numero di tipologie di RNA corrisponde un aumentato numero delle RNA polimerasi,
che passano da una a tre più una:

30
 • RNA polimerasi I: sintetizza tre dei quattro rRNA (18s,28s,5.8S)
• RNA polimerasi II2 : sintetizza mRNA e il suo precursore hnRNA oltre agli snRNA di tipo U1,U2,U4,U5
• RNA polimerasi III: sintetizza tRNA, l’ultimo rRNA (5S), un snRNA (U6)
• RNA polimerasi mitocondriale: sintetizza tutti gli RNA mitocondriali

Tutte le RNA polimerasi sono complessi formati da circa dodici subunità, di cui alcune sono comuni a
tutti e tre gli enzimi (per confronto, l’unica RNA polimerasi batterica ne possiede cinque). Come era vero
per la polimerasi batterica, anche quelle degli eucarioti hanno il problema di riconoscere il promotore:
questo avviene tramite sequenze contenute dal promotore stesso che sono specifici siti di legame per i
vari enzimi.
Un gene eucariote tipico possiede una sequenza di elementi che aiutano il processo di trascrizione e
che in generale si trovano a monte della sequenza da copiare; questi elementi sono:

• TATA box. Si trova circa 25-30bp prima del sito di inizio e si lega alla TATA binding protein facente
parte del TFIID.
• GC box. Si trova circa 50bp prima del sito di inizio e lega Sp1 (Specificity factor 1).
• CAAT box. Si trova circa 90bp prima del sito di inizio e lega CTF (come TBP)

• Elemento enhancer. Si trova circa 130bp prima del sito di inizio e lega OTF (come CTF e TBP)
L’inizio della trascrizione negli eucarioti necessita di due elementi: una polimerasi e dei fattori di
trascrizione; i fattori di trascrizione sono proteine necessarie al processo ma non facenti parte del
complesso della polimerasi. I fattori di trascrizione si dividono in fattori generali (suddivisi poi in classe
I, II e III) e specifici, questi ultimi deputati ad aumentare la trascrizione in alcune cellule o in risposta
a segnali esterni.
I fattori di trascrizione generali riconoscono elementi interni del promotore e sono regolatori specifici
sia in senso positivo che negativo. Il promotore è una sequenza di DNA subito precedente alla sede di
inizio della trascrizione ed è garante di un livello basale di trascrizione: il vero sito di regolazione
del gene è l’elemento enhancer. L’elemento enhancer, la cui posizione è molto variabile, include i
silenziatori, gli enhancer e gli elementi di risposta ed è la sede di determinazione sia della frequenza
che dell’efficacia del processo di trascrizione.

I fattori di trascrizione generali sono indicati dalle sigle:

• TFIID che si lega alla TATA box per iniziare l’assemblaggio dell’apparato di trascrizione: contiene
la TATA binding protein, e i fattori ad essa associati.
• TFIIA, TFIIB, TFIIE, TFIIF, TFIIH, TFIIJ, TFIID
La RNA polimerasi II si lega alla regione del promotore interagendo con i fattori di trascrizione; i fat-
tori di trascrizione che legano altri elementi promotori o di trascrizione interagiscono stabilizzando
ulteriormente il complesso in un processo detto transattivazione.
L’inizio della trascrizione vera e propria avviene quando la RNA polimerasi II viene fosforilata ad
opera del TFIIH a livello del dominio carbossi-terminale (CTD): questa azione la sgancia dal complesso
di pre-inizio e permette all’enzima di scorrere lungo il gene.
2 La RNA polimerasi II è la più sensibile all’α-amanitina, tossina del fungo mortale Amanita Phalloides.

31
4.2.1 Controllo dell’espressione genica
Il controllo dell’espressione genica negli eucarioti è più complesso e stratificato per vari motivi, tra cui:
• Maggiore estensione del genoma
• Presenza di vaste regioni non codificanti proteine
• Presenza di varie tipologie diverse di cellule

• Presenza di diversi stadi di sviluppo degli organismi

Il controllo è stratificato su vari livelli e può avvenire in uno qualsiasi dei passaggi in figura:

Da ricordare che il genoma umano contiene una quantità stimata tra i 30000 e i 40000 geni: di
questi in ogni momento una cellula ne esprime circa 5000. All’interno dei 5000 geni espressi, alcuni
sono definiti housekeeping in quanto legati a metabolismo, biosintesi di membrana, produzione di
istoni e di proteine ribosomiali mentre altri sono tessuti specifici e legati al differenziamento cellulare.
Tra le proteine più prodotte dalle cellule umane ricordiamo albumina (5g/dl), fibrinogeno (0, 3g/dl) ed
emoglobina (15g/dl).

Fattori di trascrizione La regolazione della trascrizione è ottenuta negli eucarioti da fattori di trascrizione
gene-specifici; i fattori di trascrizione generali, come per i procarioti, sono invece necessari per ottenere
un legame stabile tra promotore e RNA polimerasi. I regolatori gene-specifici hanno una struttura mod-
ulare con un dominio che lega il DNA e uno o più che rappresentano siti di attivazione trascrizionale;
occasionalmente sono presenti domini repressivi o domini di dimerizzazione. I fattori di trascrizione
negli eucarioti possiedono di fatto gli stessi pattern molecolari di quelli dei procarioti: zinc finger,
elica-giro-elica e cerniera di leucina.
I fattori enhancer sono gli stimolanti per la trascrizione: si legano ad un sito specifico sul DNA e ne
causano il ripiegamento in modo da portare l’enhancer stesso nelle vicinanze del promotore. L’accop-
piamento di attivatore, coattivatore e promotore, (solitamente chiamati nell’insieme complesso del pro-
motore) insieme ai fattori di trascrizione generali e alla RNA polimerasi porta all’inizio della trascrizione.
I fattori di repressione agiscono spesso inibendo il legame dell’enhancer al DNA o interagendo con esso
dopo che il legame è avvenuto prevenendo la formazione del complesso del promotore.

32
 L’attività dei fattori di trascrizione può essere modulata attraverso due vie: modificazioni covalenti
(fosforilazione soprattutto, ma anche acetilazione, ubiquitinazione) o legame a recettori specifici nu-
cleari. Un esempio di regolazione fosforilativa è la reazione all’interferone: quando i recettori a ques-
ta molecola si attivano viene attivata una chinasi che si porta a fosforilare il fattore di trascrizione
rendendolo a sua volta attivo.
Probabilmente la più importante biomolecola legata alla divisione cellulare il cui funzionamento si
basa sulla fosforilazione è p53. La sua funzione è quella di agire da oncosoppressore e di prevenire la
divisione cellulare in caso di danneggiamento del codice genetico: almeno metà delle diagnosi annuali
di varie tipologie di cancro viene condotta su pazienti portatori di mutazioni sul gene di p53. L’azione
di p53 in condizioni normali non fosforilate è nulla, i geni da essa controllati non vengono trascritti; in
condizioni di danneggiamento del DNA la proteina kinasi ATM si porta a fosforilare p53 che si accumula
velocemente e questo stimola la trascrizione dei geni da essa controllati: gli effetti sono l’arresto alla
fase G1 del ciclo cellulare, l’apoptosi oppure la riparazione del genoma.
I recettori nucleari specifici sono fattori di trascrizione che vengono attivati per via ormonale da
molecole liposolubili. I principali recettori di questo tipo sono quelli per estrogeni, progesterone, tiroxi-
na, acido retinoico e glucocorticoidi: in tutti i casi il motivo di legame è dato da zinc fingers. I recettori
nucleari omodimerici sono costituiti da due subunità identiche che si legano a ripetizioni invertite del
codice genetico (AGAACA-TGTTCT); in assenza di un ormone il recettore nucleare riposa nel citoplasma,
ma quando si lega ad una molecola viene trasportato nel nucleo, dove si lega alla sua regione ripetu-
ta e invertita di DNA. Esistono anche recettori nucleari eterodimerici che in assenza di ormone sono
legati alla loro corrispettiva sequenza di DNA e reclutano deacetilasi istoniche bloccando la trascrizione;
quando l’ormone viene diffuso e si lega all’eterodimero la deacetilasi (istone deacetilasi) viene rilasciata
e sostituita dall’acetilasi (istone acetiltrasferasi) : la trascrizione viene quindi attivata.

Istoni e cromatina Un problema fondamentale della trascrizione del DNA negli eucarioti è che quan-
do il genoma è racchiuso in uno stato di cromatina condensata non è accessibile. La cromatina
viene suddivisa in due tipologie: eterocromatina non codificante e eucromatina codificante; la con-
densazione della porzione codificante è legata anche allo stato di acetilazione degli istoni (→recettori
nucleari eterodimerici).
L’acetilazione degli istoni è una modifica post-traduzionale in cui gruppi acetilici (CH3 COO− ) ven-
gono legati covalentemente ad aminoacidi basici neutralizzando cariche positive: l’effetto è l’elimi-
nazione delle interazioni ioniche del DNA con una diminuzione della condensazione e quindi un’agevolazione
della trascrizione. I residui acetilati di lisina interagiscono con un dominio specifico detto bromodo-
minio, che non a caso è contenuto nel complesso di trascrizione e nelle proteine che legano TPB, oltre
che nei complessi proteici che rimodellano la cromatina stessa.

Metilazione del DNA e geni tessuto specifi-

ci La metilazione del DNA è il processo grazie
al quale i geni tessuto specifici vengono bloccati
quando non richiesti dalla tipologia di cellula;
questo processo è inoltre legato all’inattivazione
del cromosoma X nella donna (formazione dei
corpi di Barr). La metilazione avviene a carico del-
la C del dinucleotide 5’CpG: queste sequenze non
sono omogenee ed esistono infatti delle regioni
non metilate dette isole CpG; nel genoma umano
le isole CpG sono associate ai geni housekeeping
e a una percentuale dei geni tessuto-specifici.
Il processo di metilazione è catalizzato dalla
classe di enzimi DNA metilasi, che usano sem-
pre la S-adenosilmetionina come fornitrice del Figura 9: Ciclo della S-adenosilmetionina
gruppo metile. Un importante caratteristica del-
la metilazione è che può essere ereditata dalle cellule figlie in modo tale da evitare il lavoro di
differenziazione cellulare ad ogni generazione.

33
 La metilazione delle isole CpG blocca la trascrizione secondo due vie distinte: bloccando diretta-
mente l’aggancio di TFIID oppure reclutando deacetilasi istoniche aumentando la spiralizzazione della
cromatina.

4.2.2 Maturazione dell’RNA

Sotto il nome di maturazione dell’RNA vengono raccolti i processi di:
• aggiunta di sequenze non codificate dai geni tradotti
• rimozione di sequenze dai trascritti primari
• modifica covalente alle basi del trascritto
Le varie tipologie di RNA corrono incontro a diversi meccanismi di maturazione.

Procarioti Eucarioti
rRNA Metilazione Metilazione RNA pol I
Taglio nucleolitico Taglio nucleolitico
mRNA Nessuna modifica Capping 5’ RNA pol II
Taglio 3’ e poliadenilazione
Rimozione intronica (splicing)
tRNA Taglio 5’ e 3’ Taglio 5’ e 3’ RNA pol III
Aggiunta CCA Aggiunta CCA
Modifica alle basi Modifica alle basi
tRNA splicing

Negli eucarioti gli enzimi per il processamento dell’mRNA sono raccolti dalla coda del dominio car-
bossiterminale di RNA polimerasi II; sono presenti enzimi per il capping, lo splicing e la poliadenilazione.

Capping Il capping è il primo processo ad avvenire subito dopo l’inizio della sintesi dell’mRNA nascente.
Le funzioni del capping sono quattro:
1. Marca il primo esone al 5’ e aiuta nello splicing
2. È essenziale nel trasporto degli mRNA nel citoplasma
3. Aumenta l’efficenza della traduzione
4. Protegge il trascritto da attività esonucleasiche
Il cap viene creato per condensazione di un GTP all’estremità 5’ del trascritto e per successiva meti-
lazione della guanina in N-7; spesso vengono aggiunti altri gruppi metilici al primo e al secondo
nucleotide a partire dal cap e in ogni caso tutti questi gruppi provengono dalla S-adenosilmetionina
(SAM).

Splicing Lo splicing dell’mRNA è un passaggio reso necessario dal fatto che il codice genetico umano è
organizzato alternando porzioni codificanti (esoni, lunghi in media meno di mille nucleotidi) e porzioni
non codificanti (introni, con lunghezza variabile tra i 50 e i 20000 nucleotidi). Il trascritto primario
contiene sia esoni che introni, ma l’mRNA finale deve contere solamente la sequenza codificante: da
qui lo splicing. Un dato interessante è che quasi tutti i geni umani contengono intorni, ma non tutti: i
geni che codificano per gli istoni non contengono alcun introne.
Gli introni si dividono in quattro classi, di cui le prime due hanno una caratteristica unica: l’au-
tosplicing; queste due classi di introni non richiedono enzimi per essere rimossi dal trascritto primario.
La maggior parte degli introni non ha attività di autosplicing e vengono chiamati introni spliceosomici
in quanto la loro rimozione è catalizzata dallo spliceosoma.
L’attività di splicing è condotta dallo spliceosoma, una struttura creata da due elementi: snRNA
(U1, U2, U4, U5, U6) e proteine associate dette snRNPs o snurps (small nuclear ribonucleoproteins). Lo
splicing vero e proprio avviene mediante due reazioni di transesterificazione. Il riconoscimento dei siti

34
di splicing avviene grazie a dinucleotidi conservati GU e AG al termine dell’introne quindi la sequenza
codificante è contenuta tra una coppia GU e una AG. L’inizio dell’operazione di splicing si ha quando
U1 riconosce il dinucleotide GU al capo 5’, sede di inizio e l’aggiunta di U2, U4 ed U5 completa la
formazione dello spliceosoma (processo che richiede ATP).

Splicing alternativo Uno dei vantaggi più marcati dell’attività di splicing è che da un singolo trascrit-
to primario, a seconda del processamento eseguito, è possibile ottenere mRNA multipli: ad esempio è
possibile regolare l’espressione tessuto-specifica di una proteina eliminando o trascrivendo un partico-
lare esone. Questa particolarità viene sfruttata per produrre due tipologie di anticorpo ma con la stessa
specificità. Lo splicing alternativo si può verificare sia per la presenza di più siti di taglio per la poli-
adeinlazione sia per la presenza di patterna alternativi di splicing (entrambe le vie possono coesistere
in uno stesso trascritto)
Un secondo esempio è la proteina Slo espressa nelle cellule dell’organo del Corti: questa proteina è
il risultato di splicing alternativo ed è alla base della diversa reazione delle cellule a varie lunghezze
d’onda del suono. La proteina Slo codifica un canale del potassio dipendente da Ca2+ e le varie isoforme
si aprono a differenti concentrazioni ioniche: le differenti concentrazioni di apertura determinano la
frequenza al quale il potenziale di membrana oscilla e quindi la cellula risponde.

Poliadenilazione La poliadenilazione è la reazione, catalizzata dall’enzima poli(A) polimerasi, che por-

ta all’aggiunta di circa duecento residui di adenilato alla terminazione 3’ dell’mRNA: questo evento è
associato alla stabilizzazione della neomolecola e a proteine dette PBP (poly(A) binding proteins).
L’aggiunta della coda poli(A) è un evento multistep. Il processo inizia con la trascrizione del trascritto
primario oltre la sede dove deve essere aggiunta la coda: questo viene poi spezzato al sito di aggiunta
da un endonucleasi; il sito di taglio è marcato da sequenze altamente conservate e una volta creato
genera il gruppo 3’idrossile libero necessario all’azione della poliadenilato polimerasi che si occupa di
aggiungere i residui di adenina in numero variabile tra le 80 e le 250 unità.

Editing dell’RNA La sequenza nucleotidica dell’RNA primario non è esente da modifiche: i cambi di
base più frequenti sono quelli legati alla deaminazione della citosina a uracile.

4.2.3 RNA interference

L’RNA interference è il processo attraverso cui un RNA a doppio filamento è in grado di interferire con
l’espressione genica sia inducendo degradazione di RNA complementari che bloccandone direttamente
la traduzione. Gli RNA a doppio filamento vengono introdotti nella cellula sperimentalmente o prodotti
dalla cellula stessa.
L’RNA interference è mediata da una classe di piccoli RNA detta micro-RNA (miRNA) che media il
silenziamento di molti geni; molti di questi miRNA sono presenti solo transitoriamente e a volte vengono
definiti small temporal RNA (stRNA). I miRNA vengono trascritti come precursori a doppio filamento
(dsRNA, double stranded RNA) di una settantina di nucleotidi che contengono sequenze complementari
interne che tendono a formare strutture a forcina; i precursori vengono poi tagliati da endonucleasi
specifiche (dicer) a formare piccoli duplex di cui un filamento viene trasferito all’mRNA target portanto
ad inibizione della traduzione o direttamente alla degradazione.
L’RNA interference è usata in laboratorio per la sua semplicità: introducendo un siRNA all’interno di
un organismo è possibile bloccare selettivamente l’attività di un prodotto genico senza dover creare un
organismo mutante. Le potenzialità della RNA interference sono molte, in campo medico in particolare
potrebbe essere usata per:
• Downregolazione di geni o alleli mutati
• Blocco dei geni necessari alla proliferazione di cellule tumorali

• Blocco dei geni necessari alla codifica di proteine strutturali delle cellule tumorali

35
5 Sintesi proteica
Il processo di sintesi proteica a partire da mRNA è noto come traduzione e avviene nell’uomo sia nei
ribosomi che nei mitocondri. Il processo di traduzione è il bersaglio di parecchi antibiotici, tra cui
streptomicina, tetraciclina, eritromicina ed altre tipologie che vengono nell’insieme definiti inibitori di
sintesi proteica.
Durante la traduzione si ha un passaggio dal codice a quattro elementi dell’RNA (basi azotate)
al codice a venti elementi delle proteine (gli aminoacidi); questo passaggio impone delle domande,
ad esempio quanto è lunga un’unità codificante, o che codice è assegnato ad ogni aminoacido. La
selezione naturale predilige le soluzioni più semplici, pertanto per capire quanto è lunga l’unità minima
assegnabile ad un aminoacido è sufficiente usare le potenze:

1
1 → 4 = 4

N ucleotidi = 2 → 42 = 16

3 → 43 = 64


L’unità minima funzionale per garantire almeno venti aminoacidi diversi è dunque una tripletta di
nucleotidi. La lista completa delle sessantaquattro combinazioni è la seguente:

Le combinazioni sono in numero molto maggiore agli aminoacidi possibili, di conseguenza si dice
che il codice genetico è degenerato: più di una sequenza codifica lo stesso aminoacido. Tra le possibili
combinazioni, o codoni, ve ne sono alcune con funzioni speciali:

• UAA, UAG, UGA sono segnali di terminazione

• AUG è il segnale di inizio
• Per cinque aminoacidi (leucina, prolina, arginina, alanina e valina) i primi due nucleotidi sono
sufficienti alla determinazione

5.1 tRNA
La molecola di tRNA è un tramite tra l’RNA messaggero e la proteina, in quanto riconosce da un
lato il codone sull’mRNA e dall’altro trasporta l’aminoacido corrispondente. La forma della molecola è
caratteristicamente descritta a croce, con la regione dell’anticodone sullo stesso asse del braccio che
trasporta l’aminoacido:

36
 L’inserimento dell’aminoacido corretto dipende in modo assoluto dal corretto accoppamento di basi
tra la regione dell’anticodone del tRNA e quella del codone dell’mRNA.
Il tRNA, come tutti gli RNA, può contenere basi modificate, tra cui
la più importante è l’inosina, cioè la guanina deaminata; questa base
modificata compete con la guanina per l’accoppiamento con l’uracile
sul codone di mRNA. Uno dei risvolti della presenza di basi non stan-
dard è il cosiddetto tentennamento dell’RNA: poichè il terzo codone è
molto spesso ininfluente ai fini dell’aminoacido selezionato, è spesso
sede di riconoscimenti di più codoni diversi (fino ad un massimo di
tre); l’anticodone X-Y-I ad esempio riconosce i codoni X’-Y’-(A,U,C). Se
tutti e tre le basi si legassero saldamente come le prime due il tRNA
si staccherebbe troppo lentamente e limiterebbe troppo la velocità di
sintesi proteica. Figura 10: Inosina
Gli aminoacidi vengono legati al tRNA, e dunque il tRNA viene cari-
cato dagli enzimi aminoacil-tRNA sintetasi, che hanno la capacità di riconoscere sia il corretto RNA che
il corretto aminoacido. La reazione catalizzata da questa classe di enzimi è la seguente:

A.A + AT P
aminoacil − adenilato + P Pi

aminoacil − adenilato + tRN A

aminoacil − tRN A + AM P

P Pi + H2 O
2Pi

37
 Caricamento del tRNA Nella prima reazione l’ossigeno negativo dell’aminoacido si lega al primo fos-
fato, liberando il pirofosfato dall’ATP e legandosi al residuo. Nella seconda reazione l’OH 3’ del tRNA
attacca il carbonio carbossilico dell’aminoacil-adenilato separandolo dall’AMP generando il tRNA carico
dell’aminoacido tramite un legame ad alta energia.

Esiste una sintetasi diversa per ogni aminoacido, ma ognuna potrebbe riconoscere tRNA multipli
per la stessa molecola. Esistono due differenti classi di sintetasi, diverse in struttura 3D e in modalità
di legame all’ATP:
• Classe I: sono monomeri che acilano il ribosio terminale in posizione 2’OH; sono specifiche per
arginina, cisteina, glutamato, glutamina, isoleucina, leucina, metionina, triptofano, tirosina e
valina.

• Classe II: sono monomeri che acilano il ribosio terminale in posizione 3’OH; sono specifiche per
alanina, aspartato, asparagina, glicina, istidina, lisina, fenilalanina, serina, prolina e treonina
Le sintetasi sono uno dei meccanismi che garantiscono una traduzione fedele: la loro alta specificità è
una sorta di secondo codice genetico di controllo. Il riconoscimento della sintetasi e del tRNA è comp-
lesso e ruota intorno ad alcuni concetti cardine. In tutti i tRNA esistono dei nucleotidi conservati che
non possono dunque essere sfruttati per il riconoscimento, esistono invece delle specifiche regioni di
riconoscimento che tendono ad essere concentrate nel braccio per l’aminoacido e in quello per l’anti-
codone, ma sono presenti anche in altre regioni. Probabilmente sono oltre dieci i nucleotidi implicati
nel riconoscimento, anche se in alcuni casi questo è molto più semplice: il più semplice in assoluto è il
riconoscimento del tRNA per l’alanina, che fa riferimento ad una singola coppia G-U (in posizione 70)
nel braccio aminoacidico dell’RNA.
Sono dunque due i livelli di controllo per avere il giusto aminoacido nella proteina: il primo è quello
delle sintetasi e del caricamento del tRNA, il secondo è quello del corretto accoppiamento del tRNA
carico all’RNA messaggero.

38
5.2 Il ribosoma
Nel nucleolo la RNA polimerasi I trascrive più volte il DNA al fine di produrre il precursore RNA 45S
che viene laborato e spezzato in rRNA maturo e proteine ribosomiali che tenderanno poi ad associarsi
per generare le subunità ribosomiali grande e piccola.

Le proteine ribosomiali si trovano sulla superficie del ribosoma e presentano spesso estensioni che
vanno ad infilarsi all’interno del core dell’rRNA; queste proteine sono importanti per stabilizzare il
ribosoma, ma non hanno funzione catalitica in quanto l’rRNA ribosomiale agisce come ribozima. Sia
nei procarioti che negli eucarioti, anche se con dimensioni diverse, la subunità maggiore e quella minore
si uniscono a formare il ribosoma completo.
Una volta completo il ribosoma presenta tre siti funzionali alla sintesi proteica:
• Sito A, per l’aminoacil-tRNA
• Sito P, per il peptidil-tRNA

• Sito E, sito di uscita

Oltre ai tre siti legati al tRNA esiste anche un solco che tiene in posizione l’mRNA durante il processo
di traduzione, e questo solco è collocato nella subunità ribosomiale minore.
Il codice dell’RNA funziona dunque a triplette e dunque sono teoricamente possibili tre chiavi di let-
tura, o meglio tre punti di partenza: questo problema è risolto dal fatto che il codone AUG, unico codone
per la metionina, è sempre quello di partenza. Esistono due tRNA diversi per questo aminoacido: uno lo
inserisce come primo elemento della proteina mentre l’altro lo inserisce all’interno del peptide nascente.

39
Un punto importante è che nei batteri in risposta al tRNA per la metionina di inizio sintesi viene incorpo-
rato nel peptide non l’aminoacido metionina ma una sua versione modificata detta N-formilmetionina.
L’N-formilmetionina è formata a seguito di due reazioni, la prima è il classico caricamento del tRNA:

M et + tRN Af M et + AT P
M et − tRN Af M et + AM P + P Pi
La seconda reazione, catalizzata dall’enzima transformilasi, genera l’N-formilmetionina:

M et − tRN Af M et + N 10 − F ormiltetraidrof olato

f M et − tRN Af M et + tetraidrof olato
L’enzima transformilasi è molto più selettivo della sintetasi della prima reazione e reagisce solo
con i residui di metionina legati a tRN Af M et . L’aggiunta del formile alla metionina impedisce che
questo aminoacido modificato venga inserito per errore all’interno della catena e permette inoltre alla
molecola di legarsi a uno specifico sito d’iniziazione del ribosoma che non lega nessun’altra struttura.
L’N-formilmetionina non viene utilizzata negli eucarioti, i cui polipeptidi iniziano con una metionina
standard, tuttavia esistono comunque due tRNA specializzati.

5.2.1 Fase di iniziazione

La fase di iniziazione negli eucarioti accade esclusivamente al primo codone AUG, mentre nei procarioti
può accadere anche ad un AUG interno. Un aiuto nell’identificazione dell’AUG di partenza nei batteri
è dato dalla sequenza di Shine-Dalgarno posta ad una decina di coppie di basi dal sito di inizio. Negli
eucarioti non è necessaria la sequenza in quanto il primo AUG a valle del cap 5’ è quello di start.
Da notare che gli mRNA vengono tradotti da poliribosomi e non da un’unica struttura in modo da
velocizzare al massimo il processo.
I ribosomi dei batteri possiedono i tre siti per il tRNA: A, P ed E. La traduzione inizia quando
f M et − tRN Af M et si lega al sito P che è l’unico in grado di riconoscerla: questo è l’unico caso in
cui un aminoacido si dirige al sito P, tutti i successivi si legheranno prima al sito A. Nel passaggio
successivo si ha l’appaiamento e il riconoscimento di codone e anticodone. L’ultimo passaggio della
fase di iniziazione è l’assemblaggio del complesso di iniziazione con l’arrivo della subunità maggiore del
ribosoma che ricopre la regione contenente mRNA e f M et − tRN Af M et .
Al processo di iniziazione sono necessari parecchi fattori accessori, tra cui i più importanti sono,
negli eucarioti:

• eIF2: facilita il legame tra M et − tRN Amet e la subunità ribosomiale 40S

• eIF2B, eIF3: sono i primi fattori a legarsi a 40S e aiutano gli step successivi
• eIF4A: ha attività RNA elicasica

• eIF4B: legge l’mRNA a caccia del primo AUG

• eIF4E: si lega al cap 5’ dell’mRNA
• eIF4G: si lega ad eIF4E e alla poliA binding protein (PAB)

5.2.2 Fase di allungamento

La fase di allungamento è quella in cui vengono creati i legami peptidici e si divide in almeno tre
passaggi. La fase nel complesso richiede la formazione del complesso d’iniziazione e un set di tre
proteine citosoliche solubili dette elongation factors: EF-Tu, EF-Ts e EF-G per quanto riguarda i batteri.

