SECREZIONI BATTERICHE

La secrezione nei Gram coinvolge il trasporto attraverso lenvelope cellulare che consiste di 2 membrane (IM e OM e il periplasma interposto). I Gram in particolare hanno sviluppato strategie per esportare substrati nello spazio EC o direttamente nella cellula ospite. Vi sono diversi tipi di secrezione:

1. Secrezione di tipo I le proteine vengono secrete attraverso un macchinario semplice che attraversa interamente lenvelope.
Il traslocone consiste di una ABC (ATPase-binding-cassette), di una proteina di fusione di membrana e di un poro che attraversa lOM. I substrati di questa pathway, come lalfa-emolisina, posseggono una sequenza allestremit C-terminale non clivata.

La TSS1 viene utilizzata da:

a) E. coli;
b) Bordetella pertussis

2. Secrezione di tipo II I substrati di tale secrezione contengono una normale sequenza segnale N-terminale che media
lattraversamento della IM mediato dai trasloconi Sec o Tat. Le proteine si ripiegano nel periplasma prima di attraversare la OM, trasferimento che mediato da una struttura complessa definita secretone. Questo consiste di un poro conservato nellOM (la secretina) e una struttura pilus-like nella IM che potrebbe agire in qualit di pistone per spingere i substrati attraverso la secretina (poro dellOM). La biogenesi della secrezione di tipo II strettamente correlata a quella del pilo di tipo IV (omologia).

La TSS2 viene utilizzata, per la secrezione di tossine da:

a) P. aeruginosa;
b) Vibrio cholerae

3. Secrezione di tipo III caratterizzata dalla presenza dellingectisoma, che una struttura needle-like che forma un canale
il quale attraversa interamente lenvelope cellulare e si estende a prendere contatto con la cellula ospite. Larchittettura della struttura permette la diretta iniezione di fattori di virulenza dal citoplasma batterico allinterno della cellula ospite.

Viene utilizzata principalmente da:

a) Yersinia Pestis;
b) Salmonella tiphymurium

4. Secrezione di tipo IV trasporta substrati direttamente nella cellula ospite attraverso una complessa struttura transenvelope che culmina in una struttura fimbriale, il pilo, a livello della superficie cellulare batterica. Questo meccanismo pu trasportare DNA e proteine mediante un processo one o two-steps.

Viene utilizzata principalmente da: a) Bordetella pertussis;

b) H. pylori;

c) Legionella (utilizza anche la secrezione di tipo VI)

5. Secrezione di tipo V utilizza un semplice meccanismo two-step nel quale il traslocone Sec viene utilizzato per la
traslocazione attraverso la IM. Un dominio beta-barrel (al centro del quale vi un canale idrofilico) che contiguo alla proteina secreta o espresso come entit separata necessario per la traslocazione attraverso la OM. detta anche secrezione AT, ed uno dei sistemi di secrezione pi distribuiti tra i batteri gram -. Le sue principali caratteristiche sono la semplicit di traslocazione attraverso la OM, dal momento che i suoi substrati possono mediare il loro proprio trasporto attraverso il doppio strato lipidico esterno. Le proteine secrete dalla pathway AT sono tipicamente fattori di virulenza con diversi ruoli nella patogenesi.

6. Secrezione di tipo VI di recente scoperta. Il sistema richiesto per la secrezione di alcuni fattori di virulenza nel Vibrio
Cholerae e nello Pseudomonas aeruginosa. I substrati vengono sintetizzati senza la sequenza segnale Sec-type allestremit N-terminale, sicch il macchinario di traslocazione Sec-indipendente o Tat-indipendente. Questo tipo di secrezione si caratterizza per la presenza di vescicole che si dipartono dalla OM.

Quindi la secrezione di tipo VI si ritrova in: a) Vibrio cholerae;

b) Salmonella enterica; c) Pseudomonas aeruginosa;

d) Legionella pneumophila (utilizza anche la secrezione di tipo IV)

7. Secrezione di tipo VII sembra che il Mycobacterium tubercolosis abbia sviluppato un nuovo e specializzato tipo di
secrezione, per il trasporto di proteine EC attraverso la sua CW (cell wall) idrofobica e notevolmente impermeabile. Il genoma dei micobatteri codifica per 5 di questi sistemi di trasporto. Due di questi, ESX-1 e ESX-5 vengono coinvolti nella virulenza. I componenti di ESX-1 probabilmente formano una struttura multisubunit a livello dellenvelope cellulare molto simile a quella delle secrezioni di tipo I e di tipo IV. I batteri Gram secernono un ampio spettro di proteine le cui funzioni includono la biogenesi di organelli (quali pili e flagelli), lacquisizione di nutrienti, la virulenza e lefflusso di farmaci e di altre tossine. Il trasferimento di tali proteine a livello della superficie batterica coinvolge il trasporto attraverso lIM, il periplasma e lOM. Diverse pathways si sono evolute per la funzione secretiva. Queste pathways possono essere suddivise in 2 grandi gruppi:

1) Pathway Sec-dipendente le proteine che sfruttano tale pathway utilizzano un macchinario comune, il traslocone SEC, per
il trasporto attraverso la IM e si differenziano principalmente per il macchinario che media la secrezione attraverso lOM; la pathway Sec-dipendente raggruppa: Secrezione di tipo II; Secrezione di tipo V; I 2 partener secretori TPS e CU (chaperone usher);

2) Pathway Sec-indipendente tende a permettere il passaggio diretto dal citoplasma allambiente EC in un singolo step e non
coinvolge mediatori periplasmici. Questa pathway include:

T1S; T3S; T4S sempre Sec- indipendente; Tat un pathway Sec-indipendente alternativa che conosciuta come una traslocazione che sfrutta twinarginine; essa implicata nel trasporto di proteine, gi configurate e correttamente ripiegate, al periplasma.

TPS Il sistema TPS condivide numerosi similiarit con la pathway AT. La pathay TPS notevolmente diffusa tra i Gram ed dedicata alla secrezione di numerose proteine con funzioni di virulenza. La sua peculiarit quella di coinvolgere una proteina accessoria per la traslocazione delle proteine attraverso lOM. Viene utilizzata da: a) Bordetella pertussis; b) H. influenzae CU La pathway CU dedicata allassemblaggio e alla secrezione di una superfamiglia di strutture di superficie associate alla virulenza batterica. Questa pathway assembla tipicamente fibre rod-like (simil-bastoncellari) chimati pili e fimbrie ma anche possono assemblare strutture capsule-like amorfe. Viene utilizzata da: a) E. coli uropatogeni

SECREZIONE DI TIPO III Nella maggior parte le proteine batteriche vengono rilasciate nelle cellule ospiti da T3S. Lapparato di T3S consiste di 2 anelli che provvedono a un continuo flusso proteico attraverso la IM e la OM, incluso lo strato di PG. Lanello della IM il pi grande dei 2 anelli coassiale. Lanello della OM composto da proteien della famiglia delle secretine, che nota anche per essere coinvolta nella secrezione di tipo II. Una struttura needle-like sporge dalla superficie batterica ed associata allanello della OM. Batteri che sfruttano la T3S sono: E. coli (EPEC e EHEC); Shigella; Salmonella; Yersinia Pestis; Bordetella pertussis responsabile di malattia respiratoria, infezione del tratto urinario, setticemia ed endocardite; Chlamydia trachomatis ( un organismo a trasmissione sessuale); Chlamydia pneumoniae responsabile di malattia respiratoria, oltre che essere correlata al danno da aterosclerosi.

Lingectisoma un nano-macchinario che si evoluto per il rilascio di proteine batteriche, attraverso la secrezione di tipo III. Esso consiste di una struttura basale, che rassomiglia alla struttura basale di un flagello, sormontata da un needle (spuntone) e un filamento (o un lungo pilo).

SECREZIONE DI TIPO IV La secrezione di tipo 4 presente in tutti i plasmidi dei gram - negativi, questa secrezione, e quella di tipo 2ss, codificano una famiglia di proteine ATPasi che operano l'assemblaggio di filamenti exracellulari: pili flagelli e fagi filamentosi oppure nel trasporto di DNA dentro (trasformazione) e fuori da una cellula (coniugazione). La secrezione di tipo 4 si divide in due gruppi E ed F. La secrezione di tipo 4 multiforme, un macchinario di base che pu assumere almeno 3 meccanismi:

1.

Trasferimento diretto da battere a battere di nucleoproteine (DNA + proteine, con un meccanismo differente fra gram positivi e gram negativi). Trasferimento diretto del DNA. Trasferimento delle proteine (che abbiamo visto essere delle tossine)

2. 3.

In alcuni casi, la secrezione di tipo 4 permette il passaggio diretto di proteine da batteri a cellule eucariotiche, come nel caso della legionella pneumophila, tramite le quali modifica il vacuolo entro cui fagocitata dal macrofago .La secrezione di tipo 4 comprende al suo interno: a) Coniugazione;

b) Sistema tot icm della Legionella pneumophila;

c) Capacit di assumere o rilasciare DNA come in:

Campylobacter; Hhelicobacter pylori;

Neisseria gonorrhoeae.
La parte pi importante dellattivit secretoria di tipo 4 quello di trasferire nelle cellule proteine (tossine) per conto di batteri intracellulari.Si ha dunque una componente ATPasica, una componente che costituisce il canale e una componente che costituisce il pilum (su modello dellagrobacterium tumefaciens).

I modelli di riferimento quindi sono:

1. 2. 3.

Modello del canale (si suppone che si costituisca un vero e proprio canale) Meccanismo a pistone proteico (le proteine cambiano misura)

Per quanto riguarda i pili si ha un sistema in cui parte delle proteine coinvolte costituiscono un sistema di competenza nei casi in cui si trasferisce solo DNA (verso linterno o verso lesterno).

N.B. Per meccanismo di competenza si intende la capacit di una cellula batterica di compiere una determinata operazione.

BATTERI CON SECREZIONE DI TIPO IV: a) Legionella pneumophila;

b) Bordetella pertussis; c) Helicobacter pylori;

d) Nessun gram + (eccetto gli enterococchi che posseggono meccanismo di coniugazione)

MEMBRANE TARGETING Nei batteri, sia le proteine secrete che quelle di membrana vengono inzialmente sintetizzate nel citoplasma e successivamente dirette verso la IM per la traslocazione. Le proteine secretorie si legano allo chaperone SecB e poi vengono direzionate (targeted) verso SecA, che una ATPasi, probabilmente localizzata sulla superficie della membrana plasmatica. Molte proteine di membrana vengono direzionate alla membrana stessa attraverso la pathway SRP (signal-recognition particle). SRP si lega al sito di uscita del ribosoma. Il targeting delle proteine nascenti richiede GTP, e viene eseguito da parte di SRP dopo linterazione di SRP con il recettore FtsY. Dopo lidrolisi di GTP, SRP rilasciato da FtsY e la proteina di membrana nascente viene direzionata verso la traslocasi-Sec, per poter essere integrata nella membrana plasmatica. SRP un complesso di un RNA 4,5 S e di una GTPasi, che riconosce domini idrofobici transmembrana nelle proteine di membrana nascenti dal ribosoma.

SECREZIONI GENERALI DEI BATTERI Sec

Tat il meccanismo di twin arginine translocation, responsabile della traslocazione di proteine esportate che si ripiegano prima della traslocazione e che legano tipicamente cofattori metallici; le proteine vengono trasportate al periplasma;

YidC (o Insertasi) inserisce proteine Sec-indipendenti nella membrana citoplasmatica. Inoltre assiste anche la Sec-pathway nellinserzione di proteine nella membrana. Ha una funzione principale nellassemblaggio di proteine che trasducono energia, infatti in assenza del sistema YidC meno ATP.

Sortasi si ritrova principalmente nei gram +

REGOLAZIONE E CONTROLLO DELLATTIVIT METABOLICA

FORMAZIONE DI ENZIMI NEI BATTERI Le cellule batteriche possono cambiare il proprio pattern di enzimi, in modo da adattarsi allambiente specifico. Spesso la concentrazione di un enzima nella cellula batterica dipende dalla presenza del substrato per lenzima:

Gli enzimi costitutivi sono sempre prodotto indipendentemente dalla composizione del mezzo nel quale la cellula cresce;

Gli enzimi inducibili vengono prodotti dalle cellule in risposta a particolari substrati; ossia vengono prodotti soltanto quando ve ne il bisogno. Nel processo di induzione, il substrato provoca la formazione dellenzima, cos da essere chiamato induttore.

Un enzima reprimibile un enzima la cui sintesi viene downregolata dalla presenza, ad esempio, del prodotto finale della pathway a cui lo stesso enzima normalmente partecipa. In questo caso, il prodotto finale definito corepressore e pu agire sul repressore attraverso un meccanismo di inibizione allosterica.