Passo 1: legame con l’aminoacil-tRNA in arrivo Il tRNA carico in arrivo nel primo passo si lega
ad un complesso dato da un elongation factor (EF-Tu) e GTP. La macrostruttura risultante, detta
aminoacil-tRNA-Ef-Tu-GTP si lega al complesso A del ribosoma e successivamente, grazie all’idrolisi
del GTP, viene rilasciata la porzione Ef-Tu-GDP che verrà poi rigenerata.

40
Passo 2: formazione del legame peptidico Un legame peptidico viene ora formato tra i due aminoaci-
di legati ai loro tRNA ai siti A e P. Questo accade per trasferimento del gruppo N-formilmetionil dal primo
tRNA al secondo aminoacido che ora si trova nel sito A; questo passaggio produce un dipeptidil-tRNA
nel sito A e lascia un RNA scarico al sito P. La reazione veniva solitamente descritta come catalizzata
dall’enzima peptidil-trasferasi, ma è oggi noto che in realtà è l’rRNA 23S a compiere questo ruolo.

Passo 3: traslocazione Nell’ultimo passaggio del ciclo di allungamento, il ribosoma si sposta di un

codone a valle e questo di riflesso sposta il dipeptidil-tRNA dal sito A al sito P e il tRNA scarico dal P
all’E da cui verrà rilasciato nel citosol. Il movimento del ribosoma prevede l’elongation factor EF-G nei
batteri che prende il nome anche di traslocasi, oltre che l’energia fornita dall’idrolisi di una seconda
molecola di GTP.
Durante un giro del ciclo vengono dunque consumati due GTP idrolizzati a GDP e Pi e il ribosoma
si sposta di un codone a valle.

5.2.3 Terminazione
La fase di allungamento continua finchè il ribosoma non aggiunge l’ultimo aminoacido codificato dal-
l’mRNA. La terminazione, ultima fase della sintesi, viene segnalata dalla presenza di uno dei tre codoni
di stop: UGA, UAG, UAA. Nei batteri quando un codone di stop occupa il ribosoma, tre fattori di ter-
minazione - le proteine RF-1, RF-2 e RF-3 - contribuiscono all’idrolisi del peptidil-tRNA terminale e
rilasciano dunque il polipeptide libero e l’ultimo tRNA dal sito P.

5.3 Controllo della traduzione

La sintesi proteica è spesso controllata a livello della traduzione, in modo da non sprecare energie nel
processo.
Un esempio di controllo su specifici mRNAè dato dalla regolazione da ferro; la ferritina è una proteina
citosolica che lega il ferro quando esso è abbondante nel citosol, mentre il recettore della trasferrina
è un recettore di membrana che trasporta il ferro all’interno della cellula: l’espressione dei due geni
corrispondenti è controllata a livello di sintesi proteica in quanto la presenza simultanea è uno spreco
energetico. Quando il ferro intracellulare è scarso un’aconitasi citosolica si lega all’mRNA della fer-
ritina e ne blocca la traduzione, mentre a livello dell’mRNA per il recettore della trasferrina si ha una
stabilizzazione positiva della molecola e quindi una sua traduzione. Quando il ferro è invece presente
esso va a legarsi all’aconitasi, liberando l’mRNA della ferritina dalla sua morsa e inibendo la sintesi dei
recettori per la transferrina.

5.3.1 Controlli generali

Esistono controlli molto generali della traduzione che affliggono tutti i trascritti cellulari anche se con
effetti diversi. Questa upregolazione o downregolazione è legata soprattutto alla presenza di sostanze
nutrienti quali gli aminoacidi o alla presenza o assenza di growth factors. Il controllo generale della
traduzione viene effettuato attraverso due meccanismi primari entrambi di tipo fosforilativo: il controllo
di eIF2 e delle proteine che legano eIF4.
Il controllo della traduzione su eIF2, un fattore di iniziazione, è stimolato dalla scarsità di aminoaci-
di. Una protein chinasi si occupa di fosforilare eIF2 e quando questo avviene si ha il sequestro di tutta
eIF2B sotto forma di complesso inattivo e quindi non disponibile a partecipare alla traduzione. Il ruolo
di eIF2 è di guidare il tRNA d’inizio e portarlo verso il ribosoma: quando M et − tRN A si lega al sito P il
fattore eIF2B si lega ad eIF2 riciclandolo con l’aiuto del GTP: sequestrando eIF2B la sintesi proteica è
dunque enormemente rallentata. L’interferone svolge la sua azione protettiva proprio a livello di eIF2:
quando viene assorbito dalla cellula questo attiva la eIF2 chinasi che fosforila eIF2 e impedisce dunque
la sintesi proteica che in questo caso porterebbe alla produzione di proteine virali.
Il controllo su eIF4E è svolto da proteine leganti presenti in tutti gli eucarioti che impediscono
l’interazione tra eIF4E ed eIF4G. Quando la crescita cellulare è lenta queste proteine si legano al sito di
eIF4E che normalmente interagisce con eIF4G, mentre quando la cellula è stimolata a crescere queste
proteine vengono disattivate da una fosforilazione mediata da una protein-kinasi.

41
5.4 Modifiche post-traduzionali
Con il termine di modifiche post-traduzionali si intende l’insieme dei vari processi che subiscono le
proteine neotradotte, tra cui modifiche dirette ma anche trasporto e degradazione.

5.4.1 Trasporto
In una cellula eucariote vengono sintetizzate fino a 10000 proteine diverse, ciascuna delle quali da
smistare nella giusta direzione: anomalie a questo livello sono alla base di importanti patologie.
Un punto di partenza importante sull’argomento è la differenziazione tra i ribosomi liberi nel cito-
plasma e quelli associati al reticolo endoplasmatico: i primi sintetizzano le proteine citoplasmatiche,
mitocondriali e nucleari mentre i secondi quelle lisosomiali, secretorie e di membrana. Questo punto è
importante perchè le proteine secretorie iniziano a essere smistate durante la traduzione, mentre quelle
citoplasmatiche vengono smistate una volta tradotte.
Il trasporto delle proteine è influenzato da modifiche post traduzionali, richiede ATP o GTP e viene
diviso in tre tipologie:

• Citosol-nucleo, mediato dai pori nucleari

• Transmembrana, mediato da proteine traslocatrici
• Vescicolare, mediato da vescicole

Il trasporto è mediato da segnali di smistamento assolutamente specifici e riconosciuti da recettori sul

bersaglio oppure da traslocatori; questi segnali possono essere peptidi semplici oppure delle regioni
particolari all’interno della proteina. Il segnale di smistamento solitamente ha una lunghezza di 15-30
aminoacidi e spesso viene rimosso una volta finita la proteina; le proteine prive di questo tipo di segnale
sono destinate a rimanere nel citosol.

5.4.2 Modifiche
Le modifiche post traduzionali sono parecchie e complesse, le più importanti sono:
• Taglio proteolitico
• Glicosilazione
• Modifica degli aminoacidi

• Aggiunta di ponti disolfuro

• Aggiunta di gruppi isoprenilici
• Idrossilazione, mediata da vitamina C
• Carbossilazione, mediata da vitamina K

Buona parte delle modifiche iniziano nel reticolo endoplasmatico, e dunque molte proteine devono es-
sere dirette in questa regione. Le proteine destinate a essere modificate nel reticolo vengono legate
a livello del segnale di smistamento dalla proteina SRP (signal recognition particle); questa proteina
blocca la sintesi a una lunghezza di circa settanta aminoacidi e dirige l’intero ribosoma verso i recettori
SRP sulla faccia citosolica del RE. La proteina nascente è allora consegnata al complesso traslocatore
del peptide del reticolo che forse interagisce direttamente con il ribosoma e la SRP si dissociata accom-
pagnata da un idrolisi di GTP sia suo che del recettore. L’allungamento della proteina ora ricomincia,
termina e il ribosoma si dissocia.

42
Glicosilazione La glicosilazione è l’aggiunta di uno zucchero a un residuo aminoacidico tramite un
legame O-glicosidico se su un ossigeno (esempio alla serina) oppure N-glicosidico se su un azoto (esem-
pio all’asparagina). Circa il 50% delle proteine negli eucarioti sono glicosilate, al 90% tramite un legame
N-glicosidico. Gli zuccheri primariamente riscontrati nelle glicoproteine sono glucosio, galattosio e
mannosio.
La sintesi di un legame glicosidico avviene tramite l’attacco di uno zucchero fosfato al primo fosfato
del nucleotide:

L’enzima che catalizza questa reazione è la NDP-zucchero pirofosforilasi, e il risultato è:

Le glicoproteine nell’uomo hanno svariate funzioni:

• Nel plasma

– Sono più solubili per via degli zuccheri

– Sono più stabili e persistenti

• Nella membrana

– Svolgono funzioni recettoriali

– Mediano l’interazione tra cellule
– Mediano i processi di riconoscimento

• Nel reticolo endoplasmatico

– Hanno funzione di chaperoni, cioè aiutano le proteine ad acquisire la corretta struttura 3D

– Legano i carboidrati (lectine)

• Nel citosol

– Hanno funzione lisosomiale, degradano cioè le proteine

• Nel sangue

– Determinano il gruppo sanguigno ABO

Le lectine sono proteine presenti in tutti gli organismi che legano i carboidrati con alta specificità ed
affinità: le loro funzioni sono di riconoscimento, segnalazione, adesione intercellulare. Alcuni ormoni
peptidici in circolo possiedono oligosaccaridi che ne influenzano l’emivita per via delle lectine presenti
sugli epatociti. I residui di acido sialico proteggono le proteine plasmatiche dagli epatociti. Ultimo
dettaglio sulle lectine: molte tossine batteriche fanno parte di questa famiglia.

43
Formazione di ponti disolfuro Questa modifica ad opera del reticolo endoplasmatico è esclusiva
delle proteine secretorie e di membrana. La formazione di un ponte disolfuro avviene per ossidazione
di due residui di cisteina a cistina. La formazione dei ponti disolfuro è favorita dal glutatione (⇒ pg.
10).

Via delle vescicole Nel reticolo endoplasmatico le proteine sintetizzate sono ripiegate e assumono
struttura secondaria grazie all’enzima disolfuro isomerasi che origina i ponti disolfuro. Le proteine che
assumono la forma corretta vengono dirette al Golgi mentre quelle anomale vengono trattenute dalla
proteina BiP, una chaperonina che le aiuta a raggiungere la configurazione corretta. La via dal reticolo
al Golgi è quella di default e non richiede alcuna segnalazione.
Il trasporto vescicolare è specifico e diretto ad un compartimento preciso; esiste una via biosintetica
dal reticolo al golgi e dal golgi alla superficie, e una via endocitica, dall’esterno all’interno della cellula.
All’interno del Golgi le catene saccaridiche vengono nuovamente elaborate. L’oligosaccaride attac-
cato in N viene modificato in oligosaccaride complesso (almeno due acetilglucosammine, galattosio e
acido sialico) oppure in oligosaccaride ad alto tenore di mannosio.

Tagli proteolitici Un esempio classico di taglio proteolitico è l’insulina. Questa proteina viene prima
secreta come pre-proinsulina contenente la sequenza segnale; la sequenza viene rimossa e si viene
a formare proinsulina la quale per taglio proteolitico genera insulina matura composta da catena A,
catena B e peptide C. Il taglio della proinsulina avviene ad opera di due enzimi, PC3 e PC2 endoproteasi;
PC2 genera la catena A da sola, PC3 genera la catena B legata ad un residuo di arginina eliminato poi
da un secondo enzima detto carbossipeptidasi.
L’albumina segue lo stesso principio, secreta come proalbumina e tagliata in forma attiva dalla
furina-endoproteasi.

Destinazione ai lisosomi I residui di mannosio delle proteine destinate ai lisosomi vengono fosfo-
rilati in posizione 6 in modo da renderli marcati. L’enzima che catalizza questa reazione è il GlcNAc
fosfotrasferasi. Queste proteine marcate vengono poi trasportate dal Golgi al lisosoma oppure dalla
superficie cellulare al lisosoma: il mannosio 6-fosfato indica sia per molecole esogene che endogene la
destinazione al lisosoma.

Destinazione al nucleo Tutte le proteine del nucleo sono sintetizzate nel citoplasma: istoni, proteine
ribosomiali, polimerasi e fattori di trascrizione solo per fare qualche esempio. La membrana nucleare è
quindi un gate sia in entrata che in uscita; esistono sequenze di localizzazione nucleari per le proteine
destinate a questo compartimento, e solitamente non vengono eliminate per via delle frequenti entrate
e uscite di queste molecole.

5.4.3 Degradazione intracellulare

L’emivita di una proteina varia da pochi minuti a parecchi giorni. Tutte le proteine vengono degradate
per almeno tre motivi: impedire l’accumulo di quelle anormali, impedire l’accumulo di quelle inutili e
facilitare il riciclo degli aminoacidi. Due sono le vie principali di degradazione: il sistema lisosomiale e
quello citoplasmatico, quest’ultimo diviso in proteasi e sistemi ATP dipendenti.
La via lisosomiale è una via di degradazione aspecifica raggiungibile per autofagia (ER trasformato
in lisosoma), fagocitosi o attraverso un endosoma. Alcune proteine vengono trasportate direttamente
nel lisosoma da un segnale apposito.
La via citoplasmatica conta sopratutto sul sistema dell’ubiquitina. L’ubiquitina è una piccola pro-
teina di 76 aminoacidi altamente conservata tra specie molto diverse. Questa molecola viene attaccata
covalentemente tramite legame peptidico ad un residuo di lisina: solitamente parecchie ubiquitine
vengono legate alla stessa proteina da degradare; la degradazione da ubiquitina avviene poi per via
proteolitica. Il secondo elemento fondamentale della via dell’ubiquitina è il proteasoma, un sistema
proteolitico ATP dipendente: questa struttura digerisce unicamente le proteine marcate dall’ubiquitina
(almeno quattro unità). Tre enzimi sono legati alla formazione del legame ubiquitina-substrato. Un’at-
tività collaterale del sistema dell’ubiquitina-proteasoma è la digestione di peptidi virali che vengono poi
esposti su di un amolecola di classe I dell’MHC per il riconoscimento da parte dei linfociti T citotossici.

44
6 Biosegnalazione - ormoni
La capacità delle cellule di comunicare tra loro è fondamentale alla vita. Esistono almeno quattro
tipologie diverse di comunicazione cellulare:

• Via endocrina: viene secreto un ormone nel circolo sanguigno e cellule distanti ricevono il messag-
gio attraverso i loro recettori superficiali. Esempi di ormoni endocrini sono insulina e glucagone.
• Via paracrina: una cellula secretrice diffonde messaggi chimici nel fluido extracellulare e le cel-
lule vicine lo recepiscono. Gli eicosanoidi, molecole derivate dagli acidi grassi e precursori di
prostaglandine e trombossani, sono esempi di ormoni paracrini.
• Via autocrina: la cellula secerne un segnale chimico che viene recepito dai suoi stessi recettori di
membrana
• Via della membrana plasmatica: due cellule vicine dialogano tramite proteine di membrana che le
congiungono
Un ormone è una sostanza chimica secreta in tracce da una cellula e trasportata dal flusso sanguigno
ad un altra cellula, dove è in grado di modulare una risposta specifica, sia essa biochimica o fisiologica.
Il legame ad un recettore può essere di due tipi: se la molecola lega il recettore ma non genera risposta
è un antagonista,se invece genera una risposta è un agonista. Dal punto di vista chimico gli ormoni
possono essere suddivisi in:
• Peptidici. Includono un numero variabile tra tre e più di duecento nucleotidi e sono una classe
piuttosto numerosa, tra i più importanti esponenti vi sono: insulina, glucagone, calcitonina, tutti
gli ormoni ipotalamici ed ipofisari. Gli ormoni peptidici hanno la caratteristica di essere sintetiz-
zati nei ribosomi in forma di precursori, i proormoni, che vengono poi impacchettati in vescicole
secretorie e tagliati per via enzimatica ottenendo gli ormoni funzionanti.
• Amminici
• Steroidei. Gli ormoni steroidei, cioè gli ormoni adrenocorticali e gli ormoni sessuali, vengono sin-
tetizzati a partire dal colesterolo in parecchi tessuti endocrini. Tutti gli ormoni steroidei agiscono
attraverso recettori nucleari che mediano variazioni nei livelli di espressione di geni specifici anche
se possono avere effetti anche a breve termine probabilmente attraverso recettori sulla membrana
plasmatica. Esistono varie tipologie di ormoni steroidei:

– I glucocorticoidi come il cortisolo sono regolatori del metabolismo dei carboidrati

– I mineralcorticoidi regolano la concentrazione dei vari elettroliti nel sangue
– Gli androgeni e gli estrogeni regolano lo sviluppo sessuale, il comportamento sessuale e altri
tratti sia riproduttivi che non

• Eicosanoidi. La famiglia degli eicosanoidi comprende leucotrieni, trombossani e prostaglandine;

questi ormoni hanno la caratteristica di non essere sintetizzati e accumulati ma di essere secreti
solo a richiesta a partire dall’acido arachidonico. L’acido arachidonico viene prodotto enzimatica-
mente a partire dai fosfolipidi di membrana grazie all’azione della fosfolipasi A2 (→ Biosintesi degli
acidi grassi - Eicosanoidi)

45
Da un punto di vista più generale queste molecole possono essere divise invece in idrosolubili (tutti i
neurotrasmettitori e gli ormoni peptidici) e liposolubili (tutti gli ormoni steroidei e tiroidei)
Un recettore non è una proteina qualsiasi ma deve rispondere a cinque requisiti fondamentali:
• Deve essere specifico, legarsi cioè ad un solo segnale
• Deve essere altamente affine, cioè saper reagire anche a concentrazioni infime
• Deve essere saturabile, cioè porre un limite al numero di molecole che una cellula può legare
• Deve essere reversibile, cioè non creare legami covalenti ma staccare il ligando quando la sua
concentrazione cala
• Deve essere accoppiato al ligando, cioè trasferirne il segnale
Le tipologie di recettore sono legate sia a caratteristiche del recettore stesso che a caratteristiche del
ligando; le principali sono:
• Canale ionico controllato (dalla concentrazione del ligando)
• Recettore enzimatico
• Recettore degli steroidi
• Recettore a serpentina (recettori accoppiati a proteine G)
• Recettore senza attività enzimatica
• Recettore di adesione
Due sono le possibili posizioni per un recettore: a livello del citosol o del nucleo per i legandi liposolubili
o a livello della membrana per i ligandi lipofilici; il primo tipo di recettore ha risposta più lenta, il
secondo più veloce.
In generale l’interazione tra l’ormone e il suo recettore produce una di queste sei risposte:
1. Attivazione di uno o più enzimi per tramite di un secondo messaggero (ad esempio cAMP o
l’inositolo trifosfato)
2. Attivazione di un recettore tirosin chinasico
3. Attivazione di un recettore guanilil ciclasico con produzione del secondo messaggero cGMP
4. Variazione del potenziale di membrana attraverso l’apertura di gate ionici ormone-dipendenti
5. Variazione della struttura del citoscheletro
6. Variazione dei livelli di espressione di uno o più geni per tramite di un ormone steroideo o simil
steroideo

Adrenalina e cAMP I recettori a serpentina sono i responsabili dell’attivazione della via dell’adenilato
ciclasi con produzione di AMP ciclico. I recettori per l’adrenalina prendono il nome di recettori β-
adrenergici e vengono suddivisi in quattro tipologie in base alle loro diverse affinità con i vari agonisti
e antagonisti: α1 , α2 , β1 e β2 .
Il primo step della via dell’adrenalina è il legame dell’ormone con il suo recettore β-adrenergico (è
la tipologia di recettore che si ritrova in fegato, muscolatura e tessuto adiposo); il recettore in ques-
tione è una proteina con sette regioni idrofobiche lunghe 20-28 aminoacidi che entrano ed escono dalla
membrana della cellula. Il legame dell’ormone promuove un cambio conformazionale del dominio in-
tracellulare che coinvolge la sua interazione con una seconda proteina della via, la proteina stimolante
G, in sigla Gs . Quando questa proteina è attiva si ha stimolazione della produzione di cAMP per tramite
dell’adenilato ciclasi.
Il secondo step è l’attivazione della proteina Gs . Questa proteina presenta un sito di legame con un
nucleotide che può essere GDP nella forma inattiva o GTP in quella attiva: il recettore β-adrenergico
attivato catalizza il rimpiazzamento del GDP con GTP attivando dunque la proteina. Ad avvenuta

46
attivazione la proteina si muove e passa dall’essere vicina al recettore ad essere vicina ad una molecola
di adenilato ciclasi.
Il terzo step è la catalisi della reazione che dall’ATP produce cAMP. Questo passaggio avviene grazie
all’interazione di Gs attivata e adenilato ciclasi. La stimolazione da parte della proteina è autolimitante:
Gs è di suo dotata di attività GTPasica che degrada autonomamente il GTP a GDP spegnendosi da sola.
Il quarto step ripristina lo status iniziale. La proteina Gs dopo essersi auto-inattivata si dissocia
dall’adenilato ciclasi rendendola inattiva e si riporta nella posizione di partenza per ricominciare il
ciclo.
La presenza di cAMP nella cellu-
la ha la funzione di attivare la pro-
tein kinasi A (PKA o protein chinasi Tabella 4: Bersagli attivati da PKA (principali)
cAMP dipendente), i cui bersagli di Proteina Ruolo
azione fosforilativa sono multipli e rap- Glicogeno sintetasi Sintesi del glicogeno
presentano l’output ultimo del sistema Piruvato chinasi Glicolisi
di attivazione dell’adrenalina. Quando Piruvato deidrogenasi Da piruvato ad acetil-CoA
il cAMP viene degradato a causa del- Fosfofruttochinasi Glicolisi
lo spegnimento della via adrenalinica Fruttosio 2,6- bisfosfatasi Gluconeogenesi
viene a mancare l’attivazione di PKA Istoni H1 / H2B Condensazione DNA
e dunque si ha la chiusura della via Glicogeno fosforilasi b Metabolismo del glicogeno
aperta. L’attivazione di PKA si realiz-
za grazie al fatto che questa presenta
due subunità regolatrici che coprono i siti attivi: queste subunità a loro volta presentano siti attivi per
il cAMP che, una volta legato, le fa staccare dalle subunità catalitiche sede delle varie attività della
proteina.
Caratteristica comune di questa tipologia di vie di comunicazione è l’amplificazione: solitamente un
recettore è in grado di attivare più di una proteina G, che a loro volta attiveranno enzimi che produr-
ranno più di un messaggero e così via; l’amplificazione è la spiegazione delle bassissime concentrazioni
di ormoni necessarie ad ottenere un effetto evidente sulla cellula e sull’organismo: tra le concentrazioni
di adrenalina e quelle dei prodotti dalle vie da essa aperte può esserci una differenza anche di sette
ordini di grandezza.
La terminazione del ciclo del cAMP non è esclusivamente legata all’autospegnimento di Gs . Le
modalità di terminazione dello stimolo possono essere riassunte in:
• Drop della concentrazione dell’ormone: quando la concentrazione di epinefrina scende sotto la
soglia Kd di attivazione del recettore l’ormone si dissocia e il recettore ritorna inattivo e dunque
smette di attivare Gs .
• L’attività GTPasica della proteina Gs è in realtà parecchio debole e viene resa molto più veloce
dall’intervento di proteine che stimolano questa proprietà e che prendono il nome di GAPs (GTPase
activator proteins).
• Il secondo messaggero della via, il cAMP, è soggetto a idrolisi da parte della nucleotide ciclico
fosfodiesterasi che catalizza la formazione di 5’-AMP che non può funzionare come tramite.
• L’ultima via di arresto del ciclo differisce dalle precedenti in quanto queste ultime si attivano
quando lo stimolo è ormai cessato mentre questa via è funzionale anche in presenza di stimolo
in picco: si tratta della desensibilizzazione del recettore. La desensibilizzazione del recettore è
mediata da una proteina chinasi che fosforila il recettore dal suo lato intracellulare che normal-
mente è deputato ad interagire con Gs ; quando il recettore è legato all’epinefrina, la chinasi per
il recettore β-adrenergico (βARK o GRK2) fosforila parecchi residui di serina nelle vicinanze del
dominio carbossiterminale del recettore stesso: questa fosforilazione della serina crea un sito di
legame per la proteina β-arrestina (o βarr) che previene ulteriori interazioni tra il recettore e Gs .
Il legame con la β-arrestina favorisce inoltre il sequestramento delle molecole di recettore dalla
membrana a piccole vescicole intracellulari.

47
Esotossine batteriche e trasduzione del segnale Due esotossine batteriche sfruttano la via del cAMP
per danneggiare l’organismo: tossina del colera e tossina della pertosse.
La tossina del colera opera una ribosilazione su un residuo argininico di Gs abolendone l’attività
GTPasica: in questo modo Gs non ferma mai la sua attività e la produzione di cAMP è continua.
La tossina della pertosse opera anch’essa una ribosilazione ma su un residuo cisteinico di Gs : questo
inibisce le possibilità della proteina di reagire con i recettori e pertanto viene bloccata nel suo stato
inattivo.

Figura 11: Ciclo del cAMP

Calcio e proteina kinasi C Le varie proteine G presenti nelle cellule sono attivate di volta in volta
da recettori diversi e regolano proteine effettrici diverse. Una classe piuttosto ampia di recettori sono
accoppiati grazie ad una proteina G alla fosfolipasi C, specifica per un fosfolipide di membrana che
prende il nome di P IP2 ; quando i recettori vengono attivati la fosfolipasi C catalizza la formazione di
due secondi messaggeri potenti: diacilglicerolo e inositolo 1,4,5-trifosfato (IP3 ). L’inositolo diffonde
fino al reticolo endoplasmatico dove apre specifici canali al Ca++ IP3 -dipendenti; normalmente la con-
centrazione di calcio è molto più alta nel reticolo endoplasmatico rispetto al citosol, quindi l’apertura
genera un flusso netto e rapido di Ca2+ verso il citosol e questo causa l’attivazione della proteina kinasi
C; il diacilglicerolo ha la funzione di cooperare con lo ione Ca++ nell’attivazione della proteina kinasi. La
proteina kinasi C fosforila parecchie tipologie di proteine (cromosomiche, citoscheletriche, contrattili e
di trasporto) e controlla la divisione cellulare e la proliferazione.