REGOLAZIONE DELLE REAZIONI ENZIMATICHE Nelle cellule batteriche, le reazioni enzimatiche possono essere regolate in 2 modi:

a) Inibizione a feed-back controllo della regolazione dellattivit enzimatica, che viene utilizzato in genere per la
regolazione di pathway di biosintesi; definita anche end-product inihibition; tale inibizione regola lattivit di enzimi preesistenti.

b) End-product repression controllo della sintesi enzimatica che agisce nella regolazione di pathway di biosintesi, ma
anche nellinduzione enzimatica e nella repressione catabolica. Tale regolazione modula la sintesi di enzimi (ancora da produrre). La repressione catabolica considerata un controllo positivo in quando determina un aumento nella trascrizione delle proteine.

MECCANISMI DI GENETICA BATTERICA

Il modo migliore per osservare il nucleo di un battere quello dellassunzione di colorazioni, normalmente ad alta risoluzione (come colorazione di Voigen, Giemsa), attraverso cui possono vedersi batteri in attiva replicazione. Al microscopio elettronico impossibile vedere un nucleo, a meno che non si usino determinati accorgimenti. Larrangiamento del DNA cromosomico nei batteri piuttosto caratteristico. Segmenti consecutivi di DNA cromosomico sono disposti in domini supercoiled, i quali costituiscono una formazione circolare. Nel Caulobacter crescentus, lorigine della replicazione localizzata a livello del polo flagellato, mentre il terminus della replicazione si localizza al polo opposto. Inoltre, le braccia sx e dx del cromosoma sono orientate in parallelo rispetto allasse longitudinale della cellula. In E. coli, invece, ori e ter (origine e termine) sono entrambi localizzati al centro della cellula. Esistono batteri con pi cromosomi:

Le brucelle hanno 2 cromosomi; Le borrelie hanno cromosomi lineari e non circolari la borrelia burgdorferi la causa della malattia di Lyme

Il cromosoma, per, in generale unico e circolare, ed ha una condensazione importante, significativa. Lorganizzazione del cromosoma, il quale nelle specie batteriche pi piccole ha poco meno di 1 MLN di basi, mentre nei batteri pi grandi raggiunge anche 7 MLN di basi, comprende la presenza di geni sono distinguibili per la differenza in composizione di basi. Gli operoni sono organizzazione di geni sotto un unico promotore, in quanto gli operoni batterici sono policistronici. Il cromosoma batterico tipicamente contiene una singola origine di replicazione definita oriC. In E. coli, oriC costituita di ca. 250 paia di basi e contiene 9 elementi ripetuti BP (binding proteins), chiamati box Dna A, i quali sono siti di legame specifici per la proteina iniziatrice Dna A. La sequenza di consenso di questi box DNA A 5-TTATCCAC-3, anche se vi possono essere pi varianti. Dna A inoltre lega unaltra classe di sequenze, i siti I. La DNA A una ATP-asi, che a seconda del proprio stato di fosforilazione modula lattacco ai siti di consenso. In vicinanza dei box di DNA e ai siti I vi un elemento ricco in AT (adeninatimina) di DNA, definito DUE, composto di 13 paia di basi, il quale un a regione che contiene box di ATP-DNA, che sono simili ai siti I, e i quali legano selettivamente DnaA solo in presenza di ATP. Linterazione di DNA A con oriC favorisce la progressione dellinizio della replicazione. DnaA resta legata a tali siti lungo quasi tutto il ciclo cellulare, e inoltre oligomerizza. Assieme al DNA supercoiled e ai fattori strutturali del nucleoide, lassemblaggio della DnaA facilita direttamente il distacco dei filamenti dal DUE, cos da generare gli strands di DNA necessari alla formazione dellelicasi (DNA B-C) e del macchinario di replicazione (il REPLISOMA). I meccanismi di regolazione successivamente inattivano la DnaA stimolando lidrolisi di ATP durante la formazione del replisoma: a) Lelicasi nel B. subtilis prende il nome di DNA C, mentre il caricatore DNA I, DNA P e DNA D;

b) Lelicasi in E. Coli la DNA B, mentre il caricatore DNA C

Lelicasi si lega al DNA graize al riconoscimento del box di DNA. LA struttura che la DNA A riconosce una struttura HTH (helixturn-helix). La connessione tra il legame di ATP e lattivazione della DNA A un evento cruciale. Sebbene la DNA A si leghi strettamente ai box di DNA, indipendentemente dallo stato del proprio nucleotide, in verit essa si lega ai siti con minore affinit soltanto in presenza di ATP. Questa associazione sembra essere lo step finale e quanto pi necessario per la formazione del complesso nucleoproteico. Le AAA+ ATPasi sono ATPasi che sono associate a varie attivit cellulari, e comprendono diverse proteince che agiscono come oligomeri nel controllo di unampio spettro di processi biologici. Il modulo AAA+ pu essere suddiviso in 2 sottodomini:

a) Walker A motivo ricco in glicina, caratteristico dellATPasi; b) Walker B importante linterazione dei residui acidici di tale dominio con gli ioni magnesio associati.

MECCANISMI DI REGOLAZIONE DELLORIGINE DELLA REPLICAZIONE sempre pi evidente che i batteri utilizzano un ampio spettro di strategie di regolazione per prevenire la duplicazione aberrante dei propri genomi. In E. Coli, tali meccanismi operano di concerto per assicurare che la replicazione cromosomica avvenga ogni volta che vi sia un ciclo cellulare. In E. coli sia oriC che DNA A sono target di regolazione:

a) Il processo di sequestrazione dellorigine (ossia di oriC) assicura che le origine nuovamente replicate vengano
transitoriamente private della loro capacit di dar via a nuovi rounds di iniziazione il processo di sequestrazione modulato dallATP;

b) Linattivazione della DNA A, fa s che vi sia la possibilit di bloccare lattivit di tale fattore iniziatore al sito di origine.

SEQUESTRAZIONE DELLORIGINE

LoriC di E. coli contiene 11 siti GATC che sono disposti tra i box di DNA e lelemento DUE. Queste sequenze sono in
genere metilate a livello delladenina per via dellazione della DAM metiltrasferasi; ad ogni modo, immediatamente dopo il passaggio della forchetta di replicazione, i siti GATC possono ritrovarsi in uno stato transitorio emimetilato. La proteina SeqA si lega con alta affinit alle sequenza GATC emimetilate, unattivit di legame del DNA che, in combinazione con lalta densit di sequenze GATC a livello delloriC, permette il sequestramento delle origini recentemente replicate, cos da prevenire liniziazione. Quindi, SeqA interferisce sui siti pi deboli di legame della DNA A al Dna, cos da fungere da repressore dellinizio della replicazione. Evidentemente, molti siti GATC in oriC coincidono con siti di scarso legame della DNA A, cos da permettere a SeqA di legarsi, per bloccare direttamente lassociazione al DNA, e di settare oriC a uno stato di pre-iniziazione. Queste sequenze altamente ordinate e conservate sono inoltre coinvolte nellorganizzazione dei cromosomi nascenti figli.

SeqA costituita di un modulo di oligomerizzazione N-terminale che connesso al dominio C-terminale, il quale lega GATC ed interagisce con i nucleotidi di maggiore importanza delle sequenze GATC; ad ogni modo, SeqA necessita per legarsi stabilmente allelica di DNA di 2 sequenze di GATC emimetilate.

INATTIVAZIONE DELLA DNA A

Vi sono inoltre numerose regioni lungo il cromosoma, al di l di oriC, che contengono box di DNA e che possono legare la
proteina DNA A. Tra queste, il locus DAT A possiede unenorme capacit di legame alla DNA A, che viene quindi sequestrata dalla sua funzione di legame al DNA. Tale regolazione tiene comunque conto della titolazione di tali siti, ossia del numero di siti disponibili per il legame alla DNA A. La localizzazione prossimale di DAT A alla regione oriC, sembra

portare a interpretare la presenza di DAT A, come valvola di accumulo delle DNA A, cos che vi sia inattivazione della replicazione.

Linattivazione regolata della DNA A (RIDA) un altro evento nel controllo replicativo, ed stimolato direttamente dallidrolisi di ATP dalla DNA A, dopo che liniziatore (ossia DNA A) d luogo alla separazione dei due filamento. Questo importante, in quanto mutanti difettivi della capacit ATPasica di DNA A avranno un sovrainizio del ciclo cellulare. Componenti della RIDA sono: a) DNA pol III;

b) Proteina Hda (omologa della DNA A) essa si localizza alle origini non legate si lega alla subunit beta della
DNA pol III, cos da stimolare a questo livello lattivit ATP-asica della DNA A, ed inattivare la funzione stessa del fattore iniziatore (DNA A).

MECCANISMI DI TERMINAZIONE DELLA REPLICAZIONE La sequenza di terminazione la sequenza Ter in E. Coli, che blocca la forchetta di replicazione, in quanto una trappola per tale macchinario, il quale entra ma non riesce ad uscire da tale regione. La proteina terminatrice Tus (in E. coli si lega a Ter in forma di monomero), mentre i B. subtilis vi una proteina (che si lega al sito Ter come un dimero). Ciascun replisoma composto di una DNA pol III che responsabile della duplicazione di entrambi i filamenti stampo del DNA, assieme a un primosoma che sintetizza ripetutamente degli RNA primer per il legame iniziale del macchinario allo stampo di DNA. Il primosoma si muove in direzione 5-3, sostenuto dallelicasi DNA B, che anche responsabile della separazione dei filamenti di DNA. Il complesso Tus-Ter la struttura terminatrice del processo di replicazione. Il primo studio che mise in evidenza la durata del ciclo di replicazione batterica fu quello di Jacob Bolmann, il quale intu che i plasmidi (materiale cromosimico circolare, autoreplicantesi, indipendente dal cromosoma) possono in alcuni casi inserirsi lineramente nel cromosoma batterico circolare. Quando questo accade, vi pu essere coniugazione, per cui vi passaggio di geni del cromosoma batterico da un cromosoma allaltro. Bolmann, attraverso il famoso esperimento dellaccoppiamento interrotto, cap che il DNA batterico era circolare, nonch anche che i plasmidi negli HFR (high frequency ricombination) si potevano inserire in punti diversi del cromosoma, cos da riuscire a calcolare lintera durata del ciclo di replicazione batterica, il quale di ca. 100 minuti. Il complesso Tus-Ter inizia la sua attivit a 10 minuti dallinizio della replicazione e termina a ca. 55 minuti. Questo tipo di mappaggio temporale ha permesso di interpretare le funzioni fenotipiche (ossia di espressione di determinate proteine o di replicazione di determinati geni) in base al minutaggio:

a) La replicazione inizia a oriC, e prosegue bidirezionalmente per la presenza di 2 forchette replicative. OriC posta a 85
minuti, e le 2 forchette si muovono in due direzioni opposte, terminando a 28 minuti (ossia nella posizione 28 minuti del batterio coli non vuol dire dopo 28 minuti). La regione 28 minuti una regione con 5 geni Ter, 3 dei quali sono particolarmente vicini (ter A, ter B e terC). La replicazione si studia maggiormente nei plasmidi che nei batteri. Nel plasmide R6K si dimostrato la presenza di 2 origini e di un singolo termine. La replicazione inizia nella regione alfa, nonch anche nella regione beta termina a livello della stessa regione Ter. Nel 1977 fu determinato il sito di terminazione nel cromosoma di E. coli, attraverso lutilizzo di plasmidi R (plasmidi di resistenza batterica resistenti agli antibiotici), che sono plasmidi coniuganti, i quali scambiandosi geni sono in grado di resistere agli antibiotici. Il Terminus di coli non posto in una regione singola alla quale si ancora Tus, ma tra 23-55 minuti. Per cui i siti di terminazione sono pi di uno; le sequenze di consenso sono ricche in timina e in guanina e non producono siti di legami molto stabili, dal momento che il macchinario di terminazione deve potersi legare e slegare facilmente. Il gene tus si trova a 11 paia di basi dopo il sito di TerB. Tus vuol dire Termination Utilization Substance. Il suo promotore la regione posta a -10 basi. La proteina Tus si lega a Ter e blocca la replicazione. La presenza di Tus attiva riduce la sua trascirzione, mentre la presenza di molti siti TerB favorisce la trascrizione di Tus, in quanto si hanno pi promotori. Tus una proteina di 308 aa. Il complesso Tus-TerB blocca la proteina pi importante per la replicazione, la DNA B, che lelicasi responsabile della separazione dei filamenti muovendosi in direzione 5-3, cos da permettere lazione della DNA pol III. Un

filamento (quello leader leading strand) replicato continuamente, mentre il lagging strand sintetizzato in maniera discontinua attraverso una seria di frammenti (segmenti di Okazaki). Vi inoltre il bloccaggio della DNA primasi (DNA G), sulla quale agisce anche lelicasi DNA B. Quando il replisoma viene bloccato dal complesso Tus-Ter, la sintesi del leading strand viene fermata 4 basi prima della sequenza di 6 G-C posta in TerB. Invece, per quel che riguarda il lagging strand, la sintesi pu essere bloccata in vari punti (a 55, 66, 82 basi prima di TerB).