Il calcio non ha un ruolo confinato solamente a questo meccanismo ma anzi è un messaggero fonda-
mentale cellulare. La concentrazione di questo ione è mantenuta bassa nel citosol dall’azione di pompe

48
nel reticolo, nei mitocondri e nella membrana, ma rimane alta all’esterno: dietro stimolo ormonale
è dunque possibile aprire i vari canali e far variare la concentrazione. I cambi nella concentrazione
intracellulare di calcio vengono registrati dalle proteine leganti il calcio che regolano parecchi enzimi
Ca2+ dipendenti. La principale proteina legante il calcio è la calmodulina, la cui struttura presenta
quattro siti di legame ad alta affinità per questo ione: quando la concentrazione di calcio intracellulare
aumenta la calmodulina si satura e da questo deriva un cambio conformazionale che ne scatena l’attiv-
ità modulatoria. Sotto il controllo della calmodulina vi sono molte proteine presenti in varie tipologie di
tessuti e con varie funzioni; un importante controllo operato da questa proteina è quello sulla fosforilasi
b chinasi del muscolo: si ha sia contrazione del muscolo che l’avvio della demolizione del glicogeno per
produrre ATP destinato alla contrazione stessa.

Recettori tirosin chinasici: l’insulina I recettori tirosin chinasici rappresentano una famiglia di
recettori di membrana con attività intrinseca di proteina chinasi e il loro meccanismo di traduzione del
segnale è molto diverso da quello dei recettori accoppiati alle proteine G. I recettori tirosin chinasici
hanno un dominio di legame per l’ormone da un lato della membrana plasmatica e dall’altro un sito
attivo enzimatico tirosin chinasico che quando attivato fosforila residui di tirosina su specifiche proteine
bersaglio. I recettori dell’insulina sono i capostipite di questa tipologia di recettori.
L’insulina è una proteina costituita da due catene A e B unite da due ponti disolfuro. Viene sinte-
tizzata nel pancreas sotto forma di un singolo polipeptide precursore che prende il nome di pre-pro-
insulina che ad un capo possiede una sequenza segnale che ne dirige il trasporto verso le vescicole
secretorie. La rimozione proteolitica della sequenza segnale e la formazione di tre ponti disolfuro pro-
duce la proinsulina che viene conservata in granuli secretori nelle cellule β del pancreas. Quando il
glucosio ematico è presente in concentrazioni sufficientemente elevate da scatenare la secrezione di
insulina la proinsulina viene convertita in forma attiva da proteasi specifiche che spezzano due legami
peptidici e generano la forma matura dell’ormone.
L’insulina in forma attiva non entra nella cellula ma attiva una cascata di segnalazione che termina
a livello degli enzimi insulino-sensibili presenti nel nucleo e nel citosol, i quali stimolano la trascrizione
di geni specifici. Il recettore tirosin chinasico dell’insulina prende il nome di INS-R (Insulin Receptor
protein) e consiste di due subunità α identiche che protrudono all’esterno della membrana e di due
subunità β transmembrana. Il processo di segnalazione inizia quando INS-R lega l’insulina e l’attività
tirosin chinasica viene stimolata: ogni subunità β a questo punto fosforila tre tirosine dell’altra sub-
unità in un processo di autofosforilazione che causa un cambio conformazionale del recettore e libera
il vero sito attivo per la fosforilazione delle proteine bersaglio. Una delle proteine bersaglio di INS-R è
IRS-1 (insulin receptor substrate 1) che una volta fosforilata va a legarsi per mezzo di una delle tirosine
attivate al dominio SH2 della proteina Grb2. La proteina Grb2 non ha altra funzione se non mettere in
contatto IRS-1 e la proteina Sos; quest’ultima proteina viene reclutata da Grb2 grazie a un suo altro
dominio, SH3, che si lega ad una regione ricca in prolina di Sos avvicinandola al nascente complesso.
Quando Sos si lega a Grb2 scatena la sua attività di fattore rimpiazzante nucleotidi guanosinici e catal-
izza la sostituzione di GDP con GTP sulla proteina Ras (che fa parte della famiglia delle proteine G). La
proteina Ras attivata si occupa di fosforilare una proteina chinasi che prende il nome di Raf-1 e che è
il primo elemento di una cascata di tre protein chinasi:
• Raf-1
• MEK
• ERK
I tre elementi della cascata sono collegati da fosforilazioni successive; quando ERK viene fosforilata
si hanno alcuni degli effetti biologici dell’insulina nel senso che questa proteina si porta nel nucleo e
fosforila un fattore di transizione, Elk1, che modula la trascrizione di un centinaio di geni insulina-
regolati.
Il percorso di segnalazione dell’insulina presenta un bivio a livello di IRS-1: Grb2 infatti non è l’unica
proteina che si associa alla forma fosforilata di questa molecola. L’enzima fosfoinositide 3-chinasi (PI-
3K) si lega a IRS-1 attraverso il suo personale dominio SH2 e ne viene attivata: questa proteina attivata
converte P IP2 (un fosfolipide di membrana il cui nome completo è fosfatidilinositolo 4, 5-bisfosfato) in
P IP3 . Quando legata a P IP3 la proteina chinasi B (PKB) viene fosforilata e attivata grazie ad un’altra
proteina chinasi, PDK1; ad avvenuta attivazione di PKB è promossa la fosforilazione di residui di serina

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o treonina sulle proteine bersaglio tra cui la più importante è la glicogeno sintetasi chinasi 3 (GSK3).
Nella sua forma attiva non fosforilata la GSK3 fosforila la glicogeno sintasi inibendola e rallentando
la sintesi del glicogeno; dopo fosforilazione da parte di PKB la GSK3 viene a sua volta inattivata e
viene quindi a mancare l’inibizione sulla glicogeno sintasi che è libera di catalizzare la sintesi del
glicogeno con risultato finale di diminuzione del glucosio circolante. L’azione di PKB non si limita alla
fosforilazione di GSK3 ma si estende allo stimolo al movimento del glucosio a livello di GLUT4.

Recettori privi di attività enzimatica intrinseca Una variante al tema dei recettori tirosin chinasici
è portata dai recettori privi di attività tirosin chinasica intrinseca: questo tipo di recettori quando
occupati dai loro ligandi attivano una tirosin chinasi citosolica. Esempio classico di questo tipo di
recettori è il sistema che regola la formazione degli eritrociti che si basa sull’eritropoietina, una proteina
facente parte delle citochine.
Quando l’eritropoietina si lega al suo recettore di membrana questo va incontro a dimerizzazione e
il dimero può legare ed attivare una protein chinasi solubile che prende il nome di JAK. JAK attivata
fosforila due bersagli principali: il recettore stesso e il fattore di trascrizione STAT. Un dominio SH2
di STAT si va a legare ad una tirosina fosforilata del recettore posizionandosi nel modo migliore per la
fosforilazione del fattore di trascrizione da parte di JAK in risposta all’eritropoietina. STAT fosforilato
forma dimeri dotati di un segnale per il trasporto al nucleo dove inducono la trascrizione di geni specifici
essenziali per la maturazione dei globuli rossi.
Un altro esempio di recettore privo di attività enzimatica intrinseca è quello per l’interferone: la via è
esattamente la stessa dell’eritropoietina, cambia ovviamente solo la struttura delle molecole interessate.

50
Recettori guanilil ciclasici Questo tipo di recettori una volta attivati convertono il GTP nel secondo
messaggero cGMP: quest’ultimo porta messaggi diversi in tessuti diversi, ad esempio in reni e intestino
stimola ritenzione idrica, nel tessuto cardiaco stimola il rilassamento.
A livello renale l’attività guanilil ciclasica è attivata dall’ormone peptidico ANF, fattore atriale natri-
uretico, che viene rilasciato dalle cellule cardiace dell’atrio quando questo viene dilatato da un volume
ematico troppo alto. Giunto ai reni ANF attiva la guanilil ciclasi che produce cGMP il quale attiva un
aumento nell’escrezione renale di N a+ e di conseguenza di acqua: la perdita d’acqua riduce il volume
ematico e quindi controbilancia l’aumento di volume ematico che aveva scatenato il rilascio di ANF.
Recettori guanilil ciclasici sono presenti anche nelle cellule epiteliali dell’intestino e sono il target
dell’endotossina di E.Coli: l’aumento di cGMP causato dalla tossina aumenta la secrezione di Cl− con
conseguente perdita d’acqua e quindi diarrea.
Una categoria a parte di guanilil ciclasi è una proteina citosolica strettamente associata ad un
gruppo EME e attivata dalla presenza di ossido nitrico. L’ossido nitrico viene prodotto a partire da
arginina e calcio dall’enzima NO sintetasi, presente in molte tipologie di cellule:

L’ossido nitrico è sufficientemente apolare da passare le membrane plasmatiche senza un carrier

e quando si lega all’EME della guanilil ciclasi attiva la produzione di cGMP. A livello cardiaco cGMP
riduce la forza delle contrazioni stimolando la pompa ionica che rimuove il Ca++ dal citosol: su questo
principio si basa l’uso della nitroglicerina in cardiologia. Una seconda classe di farmaci è quella che
blocca le fosfodiesterasi, responsabili della degradazione dei nucleotidi ciclici: bloccandole i livelli di
cGMP ma anche di cAMP aumentano.

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Parte II
Dallocchio
7 Enzimi
Con l’eccezione di alcune molecole di RNA con funzione catalitica, tutti gli enzimi sono proteine e quin-
di la loro funzionalità dipende dall’integrità della loro configurazione tridimensionale. Alcuni enzimi
funzionano da soli, mentre altri richiedono altri composti chimici detti cofattori, ad esempio ioni inor-
ganici o un complesso organico o metallorganico definito coenzima; gli enzimi più complessi possono
richiedere sia un coenzima che qualche ione metallico.
In condizioni biologicamente rilevanti le reazioni non catalizzate tendono ad essere lente al punto da
non essere utilizzabili dagli esseri viventi: gli enzimi risolvono questo ostacolo fornendo un ambiente
specifico all’interno del quale la reazione può avvenire rapidamente; la caratteristica chiave di una
reazione catalizzata da un enzima è che questa avviene all’interno di una porzione dell’enzima stesso
detta sito attivo: la superficie di questa regione è rivestita da residui aminoacidici e sostituenti che
legano il substrato creando l’ambiente di catalisi.
Una semplice reazione enzimatica può essere scritta in questo modo:

E + S
ES
EP
E + P
dove E è l’enzima, S il substrato, P il prodotto ed ES e EP i complessi di transizione. La funzione
di un catalizzatore non è di aumentare il tasso di reazione: gli equilibri non vengono toccati. Il punto
di partenza per una qualsiasi reazione chimica è definito stato di riposo e vi contribuisce fondamen-
talmente l’energia libera della molecola in esame, sia essa un reagente o un prodotto; l’equilibrio tra S
e P riflette la differenza tra le energie libere dei due stati di riposo e la sua posizione e direzione non
vengono influenzate da alcun catalizzatore conosciuto. Un punto importante è però questo: un equi-
librio favorevole non significa che la conversione S → P avvenga in tempo utile; la velocità di reazione è
un parametro totalmente diverso dipendente da una barriera energetica posta tra substrato e prodotto.
La barriera tra reagenti e prodotto è derivata dall’energia richiesta per allineare i gruppi della reazione,
per formare intermedi instabili, per riarrangare i legami e altre trasformazioni simili: nel grafico di
reazione questo è rappresentato dalla pendenza tra lo stato S e quello P. La reazione è libera di avvenire
solo quando la barriera energetica viene superata: all’apice della barriera si raggiunge uno stato in
cui il decadimento allo stato S o P è ugualmente probabile ed è la situazione definita come stato di
transizione. La differenza energetica tra lo stato a riposo e lo stato di transizione è definita energia di
attivazione ∆G: un alto valore corrisponde a una reazione lenta. Il fulcro dell’azione dei catalizzatori è
a livello dell’energia di attivazione: una reazione catalizzata occorre più velocemente perchè la sua en-
ergia di attivazione è abbassata. Per via del fatto che gli equilibri non vengono spostati, un enzima che
catalizza la reazione S → P catalizza necessariamente anche P → S: un enzima di fatto accelera le in-
terconversioni facendo raggiungere prima l’equilibrio. Qualsiasi reazione può avvenire in vari passaggi
includenti la formazione e la rottura di specie chimiche transienti dette intermedi di reazione3 : nell’e-
sempio di reazione sono intermedi le specie ES e EP, che nel grafico occupano gli avvallamenti della
curva. Quando sono necessari parecchi step per condurre una reazione, la velocità totale è determinata
dallo step o dagli step con la più alta energia di attivazione, che vengono definiti step limitanti.
Gli equilibri di reazione sono legati alla variazione di energia libera di legame standard. Un equi-
librio semplice per un’interconversione S
P possiede una costante di equilibrio con espressione
matematica

[P ]
Keq = K =
[S]
Su base termodinamica la reazione tra K e la variazione di energia libera di legame è descrivibile con
la formula
0
∆G ◦ = −RT lnKeq
3 Un intermedio è una qualsiasi molecola la cui vita chimica è maggiore della vibrazione molecolare, cioè ∼ 10−13 secondi

52
 Il punto del discorso è che la costante di equilibrio è legata direttamente all’energia di legame: un
0
valore di ∆G ◦ largamente negativo è correlato ad una reazione favorita, anche se questo non garantisce
che essa proceda a velocità utile.
La velocità di una qualsiasi reazione è determinata dalle concentrazioni dei reagenti e da una
costante di velocità, solitamente definita k, che per una semplice reazione unimolecolare rappresenta
la quantità di substrato che reagisce per unità di tempo:

V = k[S]
se la reazione dipende dalle concentrazioni di due composti, o tra due molecole dello stesso compos-
to, l’equazione diventerà

V = k[S1 ][S2 ]
La relazione tra k e l’energia di attivazione è di tipo inversamente proporzionale ed esponenziale:
questo significa che una bassa energia di attivazione è legata ad una reazione che si svolge velocemente.
Le reazioni chimiche solitamente avvengono tra i substrati e i gruppi funzionali degli enzimi. Questi
gruppi possono formare legami covalenti temporanei con il substrato ed attivarlo, o un gruppo può
essere trasferito dal substrato all’enzima: le interazioni covalenti tra enzimi e substrati abbassano l’en-
ergia di attivazione fornendo una via alternativa a più bassa energia per il procedere della reazione.
Un secondo e più importante contributo al funzionamento enzimatico è dato dalle interazioni nonco-
valenti tra enzima e substrato: buona parte dell’energia richiesta per abbassare le soglie di attivazione
è derivata da interazioni deboli noncovalenti. L’energia derivata dall’interazione substrato-enzima è
definita energia di legame ∆GB : è questa la fonte principale di energia libera sfruttata dagli enzimi per
abbassare l’energia di attivazione.

7.1 Cinetica enzimatica

Un fattore chiave per la velocità di una reazione catalizzata è la concentrazione del substrato. Un ap-
proccio semplificato alla cinetica è quello di misurare la velocità iniziale V0 di una reazione: tipicamente
le condizioni saranno di un enzima presente in quantità ridottissime rispetto al substrato e vengono
monitorati solitamente i primi secondi della reazione in modo da poter ritenere costante [S]. A basse
concentrazioni di substrato il valore di V0 aumenta praticamente in modo lineare con l’aumentare della
concentrazione [S]: all’aumentare della concentrazione di substrato si raggiunge però una situazione
di plateau attorno a un valore che non viene mai raggiunto e che viene definito velocità massima di
reazione Vmax .
La spiegazione del plateau enzimatico risiede nel complesso ES e nel fatto che questo passaggio sia
necessario alla reazione e non possa essere saltato. La semplice interconversione S
P è allora in
realtà formata da due passaggi, di cui il primo è relativamente veloce e reversibile:
k1
E + S
ES
k−1

il secondo passaggio è invece la rottura del complesso ES a dare enzima libero e prodotto di reazione:
k2
ES
E + P
k−2

La seconda reazione è più lenta ed è dunque quella limitante: la velocità totale sarà proporzionale
alla concentrazione delle specie reagenti al secondo step, dunque a [ES]. Si può affermare che in
qualsiasi istante di una reazione catalizzata l’enzima è presente in due forme: quella libera E e quella
combinata ES. A basse concentrazioni di substrato quasi tutto l’enzima sarà libero, ma aumentandole si
raggiungerà la situazione di plateau poichè ad un certo punto tutto l’enzima sarà combinato a formare
il complesso ES. Quando si raggiunge la saturazione dell’enzima si ha la situazione di stato stazionario
in cui la concentrazione di ES rimane costante grazie al fatto che si forma tanto complesso quanto ne
viene degradato.

53
7.1.1 Equazione di Michaelis-Menten
La curva espressa dalla relazione tra [S] e V0 trova la sua espressione algebrica nell’equazione di
Michaelis-Menten. Il punto di partenza per ricavarla è l’equazione che descrive lo stato delle condizioni
sperimentali:
k1 k
E + S
ES →2 E + P
k−1

Nell’equazione è già imposta la prima condizione: il passaggio P → S viene ignorato nell’ipotesi di

Michaelis-Menten in quanto viene misurata la sola fase iniziale della reazione. Secondo il ragionamento
fatto lo step limitante di questa reazione è dato dalla rottura del complesso ES, che procede secondo il
coefficiente k2 dunque è possibile scrivere

V0 = k2 [ES]
Essendo ES un parametro difficilmente misurabile direttamente viene ora introdotto il concetto di
Etot , cioè di enzima totale presente nel sistema. La frazione libera di enzima può dunque essere scritta
come [Etot ] − [ES]. Le velocità di formazione e di demolizione di ES sono determinate dai vari coefficienti
di velocità, in particolare:
Formazione di ES: k1 [E][S] = k1 ([Etot ] − [ES])[S]
Breakdown di ES: k−1 [ES] + k2 [ES]
La reazione raggiunge presto lo stato stazionario, dunque formazione e breakdown di ES devono
essere equivalenti e le loro formulazioni matematiche possono essere eguagliate:

k1 ([Etot ] − [ES])[S] = k−1 [ES] + k2 [ES]

Alcune semplificazioni matematiche:
k1 [Etot ][S] − k1 [ES][S] = (k−1 + k2 )[ES]
k1 [Etot ][S] = (k1 [S] + k−1 + k2 )[ES]
[ES] = k1k[S]+k
1 [Etot ][S]
−1 +k2

[Etot ][S]
[ES] = k−1 +k2
[S] + k1
La frazione al denominatore è un insieme di costanti e dunque può essere sostituita da un’unica
costante che prende il nome di costante Michaelis Km , l’equazione diventa dunque

[Etot ][S]
[ES] =
[S] + Km
Ottenuta espressione della concentrazione di ES è possibile sostituirla all’equazione per ottenere la
velocità:

[Etot ][S]
V0 = k2 [ES] = k2
Km + [S]
La velocità massima di questa reazione viene raggiunta quando tutto l’enzima è legato al suo
substrato, cioè quando [Etot ] = [ES]. Vmax si può allora definire come k2 [Etot ] e riformulare l’equazione:

Vmax [S]
V0 =
Km + [S]
è questa l’equazione di Michaelis-Menten, cioè l’equazione di velocità per una reazione catalizzata
ad un unico substrato.
Una relazione importante derivata dall’equazione di Michaelis-Menten si ottiene quando V0 è pari a
metà di Vmax :

Vmax Vmax [S] 1 [S]

V0 = = ⇒ = ⇒ Km = [S]
2 Km + [S] 2 Km + [S]
cioè il significato della costante di Michaelis è la concentrazione del substrato necessaria ad ottenere
una velocità di reazione pari a metà della massima teoricamente possibile.

54
7.1.2 Inibizione enzimatica
Gli inibitori enzimatici sono molecole che interferiscono con la catalisi, rallentandola o interrompendola
totalmente. Un esempio di inibitore è l’acetilsalicilato (aspirina), che interrompe il primo passaggio della
sintesi delle prostaglandine che tra l’altro mediano il dolore. Esistono due grandi categorie di inibitori
enzimatici: gli inibitori reversibili e quelli irreversibili.

Inibizione reversibile Un comune tipo di inibizione reversibile è quella competitiva. Un inibitore

competitivo è in competizione con il substrato per il sito attivo dell’enzima: quando riesce ad occuparlo
per primo blocca la catalisi. Spesso gli inibitori competitivi sono strutturalmente simili al substrato ma
non conducono ad alcun tipo di catalisi mancando dei necessari gruppi chimici. L’inibizione competi-
tiva può essere affrontata con la cinetica dello stato stazionario; in presenza di un inibitore l’equazione
di Michaelis-Menten diventa:

Vmax [S]
V0 =
αKm + [S]
Si ha dunque una variazione alla sola costante di Michaelis, così definita:
[I] [E][I]
α=1+ KI KI = [EI]

L’inibitore in questo tipo di processo si lega in modo reversibile all’enzima, pertanto la competizione
può essere portata a favore del substrato semplicemente aumentando la sua concentrazione: quando
[S]  [I] la probabilità per l’inibitore di incontrare l’enzima è minima e la reazione torna alla Vmax
normale.
Esistono almeno altre due tipologie di inibizione reversibile: l’inibizione non competitiva e l’inibizione
mista. Un inibitore non competitivo si lega a un sito diverso da quello attivo per il substrato e, a
differenza dell’inibitore competitivo, si lega solamente al complesso ES. In presenza di questo tipo di
inibizione l’equazione di Michaelis-Menten viene così corretta:

Vmax [S]
V0 =
Km + α0 [S]
dove
0 [I] 0 [ES][I]
α =1+ KI
0 KI = [ESI]

Ad alte concentrazioni di substrato il valore di V0 tende a Vmax

α0
quindi un inibitore non competi-
tivo abbassa il valore di Vmax e anche quello apparente di Km poichè la concentrazione di substrato
necessaria a raggiungere la metà della velocità massima sarà minore.
Un inibitore misto unisce in qualche modo caratteristiche dell’inibizione competitiva e non com-
petitiva in quanto si lega ad un sito diverso dal substrato, ma è capace di farlo sia ad E che ad ES;
l’equazione per questo tipo di inibizione sarà dunque derivata da entrambe le equazioni precedenti:

Vmax [S]
V0 =
αKm + α0 [S]
Un inibitore misto influenza dunque sia il valore di Km che quello di Vmax .

Inibizione irreversibile Gli inibitori irreversibili si legano covalentemente all’enzima o ne distruggono

gruppi funzionali essenziali. Una classe speciale di questi inibitori è quella degli inattivatori suicida, che
sono relaitvamente inattivi fino a quando non incontrano il loro enzima: in questo caso si ha una prima
fase di reazione normale, ma poi l’inattivatore viene convertito in un composto estremamente reattivo
che si combina in modo irreversibile con l’enzima stesso. Gli inattivatori suicida sono importanti dal
punto di vista farmacologico poichè dotati di un’attività estremamente mirata.

55
8 Glicolisi
La glicolisi è l’insieme di passaggi chimici grazie al quale una molecola di glucosio è degradata a due
molecole di piruvato, composto a tre atomi di carbonio. Durante le reazioni parte dell’energia rilasciata
dal glucosio viene conservata sotto forma di ATP e di NADH.

8.1 Visione d’insieme

La glicolisi conta dieci passaggi. I primi cinque vengono definiti fase preparatoria e sono caratterizzati
da spesa energetica da parte della cellula mentre i passaggi successivi sono la fase di payoff e rappre-
sentano un guadagno energetico. Il guadagno netto per ogni glicolisi è di due molecole di ATP per ogni
molecola di glucosio. Il destino del piruvato prodotto al termine della glicolisi è un’ulteriore metabolis-
mo attraverso tre vie principali. Negli organismi anaerobi e nei loro tessuti la glicolisi è solo la prima
parte della completa degradazione del glucosio, che procede poi con il ciclo di Krebs. Una seconda
via è la riduzione del piruvato a lattato attraverso la fermentazione dell’acido lattico che è tipica delle
situazioni di carenza di ossigeno. L’ultima via è quella che conduce ad etanolo ed è la fermentazione
alcolica.
La reazione totale per un ciclo di glicolisi è

Glucosio + 2N AD+ + 2ADP + 2Pi → 2P iruvato + 2N ADH + 2H + + 2AT P + 2H2 O

Questa reazione si può spezzare in due porzioni, una esoergonica e una endoergonica. La porzione
esoergonica è:

Glucosio + 2N AD+ → 2P iruvato + 2N ADH + 2H + ∆G = −146kJ/mol

la fase endoergonica è la formazione di ATP a partire dall’ADP, secondo l’equazione:

2ADP + 2Pi → 2AT P + 2H2 O ∆G = 61kJ/mol

La somma delle variazioni di energia libera di legame per la glicolisi è:

4Geso + ∆Gendo = −146 + 61 = −85kJ/mol

La variazione è ampiamente negativa e questo garantisce che nelle condizioni intracellulari la glicolisi
sia totalmente irreversibile.

8.2 Passaggi della glicolisi

0 - Uptake del glucosio Nei mammiferi l’uptake del glucosio dal sangue è mediato da una famiglia di
trasportatori detta GLUT. I trasportatori per gli epatociti (GLUT1 e GLUT2) e per i neuroni (GLUT3) sono
sempre presenti nelle membrane plasmatiche mentre il trasportatore per la muscolatura scheletrica e
cardiaca e per il tessuto adiposo (GLUT4) è sequestrato in vescicole e viene diretto alla membrana
plasmatica solo in risposta al segnale mediato dall’insulina. Le differenze tra i vari trasportatori sono
legate soprattutto alla velocità con cui questi si saturano: il trasportatore per il tessuto nervoso ad
esempio non è mai saturo e quindi continua a garantire un apporto costante di glucosio al cervello,
mentre il trasportatore per gli epatociti è in grado di rispondere in modi diversi a seconda delle quantità
intra ed extracellulari di glucosio.

1 - Fosforilazione del glucosio Il primo step è l’attivazione del glu-

cosio tramite la fosforilazione a livello del carbonio 6 con produzione di
glucosio 6-fosfato: la funzione principale è quella di catturare il gluco-
sio, infatti il prodotto di questa reazione non può essere ritrasportato
al di fuori della cellula dai vari GLUT, che sono specifici per il glucosio
semplice. La reazione è catalizzata dall’enzima esochinasi che fa parte
della famiglia delle chinasi cioè degli enzimi catalizzanti il trasferimen-
to di un gruppo fosfato da ATP ad un accettore nucleofilo. L’accettore
dell’esochinasi è il D-glucosio, anche se catalizza con minore affinità la stessa reazione su D-fruttosio e

56
D-mannosio. Durante questo primo step si ha la richiesta di una molecola di ATP per fornire il gruppo
fosfato, oltre che della presenza dello ione M g 2+ che scherma le cariche negative dei fosforili dell’ATP
in modo da rendere il fosforo terminale più facilmente attaccabile dall’-OH del glucosio. L’esochinasi è
presente praticamente in ogni organismo e nell’uomo è presente in quattro forme diverse dette isozimi
che differiscono in proprietà cinetiche, in particolare l’esochinasi IV è esclusiva degli epatociti.

2 - Conversione da glucosio a fruttosio L’enzima fosfoesosoiso-

merasi catalizza il secondo reversibile passaggio della glicolisi, una
conversione dal glucosio 6-fosfato aldoso a fruttosio 6-fosfato chetoso.
Questo passaggio è critico per l’intera via del glucosio in quanto
il riarrangiamento di C-1 e C-2 è necessario ai passi successivi. La
reazione, come la precedente, richiede ione M g 2+ nell’ambiente e pro-
cede in entrambi i sensi dato che la variazione di energia libera è di soli
1.7kJ/mol. Il meccanismo di reazione è piuttosto complesso e richiede
che l’anello del glucosio venga aperto e legato all’enzima, venga formato un enediolo intermedio che
viene poi richiuso ad anello nella formazione del fruttosio.

3 - Fosforilazione del fruttosio 6-fosfato Nella seconda delle due

reazioni primer della glicolisi, l’enzima fosfofruttochinasi-1, o PFK-1,
catalizza il trasferimento di un gruppo fosfato dall’ATP al fruttosio 6-
fosfato, dando come prodotto il fruttosio 1-6-bisfosfato.
La nomenclatura dell’enzima è dovuta all’esistenza di una
fosfofruttochinasi-2 che catalizza la reazione che porta alla formazione
del fruttosio 2,6-bisfosfato seguendo una via separata. Questo pas-
saggio è un gateway della glicolisi: se il glucosio 6-fosfato e il fruttosio
6-fosfato potevano prendere vie diverse, il fruttosio 1,6-bisfosfato è il primo intermedio ad essere spec-
ificatamente destinato alla glicolisi. L’attività di PFK-1 è strettamente controllata e aumentata quando
la cellula è in carenza di ATP o quando i prodotti del suo metabolismo, in particolare AMP vengono
accumulati; in molti organismi il fruttosio 2,6-bisfosfato è un potente attivatore allosterico di PFK-1,
insieme al ribuloso 5-fosfato che è intermedio della via dei pentosi. L’inibizione dell’enzima avviene
quando le scorte di ATP sono abbondanti.

4 - Rottura dell’anello del fruttosio 1,6-bisfosfato L’enzima

fruttosio 1,6-bisfosfato aldolasi, o semplicemente aldolasi, catal-
izza una reversibile condensazione aldolica. L’anello del fruttosio
1,6-bisfosfato viene spezzato fornendo due triosi fosfati diversi:
gliceraldeide 3-fosfato, un aldoso, e diidrossiaceton fosfato, un
chetoso.
La reazione promossa dall’aldolasi è spinta dalla variazione
di energia libera di legame verso la rottura, ma alle basse concentrazioni dei reagenti normalmente
presenti in una cellula la reazione non è irreversibile come si potrebbe pensare.
Il meccanismo di rottura dell’anello prevede negli animali e nelle piante questi passaggi, da notare
la formazione di una base di Schiff al terzo step:

57
5 - Interconversione dei triosi Solo uno dei due prodotti dello step
4, la gliceraldeide 3-fosfato, può essere diretto ai passi successivi del-
la glicolisi; il secondo prodotto, il diidrossiaceton fosfato, viene quindi
recuperato mediante una reazione di interconversione che lo trasfor-
ma in una seconda molecola di gliceraldeide. La reazione, rapida e
reversibile, è catalizzata dal quinto enzima della glicolisi, chiamato
trioso fosfato isomerasi.
Il meccanismo di reazione è simile a quello promosso dalla fosfoesosoisomerasi dello step 2. Questo
passaggio completa la fase di preparazione della glicolisi: la molecola di glucosio è stata dunque fino a
qui fosforilata in C-1 e C-6 e poi spezzata per ottenere due molecole di gliceraldeide 3-fosfato.

6 - Ossidazione della gliceraldeide Nel primo step del-

la fase di payoff della glicolisi la molecola di gliceraldei-
de 3-fosfato viene ossidata a produrre 1,3-bisfosfoglicerato.
La reazione è catalizzata dall’enzima gliceraldeide 3-fosfato
deidrogenasi e richiede la presenza di N AD+ in cambio di
produzione di N ADH + H + . Questa è la prima delle due
reazioni della glicolisi che conservano energia e portano alla
formazione di ATP. Il gruppo aldeidico della gliceraldeide è ossidato a un’anidride di acido carbossilico
e acido fosforico definita acil fosfato che possiede una grande energia libera standard di idrolisi.
La quantità di N AD+ presente in una cellula è inferiore a 10−5 M , di gran lunga inferiore a quella di
glucosio metabolizzato in pochi minuti: la glicolisi deve prevedere dunque un meccanismo di riciclo del
N ADH formato pena l’arresto dopo pochi cicli.

7 - Trasferimento del fosfato da bisfosfoglicer-

ato a ADP L’enzima fosfoglicerato chinasi catal-
izza il trasferimento del gruppo fosfato dal car-
bossile dell’1,3-bisfosfoglicerato all’ADP e dunque
la formazione di ATP e 3-fosfoglicerato.
Gli step 6 e 7 della glicolisi sono un processo
accoppiato in cui il 1,3-bisfosfoglicerato è inter-
medio comune: viene formato nella prima endo-
ergonica reazione e viene demolito nella seconda fortemente esoergonica reazione; la somma dei due
passaggi è:

Gliceraldeide3 − f osf ato + ADP + Pi + N AD+

3 − F osf oglicerato + AT P + N ADH + H +
0
∆G ◦ = −12, 2kJ/mol

L’accoppiamento delle due reazioni conduce dunque a una reazione nel complesso esoergonica.

58
8 - Conversione del fosfoglicerato L’enzima fosfoglicerato mutasi
catalizza lo spostamento reversibile del gruppo fosfato da C-2 a C-
3 in una reazione M g 2+ dipendente. La reazione prevede due pas-
saggi. Nel primo passaggio un gruppo fosfato originariamente pos-
to sull’enzima viene trasferito a C-2 del 3-fosfoglicerato ottenendo il
2,3-bisfosfoglicerato (⇒emoglobina) mentre nel secondo passaggio il
gruppo fosfato in C-3 viene ritrasferito all’enzima rigenerandone la forma fosforilata. Per garantire un
continuo funzionamento del ciclo il 2,3-bisfosfoglicerato è continuamente rigenerato dal ciclo stesso.

9 - Disidratazione del fosfoglicerato Nella seconda reazione glico-

litica che porta alla formazione di un composto ad alta energia l’en-
zima enolasi catalizza la rimozione di una molecola d’acqua dal 2-
fosfoglicerato a dare fosfoenolpiruvato o PEP; come molte delle reazioni
di questo ciclo anche questo step richiede la presenza di ione M g 2+ . In
questa reazione si ha il passaggio da un composto con un basso poten-
ziale di trasferimento del fosfato ad uno con un potenziale molto più alto che può dunque spostare il
gruppo molto più facilmente su una molecola di ADP nell’ultimo passaggio della glicolisi.

10 - Trasferimento del fosfato da PEP ad ADP L’ulti-

mo passaggio della glicolisi è catalizzato dall’enzima piru-
vato chinasi, che richiede la presenza di ione K + e di un
secondo ione tra M g 2+ e M n2+ . In questa fosforilazione a
livello del substrato il prodotto piruvato appare prima nella
sua forma enolica che per via non enzimatica rapidamente
tautomerizza nella sua forma chetonica che a pH7 è quella dominante.

8.3 Guadagno netto e riassunto

Riassumendo tutti e dieci i passaggi è possibile costruire l’equazione netta della glicolisi ponendo a
sinistra il glucosio e i vari input di ATP, N AD+ , ADP e Pi e a destra gli output:

Glucosio + 2AT P + 2N AD+ + 4ADP + 2Pi → 2(P iruvato + N ADH + H + + AT P + H2 O)

Eliminando i termini comuni da entrambi i lati si ottiene l’equazione finale per la glicolisi aerobia:

Glucosio + 2N AD+ + 2ADP + 2Pi → 2P iruvato + 2N ADH + 2H + + 2AT P + 2H2 O

Le due molecole di NADH formate nella glicolisi nel citosol vengono riossidate a N AD+ nei mitocondri
grazie alla catena respiratoria con destinazione ultima l’ossigeno:

2N ADH + 2H + + O2 → 2N AD+ + 2H2 O

8.3.1 Vie di rifornimento della glicolisi

Sono molti i carboidrati che trovano il loro destino nella glicolisi, spesso entrandovi a ciclo già iniziato:
i primi quattro passaggi della glicolisi sono infatti sede di raccordo con le vie di degradazione dei
carboidrati inseriti nella dieta. I principali zuccheri della dieta che finiscono nel ciclo glicolitico sono il
mannosio, il fruttosio, il galattosio.

D-Fruttosio Il D-fruttosio, presente in molti tipi di frutta e formato dall’idrolisi del saccarosio nell’in-
testino, viene fosforilato dall’esochinasi secondo la reazione

F ruttosio + AT P → F ruttosio6 − f osf ato + ADP

questa è la via principale di ingresso nella glicolisi a livello muscolare e renale. Nel fegato il fruttosio
sfrutta una via diversa dove l’enzima fruttochinasi catalizza la fosforilazione a C-1 anzichè C-6:

59
 F ruttosio + AT P → F ruttosio1 − f osf ato + ADP
il fruttosio 1-fosfato viene poi spezzato in gliceraldeide e diidrossiacetone fosfato dall’enzima fruttosio
1-fosfato aldolasi; i successivi due passaggi creano metaboliti del ciclo della glicolisi:
T riosof osf ato−isomerasi
Diidrossiaceton − f osf ato −→ Gliceraldeide3 − f osf ato

T rioso−chinasi
Gliceraldeide −→ Gliceraldeide3 − f osf ato

D-Mannosio Il D-Mannosio, prodotto dalla digestione di parecchi polisaccaridi, viene fosforilato in C-6
dall’esochinasi e il mannosio 6-fosfato prodotto viene isomerizzato dall’enzima fosfomannoso isomerasi
a dare fruttosio 6-fosfato che entra direttamente nella glicolisi

D-Galattosio Il D-Galattosio è un prodotto dell’idrolisi del lattosio e viene in primis fosforilato in C-1
dall’enzima galattochinasi
Galattochinasi
Galattosio + AT P −→ Galattosio1 − f osf ato + ADP
a questo punto il galattosio 1-fosfato viene convertito nel suo epimero glucosio 1-fosfato da una
serie di reazioni in cui l’uridina difosfato funziona come coenzima carrier di gruppi esosi. Tre sono gli
enzimi che vengono coinvolti nella trasformazione da galattosio a glucosio e un qualsiasi difetto nella
loro funzione porta a galattosemia nell’uomo

8.4 Condizioni anaerobie: fermentazione del piruvato

Quando i tessuti animali si trovano in condizioni di carenza di os-
sigeno l’ossidazione aerobica del piruvato e del NADH non possono
procedere e il N AD+ viene rigenerato dalla riduzione del piruvato a
acido lattico. La riduzione del piruvato è catalizzata dall’enzima lattato
deidrogenasi.
Il lattato formato nei muscoli scheletrici o dagli eritrociti può essere
riciclato: viene trasportato per via ematica al fegato dove viene riconvertito in glucosio.

60
61
9 Gluconeogenesi
La gluconeogenesi risponde all’enorme esigenza di glucosio da parte dell’organismo: il cervello da solo
richiede almeno 120g di glucosio al giorno; tra i pasti e durante digiuni prolungati o esergizi pesanti il
glicogeno viene demolito e l’organismo deve sintetizzare glucosio extra a partire da precursori diversi
dai carboidrati. La gluconeogenesi in sostanza è la conversione del piruvato e di altri composti a tre e
quattro atomi di carbonio a glucosio e avviene nei mammiferi fondamentalmente nel fegato. Importante
è sottolineare che glicolisi e gluconeogenesi non sono vie identiche e opposte anche se condividono
parecchi step: sette dei dieci passaggi della glicolisi sono ripercorsi al contrario nella gluconeogenesi
ma i tre rimanenti sono essenzialmente irreversibili nel vivente. Le tre reazioni irreversibili sono tutte
caratterizzate da una variazione di energia libera molto negativa e devono essere bypassate da un set
di enzimi esclusivi della gluconeogenesi: il risultato è che entrambe le vie, glicolisi e gluconeogenesi,
sono irreversibili nelle cellule.

9.1 Passaggi della gluconeogenesi

Conversione del piruvato a PEP La prima delle reazioni da bypas-
sare corrisponde allo step 10 della glicolisi. La conversione da piruvato
a fosfoenolpiruvato si ottiene con una serie di reazioni che negli eu-
carioti richiede enzimi sia citosolici che mitocondriali e può avvenire
attraverso due vie principali.
Quando il piruvato è il precursore gluconeogenetico principale si
ha il trasporto di questo dal citosol al mitocondrio dove l’enzima piruvato carbossilasi lo converte a
ossaloacetato in presenza del coenzima biotina; la reazione catalizzata è:

P iruvato + HCO3− + AT P → Ossaloacetato + ADP + Pi

La piruvato carbossilasi è il primo degli enzimi regolatori della via gluconeogenetica e richiede acetil-
CoA come affettore positivo. Una volta generato l’ossaloacetato si presenta il problema di trasportarlo
all’esterno del mitocondrio, che per questa molecola non ha trasportatori. Il problema del trasporto
viene risolto dall’enzima malato deidrogenasi, che riduce l’ossaloacetato a spese del NADH:

Ossaloacetato + N ADH + H +
L − M alato + N AD+
Il malato abbandona il mitocondrio grazie a un trasportatore dedicato e una volta nel citosol viene
riossidato ad ossaloacetato con produzione citosolica di NADH:

M alato + N AD+ → Ossaloacetato + N ADH + H +

L’ossaloacetato ora contenuto nel citosol è converito a PEP dall’enzima fosfoenolpiruvato carbossichi-
nasi, che richiede GTP come donatore del gruppo fosfato:

Ossaloacetato + GT P
P EP + CO2 + GDP
In totale dunque è necessario consumare due legami ad alta energia per fosforilare il piruvato a
fosfoenolpiruvato.
Quando è il lattato ad essere il precursore gluconeogenetico la via gluconeogenetica è diversa: la
conversione di questo a piruvato nel citosol degli epatociti produce già NADH e dunque l’esportazione
di equivalenti riducenti come il malato dal mitocondrio è inutile. La via dunque procede con una con-
versione a ossaloacetato del piruvato da parte della piruvato carbossilasi come negli step precedenti, ma
questo ossaloacetato viene convertito poi direttamente a PEP da un isozima mitocondriale e trasportato
al di fuori del mitocondrio per continuare la gluconeogenesi.

62
Conversione del fruttosio 1,6-bisfosfato a fruttosio 6-fosfato Il bypass del terzo step della glicolisi è
realizzato semplicemente catalizzando la reazione con un diverso enzima, in questo caso la fruttosio 1,6-
bisfosfatasi M g 2+ dipendente: questo enzima promuove l’idrolisi del fosfato in C-1 e quindi la reazione

F ruttosio1, 6 − bisf osf ato + H2 O → F ruttosio6 − f osf ato + Pi

L’enzima in sigla viene indicato come FBPasi-1 per distinguerlo dalla FBPasi-2 che ha ruolo regola-
torio.

Conversione del glucosio 6-fosfato a glucosio L’inversione della reazione promossa dall’esochinasi
richiederebbe il trasferimento di un fosfato dal glucosio ad ADP formando ATP, una reazione ener-
gicamente sfavorita; l’enzima glucosio 6-fosfatasi bypassa questo problema promuovendo la semplice
idrolisi di un estere fosfato:

Glucosio6 − f osf ato + H2 O → Glucosio + Pi

Questo enzima è presente nelle sole cellule legate alla gluconeogenesi e assente nelle altre poichè se
fosse ubiquo renderebbe poco produttiva la glicolisi.

63
9.2 Riassunto ed equazione netta
L’equazione netta della gluconeogenesi è

2P iruvato + 4AT P + 2GT P + 2N ADH + 2H + + 4H2 O → Glucosio + 4ADP + 2GDP + 6Pi + 2N AD+

per ogni molecola di glucosio neosintetizzata si ha dunque perdita di sei legami ad alta energia: la
gluconeogenesi è un processo costoso ma necessario.

64
10 Via dei pentosi fosfati
La glicolisi in buona parte dei tessuti animali non è l’unica via per il glucosio 6-fosfato: questa molecola
segue anche altre vie per essere trasformata in prodotti specializzati per la cellula. Tra le vie alternative
alla glicolisi è di particolare importanza la via dei pentosi fosfati in cui N ADP + è l’accettore di elettroni e
si ottiene NADPH; alcune cellule usano i prodotti della via per produrre RNA, DNA, ATP, NADH, F ADH2
e coenzima A, altre semplicemente hanno bisogno di NADPH per evitare il danneggiamento dai radicali
liberi dell’ossigeno (in particolare la carenza di NADPH negli eritrociti è a rischio medico).
La via si divide in due porzioni, una fase ossidativa che produce pentosi fosfati e NADPH e una fase
nonossidativa che ricicla i pentosi fosfati a glucosio 6-fosfato. La prima reazione della fase ossidativa
è l’ossidazione del glucosio 6-fosfato ad opera della glucosio 6-fosfato deidrogenasi a formare un estere
intramolecolare detto 6 − f osf oglucono − δ − lattone : N ADP + è l’accettore di elettroni e l’equilibrio è
fortemente spostato verso la formazione di NADPH. Il lattone viene prontamente idrolizzato da una
lattonasi specifica a acido 6-fosfogluconato che subisce poi ossidazione e decarbossilazione dalla 6-
fosfogluconato deidrogenasi a dare ribuloso 5-fosfato, un chetopentoso, generando un secondo NAPDH.
L’enzima fosfopentoso isomerasi converte il ribuloso 5-fosfato nel suo isomero aldoso riboso 5-fosfato e
in alcuni tessuti questo rappresenta la fine della via, con un’equazione netta:

G6P + 2N ADP + + H2 O → Ribosio5 − f osf ato + CO2 + 2N ADP H + 2H +

Il risultato della fase ossidativa è dunque la produzione di NADPH, riducente nelle reazioni di
biosintesi, e ribosio 5-fosfato, un precursore nella sintesi dei nucleotidi.

Nelle cellule che primariamente necessitano di NADPH e il cui bisogno di ribosio 5-fosfato è minimo
la fase nonossidativa della via risintetizza glucosio 6-fosfato a partire dal ribuloso 5-fosfato. Nella prima
reazione della fase non ossidativa il ribuloso viene epimerizzato a xiluloso 5-fosfato grazie all’azione
dell’enzima ribosio 5-fosfato epimerasi. A partire da questi due composti una serie di riarrangiamenti
dello scheletro carbonioso produce la conversione di sei zuccheri a cinque atomi di carbonio in cinque
zuccheri a sei atomi di carbonio: tutte queste reazioni sono sotto controllo di due tipologie di enzimi,
definiti transchetolasi e transaldolasi.

65
 L’enzima transchetolasi necessita il cofattore tiamina pirofosfato (TPP) per funzionare.
La discriminazione per una molecola di glucosio all’entrare nei vari cicli dipende dalle necessità
cellulari del momento e dalle concentrazioni di N ADP + nel citosol: quando una cellula sta rapidamente
convertendo NADPH in N ADP + la concentrazione di quest’ultimo aumenta stimolando allostericamente
il primo enzima della via dei pentosi aumentando dunque il flusso lungo questa strada.

66
11 Controllo di glicolisi e gluconeogenesi
Nei mammiferi la gluconeogenesi avviene principalmente nel fegato. Ad ognuno dei tre punti in cui la
gluconeogenesi e la glicolisi divergono, la simultanea apertura di entrambe le vie sarebbe uno spre-
co di ATP senza produzione di lavoro chimico o biologico, ad esempio le due reazioni catalizzate da
fosfofruttochinasi-1 e fruttosio bisfosfatasi potrebbero riassumersi in:
P F K−1
AT P + F ruttosio6 − f osf ato → ADP + F ruttosio1, 6 − bisf osf ato

F BP asi−1
F ruttosio1, 6 − bisf osf ato + H2 O → F ruttosio6 − f osf ato + Pi

AT P + H2 O → ADP + Pi + Calore
questo esempio è quel che viene definito un ciclo futile che è dannoso per la cellula.

Controllo delle esochinasi L’esochinasi, che catalizza l’ingresso del glucosio nel ciclo glicolitico, è
un enzima regolatore. L’uomo possiede quattro isozimi codificati da quattro geni diversi, ciascuno con
ruoli diversi. L’esochinasi II, predominante nella muscolatura, ha un’altissima affinità per il glucosio
ed è satura al 50% a una concentrazione di glucosio pari a 0.1mM (quella del sangue è 4 − 5mM ) e
dunque opera quasi sempre alla velocità massima possibile. L’inibizione di esochinasi I e II avviene
allostericamente ad opera del loro prodotto, il glucosio 6-fosfato: quando quest’ultimo si accumula a
causa di un blocco nella glicolisi l’uptake del glucosio viene dunque rallentato enormemente. L’isozima
del fegato, l’esochinasi IV, differisce dai primi tre per almeno tre motivi:
• ha una saturazione del 50% ad una concentrazione di glucosio più alta di quella normale, cioè
circa 10mM : questo significa che alte concentrazioni di glucosio nel sangue vengono bilanciate
da un maggiore uptake a livello degli epatociti. Quando il livello di glucosio nel sangue è basso
l’azione dell’esochinasi IV è di far si che il glucosio possa uscire dall’epatocita prima di essere
intrappolato dalla fosforilazione.

• non si ha inibizione da parte del glucosio 6-fosfato, dunque l’uptake continua nel fegato anche
quando tutti gli altri isozimi sono stati inibiti.
• si ha il controllo reversibile da parte di una proteina specifica del fegato con un legame che è molto
più stabile in presenza del fruttosio 6-fosfato

Un secondo controllo su esochinasi IV è posto a livello della sintesi proteica. Circostanze che richiedono
una maggior produzione di energia da parte della cellula causano un aumento della trascrizione del
gene di esochinasi IV.

Controllo di PFK-1 e FBPasi-1 Lo step che des-

tina un metabolita alla glicolisi è la reazione catal-
izzata da fosfofruttochinasi-1 (step 3 della glicol-
isi) e pertanto questo è un altro punto di stretto
controllo: l’enzima possiede infatti parecchi siti
regolatori dove si legano inibitori e attivatori al-
losterici. ATP non è solamente un substrato per
PFK-1 ma è anche il prodotto finale della glicol-
isi: quando questa molecola viene prodotta più
velocemente di quanto non venga demolita es-
sa va ad inibire l’enzima legandosi ad un sito
allosterico e abbassando l’affinità di questo per
il fruttosio 6-fosfato; ADP ed AMP, soprattutto
il secondo, segnalano invece un aumentato con-
sumo di ATP e dunque svolgono l’azione oppos-
ta: rimuovono l’inibizione posta dall’ATP a PFK-
1. Un altra molecola regolatrice dell’attività della

67
fosfofrutto chinasi è il citrato, un intermedio del
ciclo di Krebs , la cui alta concentrazione potenzia
l’effetto inibitore di ATP riducendo ulteriormente
il flusso di glucosio alla glicolisi.
Il passo corrispondente all’azione di PFK-1 nel-
la gluconeogenesi è la reazione promossa dalla
FBPasi-1 che subisce regolazione opposta: ADP
ed AMP la inibiscono fortemente poichè la sintesi di glucosio richiede ATP e non è conveniente quando
quest’ultimo è scarso.
La regolazione ormonale di glicolisi e gluconeogenesi, quindi quella legata ad insulina e glucagone, è
mediata dal fruttosio 2,6-bisfosfato, un regolatore allosterico di entrambi gli enzimi. Quando il fruttosio
2,6-bisfosfato si lega a PFK-1 aumenta la sua affinità al fruttosio 6-fosfato: la sua azione è talmente po-
tente che in condizioni fisiologiche di fatto PFK-1 è inattivo in assenza di questo regolatore. L’effetto del
fruttosio 2,6-bisfosfato su FBPasi è ovviamente opposto e rallenta la gluconeogenesi. Le concentrazioni
intracellulari di fruttosio 2,6-bisfosfato sono regolate dalla formazione e dal breakdown dello stesso,
reazioni catalizzate da fosfofruttochinasi-2 (PFK-2) e fruttosio 2,6-bisfosfatasi (FBPasi-2): il bilancio
delle azioni di questi due enzimi nel fegato è regolato da insulina e glucagone; il glucagone abbassa il
livello di fruttosio 2,6-bisfosfato inibendo quindi la glicolisi e promuovendo la gluconeogenesi, mentre
l’insulina ha effetti opposti. Un secondo controllo sui livelli di fruttosio 2,6-bisfosfato è portato avanti
dallo xiluloso 5-fosfato; questo composto, intermedio della via dei pentosi fosfati, media l’aumento della
glicolisi a seguito di un pasto abbondante in carboidrati. La sua azione è l’attivazione della fosfopro-
teina fosfatasi 2A (PP2A) che defosforila l’enzima bifunzionale PFK-2/FBPasi-2 inibendo la FBPasi e
aumentando dunque la concentrazione di fruttosio 2,6-bisfosfato stimolando la glicolisi e rallentando
la gluconeogenesi.

68
12 Metabolismo del glicogeno
In tutti gli organismi il glucosio in eccesso viene conservato in forma polimerica: amido nelle piante e
glicogeno in vertebrati e molti microorganismi. Nei vertebrati il glicogeno si trova principalmente nel
fegato e nel muscolo scheletrico, in percentuali rispettivamente intorno al 10% e 1 − 2%. La funzione
dell’accumulo polimerico è osmotica: se la stessa quantità di glucosio fosse libera si avrebbe una
concentrazione 0.4M mentre così se ne ottiene una intorno a 0.01µM .
L’unità di base del glicogeno consiste di circa 55000 residui di glucosio con almeno 2000 estremità
non riducenti. La presenza di questo polimero garantisce una fonte veloce di energia per il metabolismo
nel muscolo e rappresenta un deposito di riserva nel fegato nei confronti degli altri tessuti.

12.1 Glicogenolisi
Nel fegato e nella muscolatura le unità di glucosio dalle ramificazioniesterne del glicogeno entrano nella
via glicolitica attraverso l’azione di tre enzimi:
• glicogeno fosforilasi
• enzima deramificante del glicogeno

• fosfoglucomutasi
Il primo enzima catalizza la reazione in cui un legame glicosidico tra due residui di glucosio ad
un’estremità non riducente viene attaccato da un fosfato inorganico rimuovendo un residuo termi-
nale sotto forma di α − D − glucosio1 − f osf ato. Per questa reazione il piridossal fosfato è un cofattore
essenziale anche se questo è un ruolo inusuale in quanto di solito è un cofattore nel metabolismo degli
aminoacidi. L’azione della glicogeno fosforilasi continua fino a che non raggiunge un punto quattro
residui a monte di un legame α1−6, cioè ad una ramificazione, dove la sua attività si ferma. Un’ulteriore
degradazione da parte della fosforilasi può avvenire solo a seguito dell’azione dell’enzima deramificante
che catalizza due reazioni successive che trasferiscono ramificazioni intere: i tre residui lasciati dalla
fosforilasi vengono staccati e portati all’estremità non riducente di una seconda ramificazione e l’attività
del primo enzima è libera di continuare.
Il glucosio 1-fosfato viene convertito a glucosio 6-fosfato dall’azione della fosfoglucomutasi, che
catalizza la reazione reversibile

Glucosio1 − f osf ato

Glucosio6 − f osf ato
e si ha l’ingresso nella glicolisi e dunque rifornimento energetico al tessuto.