CITOCHINESI BATTERICA Nei batteri la replicazione del DNA avviene contemporaneamente alla divisione cellulare. Al termine della replicazione, vi un punto di divisione cellulare, necessario per la separazione dei 2 cromosomi neoforamtisi, che devono raggiungere la corretta posizione. Molte proteine sono riconosciute essere specificatamente coinvolte nel processo di divisione celluare. Molte di queste proteine hanno il prefisso Fts, e sono ancorate alla membrana cellulare; il loro dominio pi grande protrude nel citoplasma o nel periplasma.

1) La citochinesi nei gram + regolata dallavanzamento circolare del setto;

2) La citochinesi nei gram sembra essere correlata alla costrizione dellanello FTSZ. Infatti lassemblaggio del divisoma
inizia con il posizionamento dellanello FtsZ al centro della cellula. Lanello viene ad essere stabilizzato da FtsA e ZipA (Zinteracting protein A). Successivamente vi il reclutamento allanello citochinetico di FtsK, FtsW, FtsQ, FtsL e di FtsN.

La divisione inizia nel momento in cui viene posizionato FtsZ in prossimit della membrana citoplasmatica al centro della cellula, cos da suggerire un legame stretto tra la polimerizzazione citoplasmatica di FtsZ e la sintesi periplasmatica del PG.

La forza di citochinesi fornita da un meccanismo contrattile basato su un complesso di actomiosina. Le proteine motrici sono kinesina, miosina, dineina.

Nel B. subtilis stata identificata una proteina, EzrA, che modula la frequenza e il posizionamento della formazione dellanello FtsZ. Nonch sembra avere un ruolo regolatore fondamentale nella depolimerizzazione di FtsZ durante la contrazione dellanello.

Vi sono inoltre numerose proteine quali quelle di partizione (PAR scoperte e studiate solo nei plasmidi) che sembrano intervenire nel processo di costrizione dellanello.

stato scoperto che la formazione dellanello di FtsZ in E. coli coincide con la terminazione della replicazione del DNA, e questo ha portato a sostenere la sua preponderante importanza allinterno del processo di divisione cellulare.

Oggigiorno si parla di segresoma, ossia di un complesso multiproteico che porta alla segregazione dei cromosomi replicati.

CONDENSAZIONE DEL DNA E SEGREGAZIONE CROMOSOMICA

Come gli eucarioti, i procarioti posseggono proteine strutturali di mantenimento cromosomico (SMC protein). La proteina SMC-like di E. coli Muk-B, che ha funzione simil-istonica, ossia di mantenimento della struttura genomica batterica. Essa ha a che fare con la segregazione batterica. un omodimero con una forma a roccehtto con le estremit tubulari. Lega lATP e il GTP, nonch anche il Dna:

a) La parte N-terminale pu legare FtsZ polimerizzata, quindi lanello, in presenza di GTP quindi Muk B sembra legare il
DNA a FtsZ, anche se in verit ci sono ipotesi contrarie dettate dal fatto che Muk B sembra sia confinata al nucleoide.

In B. subtilis esiste una molecola SMC-like di condensazione del DNA, il quale manipolato nel momento in cui (negli eucarioti) si ha la mitosi. Il cromosoma batterico si segrega mentre viene replicato, quindi non vi pu essere condensazione simultanea. Quindi queste proteine pi che avere una funzione di condensazione, hanno una funzione di impalcatura. Importante stata anche lindividuazione delle proteine Min (si chiamano cos, perch se mutate non permettono pi la divisione nei piani equatoriali nei bacilli, in particolare in E. coli), le quali sono fondamentali per lidentificazione dei piani di divisione ai livelli dei poli:

1) In E. coli tali proteine Min oscillano tra i 2 poli (con un periodo di 1-2 minuti), cos da creare 2 gradienti di concentrazione,
che siano meno elevati al centro, cos da favorire il posizionamento di FtsZ proprio al centro della cellula;

2) In B. subtilis non vi questa oscillazione

LETHAL DOSE AND INFECTIOUS DOSE IN BACTERIA

La potenza di una tossina si basa sul calcolo della LD50. The Lethal dose (LD) is an indication of the lethality of a given substance or type of radiation. Because resistance varies from one individual to another, the 'lethal dose' represents a dose (usually recorded as dose per kilogram of subject body weight) at which a given percentage of subjects will die. The most commonly-used lethality indicator is the LD50, a dose at which 50% of subjects will die. 1. ID50 [infectious dose 50%] a. Infection never assured: i. Different organisms have different per-individual probabilities of successfully infecting a given host. ii. For some pathogens very large number must be exposed to the host in order for infection to occur while for other pathogens relatively few individual microorganisms are necessary to induce disease. b. Measurements of pathogenicity: i. The infectious dose 50% is a measure of the likelihood of a host acquiring a disease given exposure to a pathogen. ii. The likelihood that disease will occur increases as the number of pathogens gaining access to the host increases. iii. The number of pathogens required to cause disease (or, at least, infection) in half of the exposed hosts is called the ID50. c. More than one: i. ID50s typically are 1, that is, it usually takes far more than just exposure to a single organism for a host to become infected. ii. This is one reason why we can be surround by microorganisms and even pathogens and still remain healthy most of the time.

2.

LD50 [lethal dose 50%] a. The number of pathogens required to cause lethal disease in half of the exposed hosts is called an LD50. Adherence

b.

c.

Attachment to host: i. Once entry has been accomplished, most microorganisms have mechanisms of host attachment, a.k.a., adherence. ii. For bacterial pathogens, successful adherence is usually a necessary prerequisite for virulence and even infection. Such microbial structures as glycocalyx and fimbriae (i.e., attachment pili) are involved in adherence.

Damage to the host

d. During infection there are three general mechanisms by which a pathogen can induce damage to the host:
i. ii. iii. Direct damage e. Consequences of pathogen growth: Direct damage results from the means a pathogen utilizes to: i. adhere ii. grow iii. evade host defenses g. Direct damage is usually the more minor of the three general methods of pathogen induced damage. Direct damage via hypersensitivity reactions Toxin induced-damage

f.

LE SPORE E LA SPORULAZIONE
I batteri si riproducono per scissione semplice. Alcuni bacilli Gram +, aerobi ed anaerobi (appartenenti rispettivamente ai generi Bacillus e Clostridium), in determinate condizioni ambientali danno origine a particolari cellule strutturalmente e funzionalmente differenziate che prendono il nome di SPORE. Le spore batteriche sono precisamente delle endospore, ossia si originano allinterno della cellula madre (SPORANGIO) divenendo libere nellambiente in seguito alla disgregazione dello sporangio. Le spore sono delle forme di resistenza che consentono al batterio di sopravvivere in un ambiente sfavorevole. RIPRODUZIONE BATTERICA Il materiale genetico primario dei batteri (DNA) organizzato in una unica struttura (unica molecola) di forma circolare, cui si d il nome di cromosoma batterico o cromonema. Il materiale cromosomico ancorato alla membrana citoplasmatica; la duplicazione del cromosoma batterico si accompagna alla duplicazione del punto di attacco alla membrana, per cui i 2 nuovi cromosomi sono ancorati alla membrana citoplasmatica separatamente; successivamente si ha laccrescimento delle membrane batteriche ed il conseguente allungamento della cellula batterica, partendo dal punto di separazione tra le 2 zone della membrana cui sono ancorate le 2 strutture cromosomiche. Continuando laccrescimento della cellula nella porzione centrale, le 2 strutture cromosomiche si allontanano sempre di pi luna dallaltra per lallontanamento reciproco delle zone della membrana cui essi sono ancorati. In questo modo le 2 strutture cromosomiche vengono distanziate in modo sufficiente perch la separazione delle 2 cellule figlie le trovi dislocate nelle 2 zone corrispondenti di citoplasma. Nei batteri, la presenza di un unico cromosoma consente la esatta ripartizione del materiale genetico fra le 2 cellule figlie mediante un sistema di dislocazione assai semplice, ma altrettanto efficace (che possiamo considerare una specie di apparato mitotico rudimentale) nel quale la membrana citoplasmatica, ancora una volta gioca un ruolo fondamentale. La separazione delle cellula batterica nelle 2 cellule figlie, per scissione semplice, causata dalla formazione di un setto che si diparte dalla membrana citoplasmatica e si approfondsce con direzione centripeta nel citoplasma lungo un piano che nei bacilli perpendicolare allasse maggiore della cellule e nei cocchi pi o meno equatoriale.

Allinterno del setto di membrana citoplasmatica si forma contemporaneamente un ulteriore setto di parete cellulare che pu rimanere a lungo incompleto mantenendo una stretta continuit spaziale fra le varie cellule neo formate che rimangono pertanto riunite in aggruppamenti caratteristici. SPORE E SPORULAZIONE Le spore sono cellule disidratate. Esse sono in grado di disperdersi nell'ambiente per resistere a condizioni avverse e, successivamente, generare (o rigenerare) un individuo vitale, in habitat pi adatti alle loro condizioni di vita (temperatura ottimale, presenza di acqua e di sostanze nutrienti). Esistono due categorie radicalmente diverse di spore: le spore di resistenza, dalle quali ritorna alla vita lo stesso individuo che ha prodotto la spora (si tratta normalmente di esseri unicellulari e, pi precisamente, di eubatteri); le spore di riproduzione, che costituiscono un mezzo di riproduzione (per es. funghi); le spore di riproduzione differiscono dai semi perch si originano senza fecondazione.

Spore di resistenza Le spore di resistenza o Endospora si formano in risposta a condizioni ambientali squilibrate come ad esempio temperature non ottimali o scarsa presenza di nutrienti e di acqua. Durante lo sviluppo di un'endospora l'accrescimento vegetativo o la divisione cellulare si arrestano. La spora formata viene espulsa dalla cellula dopo una lisi della parete cellulare, in questa forma la spora in uno stato di dormienza ovvero il suo metabolismo quasi impercettibile; rimane in queste condizioni fino a che le condizioni esterne non ritornano favorevoli. Queste variazioni positive nell'ambiente provocano: 1. 2. 3. una attivazione della spora una successiva idratazione una fase di crescita e sviluppo

Il tempo rivegetativo di una spora di circa un'ora. Le spore batteriche sono tipiche di alcuni Gram + quali i bacilli, gli Streptomyces e i clostridri. Spore riproduttive Un altro tipo di spore sono le spore riproduttive, presenti nei funghi, nelle piante e in molti protisti. Si dividono in mitospore che, essendo geneticamente identiche alle cellule somatiche dell'individuo che le produce, danno luogo a riproduzione agamica, e meiospore aploidi ma derivanti da individui diploidi, che danno riproduzione gamica in quanto geneticamente diverse dalle cellule del genitore. Le spore sono organizzate a strati:

1) Primo strato o esosporio; 2) Secondo strato o rivestimento strato rigido di natura proteica con alternanza di aa che impediscono la degradazione della
parete operata dalle proteasi ;

3) Terzo strato o cortex strato di PG; 4) Quarto strato o core, che contiene
DNA; Ribosomi; Ac. dipicolinico

FISIOLOGIA DELLA SPORULAZIONE E SIGNIFICATO DELLA SPORA La sporogenesi batterica pu essere considerata una particolare espressione della capacit di adattamento cellulare alla disponibilit saltuaria di alimenti nellambiente. Il meccanismo alla base della sporogenesi pu essere interpretato come una derepressione, operata

da particolari situazioni metaboliche, dei geni che regolano la sintesi degli enzimi e quindi lo svolgimento dei processi metabolici necessari alla produzione di spora.

INFIAMMAZIONE
IL RUOLO DELLINFLAMMASOMA PROTEINE NLRs (NODs e NALPs) Le proteine NODs e NALPs sono una serie di proteine che costituiscono il pattern recettoriale di riconoscimento, che sono intracellulare (al contrario dei TLR che sono extra-cellulari). Sono responsabili del legame al PMAP. Il dominio effettore pu essere:

a) Dominio di reclutamento di caspasi per le NODs;

b) Dominio pirinico per le NALPs

Le NALPs sembrano avere un ruolo molto importante nellimmunit innata durante linfezione. La funzione delle proteine NALPs quella di agire come scaffold molecolari per linflammasoma, una piattaforma molecolare per lattivazione delle caspasi infiammatorie, in modo particolare caspasi-1, la quale necessita per la propria attivazione anche dellazione della caspasi-5. Linflammasoma sembra attivarsi in risposta al LPS, cos da indurre lattivazione della caspasi-1, che successivamente avvia il rilascio di IL-1 e IL-18. Lattivazione della caspasi-1 fondamentale per la risposta infiammatoria durante la sepsi.

I PILI
Sono appendici pi rigide rispetto ai flagelli, non sono lunghe e sono fondamentali per la coniugazione e per linterazione dei batteri con i fagi. I pili posseggono quindi dei recettori per i batteriofagi, inoltre i pili di tipo I mannosio-sensibili mediano ladesione di alcuni batteri a cellule eucariotiche. I pili di tipo I sono di 7 nm, e sono costituiti da subunit di pilina di 17 kDa.