12.2 Glicogenosintesi
Nella polimerizzazione degli esosi spesso vengono coinvolti gliconucleotidi , cioè zuccheri in cui il
carbonio anomerico è attivato dall’attacco di un nucleotide attraverso un legame esterico.
La sintesi del glicogeno avviene primariamente in fegato e muscoli e virtualmente in ogni tessuto. Il
punto di partenza è il glucosio 6-fosfato che deriva dal glucosio libero dall’azione delle varie esochinasi;
il primo passo per la sintesi è la conversione del glucosio 6-fosfato a glucosio 1-fosfato grazie all’azione
della fosfoglucomutasi. Il prodotto del primo passaggio viene convertito a UDP-glucosio dall’azione
dell’enzima UDP-glucosio pirofosforilasi e questo è un passaggio chiave:

Glucosio1 − f osf ato + U DP → U DP − Glucosio + P Pi

L’UDP-glucosio è donatore immediato del suo residuo di glucosio nella reazione catalizzata dall’en-
zima glicogeno sintetasi, che promuove il trasferimenti di un residuo ad un’estremità non riducente
di una molecola di glicogeno. Caratteristica importante di questo enzima è la sua incapacità di creare
legami di tipo α1 → 6 cioè non è in grado di creare ramificazioni nel glicogeno: queste vengono formate
dall’enzima ramificante che catalizza ilt rasferimento di sei o sette residui da un’estremità non ridu-
cente a una posizione più interna. Il senso biologico delle ramificazioni è di creare una molecola più
solubile ma soprattutto di aumentare i punti in cui questa può essere attaccata per la glicogenolisi.

69
 L’enzima glicogeno sintetasi non può iniziare una catena di glicogeno dal nulla ma richiede un
primer dotato di almeno otto residui di glucosio. La proteina glicogenina è sia il primer su cui vengono
assemblate le nuove catene sia l’enzima che ne catalizza la formazione. Il primo step è il trasferimento
di un residuo dall’UDP-glucosio alla glicogenina in una reazione catalizzata dalla proteina stessa: la
catena nascente è dunque allungata da altri sette residui fino a diventare sufficientemente lunga per
la glicogeno sintetasi.

12.3 Regolazione del metabolismo

L’enzima glicogeno fosforilasi nel muscolo esiste in due forme convertibili tra loro: la forma “a” attiva e
la forma “b” meno attiva. L’enzima fosforilasi b chinasi è responsabile dell’attivazione della fosforilasi
grazie al trasferimento di un gruppo fosfato; questo enzima è a sua volta attivato dall’epinefrina o
dal glucagone. Quando il muscolo torna a riposo, un secondo enzima chiamato fosforilasi a fosfatasi
rimuove il gruppo fosfato convertendo la forma “a” in forma “b”.

Analogamente anche la glicogeno fosforilasi esiste in due forme e , in linea con la sua azione opposta,
sarà la forma non fosforilata ad essere attiva. Questo enzima è notevole per la sua capacità di essere
fosforilato da almeno undici protein chinasi diverse, tra cui la più importante è la glicogeno sintetasi
chinasi 3 (GSK3). Questo enzima regolatore non può fosforilare la sintasi se prima questa non è stata
fosforilata dalla casein chinasi II in un processo definito priming. Nel fegato la conversione tra le forme
“a” e “b” è promossa da PP1 (fosfoprotein fosfatasi 1) che rimuove i gruppi fosfati collocati da GSK3.

70
13 Ciclo di Krebs
13.1 Piruvato e PDH
Il ciclo di Krebs, o ciclo dell’acido citrico, è un hub nel metabolismo con vie degradative in ingresso e
vie anaboliche in uscita ed è dunque strettamente regolato in coordinamento con le altre vie.
Gli scheletri carboniosi di zuccheri e acidi grassi prima di entrare nel ciclo devono essere degradati
a gruppo acetile dell’acetil-CoA, cioè la forma in cui il ciclo accetta la maggior parte dei suoi input. Il
piruvato derivante dalla glicolisi è ossidato ad acetil-CoA e CO2 dal complesso piruvato deidrogenasi
(PDH), un agglomerato di copie di tre enzimi posto nel mitocondrio delle cellule degli eucarioti e nel
citosol di quelle dei batteri. Cinque cofattori, di cui quattro di derivazione vitaminica, partecipano al
meccanismo di reazione.
La reazione totale catalizzata dal complesso della piruvato deidrogenasi è una decarbossilazione os-
sidativa in cui il gruppo carbonile è rimosso dal piruvato come CO2 e i due atomi di carbonio rimanenti
vengono trasformati nel gruppo acetile per l’acetil-CoA. Il NADH formato in questa reazione fornisce
uno ione idruro alla catena respiratoria, che trasporta dueelettroni all’ossigeno.

P iruvato + CoA − SH + N AD+ + T P P + Lipoato + F AD → Acetil − CoA + N ADH + CO2

Questa reazione richiede l’azione sequenziale di tre enzimi diversi e
di cinque coenzimi o gruppi prostetici: tiamina pirofosfato (TPP), FAD,
coenzima A, NAD e lipoato. Sono a questo punto quattro le vitamine
chiamate in causa e derivanti dalla sola dieta: tiamina per il TPP,
riboflavina per il FAD, niacina per il NAD e pantotenato per il CoA. Il
CoA possiede un gruppo tiolico reattivo che ha ruolo critico nella sua
azione di carrier acilico: è questa infatti la sede del legame covalente
dei gruppi acilici a formare un tioestere. I tioesteri hanno un grande Figura 13: Lipoato
potenziale per il trasferimento del gruppo acilico e lo possono donare
facilmente a parecchie tipologie di molecole. Il quinto cofattore, il lipoato, possiede due gruppi tiolici
che possono ossidarsi reversibilmente a ponte disolfuro: per questa capacità può essere sfruttato sia
come carrier di elettroni che di carrier acilico.
Il complesso piruvato deidrogenasi contiene tre diversi enzimi:
• E1 - Piruvato deidrogenasi

• E2 - Diidrolipoil transacetilasi
• E3 - Diidrolipoil deidrogenasi
E2 è la porzione più complessa in quanto punto di inserzione del gruppo prostetico lipoato ed è dotata
di tre distinti domini funzionali: il dominio lipoile, il dominio aciltrasferasi e il dominio legante E1 ed
E3. Gli altri due enzimi legano TPP (E1) e FAD (E3) e fanno parte del complesso anche due proteine
regolatrici, una chinasi e una fosfatasi.
Gli step con cui procede la reazione sono essenzialmente cinque:
1. Distacco della CO2 e attacco del residuo del piruvato alla TPP. Questo primo passaggio è quello
limitante.

2. Il gruppo idrossietile viene ossidato ad acido carbossilico e i due elettroni rimossi riducono il ponte
disolfuro del lipoato a due tioli.
3. L’acetile prodotto viene prima esterificato ad uno dei gruppi -SH del lipoato e poi transesterificato
al CoA formando l’acetil-CoA.

4. Il FAD si fa carico dei due elettroni del lipoato ossidandolo e riportandolo alla condizione di
partenza.
5. Il N AD+ si fa carico di uno degli idrogeni del F ADH2 mentre il secondo viene liberato sotto forma
di H + .

71
13.2 Reazioni del ciclo di Krebs
Il ciclo in totale conta otto passaggi che negli eucarioti avvengono interamente nei mitocondri; quattro
di questi passaggi sono ossidazioni in cui l’energia è conservata sotto forma di coenzimi ridotti NADH e
F ADH2 . In totale ad ogni giro del ciclo entra un gruppo acetile come acetil-CoA ed escono due molecole
di CO2 .

Step 1 - Formazione del citrato La prima reazione del

ciclo è la condensazione dell’acetil-CoA e dell’ossaloacetato
a formare citrato, sotto catalisi dell’enzima citrato sintetasi.
La reazione passa per l’intermedio citroil-CoA che rapida-
mente idrolizza a CoA libero e citrato con rilascio dal sito
attivo. A seguito del primo step del ciclo il CoA viene ri-
ciclato per partecipare alla carbossilazione ossidativa di una seconda molecola di piruvato grazie al
complesso PDH.

Step 2 - Formazione dell’isocitrato L’enzima acnitasi nel

secondo step del ciclo catalizza la reversibile conversione del
citrato ad isocitrato attraverso la formazione dell’intermedio
cis-aconitato, un acido tricarbossilico. La reazione prevede
prima la rimozione di una molecola d’acqua, con formazione
di un doppio legame, e successivamente l’aggiunta dell’ac-
qua rimossa con formazione dell’isocitrato e quindi scam-
bio di posizione tra gruppo -OH e idrogeno. Nella cellula la
reazione è spinta verso destra perchè l’isocitrato viene rapidamente consumato nel passo successivo
del ciclo e dunque la sua concentrazione per lo stato stazionario risulta sempre abbassata.

Step 3 - Ossidazione dell’isocitrato L’enzima isocitrato deidroge-

nasi catalizza la decarbossilazione o ssidativa dell’isocitrato a formare
α-ketoglutarato. Esistono due diverse forme di questo enzima nelle
cellule, una che richiede N AD+ come accettore di elettroni e una che
per lo stesso scopo richiede N ADP + : è questa l’unica differenza in
due reazioni altrimenti identiche. Probabilmente l’esistenza della for-
ma N ADP + dipendente è legata alla produzione di NADPH, essenziale
nelle vie anaboliche riduttive della cellula. Entrambe le forme dell’en-
zima sono M n2+ dipendenti in quanto questo ione stabilizza gli intermedi che vengono creati (prin-
cipalmente l’ossalosuccinato, che viene a crearsi dopo la rimozione dei due idrogeni ma prima della
rimozione dell’anidride carbonica).

72
Step 4 - Ossidazione dell’alfaketoglutarato In modo analogo allo
step 3, si ha una decarbossilazione ossidativa in cui l’α-ketoglutarato
viene convertito a succinil-CoA da parte del complessoα-ketoglutarato
deidrogenasi. L’accettore di elettroni in questa reazione è N AD+ men-
tre CoA è il carrier del gruppo succinile. L’energia di ossidazione
del reagente è conservata nella formazione del legame tioestere del
succinil-CoA. Questa reazione è virtualmente identica a quella promossa dal complesso della piruvato
deidrogenasi e infatti i due enzimi si somigliano sia strutturalmente che funzionalmente: entrambi i
complessi derivano certamente da un progenitore comune.

Step 5 - Conversione del succinil-CoA In analogia all’acetil-CoA il

succinil-CoA ha un grande potenziale di idrolisi del legame tioestere:
in questo step l’energia liberata dalla rottura del legame è usata per
formare un legame fosfoanidridico su GTP o ATP con la parallela
formazione di succinato. L’enzima che catalizza questa reversibile
reazione è la succinil-CoA sintetasi e durante la reazione viene es-
so stesso fosforilato prima di cedere il gruppo fosfato ad ADP o GDP.
Le cellule animali possiedono due diverse succinil-CoA sintetasi, una
specifica per ADP e una specifica per GDP. Nel caso di formazione di GTP il risultato ultimo è comunque
l’accumulo di energia sotto forma di ATP in quanto l’enzima nucleoside difosfato chinasi catalizza la
reazione

GT P + ADP
AT P + GDP
Questa reazione non comporta variazioninell’energia libera: GTP e ATP sono energeticamente iden-
tici.

Step 6 - Ossidazione del succinato Il succinato formato a partire

dal succinil-CoA viene ossidato a fumarato dalla flavoproteina suc-
cinato deidrogenasi. L’accettore di idrogeno è dunque il FAD enegli
eucarioti è da notare come questa proteina sia saldamente alla mem-
brana interna del mitocondrio. Il malonato, un analogo del succina-
to normalmente non presente nelle cellule, è un forte inibitore com-
petitito dell’enzima e la sua presenza nel mitocondrio è sufficiente a
bloccare il ciclo di Krebs.

Step 7 - Idratazione del fumarato L’idratazione reversibile del fu-

marato a L-malato è catalizzata dalla fumarasi che è un enzima alta-
mente stereospecifico: catalizza l’idratazione del doppio legame trans
del fumarato ma non quella del doppio legame cis del maleato (l’i-
somero cis del fumarato). La stereospecificità è valida anche nel-
la reazione inversa: il D-Malato non è substrato per l’azione della
fumarasi.

Step 8 - Ossidazione del malato Nell’ultimo step del ciclo di Krebs la L-malato deidrogenasi catalizza
l’ossidazione dell’L-malato a ossaloacetato, che viene continuamente rimosso dalla reazione promossa
dalla citrato sintetasi: è questo il motivo per cui l’equilibrio viene continuamente spostato verso la
formazione del prodotto.

13.3 Bilancio energetico e riassunto

Durante un ciclo un gruppo acetile a due atomi di carbonio viene cominato all’ossaloacetato e in seguito
ossidato più volte; l’energia rilasciata da queste ossidazioni è conservata grazie alla riduzione di tre
N AD+ e di un FAD e alla produzione di un ATP o un GTP. Il ciclo è molto complesso se considerato
solo come una via per ossidare l’acetato e questo si giustifica grazie al fatto che molti degli intermedi
prodotti sono coinvolti in altri processi in particolare vie biosintetiche: non si tratta dunque della via più

73
breve, ma di quella più vantaggiosa. Un problemaderivante dalla condivisione di una stessa molecola
in più vie è quello di rimanere senza scorte: questo è risolto nel ciclo di Krebs dalle cosiddette reazioni
anaplerotiche, tese unicamente a ripristinare le scorte. La più importante reazione anaplerotica è
quella promossa dalla piruvato carbossilasi (→cfr. gluconeogenesi) che genera ossaloacetato secondo
l’equazione

P iruvato + HCO3− + AT P
Ossaloacetato + ADP + Pi

13.4 Regolazione del ciclo

La prima regolazione del ciclo si ha a livello di PDH, che è fortemente inibita dal suo prodotto diretto
e dai prodotti del ciclo: ATP, acetil-CoA e NADH; AMP, CoA e N AD+ , che invece vengono accumulati
quando vi è scarsità di acetato, sono tutti attivatori allosterici del complesso della piruvato deidrogenasi.
Una volta iniziato il ciclo di Krebs vero e proprio si hanno regolazioni ai tre step esoergonici; in tutti
i casi l’inibizione è data dai prodotti del ciclo, mentre l’attivazione è data da ADP e da Ca2+ che segnala
contrazione muscolare e prevista richiesta di ATP:

74
14 Metabolismo degli acidi grassi
14.1 Accumulo e mobilitazione
Nei vertebrati prima che i trigliceridi ingeriti possano essere assorbiti è necessaria una conversione da
grassi insolubili a micelle finemente disperse: questo stratagemma aumenta enormemente il numero
di molecole accessibili alle lipasi intestinali in modo da convertire i trigliceridi a mono e digliceridi,
acidi grassi liberi e glicerolo. Una volta assorbite dalle cellule queste molecole vengono riconvertite
a trigliceridi, confezionate insieme al colesterolo e a specifiche proteine e conservati sotto forma di
aggregati lipoproteici detti chilomicroni.
La classe delle apolipoproteine è quella delle proteine in grado di legare i lipidi e responsabile del
trasporto ematico di trigliceridi, fosfolipidi e colesterolo tra gli organi. Le apolipoproteine si combinano
ai lipidi a formare parecchie classi di lipoproteine le cui densità variano da valori molto bassi (VLDL) a
valori molto alti( VHDL). La consegna dei lipidi ai tessuti avviene secondo questo schema: l’enzima ex-
tracellulare lipoprotein lipasi idrolizza i trigliceridi a acidi grassi e glicerolo che possono essere assorbiti
dalle cellule bersaglio.
I lipidi neutri vengono conservati negli adipociti sotto forma di goccioline lipidiche circondate da
perilipine, una classe di proteine con la funzione di restringere l’accesso alle goccioline in modo da
evitare mobilitazioni lipidiche incontrollate. Quando si ha stimolazione ormonale i trigliceridi accumu-
lati nell’adipe vengono invece mobilitati e trasportati ai tessuti. La via di mobilitazione dei lipidi è la
seguente:
1. L’adrenalina o il glucagone attivano l’enzima adenilato ciclasi (→ cfr. “Adrenalina e cAMP”)
2. L’adenilato ciclasi produce il secondo messaggero intracellulare cAMP

3. La protein kinasi cAMP-dipendente (PKA) si porta a fosforilare la perilipina A

4. La perilipina A fosforilata porta la lipasi ormone-dipendente del citosol a muoversi sulla superficie
della goccia lipidica dove inizia l’idrolisi dei trigliceridi a acidi grassi e glicerolo.
Al termine della cascata di mobilitazione lipidica gli acidi grassi liberati passano dagli adipociti al
sangue dove si legano all’albumina (fino a dieci acidi si legano ad ogni monomero di albumina) e
vengono trasportati ai tessuti bersaglio per essere utilizzati come carburante. Il destino del glicerolo
liberato è la fosforilazione da parte dell’enzima glicerol chinasi a glicerolo 3-fosfato, il quale a sua
volta viene ossidato a diidrossiaceton fosfato che infine segue la consueta via di ingresso nella glicolisi
attraverso la conversione a gliceralideide 3-fosfato.

14.2 Ossidazione
14.2.1 Shuttle della carnitina
Il set di enzimi per l’ossidazione degli acidi grassi è collocato nella matrice mitocondriale. Gli acidi
grassi con meno di dodici atomi di carbonio possono attraversare la membrana mitocondriale senza

75
aiuti ma quelli con più di quattordici atomi, cioè la maggioranza, devono prima passare attraverso le
tre reazioni dello shuttle della carnitina.
La prima reazione è catalizzata da una famiglia di isozimi presente sulla membrana mitocondriale,
le acil-CoA sintetasi, che promuovono la generica reazione

AcidoGrasso + CoA + AT P
Acil − CoA + AM P + P Pi
Gli acil-CoA di derivazione lipidica sono, come l’acetil-CoA, composti ad alta energia.
Gli acidi grassi sono provvisoriamente attaccati al gruppi idrossile della carinitina a formare acil-
carinitina nel secondo step dello shuttle; questa transesterificazione è promossa dall’enzima car-
nitina aciltrasferasi I. L’estere così formato entra nella matrice per diffusione facilitata attraverso il
trasportatore acetil-carnitina/carnitina.
Nel terzo e ultimo step dello shuttle il gruppo acile lipidico viene trasferito per via enzimatica dalla
carnitina al CoA mitocondriale in una reazione promossa dalla carnitina aciltrasferasi II. La carnitina
ora liberata ritorna nello spazio intermembrana attraverso il trasportatore per ricominciare il ciclo.

Questo sistema a tre step connette due pool separati di CoA: quello citosolico e quello mitocondriale.

14.2.2 Ossidazione
L’ossidazione mitocondriale degli acidi grassi avviene in tre passaggi. Nel primo passaggio, la beta-
ossidazione, gli acidi subiscono una rimozione ossidativa ciclica di unità a due atomi di carbonio sotto
forma di acetil-CoA a partire dall’estremità carbossilica della catena. La formazione di ciascun acetil-
CoA prevede la rimozione di quattro atomi di idrogeno da parte di deidrogenasi dedicate. Nel secondo
passaggio i gruppi acetilici dell’acetil-CoA vengono ossidati a CO2 nel ciclo di Krebs. I primi due pas-
saggi dell’ossidazione producono NADH e F ADH2 che nel terzo passaggio donano elettroni alla catena
respiratoria mitocondriale attraverso cui arrivano all’ossigeno con fosforilazione accoppiata di ADP ad
ATP e conservazione dell’energia.

Beta ossidazione La beta ossidazione è compiuta grazie a quattro reazioni catalizzate da enzimi.
Nella prima reazione la deidrogenazione dell’acil-CoA produce un
doppio legame tra i carboni α e β (C-2 e C-3) generando un trans −
∆2 − enoil − CoA; il prefisso trans del prodotto di reazione indica il tipo
di doppio legame introdotto, da notare che negli acidi grassi insaturi il
legame è invece semrpe di tipo cis. Questo primo passaggio è cataliz-
zato dai tre isozimi dell’acil-CoA deidrogenasi, ciascuno specifico per un range di lunghezza della catena
lipidica; tutti e tre gli isozimi sono però flavoproteine a FAD ed è dunque a quest’ultimo che vengono
trasferiti gli elettroni con produzione di F ADH2 (quest’ultimo cederà immediatamente i suoi elettroni
a un carrier per la catena respiratoria mitocondriale che prende il nome di flavoproteina trasferente
elettroni ETF).
Nella seconda reazione del ciclo della beta ossidazione viene ag-
giunta acqua al doppio legame del trans − ∆2 − enoil − CoA formandone
lo stereoisomero L − β − idrossiacil − CoA. Questa reazione, cataliz-
zata dall’enzima enoil-CoA idratasi, è analoga all’aggiunta di acqua al
fumarato nel ciclo di Krebs.
Nel terzo passaggio della beta ossidazione l’L − β − idrossiacil − CoA
subisce deidrogenazione a formare β − chetoacil − CoA dall’azione del-
l’enzima β − idrossiacil − CoA deidrogenasi che sfrutta N AD+ come
accettore di elettroni. Questo enzima è assolutamente specifico per

76
lo stereoisomero L dell’idrossiacil-CoA. Il NADH formato in questa
reazione dona gli elettroni alla NADH deidrogenasi, un carrier della catena respiratoria.
Nella quarta ed ultima reazione della beta ossidazione, catalizzata dall’enzima tiolasi, si ha la com-
binazione del β − idrossiacil − CoA con una molecola di CoA libera e la conseguente separazione dei due
atomi di carbonio carbossiterminali sotto forma di acetil-CoA. La porzione di acido grasso rimanente a
seguito dell’ultimo passaggio è dunque una catena carboniosa più corta di due elementi:

In un singolo ciclo di beta ossidazione una molecola di acetil-CoA, due coppie di elettroni e quattro
protoni vengono rimosse da una catena di acil-CoA che risulterà più corta di due atomi di carbonio;
prendendo ad esempio il caso del palmitato, un acido grasso con sedici atomi di carbonio, il primo ciclo
ha come equazione

P almitoil − CoA + CoA + F AD+ + N AD+ + H2 O → M iristoil − CoA + acetil − CoA + F ADH2 + N ADH + H +

L’ossidazione viene ripetuta fino a rimanere con un solo acetil-CoA, quindi si può riassumere in

P almitoil − CoA + 7CoA + 7F AD+ + 7N AD+ + 7H2 O → 8acetil − CoA + 7F ADH2 + 7N ADH + 7H +

A partire da ogni molecola di F ADH2 vengono generate circa 1.5 molecole di ATP, mentre per og-
ni molecola di NADH circa 2.5: dalla beta ossidazione completa dell’acido grasso in esame verranno
prodotte dunque 28 molecole di ATP (prendendo in esame la sola ossidazione, le molecole di acetil-CoA
prodotte verrano poi ulteriormente elaborate nel ciclo di Krebs producendo altro ATP).

14.2.3 Ossidazione degli acidi grassi insaturi

La sequenza descritta è funzionante per la sola ossidazione degli acidi grassi saturi, cioè con solamente
legami singoli nello scheletro carbonioso; la maggior parte degli acidi grassi nei trigliceridi e nei fosfoli-
pidi di piante e animali è però insatura, presenta cioè uno o più doppi legami. I doppi legami degli acidi
grassi insaturi sono sempre in configurazione cis e non possono essere manipolati dall’idratasi: sono
necessari due enzimi ausiliari per poter procedere alla beta ossidazione degli acidi grassi insaturi.
L’acido grasso insaturo viene inizialmente processato come fosse un composto saturo, la variazione
subentra quando la beta ossidazione incontra il doppio legame in configurazione sbagliata; quando
avviene l’incontro l’enzima ausiliario ∆3 , ∆2 −enoil−CoA isomerasi catalizza l’isomerizzazione del doppio
legame da cis a trans e l’ossidazione riprende normalmente.

Il secondo enzima ausiliario, una reduttasi, è necessario quando si opera su grassi polinsaturi e
catalizza la seguente procedura

77
14.2.4 Ossidazione degli acidi grassi a catena dispari
Gli acidi grassi a catena dispari seguono la canonica via di ossidazione fino all’ultimo ciclo, dove il
substrato si trova ad essere uno scheletro carbonioso a cinque atomi di carbonio: quando questo viene
attaccato i prodotti sono acetil-CoA e propionil-CoA. Il propionil-CoA viene prima carbossilato a for-
mare metilmalonil-CoA grazie all’azione della propionil-CoA carbossilasi; la reazione di carbossilazione
richiede sia biotina che l’energia proveniente dalla rottura di una molecola di ATP. Il metilmalonil-CoA
inizialmente prodotto è lo stereoisomero D, che viene epimerizzato nello stereoisomero L ad opera del-
l’enzima metilmalonil-CoA epimerasi. L’ultimo passaggio è il riarrangiamento del L-metilmalonil-CoA
a formare succinil-CoA che è libero di entrare nel ciclo di Krebs: questa reazione è promossa dalla
metilmalonil-CoA mutasi che richiede un derivato della vitamina B12 per funzionare correttamente.

14.3 Corpi chetonici

L’acetil-CoA formato nel fegato durante l’ossidazione degli acidi grassi può proseguire lungo due vie:
l’ingresso nel ciclo di Krebs o la conversione a uno dei tre corpi chetonici, cioè acetone, acetoacetato e
D − β − idrossibutirrato. L’acetone, il meno rappresentato, è l’unico dei corpi chetonici ad essere esalato,
mentre gli altri vengono trasportati ai tessuti extraepatici dove vengono riconvertiti ad acetil-CoA e diret-
ti al ciclo di Krebs. Il cervello, che normalmente utilizza esclusivamente glucosio per il suo metabolismo,
in condizioni di carenze nutrizionali può adattarsi ad usare l’acetoacetato e il D − β − idrossibutirrato.
La produzione e l’esportazione dei corpi chetonici ha il significato di continuare l’ossidazione degli acidi
grassi nel fegato anche quando l’acetil-CoA per qualche motivo non sta proseguendo la sua via lungo il
ciclo di Krebs.
Il primo passo nella formazione dell’acetoacetato nel fegato è
la condensazione enzimatica di due acetil-CoA catalizzata dalla
tiolasi; il prodotto è l’acetoacetil-CoA e di fatto si tratta di un
passaggio che è semplicemente l’inverso dell’ultimo step della β-
ossidazione.
Nel secondo passaggio l’acetoacetil-CoA viene condensato a una terza molecola di acetil-CoA a
formare il β − idrossi − β − metilglutaril − CoA in sigla HMG-CoA che verrà poi spezzato a dare ace-
toacetato libero e acetil-CoA. L’acetoacetato prodotto viene reversibilmente ridotto dall’enzima D − β −
idrossibutirrato deidrogenasi a formare D −β −idrossibutirrato in una reazione altamente stereospecifica.

Nei tessuti extraepatici il D − β − idrossibutirrato viene ossidato ad acetoacetato dall’enzima D − β −

idrossibutirrato deidrogenasi. L’acetoacetato è attivato nella sua forma legata al CoA dal trasferimento

78
di questo coenzimadal succinil-CoA in una reazione catalizzata dall’enzima β − ketoacil − CoA trasferasi
(questo
enzima non esiste nel fegato, che quindi è solo produttore di corpi chetonici e non consumatore);
l’acetoacetil-CoA così creato viene spezzato dalla tiolasi per ottenere due acetil-CoA che entrano nel
ciclo di Krebs.

Dallo schema è evidente il significato della via dei corpi chetonici: uno shunt attraverso cui far fluire
l’acetil-CoA in modo da continuare l’ossidazione degli acidi grassi in ogni situazione.

79
15 Metabolismo degli aminoacidi
Indipendentemente dal motivo della demolizione, tutti gli aminoacidi vengono privati del loro gruppo
aminico per formare α − keto acidi che subiscono a loro volta ossidazione a CO2 e H2 O ma soprattutto
forniscono scheletri a tre e quattro atomi di carbonio perfetti per la gluconeogenesi. Gli aminoacidi
derivanti dalla dieta sono la sorgente della magior parte dei gruppi aminici. Parte dello ione ammo-
nio generato nel metabolismo epatico di queste molecole viene riciclato e usato nelle vie biosintetiche
mentre l’eccesso è escreto direttamente o sotto forma di urea; lo ione ammonio generato in tessuti
extraepatici viene direzionato al fegato sotto forma di gruppi aminici e convertito. Nel citosol degli epa-
tociti i gruppi aminici di quasi tutti gli aminoacidi vengono trasferiti all’α − ketoglutarato con formazione
di glutamato, libero di entrare nel mitocondrio e di cedere il gruppo formando N H4+ . L’N H4+ in eccesso
generato negli altri tessuti viene invece convertito nell’amide nitrato della glutamina che passa nel fe-
gato e nei mitocondri epatici. Glutamina e glutamato per via di questo ruolo metabolico sono presenti
in concentrazioni più alte di qualsiasi altro aminoacido in quasi tutti i tessuti.

15.1 Transaminazione, deaminazione e trasporto

Il primo passo nel catabolismo degli L-
aminoacidi nel fegato è la rimozione dei
gruppi aminici grazie a enzimi chia-
mati aminotrasferasi o transaminasi.
In queste reazioni di transaminazione il
gruppo aminico viene trasferito al car-
bonio alfa dell’α-ketoglutarato ottenen-
do come prodotti L-glutamato e l’α −
ketoacido corrispondente all’aminoaci-
do degradato. La ragione di questa reazione è semplice: in questo modo vengono raccolti tutti i gruppi
aminici sotto un’unica forma, il glutamato, e quindi si ha un unico prodotto di partenza per il ciclo di
questi gruppi.
Le cellule contengono diversi tipi di transaminasi, quasi tutte legate all’α-ketoglutarato come ac-
cettore ma con differenti specificità per gli aminoacidi. Tutte le transaminasi hanno lo stesso gruppo
prostetico, il piridossal fosfato (→ cfr. glicogenolisi), e lo stesso meccanismo di reazione. Il piridos-
sal fosfato, o PLP, funziona da carrier intermedio del gruppo aminico al sito attivo della transaminasi;
subisce in questo meccanismo una trasformazione tra la sua forma aldeidica, il PLP, e la sua for-
ma aminata detta piridossamina fosfato, che può donare il suo gruppo aminico ad un α − ketoacido
(α-ketoglutarato). Il meccanismo delle transaminasi è un meccanismo classico a ping-pong, in cui il
primo substrato reagisce e il prodotto deve lasciare il sito attivo prima che il secondo substrato possa
legarsi. Riassumendo l’aminoacido si lega al sito attivo, dona il gruppo al piridossal fosfato e lascia
l’enzima sotto forma di α − ketoacido, poi l’α − ketoglutarato si lega e riceve il gruppo dalla piridossamina
fosfato e lascia sotto forma di aminoacido.
Negli epatociti il glutamato viene trasportato dal citosol al mitocondrio dove subisce una deami-
nazione ossidativa catalizzata dall’enzima glutamato deidrogenasi. L’azione combinata della transami-
nasi e della deidrogenasi viene chiamata transdeaminazione. Questa reazione produce ione ammonio
e α − ketoglutarato libero che può essere usato nel ciclo di Krebs o nella gluconeogenesi.
L’ammoniaca è tossica ai tes-
suti animali e i livelli ematici di
questa sostanza devono dunque
essere controllati. Il trasporto
dell’ammoniaca è mediato soprat-
tutto dalla L-glutammina, criti-
ca nel metabolismo extracellulare
tanto quanto lo era il glutammato
per quello intracellulare. L’ammo-
niaca prodotta nei tessuti viene
dunque combinata al glutammato a dare glutammina grazie all’azione ATP dipendente della glutamina
sintetasi. La glutamina in eccesso rispetto a quella richiesta nelle varie biosintesi è trasportata per

80
via ematica a fegato, reni ed intestino dove viene ulteriormente elaborata; all’interno dei mitocondri
delle cellule di questi tessuti l’enzima glutaminasi converte la glutamina inglutamato e ione ammonio,
quest’ultimo diretto al fegato e da li alla sintesi dell’urea. Un ruolo speciale nel trasporto dell’ammo-
niaca è ricoperto dall’alanina, che è parte di una via definita ciclo glucosio alanina. Nel muscolo il
glutamato può essere sia convertito in glutamina che trasferire il suo gruppo aminico al piruvato grazie
all’azione dell’alanina transaminasi; l’alanina così formata passa nel sangue e raggiunge il fegato dove
lo stesso enzima trasferisce il gruppo aminico all’α-ketoglutarato producendo piruvato e glutammato.

15.2 Ciclo dell’urea

I gruppi amminici non riutilizzati nelle varie biosintesi sono incanalati in direzione di un singolo prodot-
to escretorio, l’urea. L’urea negli animali terrestri viene prodotta per conversione dell’ammoniaca
depositata nei mitocondri degli epatociti durante gli step del ciclo dell’urea che avviene quasi esclu-
sivamente nel fegato. Questo ciclo inizia all’interno del mitocondrio dell’epatocita ma tre dei cinque
passaggi totali avvengono nel citosol e dunque si ha il contatto tra pool di enzimi di compartimenti
diversi. Il primo gruppo amminico ad entrare nel ciclo è derivato dall’ammoniaca nella matrice mito-
condriale giunta qui dalle vie degradative fondamentalmente degli aminoacidi: lo ione ammonio viene
usato immediatamente insieme a CO2 o HCO3− (dalla respirazione) per formare il carbamoil fosfato in
una reazione ATP dipendente catalizzata dalla carbamoil fosfato sintetasi I.

Il carbamoil fosfato non è altro che un donatore attivato di gruppo carbamoile che può ora affrontare
i quattro step successivi. Innanzitutto il carbamoil fosfato dona il suo gruppo carbamoile (C − N H2 )
all’ornitina a formare citrullina con liberazione di Pi : l’ornitina nel ciclo dell’urea è quello che l’ossaloac-
etato è nel ciclo di Krebs, cioè un accettore di materiale per iniziare il ciclo. La reazione di trasferimento
tra carbamoil fosfato e ornitina è catalizzata dall’ornitina transcarbamoilasi e la citrullina così creata
abbandona il mitocondrio a favore del citosol.

Il secondo gruppo amminico entra nel ciclo dall’aspartato, generato nel mitocondrio per transam-
inazione e trasportato poi nel citosol: si ha una condensazione tra il gruppo dell’aspartato e il grup-
po carbonile della citrullina, con formazione di argininosuccinato in una reazione ATP dipendente
catalizzata dall’argininosuccinato sintetasi.

L’argininosuccinato viene spezzato dall’enzima argininosuccinasi e si formano arginina e fumarato,

quest’ultimo destinato ad entrare nel mitocondrio e unirsi al pool di intermedi del ciclo di Krebs. Nel-
l’ultima reazione del ciclo l’enzima arginasi spezza l’arginina dando come prodotti urea ed ornitina, la
prima destinata ad essere escreta, la seconda ad essere riportata nel mitocondrio per un altro giro del
ciclo.

81
 Al termine del ciclo di fatto l’unico metabolita rilasciato nel citosol dell’epatocita è l’urea.

I cicli dell’urea e di Krebs si incontrano in un punto molto importante definito shunt aspartato-
argininosuccinato ed è possibile costruire un grafico che mostra come questo collegamento avvenga:

15.2.1 Controllo del ciclo

Il controllo del ciclo dell’urea è regolato a due livelli: a lungo termine sui livelli di sintesi dei quattro
enzimi per gli step e a breve termine dalla regolazione allosterica principalmente dell’enzima carbamoil
fosfato sintetasi I. Il livello a breve termine si realizza grazie al fatto che l’enzima carbamoil sintetasi
I è attivato allostericamente da N-acetilglutammato, che viene sintetizzato a partire da acetil-CoA e
glutammato da parte dell’enzima N-acetilglutammato sintasi.

15.3 Vie di degradazione degli aminoacidi

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 Le venti diverse vie di degradazione, tante quanti gli aminoacidi di base, convergono a formare sola-
mente sei prodotti, tutti diretti al ciclo di Krebs per essere usati per la gluconeogenesi o la ketogenesi.
Sette aminoacidi vengonodegradati interamente o in parte ad acetoacetil-CoA e/o acetil-CoA (fenilalani-
na, tirosina, isoleucina, leucina, triptofano, treonina e lisina): queste molecole nel fegato possono essere
trasformate in corpi chetonici e pertanto vengono definite chetogeniche. Gli aminoacidi che invece ven-
gono degradati a piruvato, α-ketoglutarato, succinil-CoA, fumarato e/o ossaloacetato possono essere
convertiti in glucosio e glicogeno e pertanto sono definiti aminoacidi glucogenici. Cinque aminoacidi
(triptofano, fenilalanina, tirosina, treonina e isoleucina) sono sia chetogenici che glucogenici.

Cofattori nella degradazione Oltre alla già vista transaminazione, nelle degradazioni degli aminoaci-
di sono comuni anche i trasferimenti di un singolo atomo di carbonio che di solito includono uno di
questi tre cofattori:
• Biotina, che trasferisce CO2
• Tetraidrofolato
• S-adenosilmetionina
Il tetraidrofolato è una molecola composta da tre porzioni che nella sua forma ossidata, il folato, è una
vitamina: la conversione nella forma ridotta avviene in due step grazie all’enzima diidrofolato reduttasi.
Questo cofattore trasporta gruppi ad un atomo di carbonio che, in ognuno dei tre stati di ossidazione
possibili, vengono legati a N-5 o N-10:

La fonte principale di unità monocarboniose per il tetraidrofolato è la conversione della serina in

glicina con produzione di N 5 , N 10 -metilenetetraidrofolato
Per il trasferimento biologico di gruppi metilici il cofattore prescelto è quasi sempre la S-adenosilmetionina,
sintetizzata a partire da ATP e metionina dall’azione dell’enzima metionina adenosil trasferasi. Il trasfer-
imento del gruppo metile dalla S-adenosilmetionina all’accettore produce S-adenosilomocisteina, che
viene immediatamente degradata ad omocisteina e adenosina da cui ripartire per generare il cofattore
di partenza in quello che viene definito ciclo metil-attivato:

Il passaggio di conversione da omocisteina a metionina è uno dei due soli eventi che richiedono la
vitamina B12: il secondo è la conversione da metilmalonil-CoA a succinil-CoA (→cfr. acidi grassi a
catena dispari).

15.3.1 Aminoacidi degradati a piruvato

Gli scheletri carboniosi di sei aminoacidi vengono convertiti in toto o in parte a piruvato per poi produrre
acetil-CoA o ossaloacetato. Gli aminoacidi coinvolti sono alanina, triptofano, cisteina, serina, glicina e
treonina.

83
Alanina L’alanina produce piruvato direttamente per transaminazione con l’α-ketoglutarato (→ cfr. via
del glucosio - alanina).
Triptofano Il triptofano attraverso quattro step viene convertito in alanina e dunque in piruvato
anch’esso.
Cisteina La cisteina viene convertita in piruvato in due passaggi: il primo rimuove l’atomo di zolfo, il
secondo è una transaminazione.
Serina La serina viene convertita a piruvato dalla serina deidratasi; sia il gruppo β-idrossilico che
quello α-amminico vengono rimossi in una singola reazione dipendente dal piridossal fosfato.
Glicina La glicina viene degradata in tre modi diversi di cui solo uno porta al piruvato. La via che
porta al piruvato prevede la conversione in serina grazie all’aggiunta di un gruppo idrossimetile
catalizzata dall’enzima serina idrossimetil trasferasi (che richiede tetraidrofolato e piridossal fos-
fato per funzionare). La seconda via prevede rottura ossidativa dell’aminoacido a dare CO2 , N H4+ e
un gruppo metilene che viene accettato dal tetraidrofolato. Nella terza via la glicina è conver-
tita a gliossilato che viene ossidato in una reazione NAD dipendente a ossalato (è il costituente
principale dei calcoli renali).

Treonina Due vie interessano la treonina: una porta a piruvato, l’altra a succinil-CoA. La via che
porta al piruvato prevede la conversione dell’aminoacido a glicina in due step, con una prima
conversione a 2-amino-3-chetobutirrato.

15.3.2 Aminoacidi degradati ad acetil-CoA

Porzioni dello scheletro di sette aminoacidi vengono convertite in acetil-CoA oppure acetoacetil-CoA. Gli
aminoacidi coinvolti sono triptofano, lisina, fenilalanina, tirosina, leucina, isoleucina e treonina.
Triptofano Il breakdown del triptofano è il più complesso di tutti gli aminoacidi in quanto alcuni degli
intermedi sono precursorsi di sintesi di biomolecole quali niacina (precursore di NAD e NADP),
serotonina e indolacetato (importante solo nelle piante).
Fenilalanina Il breakdown è importante perchè difetti genetici negli enzimi di questo processo portano
a parecchie malattie umane ereditabili. La felilalanina e il suo prodotto di ossidazione tirosina
vengono degradati in due frammenti che entrano nel ciclo di Krebs; quattro dei nove carboni
danno acetoacetato (convertito poi ad acetoacetil-CoA e quindi acetil-CoA) mentre gli altri cinque
atomi si dividono in una molecola di fumarato e una di CO2 . La felilalanina, una volta ossidata a
tirosina, è anche la base di sintesi per dopamina, epinefrina, norepinefrina e melanina.
Tirosina La tirosina può essere considerata un intermedio della degradazione della fenilalanina e quin-
di ne condivide gli step: produzione di fumarato e acetoacetato, quindi acetil-CoA e in ultima
analisi acetil-CoA.

Leucina La leucina viene rielaborata dando come prodotti sia acetil-Coa che acetoacetato e quindi
indirettamente acetil-CoA per tramite dell’acetoacetil-CoA.

84
Isoleucina Parte dello scheletro carbonioso viene trasformato in propionil-CoA e da questo viene rica-
vato succinil-CoA mentre la rimanente porzione viene trasformata direttamente in acetil-CoA.
Lisina La lisina viene convertita in quattro step ad α-chetoadipato, un intermedio della via di degradazione
del triptofano, che a sua volta viene convertito in glutaril-CoA e in una serie di quattro ulteriori
passaggi porta alla formazione di acetoacetil-CoA.

Treonina La via secondaria della treonina produce una piccola quantità di acetil-CoA a partire dal
2-amino 3-chetobutirrato.

15.3.3 Aminoacidi degradati ad alfa chetoglutarato

Cinque aminoacidi (prolina, glutamina, glutammato, arginina ed istidina) vengono immessi nel ciclo di
Krebs sotto forma di α-chetoglutarato.

Prolina La struttura ciclica della prolina viene aperta per ossidazione del carbonio più distante dal
gruppo carbossile e viene così creata una base di Schiff che viene poi idrolizzata a creare una
struttura semialdeidica chiamata glutammato γ-semialdeide; questo intermedio viene ossidato a
livello dello stesso carbonio per produrre glutammato.

Glutammina La glutammina per azione delle glutaminasi viene convertita in glutammato.

Arginina L’arginina in origine possiede sei atomi di carbonio in totale ma viene convertita in una
struttura a cinque atomi nel ciclo dell’urea e quindi raggiunge la configurazione della glutammato
γ-semialdeide passando per l’ornitina.
Prolina La prolina viene prima ossidata a dare una molecola che prende il nome di ∆1 − pirollina − 5 −
carbossilato, che viene poi idratata arrivando alla configurazione della glutammato γ-semialdeide.
Glutammato L’enzima glutammato deidrogenasi converte il glutammato in α-chetoglutarato senza step
intermedi.

85
15.3.4 Aminoacidi degradati a succinil-CoA
Gli scheletri carboniosi di metionina, isoleucina, treonina e valina vengono degradati a dare succinil-
CoA.
Metionina La metionina cede il suo gruppo metile a vari accettori tramite SAM e tre dei sui quattro
carboni rimanenti vengono convertiti nel propionato del propionil-CoA, un precursore del succinil-
CoA.

Isoleucina Lo scheletro a cinque atomi di carbonio dell’isoleucina viene ossidato a dare acetil-CoA e
propionil-CoA.
Valina La valina subisce una serie di ossidazioni che la trasformano in propionil-CoA.
Treonina In due step viene convertita in propionil-CoA ed è questa la via primaria di manipolazione
della treonina.

15.3.5 Aminoacidi a catena ramificata

I tre aminoacidi a catena ramificata (leucina, isoleucina e valina) vengono ossidati nel muscolo, nel tes-
suto adiposo, nel rene e nel tessuto nervoso; questi tessuti extraepatici contengono tutti una transam-
inasi non presente nel fegato che agisce sulle sequenze ramificate producendo il corrispondente α-
chetoacido. I chetoacidi prodotti dalla transaminasi extraepatica vengono poi processati dal comp-
lesso α-chetoacido ramificato deidrogenasi, uguale per tutte e tre le strutture, che produce derivati
dell’acil-CoA come prodotto finale.

15.3.6 Schema complessivo

86
16 Catena respiratoria e fosforilazione ossidativa
Tutti i processi ossidativi di degradazione di carboidrati, grassi e aminoacidi convergono in questo
stadio finale della respirazione cellulare in cui l’energia di ossidazione guida la sintesi di ATP. La fosfo-
rilazione ossidativa in breve implica la riduzione di O2 ad H2 O grazie agli elettroni donati dal NADH e
dal F ADH2 . La teoria che spiega il funzionamento di questo processo prende il nome di teoria chemios-
motica e prevede che l’energia estratta dalle ossidazioni venga immagazzinata sotto forma di differenti
concentrazioni protoniche transmembrana; questa teoria rispecchia il fatto che la membrana interna
del mitocondrio non è attraversabile se non attraverso un trasportatore e quindi i protoni sono confinati
nella loro sede, sia essa interna o esterna.
Gli elettroni che fanno iniziare il processo di fosforilazione arrivano dall’azione delle varie deidroge-
nasi che li porta a convergere verso accettori universali a NAD secondo reazioni standard:

SubstratoRidotto + N AD+
SubstratoOssidato + N ADH + H +

SubstratoRidotto + N ADP +
SubstratoOssidato + N ADP H + H +
Quasi tutte le deidrogenasi sono specifiche per il NAD e rimuovono due idrogeni dal substrato, di cui
uno finisce libero come H + e uno si lega sotto forma di ione : H − . Il NADPH solitamente ha la funzione
di fornire elettroni nelle reazioni anaboliche e in generale la cellula mantiene pool separati di NADH e
NADPH con diversi potenziali redox. Il secondo tipo di accettori universali per elettroni è quello delle
flavoproteine che contengono un flavonucleotide, il FAD, saldamente legato e che possono accettare
sia un singolo elettrone (generando un semichinone) che una coppia (generando F ADH2 ); per via della
capacità di accettare uno o due elettroni le flavoproteine vengono sfruttate nelle reazioni in cui vengono
donati due elettroni ma ne viene accettato solo uno.
La catena respiratoria mitocondriale consiste in una serie di carrier di elettroni, quasi tutti proteine
integrali con gruppi prostetici in grado di donare o accettare uno o due elettroni. I trasferimenti di
elettroni avvengono in tre forme:
• Trasferimento di elettroni, ad esempio nella riduzione da F e+++ a F e++
• Trasferimento di un atomo di idrogeno (H + + e− )
• Trasferimento di uno ione idruro : H − che porta due elettroni
In aiuto di NAD e flavoproteine nella catena respiratoria intervengono altri tre carrier di elettroni:l’ubiquinone,
i citocromi e le proteine ferro-zolfo. L’ubiquinone (o coenzima Q o Q semplicemente) è un benzochinone
liposolubile con una lunga catena isoprenica laterale e può accettare un singolo elettrone diventan-
do un semichinone radicalico . QH oppure due diventando ubiquinolo QH2 .L’ubiquinone è una strut-
tura piccola e idrofobica e pertanto diffonde liberamente tra il doppio strato lipidico della membrana
mitocondriale esterna e può agire da shuttle di equivalenti riducenti tra gli altri carrier meno mobili.

I citocromi sono proteine contenenti gruppi prostetici EME legati al ferro. I mitocondri contengono
tre diverse classi di citocromi, chiamate “a”, “b” e “c”; a distinguere le varie classi è il cofattore EME
che nelle classi “a” e “b” è legato saldamente ma in modo non covalente mentre nella classe c ha
legami covalenti. I citocromi “a” e “b” sono proteine integrali della membrana mitocondriale interna
mentre i citocromi “c” sono proteine solubili associate per via elettrostatica alla superficie esterna della
membrana interna.
Nelle proteine ferro-zolfo il ferro è presente non in un gruppo EME ma in associazione ad atomi di
zolfo inorganico o a zolfo legato a residui di cisteina (o entrambe le tipologie). I centri ferro-zolfo possono
essere della tipologia più semplice cioè un atomo di ferro legato a quattro di zolfo, oppure strutture più
complesse come la “2Fe-2S” o la “4Fe-4S”:

87
 Nel processo totale catalizzato dalla catena respiratoria mitocondriale gli elettroni passano dal NADH
o da altri donatori a flavoproteine, ubiquinone, proteine ferro-zolfo, citocromi e infine a O2 dove termina
la catena.

16.1 Complessi della catena respiratoria

I carrier di elettroni della catena respiratoria sono organizzati in complessi incastonati nella membrana;
esistono quattro complessi principali: i complessi I e II che catalizzano il trasferimento elettronico
all’ubiquinone da NADH o succinato, il complesso III che li trasferisce dall’ubiquinone al citocromo “c”,
e il complesso IV che completa il tutto trasferendoli dal citocromo “c” a O2 .

16.1.1 Complesso I: da NADH ad ubiquinone

Il complesso I, detto anche NADH:ubiquinone ossidoreduttasi
o NADH deidrogenasi, è un enzima complesso contenente una
flavoproteina a FMN (flavin mononucleotide) e almeno sei pro-
teine ferro-zolfo. Questo complesso catalizza due reazioni simul-
tanee e accoppiate: il trasferimento dello ione idruro da NADH a
ubiquinone e il trasferimento di quattro protoni dalla matrice allo
spazio intermembrana; in base alla sua azione è dunque possi-
bile definire il complesso I come una pompa protonica alimentata
dall’energia del trasferimento di elettroni.

N ADH + 5H + + Q → N AD+ + QH2 + 4H +

La reazione promossa dal complesso I sposta dunque delle cariche in modo netto: la matrice diventa
carica negativamente mentre lo spazio intermembrana diventa carico positivamente. Questo passaggio
è il target di antibiotici ma anche di barbiturici e insetticidi. L’ubiquinolo prodotto diffonde a questo
punto nella membrana mitocondriale interna passando al complesso III dove viene riossidato a Q in un
processo che coinvolge anch’esso movimenti di H + .

16.1.2 Complesso II: da succinato ad ubiquinone

Il complesso II in realtà è la succinato deidrogenasi già vista per il ciclo di Krebs ed è una struttura
più piccola e semplificata del complesso I. Il complesso comprende cinque gruppi prostetici e quattro
subunità proteiche e contiene un gruppo EME e un sito di legame per l’ubiquinone. Le subunità A
e B si estendono nella matrice e contengono tre centri ferro zolfo, un FAD e un sito di legame per il
succinato.
Il gruppo EME del complesso II non sembra coinvolto direttamente nella via degli elettroni ma prob-
abilmente serve a ricatturare gli elettroni che potenzialmente possono sfuggire spostandosi dal succi-
nato a ossigeno molecolare producendo perossido di idrogeno H2 O2 , una specie reattiva dell’ossigeno,
e radicale superossido . O2− .
Il passaggio degli elettroni lungo il complesso II è il seguente: da succinato a FAD; poi da FAD a pro-
teine ferro-zolfo le quali riducono l’ubiquinone a ubiquinolo che poi prende la stessa via del complesso
I.

16.1.3 Complesso III: da ubiquinone a citocromo “c”

Il complesso III, dettto anche complesso citocromo bc1 o ubiquinone:citocromo c ossidoreduttasi, accop-
pia il trasferimento di elettroni dall’ubiquinolo al citocromo “c” con il trasporto di protoni dalla matrice
allo spazio intermembrana. L’unità funzionale del complesso è un dimero i cui due monomeri sono
citocromi “b” posti a circondare una cavità della membrana in cui l’ubiquinone è libero di muoversi dal
lato della matrice a quello intermembrana facendo da shuttle per gli elettroni e i protoni.

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 Il passaggio degli elettroni e dei protoni attraverso il complesso III è stato definito ciclo Q, la cui
reazione redox netta e:

QH2 + 2cytc1 (ox) + 2H + → Q + 2cytc1 (red) + 4H +

I vari step del ciclo sono complessi ma il senso del processo è semplice: un ubiquinolo viene ossidato
a ubiquinone e due molecole di citocromo “c” vengono invece ridotte. Quando il citocromo “c” viene
ridotto si sposta verso il complesso IV per donare il suo unico elettrone.