I pili ed altre appendici fanno parte dei meccanismi di virulenza di alcuni batteri, in modo particolare degli enteropatogeni e quindi degli E.Coli, i quali sono i principali costituenti della flora batterica aerobica nelluomo. I Coli posseggono gli antigeni O (antigeni del LPS) e gli antigeni H (antigeni dei flagelli). Ci sono almeno 6 gruppi di coli (ciascuno con i propri sierotipi) che sono patogeni.

La diarrea determinata o da EPEC (enteropatogeni) o da ETEC (enterotossigeni); gli enteropatogeni (EPEC) determinano una particolare lesione ultrastrutturale attraverso la quale essi entrano in diretto contatto con la membrana plasmatica apicale dellenterocita, causando una distruzione localizzate dellorletto a spazzola intestinale e una distorsione locale della struttura della membrana. Questo contatto provoca un marcato riarrangiamento del citoscheletro, in modo particolare la formazione di un dominio ricco in actina a livello del contatto tra cellula e battere, producendo il cosiddetto piedistallo; tale processo definito come AE lesion (attaching and effacing lesion), cos da permettere il movimento del battere a livello della superficie cellulare. Tale lesione provoca una riduzione nellassorbimento della mucosa intesintale, che inevitabilmente conduce a uno squilibrio elettrolitico con conseguente diarea. La AE lesion dipende da innumerevoli fattori come la temperatura, lo stress meccanico, ecc. In determinate e appropriate condizioni, le cellule EPEC esprimono il bundle-forming-pili (Bfp), un pilo che forma un ciuffo e che permette lancoraggio batterico alla cellula. LEPEC aderisce alle cellule epiteliali attraverso il cosidetto modulo di aderenza localizzata. Tale fenotipo inducibile, per cui in un terreno di coltura gli EPEC si localizzano soltanto in alcuni punti, che corrispondono ai moduli di aderenza localizzata. Laderenza dipende sia da geni cromosomici sia da geni presenti sul plasmide (che esprimono lEAF EPEC adherence factor), per cui la possibilit che un Coli sia EPEC dipende dal fatto che sul plasmide abbia geni che specificano per EAF. LEAF assieme altri prodotti dei geni cromosomici costituisce il Bfp. Il Bfp costituito da ciuffi larghi 50-500 nm e lunghi 14-20 micrometri e si dispongono formando un network tridimensionale. Esso sembra appartenere a pili del IV tipo, similmente a quelli espressi da altri batteri quali Pseudomonas aeruginosa, Neisseria gonorrhoeae, Vibrio cholerae. Il Bfp necessario per poi permettere lespressione dei prodotti dei geni che costituiscono le fasi successive di virulenza. LOCUS OF ENTEROCYTE EFFACEMENT Labilit di EPEC di indurre AE lesions associata alla presenza di una grande isola cromosomica di patogenicit, definita LEE (locus of enterocyte effacement), la quale contiene i geni che provvedono a fornire la AE lesion. LEEs si ritrovano negli EHEC, nellHelicobacter pylori e in altri batteri. Il primo gene identificato nella LEE stato il gene eae che specifica per lintimina, la quale presente in tutte le AE lesions, ed fondamentale per attivare le pathway per la trasduzione del segnale che portano al rimodellamento della superficie cellulare eucariotica a livello del sito di lesione batterica. Mediante tali processi si pu avviare infine la secrezione di tipo III ( un meccanismo di esportazione di proteine, in modo particolare ESPA, ESPB, ESPD) che caratterizza lazione patogena di EPEC. Se non avvengono questi processi, il meccanismo di secrezione non viene avviato.

ASSEMBLAGGIO DEI PILI Per assemblare i pili c bisogno di proteine assemblatrici prodotte in sede citoplasmatica e poi esportate mediante un sistema Secdipendente:

Lestremit N-terminale del peptide segnale delle subunit dei pili (o fimbrie) viene clivata durante il loro trasporto attraverso la membrana citoplasmatica, mediata dal sistema Sec-dipendente; Nel periplasma, lo chaperone (C) completa il dominio Ig-like delle subunit della fimbria in qualit di donatore del filamento beta; Linterazione dello complesso chaperone/subunit della fimbria con la proteina U (usher) permette la sostituzione dello chaperone donatore del filamento beta con lestremit N-terminale del filamento beta di una seconda subunit, cos da unire le varie subunit in unico filamento che trasportato attraverso la OM, mediante il LEE.

TIPI DI PILI Seguendo la filogenesi delle proteine C ed U stato possibile raggruppare i pili in varie famiglie (alfa, beta, gamma, ecc).

1. Le fimbrie beta sono caratteristiche dellE. Coli K12; 2. Le fimbrie gamma1 sono caratteristiche delle Enterobacteriaceae (gammaproteobacteria), tra cui ricordiamo E. coli (alcuni
sierotipi), Proteus mirabilis; tali fimbrie corrispondono alle fimbrie di tipo 1 (mannosio-sensibili);

3. Le fimbrie kappa sono quelle pi flessibili e sono caratteristiche delle Enterobacteriaceae. Il pilo sessuale appartiene a
questo tipo di fimbrie.

PILO TIPO IV Si ritrova nella Legionella pneumophila, in Neisseria gonorrhoeae, in Neisseria meningitidis, in Pseudomonas aeruginosa, in E. coli (15) e in Vibrio cholerae. I pili di tipo IV sono caratterizzati da una regione di omologia allestremit amino-terminale della sequenza aminoacidica. Le componenti proteiche coinvolte nella formazione dei pili di tipo IV sono state implicate nella secrezione proteica, nella motilit e nellassemblaggio del filamento di interazione fagica.

I FLAGELLI

Il flagello dei batteri sia un organello motore, sia un apparato di assemblaggio e di esportazione delle proteine. Si estende dal citoplasma allesterno della cellula. Tutte le subunit proteiche degli elementi esterni devono essere esportati, e tale esportazione implica il coinvolgimento di una secrezione di tipo III, anche utilizzata per la secrezione di fattori di virulenza. Sei dei componenti dellapparato di esportazione sono proteine integrali di membrana e sembrano siano localizzate allinterno del corpo basale del flagello. Altre 3 componenti sono solubili e sono: una ATPasi che indirizza lesportazione, un regolatore dellATPasi, e uno chaperone. I substrati esportati diffondono attraverso uno stretto canale nella struttura crescente per poi assemblarsi allestremit distale, spesso con laiuto di una struttura di capping.

STRUTTURA DEL FLAGELLO Corpo basale Consiste di diversi anelli sovrapposti:

MS ring anello di proteine integrali di membrana; Un bastoncello che attraversa lo spazio periplasmico; P ring anello periplasmico; L ring anello dellOM (outer membrane).

Il corpo basale una struttura passiva, infatti riceve la torsione dal rotore per poi propagarla attraverso la molla al filamento.

Il motore flagellare

Funziona attraverso un meccanismo rotore, e pu essere suddiviso in:

Statore Consiste di diverse copie, organizzate attorno al corpo basale, di una struttura di integrale di membrana costituita da 2 proteine: MotA e MotB. Lo statore legato non covalentemente al peptidoglicano;

Rotore Consiste di diverse copie di una proteina chiamata FliG; legato non covalentemente allMS ring e assieme alle proteine Mots responsabile delle generazione della torsione.

Lo switch La motilit sotto il controllo di fattori ambientali e il motore possiede pi di una modalit di azione come risposta a tali diverse segnalazioni. Il meccanismo di movimento pi studiato quello della rotazione in senso orario o antiorario, la quale richiede uno switch, che in Salmonella consiste di 3 proteine: FliG, FliM e FliN. FliG sembra fondersi con la proteina FliF dellMS ring e partecipare sia allo switching che alla generazione della torsione, mentre FliM il target per loutput della trasduzione di segnale. Il gancio una struttura cilindrica, che funziona come una giunzione universale. Nei batteri come Salmonella, che possiede molteplici flagelli che emergono da diversi punti della cellula, il gancio permette aquesti flagelli di funzionare effettivamente come tali. La lunghezza dellhook viene controllata dalle proteine FlhB e FliK dellapparato di secrezione.

Il filamento flagellare di forma allungata e cilindrica. La struttura sembra essere costituita di 11 fibrille che formano il cilindro.

Proteine capping Allestremit del filamento crescente vi una struttura di capping. Tra queste ricordiamo FliD che essenziale per la polimerizzazione del filamento.

Proteine di giunzione Tra il gancio e il filamento vi sono 2 piccole zone di collegamento che vengono chiamate proteine di giunzione. Essi sono adattatori di struttura. Una volta che il gancio ha raggiunto la sua forma matura, la hook cap (costituita da FlgD) viene sostituita da 3 successive zone proteiche: la prima proteina di giunzione gancio-filamento FlgK, la seconda proteina di giunzione FlgL e infine la terza proteina che quella del filament-cap, ossia FliD.

ASSEMBLAGGIO Lordine di assemblaggio delle strutture flagellari un meccanismo lineare che prosegue incorporando strutture da quelle pi prossimali a quelle pi distali: dai componenti integrali e periferici di membrana ai compartimenti periplasmico e dellOM, fino ai componenti che si estendono allesterno della cellula. Questo assemblaggio recluta la pathway Sec per i componenti integrali di membrana e per altri. Ad ogni modo, la maggior parte delle componenti sfrutta una patwhay di secrezione di tipo III. Nellassemblaggio sono coinvolte diverse proteine. Tutte le proteine che devono fare un ampio lavoro devono avere a disposizione energia facile, che si ottiene legando un nucleotide ad alta energia, avendo dominio -asico. La proteina che deve essere trasportata allesterno ha un suo regolatore e uno o pi accompagnatori( le proteine non devono essere modificate nei passaggi). Esistono inoltre proteine di integrazione con il motore flagellare, quali le proteine del MS ring, del P ring (tutte queste sono esterne). I primi eventi nellassemblaggio del flagello sono quelli di assemblaggio dei componenti integrali di membrana attraverso il sistema Sec.

 Lassemblaggio dellMS ring della membrana citoplasmatica pu verificarsi dapprima in assenza di altri componenti
flagellari. LMS ring fondamentale per la struttura flagellare, per il suo assemblaggio e per la sua funzione. LMS ring sembra essere importante come base di montaggio per lo swith del rotore, inoltre esso si connette mediante FliE allintera struttura assiale, cos da permettere la rotazione flagellare. Infine esso punto di localizzazione dellapparato di esportazione.

Unaltra componente importante quella delle proteine Mot, le quali possono essere inserite nella membrana in qualsiasi
momento. Esse costituiscono lo statore e sono proteine integrali di membrana che circondano lMS ring.

Assemblaggio del rotore/switch FliG e lo C ring (costituito da FliM e FliN) insieme costituiscono il rotore/switch e
vengono assemblati sullMS ring. Sono proteine periferiche di membrana.

ESPORTAZIONE FLAGELLARE: PATHWAYS TIPO III Le caratteristiche di tale meccanismo (utilizzato come meccanismo di virulenza da alcuni batteri in questo caso non verranno assemblati lhook e il corpo basale) sono: Costituzione di una struttura ben definita che serve allassemblaggio e alla motilit flagellare; Fatta eccezione per FliK (proteina di controllo della lunghezza della molla) e per FlgM (fattore antisigma) le proteine esportate vengono incorporate nella struttura. Le componenti dellapparto di esportazione sono divise in:

a) Solubili FliH, FliI e FliJ sono aspecifiche e sono coinvolte nellesportazione di tutti i substrati;
b) Associate alla membrana. Vi un continuo canale centrale nella struttura nascente. Le subunit vengono assemblate distalmente, attraverso la diffusione per questo canale, che riceve tali subunit da una parte della membrana al centro dellMS ring.

ASSEMBLAGGIO DI FliE E IL BASTONCELLO FLAGELLARE La prima struttura che utilizza la pathway di tipo III probabilmente FliE, la quale una proteina inusuale. Essa una componente del corpo basale, ed non solo un substrato che attraversa il canale di tale pathway ma facilita anche il trasporto di altri substrati.

Le proteine bastoncellari sono molteplici, ma 4 di queste sono definite come FlgB, FlgC, FlgF e FlgG. Esiste inoltre unaltra proteina FlgJ che bifunzionale, possiede unattivit muramidasica allestremit C-terminale, nonch un legame ad alta affinit per le proteine bastoncellari allestremit N-terminale; La muramidasi del dominio C-terminale di FlgJ sembra essere importante per la digestione locale dello strato di PG, permettendo linserimento del bastoncello nascente.

ASSEMBLAGGIO DI L RING E P RING Sia la proteina periplasmica FlgI sia la lipoproteina L-ring dellOM FlgH vengono esportate attraverso il sistema Sec (o primario) per 2 motivi: perch sono destinate a compartimenti definiti e quindi non vi rischio di diluizione; inoltre, perch esse devono essere assemblate prossimalmente in modo circonferenziale e non distalmente.