16.1.4 Complesso IV: da citocromo “c” all’ossigeno

Nell’ultimo step della catena respiratoria il complesso IV, detto anche citocromo ossidasi, porta gli
elettroni dal citocromo “c” all’ossigeno molecolare riducendolo ad acqua. Il complesso contiene tredici
subunità negli eucarioti e solamente tre nei batteri; nella subunità II degli eucarioti sono contenuti
due ioni rame accoppiati con i gruppi sulfidrilici di due residui di cisteina in un centro binucleare CuA
non lontano dalla struttura 2Fe-2S delle proteine ferro zolfo. La subunità I contiene invece due gruppi
EME, a e a3 , e un altro ione rame a formare un secondo centro binucleare CuB che accetta elettroni
dall’EME a e li trasferisce all’ossigeno legato all’EME a3 . I passaggi compiuti dagli elettroni grazie al
complesso IV sono dunque: citocromo “c”→centro CuA →EME a →centro Eme a3 −CuB →O2 . Ad ogni
ciclo il complesso sfrutta quattro H + della matrice per ridurre l’ossigeno e pompa un protone verso lo
spazio intermembrana alimentando il gradiente elettrochimico; la reazione complessiva catalizzata è
dunque:

4cytc(red) + 8H + + O2 → 4cytc(ox) + 4H + + 2H2 O

16.1.5 Movimenti netti e riassunto

L’equazione vettoriale, cioè quella che indica i movimenti netti delle varie parti, per il processo della
respirazione è:

+ 1 + +
N ADH + 11HM atrice + O2 → N AD + 10HIntermembrana + H2 O
2
La disparità e la separazione di cariche rappresenta una conservazione temporanea dell’energia dei
trasferimenti elettronici e prende il nome di forza protonica: sarà questa forza a guidare la sintesi
dell’ATP.

16.2 Sintesi di ATP

Il modello chemiosmotico, lo stesso che spiega i passaggi della catena respiratoria, prevede che l’ATP
venga sintetizzato durante lo scorrimento dei protoni accumulati in direzione della matrice attraverso
un poro protonico associato ad una ATP sintasi. Per enfatizzare il ruolo del movimento dei protoni è
possibile riscrivere l’equazione della sintesi di ATP indicandoli esplicitamente:
+ +
ADP + Pi + nHIntermembrana → AT P + H2 O + nHM atrice

Da notare è la totale interdipendenza dei processi di trasferimento di elettroni e di sintesi di ATP; se

la sintesi viene bloccata non esiste alcuna via di ritorno per i protoni, il gradiente continua a crescere
fino a che il costo del pompare i protoni stessi al di fuori della matrice diventa uguale a quello per
portarli dentro:a questo punto il flusso si ferma e il sistema raggiunge l’equilibrio.
L’ATP sintasi dei mitocondri è un grande complesso enzimatico della membrana mitocondriale in-
terna che catalizza la formazione di ATP a partire da ADP e fosfato insieme al flusso di protoni dalla
matrice allo spazio intermembrana. Questo enzima, a volte definito complesso V, possiede due distinti
componenti: F1 , una proteina periferica di membrana, e Fo , una proteina integrale della membrana. Fo
è la porzione che possiede il poro protonico attraverso cui i protoni scorrono seguendo il loro gradiente
ma da sola non è in grado di creare ATP;F1 in isolamento è invece in grado di catalizzare l’idrolisi di ATP,
cioè l’inverso della sintesi: l’accoppiata F1 + Fo è invece in grado di promuovere la sintesi accoppiando i
vari processi.

89
 Il complesso dell’ATP sintetasi conta due proteine, Fo e F1 .
Fo crea fondamentalmente il poro attraverso il quale i protoni accumulati dal lato della matrice ritor-
nano nello spazio intermembrana secondo gradiente. Una sua piccola porzione composta dalle due
subunità b, è associata alla proteina F1 (in particolare alla porzione δ) e la tiene saldamente ancorata
alla membrana.
F1 è una struttura complessa composta da nove subunità di cinque tipi diversi secondo la composizione
α3 β3 γδ; Le subunità  e γ rappresentano il raccordo di F1 con Fo e formano un cilindro attorno al quale
le subunità α e β si associano alternandosi: quando il flusso di protoni attraversa Fo questa ruota
insieme al cilindro che vi è associato e causa cambiamenti conformazionali a livello di α e β , che si
presentano dunque in due forme, una catalitica e una rilasciante le neomolecole di ATP.

16.2.1 Regolazione della fosforilazione ossidativa

Il tasso di consumo di O2 nel mitocondrio è strettamente regolato e limitato in genere dalla disponibilità
di ADP. Quando una cellula è in condizioni di ipossia il trasferimento di elettroni all’ossigeno e quindi
il movimento dei protoni cala e la forza da esso derivante collassa dopo poco: in queste condizioni
l’ATP sintasi si troverebbe a catalizzare la reazione inversa demolendo ATP e causandone carestia in un
attimo. Il ribaltamento dell’azione dell’ATP sintasi è prevenuto da una piccola proteina inibitoria detta
IF1 che lega simultaneamente due ATP sintasi bloccandone l’attività. Questa proteina è inibitoria solo
nella sua forma d imerica, che è favorita per pH < 6.5 quindi in situazioni di ipossia.

90
17 Biosintesi dei lipidi
17.1 Biosintesi degli acidi grassi
Il processo di biosintesi degli acidi grassi non è semplicemente l’inverso della degradazione ma prevede
la partecipazione di un intermedio a tre atomi di carbonio, il malonil-CoA che non è presente nel
processo di degradazione. La formazione del malonil-CoA a partire dall’acetil-CoA è un processo irre-
versibile catalizzato dall’enzima acetil-CoA carbossilasi e prevede tre attività che negli animali vengono
svolte da un unico polipeptide multifunzionale. L’enzima contiene biotina come gruppo prostetico lega-
to covalentemente a un residuo di lisina; i due passaggi sono simili alle reazioni che coinvolgono la
biotina:
• Un gruppo carbossile derivante d al bicarbonato viene prima trasferito sulla biotina in una reazione
ATP dipendente
• Il gruppo biotinile viene usato come carrier temporaneo di CO2 per poi trasferire il gruppo sull’acetil-
CoA a dare malonil-CoA
In tutti gli organismi la sintesi delle catene degli acidi grassi avviene per ripetizione degli stessi quattro
passaggi catalizzati da un sistema enzimatico chiamato genericamente acido grasso sintasi; ad ogni
ciclo di quattro step la catena dell’acido grasso nascente viene allungata di due atomi di carbonio.
Nella reazione di sintesi sia il cofattore trasportante gli elettroni che i gruppi attivatori sono diversi da
quelli usati nella degradazione: nella β-ossidazione engono usati N AD+ e FAD e il gruppo attivante è
-SH sul coenzima A, mentre nella sintesi l’agente riducente è il NADPH ei gruppi attivanti sono due
gruppi -SH legati ad enzimi.
Esistono due acido grasso sintasi, il tipo I (FAS-I) per gli animali e il tipo II (FAS-II) per piante e
batteri. Il tipo I, che è il prototipo e si trova esclusivamente nel citosol, presenta sette siti attivi separati
per differenti reazioni: funzionano infatti come enzimi distinti ma collegati. I sette enzimi della FAS
sono:
1. KS: β-chetoacil-ACP sintasi

2. MAT: malonil/acetil-CoA trasferasi

3. DH: β − idrossiacil − ACP deidratasi
4. ER: enoil-ACP reduttasi
5. KR: β − chetoacil − ACP reduttasi

6. ACP: acil carrier protein

7. TE: tioesterasi
L’azione di FAS-I porta direttamente alla sintesi di un acido grasso senza rilascio di alcun intermedio:
quando la catena raggiunge i sedici atomi di carbonio il prodotto (palmitato) abbandona il ciclo. Durante
tutto il processo di sintesi gli intermedi di reazione rimangono covalentemente attaccati come tioesteri
a uno di due gruppi tiolo: il primo è il gruppo -SH di un residuo di cisteina in uno dei domini della
sintasi mentre l’altro è il gruppo -SH della proteina carrier dell’acile (ACP), un dominio separato dello
stesso polipeptide. L’idrolisi di un legame tioestere è altamente esoergonica e questa caratteristica viene
sfruttata per aiutare in due diversi step della sintesi.
Prima che il ciclo possa iniziare i due gruppi -SH dell’enzima devono essere caricati con i corret-
ti gruppi acilici. Il primo passaggio è il trasferimento dell’acetile dell’acetil-CoA ad ACP (acil carrier
protein) in una reazione catalizzata dalla malonil/acetil-CoA-ACP trasferasi (MAT), un dominio del
polipetide multifunzione. Il gruppo acetile ora caricato sulla ACP viene trasferito all’-SH sul residuo
di cisteina dall’enzima β-chetoacil-ACP sintasi (KS). La seconda reazione preparatoria, il trasferimento
di un gruppo malonile dal malonil-CoA ad ACP, è anch’essa catalizzata da MAT. Al termine di queste
due reazioni inizia il ciclo che in quattro step produce una catena allungata.

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Step 1: condensazione Nella prima reazione si ha la con-
densazione tra il gruppo acetile e il gruppo malonile prece-
dentemente caricati per formare acetoacetil-ACP con pro-
duzione simultanea di una molecola di CO2 . In questa
reazione, catalizzata dall’enzima β-chetoacil-ACP sintasi, è
il gruppo acetile legato a Cys-SH a essere trasferito al grup-
po malonile già legato ad ACP diventando così l’unità metil terminale a due carboni del nuovo gruppo
acetoacetile. L’atomo di carbonio rimosso in questa reazione sotto forma di CO2 è lo stesso che era stato
introdotto nel malonil-CoA a partire dal bicarbonato per azione della acetil-CoA carbossilasi (tramite
la biotina). La ragione di questa aggiunta e rimozione è termodinamica: poichè nella β-ossidazione
la rottura di un legame tra due gruppi acili è altamente esoergonica, il processo inverso è altamente
endoergonico e quindi sfavorito. Il C-2 del malonile è posto tra carbonile e carbossile ed è in un’ottima
posizione per agire da nucleofilo.

Step 2: riduzione L’acetoacetil formato nel pri-

mo passaggio viene ora ridotto sul carbonile in
C-3 a formare D − β − idrossibutirril − ACP in
una reazione catalizzata dall’enzima β −chetoacil−
ACP reduttasi, uno dei sette domini di FAS-I. Il
donatore di elettroni in questo processo è NADPH.

Step 3: disidratazione Una molecola d’acqua

viene a questo punto rimossa da C-2 e C-3 del D − β − idrossibutirril − ACP introducendo così un doppio
legame nel prodotto, che prende il nome di trans − ∆2 − butenoil − ACP . L’enzima β − idrossiacil − ACP
deidratasi si occupa di catalizzare questa reazione.

Step 4: riduzione L’ultimo passaggio è la riduzione o saturazione

del doppio legame introdotto con il trans − ∆2 − butenoil − ACP : questa
azione è promossa dall’enzima enoil-ACP reduttasi, che nuovamente
sfrutta il NADPH come donatore di idrogeni. Il prodotto finale dopo il
primo ciclo di allungamento è il butirril-ACP che viene ora trasferito
dal gruppo -SH dell’ACP al gruppo Cys-SH della β-chetoacil-ACP sin-
tasi che inizialmente aveva portato il gruppo acetile. Un nuovo ciclo
prende inizio quando il gruppo -SH dell’ACP viene caricato da un nuovo gruppo malonile.
Il ciclo continua per sette volte fino a dare un gruppo palmitoile saturo a sedici atomi di carbonio
legato ad ACP: generalmente la sintesi a questo punto si ferma e il palmitato viene rilasciato grazie
all’attività del settimo enzima del complesso, la tioesterasi.

Reazione complessiva Nel considerare il processo totale di produzione di una molecola di palmitato
è possibile semplificare la reazione in due passaggi. Il primo passaggio è la formazione di sette molecole
di malonil-CoA:

7Acetil − CoA + 7CO2 + 7AT P → 7M alonil − CoA + 7ADP + 7Pi

Il secondo passaggio è contabilizzare i sette cicli di condensazione e riduzione (una molecola d’acqua
è sottratta dall’idrolisi finale):

Acetil − CoA + 7M alonil − CoA + 14N ADP H + 14H + → P almitato + 8CoA + 7ADP + 7Pi + 14N ADP + + 6H2 O

Combinando le due equazioni il risultato netto è:

8Acetil − CoA + 7AT P + 14N ADP H + 14H + → P almitato + 8CoA + 7ADP + 7Pi + 1N ADP + + 6H2 O

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Fornitura dell’acetil-CoA Il processo di biosintesi degli acidi grassi avviene esclusivamente nel citosol,
mentre la formazione dell’acetil-CoA per ossidazione del piruvato avviene praticamente solo nei mito-
condri la cui membrana è impermeabile a questa molecola: è quindi necessario introdurre un carrier
che possa trasportare fuori l’acetil-CoA necessario alle biosintesi.
L’acetil-CoA mitocondriale reagisce prima con l’ossaloacetato per formare citrato (primo passo del
ciclo di Krebs), quest’ultimo possiede poi un trasportatore che lo porta nel citosol. Nel citosol il citrato
viene attaccato dalla citrato liasi che produce acetil-CoA e ossaloacetato in una reazione ATP dipen-
dente: è questa la fonte di acetil-CoA per la sintesi degli acidi grassi. L’ossaloacetato prodotto non
può rientrare nel mitocondrio autonomamente (era lo stesso problema della gluconeoneogenesi) ma
deve essere prima convertito a malato dalla malato deidrogenasi citosolica; il malato prodotto può sia
rientrare nel mitocondrio attraverso un trasportatore dedicato sia essere substrato per l’enzima malico
e produrre grandi quantità di NADPH (è questa la via principale di produzione di NADPH, l’altra è la via
dei pentosi fosfati). Il ciclo di fornitura di acetil-CoA risulta dunque in una spesa di due ATP (citrato
liasi e piruvato carbossilasi) per ogni molecola fornita alla sintesi degli acidi grassi.

17.1.1 Regolazione della biosintesi degli acidi grassi

La reazione catalizzata dalla acetil-CoA carbossilasi (cioè la formazione del malonil-CoA) è il punto
limitante la velocità della sintesi degli acidi grassi ed è anche la principale sede di regolazione dell’intero
processo. Come è prevedibile il palmitoil-CoA, prodotto del processo della sintesi è un inibitore di
questo enzima mentre il citrato ne è un attivatore allosterico: il citrato ha un ruolo centrale nello
switch tra consumo e stoccaggio di energia nell’organismo, regolava infatti anche la glicolisi. L’acetil-
CoA carbossilasi subisce anche regolazione tramite modifiche covalenti: la fosforilazione, attivata da
glucagone ed epinefrina, inattiva l’enzima e reduce la sua sensibilità al citrato rallentando molto la
sintesi degli acidi grassi.
La simultanea attivazione di sintesi degli acidi e β-ossidazione è un esempio di ciclo futile. L’ossi-
dazione viene bloccata dal malonil-CoA (che inibisce la carnitina trasferasi I, enzima dello shuttle della
carnitina) e quindi i due cicli non possono mai essere attivi allo stesso momento.

17.1.2 Acidi grassi a catena lunga

Gli acidi grassi a catena lunga vedono come precursore ovviamente il palmitato; questo può essere
allungato a formare stearato (C18) o strutture più lunghe grazie ai sistemi di elongazione presenti nel
reticolo endoplasmatico liscio e nei mitocondri. Il sistema di allungamento è sempre lo stesso che ha
prodotto il palmitato: donazione di due carboni al malonil-CoA, poi riduzione, disidratazione, riduzione.

17.1.3 Acidi grassi insaturi

Il palmitato e lo stearato sono i precursori dei due acidi grassi insaturi più comuni: palmitoleato (∆9 )
e oleato (∆9 ), entrambi con un doppio legame cis tra C-9 e C-10. Il doppio legame viene inserito da
una reazione ossidativa catalizzata dall’enzima acido grasso-CoA desaturasi. Due substrati differenti,
l’acido grasso e NAD(P)H subiscono simultaneamente ossidazione in cui il flusso di elettroni include un
citocromo e una flavoproteina.

17.1.4 Eicosanoidi
Gli eicosanoidi sono molecole di segnalazione molto potenti che agiscono come messaggeri a corto
raggio.
In presenza di stimolo ormonale la fosfolipasi A2 presente in quasi ogni cellula di mammifero attac-
ca i fosfolipidi di membrana rilasciando acido arachidonico dal carbonio centrale del glicerolo. Enzimi

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presenti sul reticolo endoplasmatico liscio convertono l’acido arachidonico a prostaglandine iniziando
con la formazione della prostaglandina H2 (P GH2 ) che è il precursore di prostaglandine e trombossani.
Le due reazioni che portano alla formazione di P GH2 sono catalizzate da un enzima bifunzionale detto
cicloossigenasi (COX) o prostaglandina H2 sintetasi: nella prima reazione l’arachidonato viene conver-
tito in P GG2 , nella seconda si ha la conversione da P GG2 a P GH2 . I mammiferi possiedono due COX:
COX-1 e COX-2; il primo isozima sintetizza le prostaglandine che regolano la secrezione gastrica di
mucina, il secondo quelle che mediano infiammazione, dolore e febbre.
L’enzima trombossano sintasi, presente nelle piastrine, converte P GH2 in trombossano A2 da cui
tutti gli altri trombossani derivano a loro volta: queste molecole inducono vasocostrizione e aggregazione
piastrinica, le prime fasi della coagulazione.

Gli ormoni facenti parte della famiglia degli eicosanoidi hanno grande importanza medica, soprattutto
per quanto riguarda le prostaglandine. Un’applicazione molto comune è l’inibizione dell’attività di COX-
2 da parte dell’aspirina, che allevia così i sintomi di febbre e infiammazione per mancata produzione
delle prostaglandine di riferimento. Sempre le prostaglandine inducono contrazione della muscolatura
liscia e dell’utero e possono essere usate a scopo medico nell’induzione del parto. I trombossani sono
importanti regolatori della funzione piastrinica e dunque della cascata coagulativa: la riduzione della
loro formazione tramite l’uso di piccole quantità quotidiane di aspirina è alla base della terapia dei
restringimenti coronarici.

17.2 Biosintesi dei trigliceridi

Quasi tutti gli acidi grassi ingeriti o sintetizzati hanno due destini possibili: essere incorporati nelle
membrane oppure essere immagazzinati sotto forma di trigliceridi.
Nei tessuti animali i trigliceridi e i fosfolipidi condividono due precursori, acil-CoA e L-glicerolo-3-
fosfato, e parecchi step di biosintesi. Quasi tutto il glicerolo 3-fosfato deriva dall’intermedio della gliclosi
diidrossiaceton fosfato grazie all’azione dell’enzima NAD dipendente glicerolo 3-fosfato deidrogenasi; gli
acil-CoA vengono formati a partire da acidi grassi dall’acil-CoA sintetasi, lo stesso enzima responsabile
dell’attivazione degli acidi grassi per la β-ossidazione.
Il primo passo nella biosintesi dei trigliceridi è l’acilazione dei due gruppi OH liberi dell’L-glicerolo 3-
fosfato con due molecole di acil-CoA a dare diacilglicerolo 3-fosfato (o acido fosfatidico): questa moleco-
la, presente solo in tracce nella cellula, è un intermedio centrale che può essere convertito sia in
fosfolipide che in trigliceride. Nella via di produzione dei trigliceridi l’acido fosfatidico viene idroliz-
zato dalla acido fosfatidico fosfatasi a formare 1,2-diacilglicerolo: questa molecola verrà poi resa un
trigliceride per transesterificazione con un terzo acil-CoA.

17.2.1 Regolazione della sintesi dei trigliceridi

La sintesi e la demolizione dei trigliceridi sono regolate in base alle risorse metaboliche e alle richieste
del momento. La regolazione avviene per via ormonale, ad esempio l’insulina promuove la conversione
da carboidrati a trigliceridi, ma anche attraverso il controllo sulla formazione delle varie molecole neces-
sarie ai processi. Quando è richiesta mobilitazione degli acidi grassi il rilascio è stimolato da glucagone
ed epinefrina (→ cfr. accumulo e mobilitazione degli acidi grassi).

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 La gliceroneogenesi è una versione accorciata della gluconeogenesi che dal piruvato produce di-
idrossiaceton fosfato prima e lo converte in glicerolo 3-fosfato poi grazie all’azione della glicerolo 3-
fosfato deidrogenasi. Questo processo ha più di una funzione. Nel tessuto adiposo la gliceroneogenesi
è abbinata alla reesterificazione degli acidi grassi liberi e controlla il tasso di rilascio di questi ultimi
nel sangue: in individui malnutriti la gliceroneogenesi nel solo fegato supporta la sintesi di abbastanza
glicerolo 3-fosfato da contare per il 65% del totale.

17.3 Biosintesi dei fosfolipidi di membrana

17.3.1 Fosfolipidi
In generale, l’assemblaggio di un fosfolipide richiede:
• Sintesi di uno scheletro strutturale, cioè glicerolo o sfingosina

• Attaccamento degli acidi grassi allo scheletro attraverso un legame esterico o amidico
• Aggiunta di una testa idrofilica allo scheletro tramite un legame fosfodiesterico
• Eventualmente manipolazione della testa per dare il fosfolipide finale

I primi passi della sintesi dei glicero-

fosfolipidi sono condivisi con la sinte-
si dei trigliceridi: due gruppi acile ven-
gono esterificati ai carboni 1 e 2 dell’L-
glicerolo-3-fosfato a dare l’acido fosfa-
tidico (spesso l’acido grasso di C-1 è
saturo e quello di C-2 insaturo). La tes-
ta polare viene attaccta attraverso un
legame fosfodiesterico in cui due grup-
pi -OH, uno sulla testa e uno su C-3,
formano un legame di tipo estere con il
gruppo fosfato. Nel processo di sintesi
l’evento non è simultaneo ma uno dei
due OH viene attivato per primo dall’attacco di un nucleotide detto citidina difosfato (CDP): questo
nucleotide può attaccarsi dunque sia al diacilglicerolo formando CDP-diacilglicerolo che alla testa
polare4 .
Un esempio della strategia seguita dagli eucarioti è dato dalla sintesi di fosfatidiletanolamina,
fosfatidilglicerolo e fosfatidil serina in E.Coli:
4 La doppia strategia è caratteristica esclusiva degli eucarioti: nei batteri viene seguita solamente la prima strada.

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 Negli eucarioti alcuni passag-
gi sono leggermente diversi nel
senso che la cardiolipina viene
sintetizzata per condensazione
tra fosfatidil glicerolo e CDP-
diacilglicerolo. Nei mammiferi
anche la sintesi della fosfatidil-
serina è diversa da quella batter-
ica in quanto deriva dalla fosfa-
tidiletanolammina o dalla fosfatidilcolina attraverso uno scambio di gruppi polari nel reticolo endo-
plasmatico; la sintesi dei precursori a sua volta avviene secondo la strategia 2 (attivazione del gruppo
polare e non del diacilglicerolo).

17.3.2 Sfingolipidi
La biosintesi degli sfingolipidi prevede quattro step:

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 • Sintesi della sfinganina, un ammina a 18 atomidicarbonio, a partire da palmitoil-CoA e serina
• Attacco di un acido grasso con legame di tipo ammide a dare N-acilsfinganina
• Desaturazione a formare N-acilsfingosina
• Attacco della testa polare a dare lo sfingolipide, ad esempio la sfingomielina

17.4 Biosintesi del colesterolo

La struttura a 27 atomi di carbonio del colesterolo non implica una
sintesi complessa: tutti gli atomi arrivano da uno stesso precursore,
l’acetato. Le unità di isoprene che sono intermedi essenziali a questa
sintesi sono precursori di parecchi altri lipidi naturali e il meccanismo
di polimerizzazione è sempre lo stesso.
Il colesterolo, come gli acidi grassi a lunga catena, è costruito a
partire dall’acetil-CoA, con la differenza che il piano di assemblaggio è
qui modificato in modo da creare quattro anelli che vengono indicati
con le lettere A-B-C-D. La sintesi avviene in quattro passaggi:
• Condensazioni di tre acetati a formare un’unità di mevalonato

• Conversione del mevalonato ad isoprene

• Polimerizzazione dell’isoprene a squalene
• Ciclizzazione dello squalene e altre modifiche minori

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Step 1: sintesi del mevalonato In questo step due molecole di acetil-CoA vengono condensate a
formare acetoacetil-CoA che viene fatto condensare a sua volta con una terza molecola di acetil-CoA
a dare l’intermedio a sei atomi di carbonio β − idrossil − β − metilglutaril − CoA in sigla HMG-CoA
(→ cfr. corpi chetonici). Questi primi due passaggi sono catalizzati dall’enzima tiolasi e HMG-CoA
sintetasi (questo enzima citosolico è diverso da quello mitocondriale che catalizza la sintesi nel processo
di formazione dei corpi chetonici) rispettivamente. La terza reazione è la riduzione di HMG-CoA a
mevalonato in cui due molecole di NADPH donano due elettroni. L’enzima HMG-CoA reduttasi è un
punto importante di regolazione della via del colesterolo.

Step 2: conversione in isoprene In questo step tre gruppi fosfato vengono trasferiti da tre diversi
ATP al mevalonato: uno viene attaccato all’OH in C3, gli altri due all’OH in C-5 come pirofosfato. Il
fosfato attaccato all’idrossile in C-3 (nell’intermedio 3-fosfo 5- pirofosfomevalonato) è un buon gruppo
uscente e la sua dipartita insieme al carbossile terminale produce un doppio legame nel prodotto
∆3 − isopentenil − pirof osf ato: è questo il primo dei due isopreni attivati. L’isomerizzazione del ∆3 −
isopentenil − pirof osf ato produce il secondo isoprene attivato, chiamato dimetilallil-pirofosfato.

Step 3: formazione dello squalene ∆3 − isopentenil − pirof osf ato e dimetilallil pirofosfato nel terzo
step subiscono una condensazione testa coda in cui un pirofosfato viene rimosso e una catena di dieci
atomi di carbonoio, il geranil pirofosfato, viene formata. Il geranil pirofosfato subisce una seconda
condensazione conisopentenile pirofosfato a dare l’intermedio a quindici carboni farnesil-pirofosfato.
Nell’ultimo passaggio due molecole di farnesil pirofosfato vengono unite testa a testa a dare lo squalene.

Step 4: creazione del nucleo steroideo L’azione dell’enzima squalene monoossigenasi aggiunge un
atomo di ossigeno preso da O2 ad un’estremità dello squalene formando un epossido che prende il
nome di squalene 2,3 epossido; i doppi legami dell’epossido sono posizionati in modo da poter passare
da una struttura lineare ad una ciclica che negli animali prende il nome di lanosterolo. Il lanosterolo
in una serie di almeno venti reazioni viene poi convertito nel prodotto finale che è il colesterolo.

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99
18 Biosintesi degli aminoacidi non essenziali
Gli aminoacidi possono essere suddivisi in due categorie: non essenziali, cioè non indispensabili nella
dieta, ed essenziali, cioè non sintetizzabili dall’organismo e da introdurre necessariamente tramite
l’alimentazione. Per organizzare le vie biosintetiche per gli aminoacidi è utile dividere gli aminoacidi
non essenziali in sei famiglie in base al precursore dal quale originano:

18.1 Aminoacidi derivati dall’alfa chetoglutarato

Glutammato il glutammato deriva dall’α-chetoglutarato grazie al processo di transaminazione che
viene promosso durante il catabolismo degli aminoacidi.
Glutammina la glutammina deriva dal glutammato grazie all’azione della glutamina sintetasi, che
catalizza la reazione del glutammato con N H4+

Prolina la prolina è un derivato ciclico del glutammato. Nel primo step l’ATP reagisce con il gruppo γ-
carbossile del glutammato a dare un acil fosfato che viene poi ridotto da NAD(P)H a dare glutamato
γ-semialdeide; la semialdeide va incontro a rapida e spontanea ciclizzazione e con una successiva
riduzione si raggiunge la configurazione della prolina.