ASSEMBLAGGIO DEL GANCIO Consta della sostituzione del rod cap, con lhook cap, mediante FlgD. Da questo punto in poi laddizione di altre subunit avviene soltanto a livello endogeno. La formazione dellhook cap sembra essere particolarmente correlata allo sviluppo dellL ring.

APPARATO DI ESPORTAZIONE

FliI lATPasi che energizza il processo di esportazione;

FliH importante per un assemblaggio efficiente del flagello;

FliJ, FliH e FliI sembrano essere tra di loro in connessione, e hanno specificit per i domini solubili delle componenti di
membrana dellapparato di esportazione FlhA (interagisce con lMS ring) e FlhB ( fondamentale nel decidere quale substrato deve essere esportato ad ogni stadio del processo di assemblaggio);

FliO, FliP, FliQ e FliR sono proteine associate alla membrana che intervengono anchesse nel meccanismo di esportazione
con ruolo ancora sconosciuto. Sembrano localizzarsi a livello del poro centrale allinterno dellMS ring del corpo basale flagellare.

Lo switch signal sembra essere dato dal legame di FliK (implicato nel monitorare la lunghezza del gancio) e FlhB. A tale
livello c un cambiamento di specificit di substrato per il passaggio dalla fase di assemblaggio delle parti iniziali del flagello allassemblaggio del filamento vero e proprio. In tale fase fondamentale il ruolo dellhook. Quando esso ragginge i 55 nm la specificit di substrato passa da substrati bastoncellari o del canale a substrati propri del flagello. C una proteina che determina questo; si chiama FlgM ed inibisce la trascrizione dei geni tardivi sequestrando il 28 (il fattore sigma specifico flagellare = la subunit dellRNA pol batterica che riconosce sequenze del promotore). Dopo lexport di FlgM inizia la produzione del filamento. Le 3 proteine principali che intervengono nello switch sono:

1) FlhB un membro dellapparato di esportazione, che va incontro ad autoclivaggio per formare 2 sottodomini che
interverranno nello switch;

2) FliK misura la lunghezza del gancio e interagisce con FlhB; 3) Flk (o fluke funziona come un secondo blocco a livello del processo di switch, per prevenire che si inizi la
formazione del filamento prima che il bastoncello e il gancio abbiano completato la loro maturazione).

Il modello pi recente per esplicare la modulazione della lunghezza del gancio quello che certifica la presenza di un molecular-clock che si basa su 3 punti fermi: la overespressione di proteine del gancio produce un allungamento della struttura dellhook; un hook mutante che sia difettivo nella proliferazione produce un gancio ridotto; loverespressione di un mutante difettivo di proliferazione produce un gancio di lunghezza normale. Queste informazioni portano a considerare che vi sia un orologio che tenga conto del momento in cui dare inizio allo switch.

evidente quindi che vi sia un accoppiamento tra la genetica del flagello e lassemblaggio del flagello stesso. E un sistema regolato a livello genetico e a livello trascrizionale, ossia un sistema di equilibrio tra linibizione o il blocco della trascrizione di fattori sigma, e lattivazione di fattori sigma. Questo un metodo citato gi per quanto riguarda il programma della sporulazione, e la deprogrammazione della sporulazione. Anche nel flagello il sistema a livello genetico regolato dal meccanismo di attivazione e disattivazione dei geni che producono il sigma.

Il locus genico di controllo flagellare nella Salmonella Typhumurium di 60 geni. I trascritti di tali geni sono organizzati in modo gerarchico, che si basa sulla presenza di 3 classi di promotori che agiscono alternativamente in risposta al meccanismo di assemblaggio. In S. Typhumurium (S.T.) loperone principe FlhDC, il quale controlla sia la sintesi che lassemblaggio del flagello. Risponde a stimoli chemotattici, attivando fosfatasi e chinasi, le quali attiveranno o inibiranno lespressione di fattori di trascrizione che a loro volta andranno a stimolare o bloccare i promotori. FlhDC produce sia proteine FlhD che proteine FlhC, le quali assieme formano un complesso multimerico, che funziona come attivatore trascrizionale dipendente dal sigma pi frequente nei batteri, ossia quello a cui sono sensibili buona parte dei promotori dei geni e degli operon batterici, in modo particolare in tal caso i promotori flagellari. Questi promotori, attivati dal complesso multimerico, trascrivono geni che sono importanti per la struttura e per lassemblaggio del rotore; una volta terminato il rotore, vengono trascritti promotori controllati da un altro sigma, il 28. Prima dellassemblaggio del rotore, infatti, il sigma 28 era inibito da FlgM, fattore che viene secreto nel momento in cui si finito lassemblaggio del complesso gancio-corpo basale (HBB). Infatti tale fattore necessario per permettere la trascrizione dei geni e la maturazione dei trascritti che condurranno alla formazione del rotore, necessario affinch possano poi assemblarsi i prodotti dei geni dei filamenti di flagellina, i quale possono costituirsi soltanto se gi formato il rotore (meccanismo di regolazione temporale). Un altro modulatore FliT che inibisce sia FlhDC e lautoinibizione di FlhDC (fornita dalle proteine che sono intervenute precedentemente le quali sono anche auto-inibitorie come se tenessero sempre a freno il meccanismo). SCHEMA IMPORTANTE DA STUDIARE

STRUTTURA DEI TREPONEMA PRIMITIA E LORO MOTILIT I treponema primitia fanno parte della famiglia delle spirochete, e sono interessanti per il loro vario ruolo allinterno del sistema gastrointestinale delle termiti, dove concorrono con i protozoi nella digestione della cellulosa, liberando poi idrogeno molecolare. La struttura di tali batteri ottenuta dalla visualizzazione mediante tecniche che non ne permettono lalterazione (quali la sostituzione con gel o con ghiaccio) molto caratteristica. I treponemi sono allungati e per essere visibili bisogna utilizzare il microscopio a campo oscuro ( un microscopio con un condensatore che invia la luce in senso trasversale, in modo da ottenere un campo oscuro; la visione nelloculare si ha quando vi diffrazione di un elemento, cos da poter osservare i batteri come masse brillanti su sfondo oscuro). I batteri vengono poi colorati con tecniche di impregnazione argentica o con la colorazione di Timenez o di Montanti/Mont, anche se in effetti tali procedimenti sono sorpassati, in quanto oggigiorno si sfrutta limmunofluorescenza. Tali batteri hanno a decoro dellOM elementi sconosciuti che sono bowl-like objects (ossia oggetti a forma di scodella). Al di sotto della OM vi sono i flagelli, inoltre vi sono anche le fibrille e un cono (allinterno del periplasma). Invece del singolo strato di PG che viene osservato nei Gram -, in questo caso vi un doppio strato periplasmico. Questi 2 strati periplasmici formano uno spazio aperto centrale che contiene 2 flagelli (i flagelli periplasmici sono la caratteristica di questi batteri). In alcune aree la IM (inner membrane) produce delle invaginazioni che protrudono nel citoplasma. I T.primitia sembrano avere i corpi cellulari rigidi durante il movimento, che si sviluppa seguendo un modulo elicoidale piuttosto che planare.

GENETICA BATTERICA
Il genoma batterico serve per deposito dellinformazione genetica, ed la struttura capace di replicarsi, in sincronia con la cellula batterica, per assicurare lo stesso tipo di info genetiche alla cellula neoformata. Il genoma batterico presenta sue peculiarit: 1. 2. 3. 4. Presenza di un unico cromosoma ed assenza di diploidia genica; Assenza di istoni che complessano il DNA; Colinearit tra il DNA e le proteine che vengono codificate a partire da esso, per lassenza di sequenze introniche; Utilizzazione dellintero stampo di DNA, per lassenza di tratti ridondanti dello stesso;

5. Tendenza dei geni batterici, che codificano per proteine correlati, di ritrovarsi legati in unit trascrizionali multicistroniche
denominate operon;

6. Esistenza di unit genetiche accessorie, plasmidi, in aggiunta al singolo cromosoma.

La presenza di una APLOIDIA fa s che vi sia una condizione negativa per cui, in caso di mutazione genetica questa verr espressa nella codifica della proteina corrispettiva e una condizione positiva per cui si pu modificare la sintesi di proteine andando ad agire nellattivazione o nella inattivazione dei promotori che avviano la replicazione dei geni interessati. PLASMIDI I plasmidi sono unit genetiche associate al cromosoma batterico (unit extracromosomiche). Sono costituite da un DNA bicatenario, con una quantit in coppie di basi compresa tra 10000-200000, molto inferiore rispetto alla dimensione del cromosoma (coppie di basi da 1 a 5 MLN). Un singolo batterio pu contenere diverse tipologie di plasmidi. Una specie batterica possiede un corredo plasmidico peculiare, nel quale rientra il concetto di gruppi di compatibilit, ossia la possibilit, allinterno di un battere, di ritrovare soltanto i plasmidi che possono coesistere tra di loro. Un plasmide dotato di un corredo genetico capace di assicurarne la duplicazione e linserzione nella cellula figlia. I plasmidi che non hanno attivit riscontrate a livello fenotipico, alternative alle sovracitate, prendono il nome di Plasmidi Criptici. Generalmente la presenza dei plasmidi non importante per la sopravvivenza del battere in condizioni di ambiente ottimale, bens necessaria per la sopravvivenza del battere in condizioni non ottimali, quali possono essere quelle di una nicchia ecologica. I plasmidi provvedono cos a sintetizzare, dal loro stampo di DNA, macromolecole quali tossine, enzimi che producono una farmacoresistenza del battere (FATTORE F), oppure pili o altre adesine, inoltre provvedono alla sintesi di batteriocine (che sono proteine tossiche capaci di uccidere i batteri) e di siderofori batterici che hanno la funzione di accumulare ferro nella cellula. Alcuni plasmidi vengono definiti Plasmidi coniugativi e permettono, mediante la formazione di un ponte coniugativo intercellulare, il trasferimento orizzontale del plasmide da una cellula donatrice ad una accettrice, trasferimento che si aggiunge a quello verticale (trasferimento da cellula madre a cellula figlia). I plasmidi coniugativi permettono anche il trasferimento intercellulare di plasmidi non coniugativi, cos come di cromosomi (CONIUGAZIONE), meccanismo che prevede dapprima linserzione del plasmide nel cromosoma batterico. I plasmidi che possono, cos, alternativamente provvedere alla propria duplicazione autonomamente o in associazione al cromosoma, vengono detti Episomi.

SEQUENZE DI INSERZIONE, TRASPOSONI, ELEMENTI INVERTIBILI Allinterno del genoma batterico (DNA cromosomico, e DNA extracromosomico o appartenente ai plasmidi) esistono delle sequenze di DNA trasponibili, ossia capaci di comparire in una regione alternativa del genoma stesso, diversa rispetto alla regione di localizzazione originale. In effetti questo processo verificabile previa duplicazione della sequenza trasponibile; la sequenza che viene ad essere trasposta non quella originale, bens la sequenza copia. Linserzione di una sequenza in un sito alternativo, determinata dalla digestione di un tratto del doppio filamento di DNA, dalla formazione di una apertura asimmetrica che viene riempita dalla aggiunta di sequenze nucleotidiche, e dal legame finale che si viene a creare tra le estremit del segmento trasposto e le estremit nucleotidiche del doppio filamento di DNA ivi presente. Questo processo ha come aspetto peculiare un effetto mutageno, ossia capace di modificare la sequenza nucleotidica di un gene, in modo da determinarne lincapacit di sintesi di quella determinata macromolecola. In condizioni non letali, questo effetto mutageno promuove lespressione di una macromolecola diversa rispetto a quella originale. Gli elementi trasponibili sono:

1. Sequenze di inserzione. Sono sequenze piuttosto corte (800-2000 coppie di basi) che sono caratterizzate da estremit in cui
sono presenti sequenze di basi piuttosto ripetute, che decorrono in senso complementare rispetto al filamento contrapposto (formazione di palindromi) o che decorrono nello stesso ordine, e che sono responsabili della codifica degli enzimi necessari al processo di inserzione dellelemento trasponibile nel sito genomico alternativo;

2. Trasposoni. Sono sequenze pi ampie di quelle di inserzione (pi di 2000 coppie di basi). Hanno alle loro estremit sequenze
di inserzione, nonch sequenze nucleotidiche ripetute. In aggiunta alla codifica di enzimi necessari allinserzione nel sito genomico alternativo identificato, vi nel core del trasposone la presenza di geni che sono responsabili della ANTIBIOTICO-RESISTENZA. La scoperta dei trasposoni ha permesso di comprendere come in effetti vi la possibilit

per queste sequenze correlate alla farmaco-resistenza di saltare da un sito allaltro del genoma, e di localizzarsi in regioni che sono possibilmente trasferibili mediante processi di coniugazione.

3. Elementi invertibili. Sono sequenze pi complesse delle precedenti. Hanno permesso di comprendere il fenomeno della
VARIAZIONE DI FASE, che si riscontra in generi di batteri come ad es. quello della Salmonella. In questo genere batterico, vengono in effetti alternativamente espressi flagelli costituiti da antigeni diversi (flagelli di fase I o flagelli di fase II), in modo da evadere lazione della RI. In effetti gli elementi inveritibili posseggono in aggiunta alle sequenze geniche riscontrabili negli altri elementi trasponibili, la presenze di sequenze nucleotidiche che codificano per un enzima specifico, la DNA-invertasi, che permette la rotazione della sequenza genomica attorno ad un asse centrale immaginario, di 180. noto che la macchina trascrizionale batterica sia costituita da unit trascrizionali chiamate operon, che sono controllate da sequenze promoter, correlate al gene operatore. Quando il promoter viene attivato per esposizione a fattori proteici attivanti, permette a sua volta lespressione e la conseguente attivazione della RNA polimerasi, che trascrive specifici mRNA. Nel genere Salmonella abbiamo 2 unit trascrizionali che codificano per proteine flagellari diverse. Luna codifica per la flagellina di tipo HI, caratteristica del flagello in fase I, e codifica per un repressore del promoter che avvia la codifica per la flagellina di tipo H2, in modo che se il repressore attivo viene bloccata la sintesi del flagello di fase II; laltra unit trascrizionale ha attivit opposte. La DNA-invertasi quando espressa fa s che vi sia una inversione strutturale (rotazione dellelemento invertibile) e funzionale, sicch venga ad essere codificata la flagellina di tipo H2 e invece bloccata la sintesi della flagellina di tipo H1. TRASFERIMENTO INTERCELLULARE DEL MATERIALE GENETICO 3 sono i meccanismi di trasferimento intercellulare di materiale genetico cromosomico nei batteri: 1. 2. 3. Trasformazione; Trasduzione; Coniugazione

Questi meccanismi sono notevolmente differenti tra di loro, sebbene abbiano in comune il fatto che il trasferimento del materiale genetico non comprende lintero cromosoma, ma parte di esso. In effetti non si verr a creare mai un zigote nella cellula ricevente, bens si parla di merozigote. Inoltre evidente che il trasferimento intercellulare sempre polarizzato, ossia caratterizzato dalla presenza di una cellula donatrice e di una cellula accettrice. Il DNA della cellula donatrice, definito esogenote, manca della caratteristiche che ne consentono una autonoma replicazione intracellulare, non quindi un replicon, ossia un DNA capace di autoreplicarsi. Per tale motivo, a meno che lesogenote non si integri al replicon della cellula ricevente, non si avr la sua replicazione, cos che rimarr esclusivamente nella cellula donatrice originaria senza trasmettersi alla progenie. Lunico caso in cui lesogenote non si integra al replicon della cellula recettrice quello in cui il trasferimento a carico dei plasmidi coniugativi.

1.

Trasformazione

Il processo di trasformazione fu per la prima volta descritto da Griffith che studiava la patogenicit dei Streptococcus pneumoniae. Scopr che se in un topino si poneva una miscela di streptococcus capsulato (virulento) e streptococcus acapsulato (virulento), i cocchi acapsulati si trasformavano nei cocchi capsulati. Alla base di questo processo c la capacit di inserire nel codice genetico di un battere (DNA), un filamento di DNA proveniente da batteri adiacenti (questo si specific dopo le scoperte di Avery, McLeod, e McCarty sul DNA). Tra i Gram + abbiamo il Bacillus subtilis e lo Streptococcus pneumoniae che sono capaci di trasformazione, mentre tra i Gram abbiamo Nesseria gonorrhoeae, Haemofilus influenzae e parainfluenzae. Affinch sia possibile la trasformazione nei Gram + necessario che il battere passi dapprima attraverso il processo di attivazione del fattore di competenza, il quale viene codificato a partire da una serie di geni, definiti geni Com, importanti anche per la sporulazione e nei flagelli. Questo processo comprende la possibilit, in una popolazione recente di S. pneumoniae, di sintetizzare da parte delle cellule capsulate e quindi virulente, una proteina molto piccola, detta appunto Fattore di competenza, in grado di interagire con recettori posti su cellule adiacenti, e di avviare processi di derepressione genica cos da sintetizzare 8-10 proteine capaci di avviare il processo di trasformazione. Tra queste proteine vi lautolisina, capace di digerire una parte della membrana cellulare, in modo da poter esporre il DNA posto nellambiente EC (proveniente da altre cellule, ma con omologie rispetto al DNA della cellula considerata) a delle DNA Binding-

Protein e a una nucleasi. Le DNA BP legano il doppio filamento di DNA, mentre la nucleasi provvede a digerirne un filamento. Laltro filamento viene quindi introdotto nella cellula e si lega a una parte del DNA ivi presente in cui esistono regioni di omologie o complementari, in modo da formare un ETERODUPLEX. Questo verr poi duplicato, cos una parte della progenie possieder DNA trasformante e laltra parte invece possieder DNA proprio della cellula. Nei batteri Gram il processo della trasformazione molto simile a quello descritto per i Gram +, soltanto che non si provvede alla formazione del fattore di competenza. Sembra che questo venga ad essere sostituito da propriet del mezzo di coltura. possibile inoltre avviare una trasformazione artificiale in laboratorio mediante introduzione di DNA esogeno, contenuto in un replicon costruito in laboratorio ed, eventualmente, provvedendo alla sua ricombinazione con lendogenote, attraverso una serie di artifizi sperimentali. La trasformazione serve essenzialmente a consentire il trasferimento di DNA tra batteri affini.

2.

Trasduzione

Il processo della trasduzione si evoluto tenendo conto degli errori che si presentano durante i meccanismi replicativi fagici. Il batteriofago o fago, non altro che un virus parassita dei batteri. Esso fornito di un genoma a DNA (con i caratteri di un replicon), circondato da una capsula proteica, che ne permette linterazione, ladsorbimento, e la penetrazione allinterno della cellula target, nonch anche lesposizione del genoma allapparato traduttivo della cellula ospite. Distinguiamo 2 tipi dei cicli replicativi del fago, in particolare:

a) Ciclo litico. Condizione in cui il fago inserisce il suo genoma allinterno della cellula batterica, e sfruttando il metabolismo
della cellula ospite, avvia i suoi processi replicativi, di trascrizione e traduzione che ne permettono la formazione della nuova entit virionica, pronta a gemmare dalla membrana cellulare (FAGO VIRULENTO), avviando poi la lisi della cellula batterica;

b) Ciclo lisogeno. il ciclo di eventi in cui un genoma fagico (che non ha caratteri di replicon, ossia non auto-replicabile) si
integra al genoma cellulare batterico, a livello di specifiche sequenze omologhe, in modo da replicarsi in concomitanza alla replicazione del genoma ospite. Non vi espressione del genoma fagico, in quanto esso tenuto silente da un gene che codifica per una proteina repressore, presente nel template fagico. Conseguentemente ad esposizione a determinati stimoli, il genoma fagico viene escisso dallendogenote (processo di deintegrazione) e si avvia il ciclo litico, con lisi cellulare batterica.

Gli errori che possono incorrere in questi processi sono 2:

a) Durante il ciclo litico, il genoma fagico va incontro a diverse replicazioni, e viene riprodotto in diverse copie, tra di loro
concatenate (concatameri), verso le quali agiscono diverse nucleasi, che provvedono a scindere queste catene genomiche, e ad inserirle nelle componenti proteiche sintetizzate de novo, per la costituzione del virione. Vi pu essere la condizione per cui venga ad essere scisso il genoma batterico invece di quello fagico da parte delle nucleasi, sicch tale genoma viene poi ad essere inserito nella componente proteica fagica, con formazione di queste strutture che prendono il nome di particelle trasducenti, che accompagnano i virioni neoformati. Si viene a costituire cos una struttura ibrida, che permette il trasferimento intercellulare di materiale genetico batterico. Questo processo prende il nome di TRASDUZIONE GENERALIZZATA, e viene cos definita perch il genoma batterico pu provenire da qualsiasi cellula donatrice batterica, e inoltre si pu considerare qualsiasi regione dellintero genoma batterico, come regione donatrice.

b) Esiste poi un secondo tipo di trasduzione, definito TRASDUZIONE SPECIALIZZATA, che si riferisce allerrore che
incorre durante il processo di deintegrazione del genoma fagico dallendogenote. Gli enzimi che svolgono tale azione, provvedono erroneamente alla scissione di regioni di genoma batterico adiacenti al genoma fagico, sicch viene a crearsi una condizione per cui la progenie pu essere dotata di attivit re plicativa, ma pu essere sprovvista di attivit litica. Viene definita trasduzione specializzata, perch in questo processo di trasferimento intercellulare genetico batterico, viene ad essere trasferito soltanto quella regione del genoma batterico adiacente al genoma fagico.

3.

Conversione lisogenica

Nei batteri lisogeni il DNA del profago non viene espresso, dal momento che esiste un gene fagico che codifica per una proteina repressore che non permette lespressione del DNA. Esistono delle condizioni per cui il DNA fagico pu essere espresso, cos da influenzare il fenotipo cellulare. A questo fenomeno si d il nome di conversione lisogenica. Nonostante questo non venga, a rigore, considerato un fenomeno di trasferimento intercellulare di materiale genetico batterico, si pu considerare effettivamente un meccanismo di questo tipo, dal momento che in questo fenomeno il DNA fagico silente viene espresso e quindi non pi suscettibile a repressione da parte del gene fagico. Probabilmente tali geni, espressi durante il processo di conversione lisogenica, sono ereditati da geni ancestrali provenienti dal genoma batterico.

4.

Coniugazione batterica

Il processo di coniugazione batterico, un processo che sfrutta la struttrura genetica dei plasmidi, in particolar modo del cosiddetto plasmide F (come tutti i plasmidi costituito da un DNA circolare bicatenario), che codifica per il pilo F, e per tutta una serie di fattori che favoriscono la replicazione e il trasferimento del replicon da un battere donatore a uno accettore. Il genoma plasmidico contiene una componente di circa 13 geni tra, che provvedono ad associarsi in forma di operon, e codificano per proteine regolatrici del processo di coniugazione. Inoltre vi una componente genomica plasmidica offerta a un cluster di 4 IS (sequenze di inserzione), inoltre una regione non tradotta. Le cellule contenenti un plasmide F (fertility) vengono definite cellule F+; mentre le cellule senza plasmide F, vengono definite F-. Se questi 2 tipi cellulari entrano tra loro in rapporto, si viene a formare una coppia di coniugazione con lespressione del pilo F da parte della cellula F+ che costituisce un ponte verso la cellula F-, cos da provvedere al trasferimento intercellulare di materiale genetico. Il meccanismo della coniugazione batterica molto semplice. Comprende diversi momenti:

a. Scissione di un filamento del DNA bicatenario del plasmide (cellula maschile, donatrice), a livello della regione OriT;
b. c. Avviamento della replicazione del filamento escisso in direzione 5-3; Trasferimento simultaneo del filamento escisso, attraverso il ponte intercellulare fornito dal pilo, alla cellula accettrice (cellula femminile) e avviamento del processo di circolarizzazione del filamento del DNA, mediante meccanismo del rolling circles; Formazione nella cellula accettrice del filamento complementare al filamento ereditato.

d.

Nelle rare coppie coniugali in cui il trasferimento del genoma plasmidico F si associa al trasferimento del DNA cromosomico (es. in E. Coli), avviene linserzione di una parte del genoma del plasmide nel genoma cromosomico, mediante linterazione tra IS del plasmide ed IS del cromosoma. Il plasmide F in queste cellule, che prendono il nome di cellule Hfr (high-frequency-recombination cells), continua ad esprimere i propri geni tra e avvia il processo di coniugazione. In questo processo il trasferimento del genoma del plasmide accompagnato dal trasferimento del genoma del cromosoma, mediato dal pilo F, il quale comunque fragile e sottile, e non capace di trasferire un carico di materiale cos imponente, sicch quasi sempre la coniugazione parziale. Il genoma misto cos pervenuto alla cellula ricettrice pu persistere nella cellula ospite in forma indipendente, oppure integrarsi nellendogenote cellulare, oppure fornire un plasmide F particolare. In alcuni batteri (es. Enterococcus Faecalis) il processo di coniugazione non mediato dal pilo, bens vi il rilascio di particolare sostanze (feromoni) da parte della cellula ricettrice, che interagiscono con recettori posti sulla cellula donatrice, la quale cos sollecitata, sintetizza materiale aggregante che permette il laggregazione tra cellule e il trasferimento di materiale genetico. Esiste inoltre la possibilit di osservare dei trasposoni coniugativi.

FARMACI ANTIBATTERICI
Si distinguono in:

a) Batteriostatici hanno azione reversibile sulla cellula, determinando un blocco metabolico;

b) Battericidi uccidono la cellula infetta

CHEMIOTERAPICI SINTETIZZATI

1) Sulfanilamidici sono analoghi strutturali dellacido para-aminobenzoico, necessario alla sintesi di acido folico. I batteri
necessitano di sintetizzare tale struttura dal momento che non sono in grado di acquisire lacido folico direttamente dalla dieta, per cui incorporano lacido p-aminobenzoico.