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Arginina nei mammiferi l’arginasi, un enzima del ciclo dell’urea, converte arginina ad ornitina ed urea.
L’ornitina viene convertita a glutammato γ-semialdeide dall’enzima ornitina δ-amminotrasferasi
e ciclizza poi spontaneamente a ∆1 -pirrolina-5-carbossilato che viene poi converita in prolina.
Quando l’arginina assunta con la dieta è insufficiente l’ornitina amminotrasferasi spinge in di-
rezione della formazione di ornitina che verrà poi convertita in citrullina ed arginina nel ciclo
dell’urea.

18.2 Aminoacidi derivati dal 3-fosfoglicerato

Serina Il gruppo idrossile del 3-fosfoglicerato viene prima ossidato da una deidrogenasi a N AD+ a dare
3-fosfoidrossipiruvato; una transaminazione con il glutammato produce la 3-fosfoserina che viene
poi idrolizzata a serina libera dall’enzima fosfoserinafosfatasi.

Glicina La serina a tre atomi di carbonio è il precursore della glicina a due atomi di carbonio attraver-
so la rimozione di un carbonio da parte dell’enzima serina idrossimetiltrasferasi che lo sposta sul
tetraidrofolato. La reazione complessiva, peraltro reversibile, richiede anche la presenza di piri-
dossal fosfato. Esclusivamente nel fegato la glicina può pure essere prodotta tramite la reazione
promossa dall’enzima glicina sintasi.

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Cisteina La cisteina viene prodotta nei mammiferi a partire da altri aminoacidi: la metionina fornisce
l’atomo di zolfo mentre la serina lo scheletro carbonioso. La metionina viene prima convertita in
S-adenosilmetionina che può donare il suo gruppo metile formando così la S-adenosilomocisteina;
la S-adenosilomocisteina viene idrolizzata a dare omocisteina libera che può reagire con la serina
in una reazione catalizzata dall’enzima cistationina β-sintasi che produce cistationina. Nell’ultimo
passaggio la cistationina γ-liasi catalizza la rimozione dell’amoniaca e la rottura della cistationina
a dare cisteina libera.

18.3 Aminoacidi derivati da ossaloacetato e piruvato

Alanina l’alanina viene sintetizzata a partire dal piruvato per transaminazione dal glutammato

Aspartato l’aspartato viene sintetizzato a partire dall’ossaloacetato per transaminazione dal glutam-
mato

Asparagina l’asparagina viene sintetizzata per amidazione dell’aspartato grazie al dono di N H4+ da
parte della glutammina

102
19 Biosintesi dell’EME
La biosintesi dell’EME inzia con la biosintesi delle porfirine, molecole per
le quali la glicina è un importante precursore. Le porfirine sono costru-
ite a partire da quattro molecole di porfobilinogeno a loro volta derivate
ciascuna da due molecole di δ-aminolevulinato. Esistono due vie maggiori
di produzione dell’δ-aminolevulinato; nell’uomo questo viene prodotto in
due passaggi: nel primo glicina e succinil-CoA reagiscono a formare α-
ammino,β-chetoadipato, nel secondo questa molecola viene decarbossilata
a produrre l’δ-aminolevulinato. In tutti gli organismi una coppia di molecole
di aminolevulinato reagisce a formare porfobilinogeno il quale in una serie
complessa di reazioni si associa ad altre tre molecole analoghe a formare
la protoporfirina. Una volta assemblata la protoporfirina un atomo di ferro viene incorporato grazie
all’azione dell’enzima ferrochelatasi. Difetti genetici nel set enzimatico che porta alla formazione delle
protoporfirine sono alla base del gruppo di malattie dette porfirie.

A seguito della morte dei globuli rossi avviene il rilascio di emoglobina e quindi di gruppo EME che
deve essere degradato a dare F e++ libero e bilirubina. Il primo step della degradazione è catalizzato
dall’enzima EME ossigenasi e converte l’EME in biliverdina, una struttura lineare, producendo F e++ e
CO. La biliverdina viene convertita in bilirubina dall’azione della biliverdina reduttasi; la bilirubina è
totalmente insolubile e viene trasportata nel sangue legata all’albumina. Una volta giunta nel fegato
viene trasformata nel pigmento biliare bilirubin diglucuronide che è sufficientemente solubile da es-
sere secreto insieme ad altri componenti nella bile che viene svuotata nell’intestino tenue. All’interno
dell’intestino tenue enzimi di origine microbica convertono questa molecola in altri prodotti, soprat-
tutto urobilinogeno che viene riassorbito e trasportato per via ematica al rene dove viene convertito in
urobilina, il composto che fornisce colorazione giallastra alle urine.

103
20 Biosintesi dei principali neurotrasmettitori
I principali neurotrasmettitori derivano da tre aminoacidi: tirosina, glutammato e triptofano. A partire
dalla tirosina è possibile ottenere dopamina, norepinefrina ed epinefrina, tutte molecole facenti parte
della classe delle catecolammine. Dal glutammato per decarbossilazione è possibile ottenere l’acido
gamma ammino butirrato (GABA) mentre la serotina è un derivato del triptofano.

Biosintesi delle catecolammine La sintesi delle catecolammine è un percorso lineare: il primo

prodotto ottenibile dalla tirosina è la dopamina, da cui si ricava la norepinefrina, da cui si ricava
l’epinefrina.

Il morbo di Parkinson è un disordine neurologico associato ad una sottoproduzione di dopamina

mentre una overproduzione potrebbe essere associata a disordini quali la schizofrenia.

Biosintesi del GABA La sintesi del GABA è una semplice reazione ad un solo passaggio catalizzata
dall’enzima glutammato decarbossilasi:

Biosintesi della serotonina La sintesi avviene a partire dal triptofano in due passaggi, il primo
catalizzato dalla triptofano idrolasi, il secondo da una decarbossilasi:

Biosintesi dell’istamina L’istamina non è un neurotrasmettitore ma un potente vasodilatatore ed è

rilasciata in grandi quantità durante le reazioni allergiche e pertanto ha interesse medico. L’istamina
viene sintetizzata in un singolo passaggio decarbossilativo a partire dall’istidina:

104
21 Biosintesi e degradazione dei nucleotidi
21.1 Sintesi
Esistono due vie per arrivare ai nucleotidi: la sintesi ex novo ed il riciclo. La sintesi ex novo inizia con
precursori metabolici quali aminoacidi, ribosio 5-fosfato, CO2 e N H3 mentre il riciclo sfurutta le basi e
i nucleosidi rilasciati durante il breakdown degli acidi nucleici.
La sintesi ex novo è uguale in tutti gli organismi viventi e non prevede come intermedi le basi libere,
cioè non si ha un meccanismo di sintesi delle basi con seguente attacco al ribosio: gli anelli vengono
invece costruiti uno o due atomi alla volta per le purine o sotto forma di orotato per le pirimidine.
Parecchi precursori sono condivisi dalle vie di sintesi per purine e pirimidine di cui uno fondamen-
tale è il fosforibosil pirofosfato (PRPP); un aminoacido per ciascuno tipo di base è inoltre precursore
fondamentale: glicina per le purine ed aspartato per le pirimidine.

21.1.1 Sintesi ex-novo delle purine

Il primo passo è la donazione di un gruppo amminico dalla glutammina al C-1 del PRPP dando come
risultato altamente instabile la 5-fosforibosilammina su cui verrà costruito l’anello purinico.
Il secondo step è l’aggiunta dei tre atomi provenienti dalla glicina. Una molecola di ATP viene con-
sumata per attivare il gruppo carbossile della glicina sotto forma di acil fosfato. Il gruppo aggiunto viene
a questo punto formilato da parte dell’N 10 -formiltetraidrofolato e un azoto viene messo a disposizione
dalla glutammina prima della chiusura della struttura a formare un anello imidazolico che prende il
nome di 5-ammini imidazolo ribonucleotide.

Arrivati alla costruzione dell’anello imidazolico tre dei sei atomi necessari al seondo anello sono già
in posizione. A questo punto si ha carbosilazione diretta grazie all’enzima AIR carbossilasi; l’aspartato
dona ora il suo gruppo amminico in due step mentre l’ultimo carbonio è dato dall’N 10 -formiltetraidrofolato:
il primo intermedio con un anello purinico completo è l’inosinato (IMP).

La conversione dell’inositato ad adenilato richiede l’inserimento di un gruppo amminico derivante

dall’aspartato e questo avviene in due reazioni simili a quelle usate per inserire N-1 nell’anello purini-
co; una differenza sostanziale è che l’energia per la sintesi arriva qui da GTP mentre nel passaggio
precedente da ATP. Il prodotto di formazione è l’adenilosuccinato che viene poi trasformato in adenilato
(AMP) grazie all’azione dell’adenilosuccinato liasi con perdita netta di fumarato. A partire dall’inosinato
è possibile ottenere anche guanilato (GMP) in due passaggi: il primo è una deidrogenazione promossa
da IMP deidrogenasi e N AD+ dipendente e porta alla formazione di xantilato (XMP); il secondo step è il

105
trasferimento di un gruppo amminico derivante dalla glutammina a formare guanilato con spesa di un
ATP.

Controllo della sintesi purinica Il controllo della sintesi purinica si basa su meccanismi a feedback
relativi ai prodotti delle varie reazioni preparatorie. Un passaggio di regolazione è unico per le purine ed
è quello della formazione della 5-fosforibosilammina a partire da PRPP con catalisi della glutammina-
PRPP amidotrasferasi: questo enzima viene inibito da IMP, AMP e GMP. Gli altri shunt di controllo sono
nello schema.

21.1.2 Sintesi ex-novo delle pirimidine

I ribonucleotidi pirimidinici comuni sono la citidina 5’-monofosfato (CMP) e l’uridina 5’-monofosfato
(UMP). L’anello pirimidinico a sei atomi viene costruito per primo e poi attaccato al ribosio 5-fosfato
in un processo che richiede il carbamoil fosfato, un intermedio del ciclo dell’urea (veniva formato per
reazione di ammoniaca, bicarbonato e ATP grazie all’enzima carbamoil fosfato sintetasi I) che però per
questo scopo viene sintetizzato da un enzima diverso, la carbamoil fosfato sintetasi II. Il carbamoil
fosfato a questo punto reagisce con l’aspartato a dare N-carbamoilaspartato in una reazione catalizzata
dall’aspartato transcarbamoilasi. Il secondo passaggio è la rimozione d’acqua dal N-carbamoilaspartato
a dare L-diidroorotato:

Queste prime tre reazioni vengono catalizzate da enzimi che fanno parte di una singola proteina
trifunzionale che prende l’acronimo di CAD. A questo punto l’L-diidroorotato viene ossidato a orotato in
una reazione in cui N AD+ è l’accettore di elettroni grazie alla catalisi della diidroorotatodeidrogenasi.

106
Una volta formato l’orotato il ribosio 5’fosfato, fornito sotto forma di PRPP, viene attaccato a dare
uridilato (o uridina 5’monofosfato o UMP), che viene poi fosforilato a formare UTP. CTP viene formato
a partire da UTP per azione della citidilato sintetasi in cui solitamente la glutammina dona un gruppo
azotato.

Controllo della sintesi pirimidinica Il controllo (nei batteri) avviene soprattutto a livello del primo
passaggio della sintesi, cioè sull’attività dell’enzima aspartato transcarbamoilasi, che viene inibito da
CTP.

21.1.3 Sintesi dei nucleosidi trifosfati

I nucleotidi da usare nelle biosintesi tipicamente vengono convertiti in nucleosidi trifosfati grazie a vie
comuni a tutte le cellule. La fosforilazione da AMP ad ADP è promossa dall’adenilato chinasi nella
reazione

AT P + AM P
2ADP
L’ADP formato in questa reazione viene poi fosforilato ad ATP dagli enzimi glicolitici o attraverso la
fosforilazione ossidativa. L’ATP promuove anche la formazione di altri nucleosidi difosfati in una classe
di reazioni catalizzate da enzimi chiamati nucleoside monofosfato chinasi; la reazione generica è:

AT P + N M P
ADP + N DP
I nucleosidi difosfati vengono convertiti in trifosfati da parte di un enzima ubiquitario, la nucleoside
difosfato chinasi, che catalizza la reazione

N T Pdonatore + N DPaccettore
N DPdonatore + N T Paccettore
L’enzima non è specifico per purine/pirimidine o per ribosio/desossiribosio anche se N T Pdonatore è
quasi sempre ATP per via della sua concentrazione sempre alta nella cellula.

21.1.4 Sintesi dei desossiribonucleotidi

I desossiribonucleotidi, colonna portante del DNA, vengono sintetizzati dai ribonucleotidi corrispon-
denti per riduzione diretta al carbonio 2 del ribosio in una reazione catalizzata dalla ribonucleotide
reduttasi. La reazione di riduzione richiede una coppia di idrogeni che vengono donati da NADPH
attraverso una proteina carrier di nome tioredossina (possiede due gruppi -SH in grado di accettare
gli idrogeni provenienti da NADPH). La forma ossidata della proteina viene ridotta da NADPH in una
reazione catalizzata dalla tioredossina reduttasi e la forma ridotta viene usata dalla ribonucleotide re-
duttasi per ridurre il nucleotide difosfato a trifosfato. Una seconda fonte di equivalenti riducenti è il
glutatione GSH che serve da riducente per una proteina simile alla tioredossina, la glutaresoddina che
fa da tramite del potere riducente alla reduttasi.

107
 Il DNA contiene la timina invece dell’uracile e la sintesi di questa base azotata coinvolge sola-
mente desossiribonucleotidi. Il precursore del timidilato (dTMP) è il dUMP; la conversione da dUMP a
dTMP è catalizzata dall’enzima timidilato sintasi. Un’unità monocarboniosa idrossimetilica (−CH2 OH)
viene trasferita da N 5 , N 10 -metilentetraidrofolato al dUMP e ridotta poi a un gruppo metile a spese del
tetraidrofolato che viene ossidato a diidrofolato. Il diidrofolato formato in questa reazione viene ridotto a
tetraidrofolato dall’enzima diidrofolato reduttasi e questa rigenerazione è essenziale per tutti i processi
che richiedono il tetraidrofolato.

21.2 Degradazione
21.2.1 Degradazione purinica
La degradazione delle purine prevede la perdita del fosfato attraverso l’azione della 5’ nucleotidasi.
L’adenilato produce così adenosina che viene deaminata a dare inosina dall’enzima adenosina deami-
nasi. L’inosina viene a questo punto idrolizzata a ipoxantina, la sua base purinica, e D-ribosio. L’ipox-
antina subisce gli ultimi due passaggi del ciclo: il primo è l’idrolisi a formare xantina, il secondo è
l’ossidazione ad acido urico promossa dalla xantina ossidasi.
GMP produce ugualmente acido urico come prodotto finale di degradazione. Si ha una prima idrolisi
a guanosina che viene poi spezzata per dare guanina libera. La guanina ottenuta subisce rimozione
idrolitica della sua ammina a dare xantina, che segue poi gli stessi passi della degradazione dell’AMP.
In quasi tutti i mammiferi l’acido urico prodotto in questo modo viene ulteriormente degradato ad
allantoina dall’azione dell’urato ossidasi.

108
21.2.2 Degradazione pirimidinica
La degradazione delle pirimidine porta alla formazione di N H4+ e quindi alla sintesi di urea. La timina
per esempio è degredata a metilmalonilsemialdeide che è un intermedio del catabolismo della valina e
viene degradata ulteriormente attraverso il propionil-CoA e il metilmalonil-CoA a succinil-CoA.

21.3 Riciclo
Durante il metabolismo dei nucleotidi vengono costantemente rilasciate purine e pirimidine libere nella
cellula. Le purine libere vengono per la gran parte riciclate e riutilizzare per nuovi nucleotidi in una via
molto più semplice della sintes ex-novo; un singolo passaggio catalizzato dall’adenosina fosforibosil-
trasferasi porta alla reazione dell’adenina libera con PRPP a dare il corrispondente nucleotide:

Adenina + P RP P → AM P + P Pi
Gunanina e ipoxantina vengono riciclate nello stesso identico modo da due enzimi che portano il
loro nome, cioè l’ipoxantina e la guanina fosforibosiltrasferasi.
Un processo di riciclo simile esiste per le pirimidine nei microorganismi e probabilmente anche nei
mammiferi.

109
22 Metabolismo tessuto specifico
22.1 Fegato
Il fegato gioca un ruolo di primo piano nel metabolismo in quanto rifornisce tutti gli altri organi e
tessuti di un appropriato mix di nutrienti per via ematica. Durante la digestione le tre principali classi
di nutrienti, cioè carboidrati, grassi e proteine, subiscono idrolisi dando i loro componenti di base
come prodotto. Molti degli acidi grassi e dei monogliceridi vengono riassemblati nelle cellule epiteliali
intestinali come trigliceridi. Molti degli zuccheri e degli amminoacidi e dei trigliceridi passano poi nei
capillari dirigendosi al fegato (parte dei trigliceridi si dirige invece al tessuto adiposo) attraverso la vena
porta. All’interno del fegato gli epatociti trasformano i nutrienti in carburanti e precursori per gli altri
tessuti e li esportano per via ematica. L’adattabilità del fegato ai nutrienti in arrivo è enorme: i set
enzimatici epatici hanno un turnover tra le cinque e le dieci volte maggiore di quello di qualsiasi altro
tessuto.

22.1.1 Zuccheri
Gli zuccheri vengono trasportati all’interno dell’epatocita da GLUT2, un trasportatore talmente effi-
ciente da garantire che all’interno della cellula la concentrazione di glucosio sia praticamente quella
ematica. Il glucosio viene poi fosforilato dall’esochinasi IV a glucosio 6-fosfato, e questo isozima è l’uni-
co a non essere inibito dal suo stesso prodotto e può quindi operare praticamente sempre; l’esochinasi
IV ha inoltre una Km molto più alta degli altri isozimi e questo garantisce che alte concentrazioni di
glucosio ematico non vadano a minarne la funzionalità. Un risvolto della alta Km di esochinasi IV si
ha a basse concentrazioni di glucosio: il fegato non cattura più glucosio, risparmiandolo per tessuti
meno adattabili, nervoso in primis. Il destino del glucosio 6-fosfato è piuttosto vario in quanto esistono
parecchie vie epatiche di utilizzo:
• Il glucosio 6-fosfato può essere defosforilato dalla glucosio 6-fosfatasi a dare glucosio libero per
ripristinare la concentrazione ottimale di glucosio nel sangue.
• Il glucosio 6-fosfato può essere convertito a glicogeno.
• Il glucosio 6-fosfato può entrare nella glicolisi e, dopo la reazione della piruvato deidrogenasi,
l’acetil-CoA può essere ossidato nel ciclo di Krebs per produrre energia.

• L’acetil-CoA può essere usato come precursore degli acidi grassi che verranno incorporati in
trigliceridi, fosfolipidi e colesterolo
• Il glucosio 6-fosfato può entrare nella via dei pentosi producendo sia potere riducente (NADPH)
che D-ribosio-5-fosfato per la sintesi dei nucleotidi

22.1.2 Aminoacidi
Gli aminoacidi che entrano nel fegato hanno moltissime vie di metabolizzazione.

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 • Sintesi proteica:il fegato rinnova costantemente le sue stesse proteine e buona parte delle proteine
plasmatiche
• Trasmissione ad altri organi per la sintesi proteica tessuto specifica
• Sintesi di nucleotidi, ormoni e composti azotati

• Transaminazione/deaminazione a dare intermedi del ciclo di Krebs o piruvato

• Ciclo dell’urea (gruppi amminici)
• Gluconeogenesi/glicolisi

22.1.3 Lipidi
Gli acidi grassi che costituiscono i lipidi in ingresso negli epatociti hanno vari destini:
• alcuni vengono convertiti a lipidi epatici
• la maggior parte rappresenta il carburante principale per le ossidazioni nel fegato: la porzione
ossidata diventerà poi NADH o acetil-CoA

• la porzione trasformata in acetil-CoA viene ossidata ulteriormente nel ciclo di Krebs per in defini-
tiva produrre ATP
• l’eccesso di acetil-CoA viene convertito in corpi chetonici
• una piccola porzione viene usata per sintetizzare colesterolo

• si ha conversione a fosfolipidi e trigliceridi per le proteine del sangue che portano i grassi al tessuto
adiposo
• una quantità di acidi grassi liberi viene legata all’albumina e portata a cuore e muscolatura dove
produrrà energia

111
22.2 Tessuto adiposo
Esistono due distinte tipologie di tessuto adiposo: bianco e bruno. Il tessuto adiposo bianco è il
più abbondante e composto da adipociti di grande diametro completamente riempiti da un singolo
trigliceride che costituisce il 65% in massa della cellula. Nell’uomo adulto il tessuto adiposo bianco
costituisce circa il 15% della massa corporea.
L’adipocita è una cellula che come tutte le altre conduce glicolisi, ossida il piruvato e gli acidi grassi
nel ciclo di Krebs, conduce fosforilazione ossidativa ed è in grado di adattarsi velocemente a stimoli
ormonali. Quando si hanno periodi di grande assunzione di carboidrati il tessuto adiposo è in grado di
convertire il glucosio (via piruvato e acetil-CoA) in acidi grassi per poi convertirli in trigliceridi e stoccarli
sotto forma di globuli di grasso; anche se esiste questa capacità è da sottolineare che comunque la
maggior parte della sintesi di grasso avviene grazie al fegato. Quando la richiesta di energia aumenta
le lipasi degli adipociti idrolizzano i trigliceridi accumulati che possono dunque sfruttare la circolazione
per raggiungere cuore e muscoli. La liberazione degli acidi grassi è fortemente velocizzata dall’epinefrina
che stimola la fosforilazione cAMP dipendente delle perilipine e fornisce dunque un accesso ormone-
dipendente alle lipasi. L’insulina si occupa di bilanciare gli effetti dell’epinefrina rallentando l’attività
delle lipasi.
Il breakdown e la sintesi dei trigliceridi costituiscono un ciclo tra loro: fino al 70% degli acidi grassi
liberati vengono riesterificati dagli adipociti riformando i trigliceridi di partenza. Questo tipo di ciclo
consente una regolazione più fine della velocità e del flusso degli intermedi in una via bidirezionale. Nel
tessuto adiposo il glicerolo liberato dalla lipasi non può essere riutilizzato per la sintesi dei trigliceridi
perchè gli adipociti non possiedono la glicerolo chinasi: il glicerolo fosfato è infatto prodotto a partire
dal piruvato nella gliceroneogenesi. (→ cfr. 17.2)
Il tessuto adiposo bruno ha funzione termogenica e termoregolatrice nei vertebrati minori e negli
animali in letargo ma nell’uomo adulto non è presente anche se gli adipociti bruni rimangono sparsi
all’interno del tessuto adiposo bianco. In fase fetale e postnatale esiste una piccola quantità di tessuto
adiposo bruno, circa l’1% in massa, con funzione di protezione dallo shock termico degli organi vitali
ma questa tende a sparire in poche settimane.

22.3 Tessuto muscolare

Il metabolismo delle cellule muscolari, i miociti, è specializzato per generare ATP. Esistono due tipolo-
gie di tessuto muscolare, diverse per fisiologia e utilizzo dei carburanti metabolici: il tessuto rosso a
contrazione lenta che produce basse tensioni ma resiste moltissimo alla fatica e il tessuto bianco a
contrazione rapida che può sviluppare velocemente grandi tensioni ma si affatica velocemente; il primo
tipo di tessuto è molto ricco in mitocondri e produce lentamente ma inmaniera costante ATP mentre il
secondo tipo ha la caratteristica di avere meno mitocondri e di bruciare ATP più velocemente di quanto
riesca a sintetizzarlo.
La muscolatura scheletrica può usare come carburante gli acidi grassi, i corpi chetonici oppure il
glucosio a seconda dello stato di attività. Il muscolo a riposo usa soprattutto gli acidi grassi derivanti

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dall’adipe e i corpi chetonici derivanti dal fegato e li ossida e degrada ad acetil-CoA che entra nel
ciclo di Krebs. Il muscolo in fase di moderata attività usa il glucosio ematico in aggiunta a acidi
grassi e chetoni: il glucosio è fosforilato, passa per la glicolisi, viene indirizzato nel ciclo di Krebs e
poi sfruttato per la fosforilazione ossidativa. Il muscolo in tensione massima ha una domanda di ATP
tanto grande da rendere insufficiente l’apporto in arrivo dal sangue e si ha dunque lo sfruttamento del
glicogeno muscolare che viene demolito producendo lattato. L’aumento della concentrazione di lattato e
la conseguente caduta del pH limita però l’efficienza muscolare e contribuisce al senso di affaticamento.
La muscolatura scheletrica contiene anche un’altra fonte di ATP, la fosfocreatinina che rapidamente
può rigenerare ATP dall’ADP grazie all’azione della creatinina chinasi:

Durante periodi di contrazione e glicolisi la reazione procede in direzione della creazione di ATP
mentre durante i periodi di riposo e recupero lo stesso enzima resintetizza la fosfocreatina a partire da
creatina ed ATP.
Dopo uno sforzo intenso la respirazione è affannosa per via dell’aumentata necessità di O2 che viene
sfruttato per la fosforilazione ossidativa nel fegato. L’ATP prodotto viene usato per la gluconeogenesi
nel fegato a partire dal lattato che è stato trasportato dai muscoli. Il glucosio così formato ritorna ai
muscoli per riformare le scorte di glicogeno in quello che viene chiamato ciclo di Cori.

22.4 Tessuto nervoso

Il tessuto nervoso e in particolare il cervello hanno richieste metaboliche molto precise: possono utiliz-
zare solamente glucosio come carburante e il consumo di ossigeno è costante ed elevato, pari a circa
il 20% del totale consumato a riposo. Altra caratteristica cruciale è l’assenza di scorte di glicogeno:
la dipendenza dai nutrienti in arrivo grazie al sangue è totale. La dipendenza dal glucosio è alleviata
in alcuni casi dall’uso del β-idrossibutirrato, un corpo chetonico formato a partire da acidi grassi nel
fegtato: questa capacità è importante durante digiuni prolungati in cui le scorte di glicogeno del fega-
to vengono esaurite. Durante digiuni estremi, prima che sopraggiunga il decesso da denutrizione, il
cervello si trova a sfruttare le proteine muscolari per ottenere glucosio attraverso la gluconeogenesi.
I neuroni ossidano il glucosio tramite glicolisi e ciclo di Krebs e il flusso di elettroni da queste alla
catena respiratoria fornisce tutto l’ATP usato da queste cellule; l’energia proveniente dall’ATP è in gran
parte usata per creare e mantenere un potenziale elettrico attraverso la membrana plasmatica grazie
alle pompe sodio potassio.

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