I sulfanilamidici competono attivamente per lenzima diidropteroato sintasi, necessario per lincorporazione di ac. paminobenzoico e per la formazione di ac. folico. Sicch la loro presenza blocca tale produzione, con blocco del metabolismo cellulare.

Gli Enterococchi che sono in grado di acquisire ac. folico direttamente con la dieta sono resistenti ai sulfanilamidici.

2) Inibitori della sintesi del DNA sono derivati dal 2,4-diaminopirimidina con diverse sostituzioni, e sono inibitori della
diidrofolato reduttasi (DHFR) necessaria alla sintesi di tetraidrofolato, il quale interviene come navetta metabolica nella maggior parte delle reazioni del nostro organismo.

Nella sintesi di timidilato necessario che THF venga ridotto a DHF. Lalterazione di tale pathway ad opera degli analoghi della 2-4 diaminopirimidina blocca tale reazione cos da avere blocco della sintesi di timidilato e quindi della sintesi di DNA.

3) Lacido p-aminosalicilico un analogo strutturale dellac. p-aminobenzoico che ha azione sui micobatteri, poco sensibili ai
sulfanilamidici.

4) Isoniazide:
lidrazide dellacido nicotinico; Determina blocco della sintesi di NAD; attiva soprattutto contro i micobatteri; rilasciata in forma pro-attiva; Necessita per la sua attivazione di una catalasi-perossidasi; Lenzima viene codificato a partire dal gene KatG; Mutazioni nel gene KatG sono una forma di isoniazide-resistenza

5) Nitrofurani e nitroimidazoli:

Possono inibire la sintesi di DNA ed RNA; Sono importanti come terapie nelle infezioni urinarie; Possono degradare anche il DNA preesistente

6) Chinoloni:
Hanno come struttura di base la 4-oxo-1,4 dichinolina; Agiscono sulle subunit GyrB della girasi e ParC della topoisomerasi IV; Determinano blocco della sintesi di DNA; Es. conosciuto di chinolonico lac. nalixidico utilizzato per linfezione da micobatterio tubercolare;

ANTIBIOTICI

Sono ricavati da microrganismi a basso P.M. e a basse concentrazioni sono responsabili di una tossicit selettiva nei confronti dei batteri. Sono maggiormente derivati (80%) dagli Actinomycetales, e in modo particolare dal genere degli Streptomyces, nonch da funghi quali Penicillum e Cephalosporium.

ANTIBIOTICI BETA-LATTAMICI Posseggono un anello beta-lattamico di base e interferiscono con la sintesi del PG. Hanno un anello tetratomico azetidinico betalattamico:

a) Tiazolidinico Penicilline; b) Diidrotiazinico Cefalosporine

La struttura di base :

1. Penicilline ac. 6-aminopenicillanico;

2. Cefalosporine ac. 7-aminocefalosporanico

PENICILLINE

Sono derivate dal Penicillum chrysogenum; Differiscono per il gruppo acilico legato al gruppo aminico; La Penicillina G (o benzil-penicillina) ha come gruppo acilico lac. fenilacetico; Sono attivi contro tutti i Gram + e contro i cocchi Gram (Neisseriae); Non sono attivi contro la maggior parte dei Gram -, in quanto questi posseggono lOM (resistente) e nello spazio periplasmico sono ricchi in beta-lattamasi;

Esistono penicilline semisintetiche in grado di evadere le beta lattamasi (meticillina).

Le penicilline ad ampio spettro sono: a) Sulfossipenicilline; b) Ureidopenicilline; c) Aminopenicilline (ampicillina, amoxicillina); d) Carbossipenicilline Le penicilline sono in grado di bloccare il legame di transpeptidazione tra le catene peptidiche laterali e di legare le PBPs. Inoltre sono in grado di degradare la struttura del PG reclutando lenzima mureina-idrolasi.

CEFALOSPORINE E CEFALOMICINE

Derivano dal Cephalosporium achremonium; Sono attive contro i Gram -; Tra le pi recenti vi sono le metossimine

ALTRI FARMACI BETA-LATTAMICI

1) Monobattamici:
Sono costituiti da un anello beta-lattamico monociclico; Prodotti da Chromobacterium Violaceum; Hanno notevole affinit verso i Gram (ad esclusione degli anaerobi obbligati)

2) Gamma-lattamici:
Sono attivi contro i Gram -; Evadono lazione della beta-lattamasi

ALTRI ANTIBIOTICI CHE INIBISCONO LA SINTESI DI PG

1) Fosfonomicina; 2) Cicloserina; 3) Ristocetina; 4) Vancomicina si complessa al dimero D-ALA, impedendo lazione delle PBPs

ANTIBIOTICI CHE AGISCONO SULLE MEMBRANE BATTERICHE Polimixine: Sono attive solo sullOM dei Gram -; Determinano uno squilibrio osmotico

ANTIBIOTICI CHE INIBISCONO LA SINTESI DI DNA Novobiocina: Lega GyrB della topoisomerasi II su un sito diverso rispetto a quello dei chinoloni; Ha azione sinergica a quella chinolonica

ANTIBIOTICI CHE INIBISCONO LA SINTESI DI RNA Rifampicina Si lega alla subunit beta della RNA pol batterica; attiva nei confronti di Gram + e Gram -; soprattutto attiva contro il Mycobacterium tubercolosis

INIBITORI DELLA SINTESI PROTEICA INIBITORI DELLA SUBUNIT 30 S

1) Tetracicline:
Legano la subunit 30S; Sono attivi sia nei Gram + che nei Gram -; Impediscono lattacco dellaa-tRNA

2) Aminoglicosidi:
Legame irreversibile a 30 S; Sono inattivi contro anaerobi obbligati

INIBITORI DELLA SUBUNIT 50 S

1) Macrolidi (Eritromicina):
Si legano allRNA 23S della subunit 50S; Agiscono da disaccoppianti tra larrivo dellmRNA e lattacco dellaa-tRNA; I chetolidi sono una nuova specie di macrolidi maggiormente attivi

2) Cloramfenicolo:
Interagisce con la subunit 50S;

Blocca la peptidil-trasferasi; Inibisce la sintesi proteica

RESISTENZA AI FARMACI ANTIBATTERICI La resistenza ai farmaci antibatterici viene acquisita ex-novo come risultato di una modificazione genomica:

a) Mutazione resistenza cromosomica;

b) Acquisizione di determinanti genetici trasferimento di elementi coniugativi (posti su plasmidi) o di elementi posti su
trasposoni; definita resistenza a collocazione plasmidica

Da tale resistenza bisogna tener distinte:

a) Resistenza naturale o intrinseca un battere di per s resistente a un determinato antibiotico o antibatterico;

b) Resistenza fenotipica in determinate condizioni ambientali un battere pu essere resistente transitoriamente a un farmaco

TIPI DI RESISTENZA

1) Resistenza ai beta-lattamici:
Produzione di beta-lattamasi in grado di idrolizzare il legame amidico di penicilline e cefalosporine;

Le beta-lattamasi sono:

a) Nei Gram + inducibili ed esocellulari; b) Nei Gram - inducibili/costitutive ed endocellulari (collocate nel periplasma)

Il meccanismo di resistenza legato a determinanti antigenici presenti sui trasposoni.

Altri meccanismi di farmaco-resistenza sono:

a) Ridotta permeabilit (riduzione della formazione di porine, con modifica della struttura del LPS) al
farmaco;

b) Mutazioni cromosomiche che portano ad una alterata sintesi di PBPs, con ridotta affinit per i betalattamici;

c) Blocco degli enzimi autolitici si arresta la crescita cellulare ma non la lisi cellulare

2) Resistenza agli aminoglicosidi:

a controllo plasmidico; Ridotta permeabilit agli aminoglicosidi

3) Resistenza ai glicopeptidi (vancomicina)

Acquisizione di un trasposone (presente su plasmide coniugativo), con geni che codificano per enzimi in grado di sostituire il dimero D-ALA con un D-ALA D-lattato, impedendo cos il legame del farmaco.

4) Resistenza ai sulfanilamidici:
Resistenza presente soprattutto nelle Enterobacteriaceae; Sintesi di enzimi DHFR (da determinanti antigenici posti su trasposoni o plasmidi) che presentano minore affinit per linibitore rispetto a quelli omologhi sotto controllo cromosomico

5) Resistenza al cloramfenicolo:
Produzione di acetil-transferasi, controllata da geni presenti su plasmidi e trasposoni

6) Resistenza ai chinolonici ed alla novobiocina:

Riduzione della sintesi di enzimi con affinit per il farmaco;

7) Resistenza ai macrolidi:
Modificazione del bersaglio ribosomiale mediante un processo di metilazione delladenina nella frazione 23S del rRNA

8) Stafilococchi meticillino-resistenti:
Meticillino-resistenza indica una resistenza anche nei confronti di tutte le penicilline semisintetiche; Il meccanismo di base della resistenza sembra essere data da una diminuit affinit per le PBPs

SINTESI DEL PEPTIDOGLICANO DIVISIONE CELLULARE ED ELONGAZIONE

Durante il ciclo cellulare batterico, il nuovo peptidoglicano (PG) deve essere sintetizzato a livello del sito di divisione cellulare (ossia il setto); nei bacilli, ossia nei batteri a forma bastoncellare, quali E. coli e B. subtilis, PG deve anche essere sintetizzato lungo la parete cellulare (questo processo presente anche nello S. pneumoniae). La divisione cellulare e lelongazione della parete sono processi che richiedono la localizzazione precisa di una variet di proteine essenziali, le PBPs, su specifici siti della CW. Spesso si osserva crescere, nei batteri gram , due nuclei (almeno 2), in una unica cellula batterica. I batteri gram sono in genere batteri ad alta moltiplicazione, quindi con tempo di divisione molto brevi (ca. 30 minuti); mentre avviene la moltiplicazione in tali batteri, essi contemporaneamente producono proteine. Non si tratta soltanto di suddividere la cellula, ma di suddividerla contemporaneamente alla replicazione del genoma. In questo processo importante il ruolo di FTSZ. Una volta che FTSZ si posiziona a livello del setto, gli altri membri del macchinario di formazione del PG iniziano assemblarsi al sito di divisione in una maniera specifica ed interdipendente: FtsA, ZipA e ZapA, le cui funzioni principali sono quelli di stabilizzare lanello FtsZ. Successivamente FtsK, FtsQ, FtsL, FtsB, FtsW, FtsI (una PBP di classe B), FtsN e AmiC si localizzano a livello del setto.

PBPs Esistono pi di 430 tipi di PBP di classe A e pi di 350 PBP di classe B, codificate dal genoma batterico. Dal momento che le PBPs sono molecole associate alla membrana:

Le molecole di classe A portano sequenze che codificano per domini GT (glicosiltransferasi) e TP (transpeptidasico); Le molecole di classe B espongono solo un dominio TP, preceduto da una unit N-terminale (a funzione sconosciuto).

Le PBP possono distinguersi anche in HMM PBPs (high molecular mass PBPs) e LMM PBPs (low molecular mass PBPs).

CITOSCHELETRO BATTERICO Il citoscheletro batterico contiene numerose protein che hanno ruoli cellular improtanti nella segregazione del DNA, nella polarit cellulare e nella sporulazione. Altre protine batteriche, le proteine Min, sembrano far parte del citoscheletro, e partecipare alla divisione cellulare. Il citoscheletro si costituisce di cavi di MreB, che assumono in vivo forma a spirale con diverse curvature. Studi sul B. subtilis hanno dimostrato che esso (battere Gram +) possiede un unico gene mreB, che codifica per 3 omologhi di actina, MreB, Mbl e MreBH, che interagiscono tra di loro e si assemblano in unico filamento ad elica, cos da avere un ruolo importante nella determinazione della forma cellulare. importante nella morfogenesi batterica il ruolo di MreC, che una proteina di membrana, parte di un complesso che include le proteine MreD e RodA; essa essenziale per la sopravvivenza di molti batteri; linattivazione di tale complesso correlato alla perdita della forma cellulare e alla successiva lisi. Lapparato di divisione cellulare strettamente associato alla regolazione della morfologia della cellula. Non solo questo apparato comprende le sintasi e le idrolasi del PG, che mediano la formazione del setto, ma anche proteine come MurG, lenzima che catalizza lultimo step della formazione citoplasmatica del PG, il quale risulta associato allapparato di divisione cellulare. FTSZ il primo degli omologhi del citoscheletro batterico ad essere scoperto, ed richiesto per la divisione cellulare, dove forma una struttura ad anello (Z ring) a livello del setto. FtsZ capace di idrolizzare il GTP, per cui un omologo a tutti gli effetti della tubulina. FtsZ ha un ruolo fondamentale nella divisione cellulare, soprattutto nel richiamo delle altre proteine al sito di divisione. La presenza nei bacilli (batteri a bastoncello) di 2 famiglie di proteine del citoscheletro MreB e FtsZ, per lo pi associata a 2 fasi della crescita della CW, lelongazione e la divisione. Le proteine MreB non vengono codificate dalla maggioranza dei genomi dei cocchi (eccezione sono alcuni cianobatteri e la Clamydia).

Lappropriata localizzazione dellanello FtsZ seguita dal reclutamento di altre proteine di divisione al centro della cellula, tra cui le PBPs. La prima PBP ad essere individuata nel coordinare il processo di divisione nello S. pneumoniae la PBP3. Utilizzando il suo dominio transpeptidasico provvede a degredare i substrati peptidici. Prima che la divisione cellulare inizi, PBP 3 sembra localizzarsi tuttintorno la superficie cellulare, eccetto a livello dellequatore, dove si accumulano pentapeptidi che sono substrati attaccati dallattivit transpeptidasica delle altre PBPs, che vengono quindi richiamate a tale livello. Lenzima che distrugge la CW settale degli streptococchi probabilmente PcsB, e suoi ortologhi (ossia proteine con diversa composizione ma stessa funzione). Linattivazione di tale enzima non permette la divisione cellulare, sicch vengono a formarsi lunghe catene pluricellulari, caratterizzate da anormalit nella forma delle cellule. Gli enterococchi hanno una proteina chiamata SagA (SagB o Sal A) a seconda delle specie in cui si ritrova, la cui estremit Nterminale analoga a PcsB. Nello S. pneumoniae, una volta che il setto viene distrutto, le cellule restano attaccate mediante la punta dei loro poli e formano una lunga catena, fin quando non interviene una idrolasi chiamata LytB, la quale assicura la separazione cellulare. Unaltre idrolasi che si ritrova in S. pneumoniae LytA, la quale ha un ruolo minore nella lisi cellulare.

DIVISIONE CELLULARE NEI COCCHI La sintesi del setto procede attraverso una crescita centripeta, fino alla formazione del setto che si fonda al centro della cellula. Dopo che il setto completato, le 2 cellule figlie si dispongono assieme in una singola sfera, senza alcun segno di invaginazione. Soltanto alla fine della divisione cellulare il setto provvede ad individuare le 2 cellule figlie.

DIVISIONE CELLULARE ED ELONGAZIONE noto che linizio della divisione richiede la formazione di un anello FtsZ propriamente localizzato. I bacilli hanno 2 principali sistemi per assicurare il corretto assemblaggio dellanello FtsZ nel mezzo della cellula:

Effetto di occlusione nucleoide corrisponde alla capacit del nucloide (lequivalente batterico del nucleo) di prevenire la divisione cellulare in sua prossimit. Un effettore specifico di tale meccanismo la proteina Noc, identificata nel B. subtilis; esiste inoltre un suo analogo funzionale in E. coli, chiamato SlmA. Queste proteine sono DNA-BPs che prevengono che lassemblaggio del macchinario di divisione cellulare avvenga in prossimit del nucleoide.

Sistema Min agisce nel prevenire la formazione dei setti in vicinaza dei poli della cellula. Le proteine MinC e MinD formano un complesso che agisce in qualit di antagonista dellassemblaggio dellanello di FtsZ:

a) Nel B. subtilis, lattivit del complesso MinC-D limitato ai poli, attraverso un fattore specifico chiamato
DivIVA, che direttamente recluta linibitore a tale livello (a livello dei poli cellulari);

b) In E. coli, Min C-D oscilla tra i poli, formando un gradiente con la minima concentrazione nel mezzo della
cellula, e MinE il fattore che limite lattivit del complesso Min C-D a livello del centro cellulare.

Leffetto netto dei 2 sistemi quello di far assemblare e far localizzare lapparato di divisione cellulare a livello del setto. Le proteine Min sono presenti in poche specie di cocchi quali: a) N. gonorrhoeae; b) N. meningitidis; Il sistema Min non presente in molti altri tipi di cocchi quali: a) Stafilococco;

b) Enterococco o Streptococco

Come fanno quindi tali cocchi a localizzare il loro centro? Al contrario dei bacilli, i cocchi hanno un infinit di piani di divisione cellulare che possono dare origine a 2 cellule figlie. I cocchi, in genere, non hanno necessit di un sistema Min. Infatti la zona di massimo diametro quella in cui un polimero circolare (nucleoide) si localizza in prossimit della membrana cellulare, cos come lanello FtsZ. I cocchi circolari si dividono attraverso 2-3 piani perpendicolari. Quindi, il cromosoma deve segregarsi lungo 2-3 assi perpendicolari che sono perpendicolari ai piani del setto. Negli ovococchi, invece, esiste un meccanismo di moltiplicazione ben definito; tutti i batteri appartenenti a tale famiglia si moltiplicano nella stessa direzione, cos da costituire delle piccole catene, e lequatore si localizza a livello del nucleoide, in quanto questultimo in posizione centrale.

DIVISIONE CELLULARE E SPOROGENESI Vi una proteina identificiata in bacillus T, che SPOIII (SPO sta per spora). La sporogenesi il fenomeno pi eclatante della divisione cellulare. Il bacillus o il clostridium hanno questo tipo di moltiplicazione: improvvisamente, per ragioni non note cambiano il loro programma: c un interruttore che passa dal programma A, di moltiplicazione vegetativa, a quello B, dove si produce la spora. Da quel momento c un altro interruttore, per cui si passa di nuovo al programma A. Ci sono una serie di operazioni che fanno s che da spora si passi a un programma vegetativo e viceversa. Questo molto importante, perch le spore sono le formazioni batteriche pi pericolose, sono strutture molto resistenti ai prodotti chimici e fisici. Una proteina di divisione FtsK, che serve alla risoluzione di dimeri di nucleo. E una proteina molto simile a SPOIII. Quindi, vi sono varie proteine che hanno a che fare con la divisione cellulare e con la ripartizione. Nel caso dei plasmidi, ci sono delle proteine ben note che sono le Par (Par sta per partition), che sono delle proteine che dirigono la ripartizione dei plasmidi (problema della segregazione dei plasmidi: i plasmidi non possono segregare tutti in una cellula , altrimenti morirebbero). Due sono le proteine di ripartizione fondamentali: Par A e Par B. Ci sono zone del DNA che hanno a che fare con queste proteine, in modo da determinare con certezza la ripartizione dei due nuclei da una parte e dallaltra Quando tali proteine sono mutate, abbiamo una ripartizione errata o addirittura scontro tra setto e nucleo, non abbiamo posizionamento esatto dei due nuclei replicanti da un lato e dallaltro. Sappiamo che MreB quella proteina che viene ripartita elicoidalmente nei batteri e che fa s che vi sia la crescita laterale del peptidoglicano di tutta la parete. Poi c la proteina FtsZ, che determina la mediana equatoriale della divisione cellulare. Nei bacilli sappiamo che esistono due montaggi per costruire peptidoglicani: quello del setto e il laterale. a) Nel laterale la molecola chiave MreB; b) Nel centrale o del setto FtsZ. Sappiamo che deve esserci qualcosa che impedisce produzione di peptidoglicani laddove c il nucleo. Sappiamo che esistono delle proteine dove si moltiplicano i nuclei, che i due punti centrali sono uno opposto allaltro. I due oriC, quello vecchio e il replicato, si posizionano ai poli, poli dove non si hanno setti normalmente, a meno che non siano mutate delle proteine che sono le Min(cells). Quando c mutazione in queste proteine, il setto si mette vicino ad un polo invece che nel mezzo. E allora si creano le Min cells(da cui il nome delle proteine Min). E evidente che, da un punto di vista del movimento, deve esserci una preminenza dellazione Min, perch le proteine Min corrono da un polo allaltro continuamente e creano un gradiente nei poli. La presenza di Min minore al centro. Tra le proteine Min tuttavia vi una Min E che blocca le altre in una certa posizione.

NUCLEOID OCCLUSION

Nei mutanti, dove manca Min o dove il sistema Min non funzionante, la divisione pu avvenire ai poli ma non c mai laddove ci sono i nucleoidi. Ci vuol dire che vi sono due proteine diverse in coli e subtilis e hanno nomi diversi (knok-out in subtilis e SLM A in coli), ma con la stessa funzione di nucleoid occlusion. Queste proteine proteggono il nucleo dalla crescita di peptidoglicani. Ci sono altre proteine probabilmente a livello della parete . La selezione poi avviene attraverso FtsZ e la produzione dellanello Z. Le proteine coinvolte sono: a) Mre B; b) Min;

c) FtsZ organizza il setto

Queste sono proteine simil-citoscheletriche:

a) Min E modula il movimento di tutte le altre proteine Min; un fattore di specificit topologica. Min E pu creare
accumulo di tali proteine su un polo o sullaltro. Laddove c tale accumulo, si ha linibizione della divisione. In altri casi pu succedere che le proteine Min si dispongano in modo elicoidale, similmente a Mre B. Nelle altre specie le proteine Min sono pi fisse, non hanno oscillazione da un polo allaltro (B. subtilis);

b) Le proteine Min circolanti sono MinD e MinC.

Negli E. coli la nucleoid occlusion corrisponde alla zon in cui si ha invaginazione delle membrane delle pareti verso il centro, fenomeno seguito dalla fusione. Nel B. subtilis si tratta, invece, di una vera e propria crescita progressiva delle pareti settali che alla fine vengono a suddividersi.

COLORAZIONI PER LACIDO RESISTENZA

Le specie di: M. tubercolosis; Nocardia; Legionella miedadei

In generale le colorazioni seguono tale schema: Un sottile striscio del campione, preparato ed asciugato allaria viene fissato per esposizione al calore; Viene poi trattato con un colorante primario penetrante; Viene decolorato con un reagente contenente un acido minerale forte; Viene colorato con il colorante di contrasto

Lacido-resistenza dovuta alla formazione di arilmetano-micolati tra la fucsina e gli acidi micolici presenti negli involucri cellulari del micobatterio.

COLORAZIONE DI ZIEHL-NIELSEN

Richiede che il colorante primario, costituito da fucsina-fenicata, venga riscaldato durante la colorazione fino al punto di evaporazione. Lagente decolorante rappresentato da una soluzione di acido cloridrico concentrato e alcol al 95%; il colorante di contrasto il blu di metilene.

COLORAZIONE DI KINYOUN Differisce dalla Ziehl-Nielsen in quanto non necessario riscaldare il colorante primario. Una maggior concentrazione di fucsinafenicata nel colorante primario ne facilita la penetrazione, rendendo inutile il riscaldamento.

COEFFICIENTE DI SEDIMENTAZIONE (misurato in Svedberg) un numero adimensionale che misura il rapporto tra la velocit di sedimentazione, di un corpo ideale (sfera) e quella del corpo in esame, a parit di condizioni di riferimento. In date condizioni fisiche (temperatura, pressione, viscosit del mezzo) il coefficiente di sedimentazione influenzato soprattutto dalla forma del corpo che sedimenta - intuitivamente, una sfera decanter con velocit diversa da una lamina sottile - ma anche da altri fattori, quali la concentrazione di particelle decantanti nel mezzo.

AZIONE PATOGENA DEI BATTERI

Le 2 tossine pi potenti conosciute, in assoluto, sono: a) Tossina tetanica; b) Tossina botulinica Lesotossina pi potente invece la tossina botulinica.

ESOTOSSINE (che agiscono a livello delle strutture superficie cellulare) Le principali esotossine che agiscono a livello delle strutture della superficie cellulare, sono rappresentate da:

a) Tossina esfoliativa; b) Tossine emolitiche o citolitiche (emolisine o citolisine)

TOSSINA ESFOLIATIVA (o EPIDERMOLITICA) una tossina monomerica prodotta da S. aureus, della quale sono note 2 variet antigeniche (tossina esfoliativa A e B). La tossina esfoliativa la causa fondamentale della cosidetta Sindrome della cute ustionata (SSSS). Il meccanismo dazione sembra riconducibile al processo di una attivit serino-proteasica atipica, che viene attivata solo dopo la fissazione della tossina a livello dello strato granuloso dellepidermide e che rende la tossina in grado di provocare la rottura delle proteine della ECM.

TOSSINE EMOLITICHE (emolisine, citolisine) Comprendono una prima serie di tossine prodotte da diversi batteri Gram +, il cui prototipo rappresentato dalla tossina alfaemolisina di S. aureus. Tutte queste tossine presentano alcuni gruppi SH essenziali per la loro attivit (tossine tiol-dipendenti) e sono rapidamente inattivate in presenza di ossigeno e sono quindi denominate emolisine-O (streptolisina-O di S. pyogenes oppure di pneumolisina di S. pneumoniae); sono proteine monomeriche che polimerizzano sulla membrana delle cellule sensibili, formando oligomeri (eptamerici) tubolari che si inseriscono nella porzione lipidica della membrana causando la formazione di pori che alterano profondamente gli scambi della cellula con lambiente, causandone la morte (in genere per apoptosi).

Un altro tipo di tossine emolitiche/citolitiche sono le tossine RTX, cos denominate per la presenza di una serie di sequenze ripetute ricche in glicina, che conferiscono alla tossina la propriet di legare calcio. Il prototipo di questo gruppo di tossine rappresentato dalla emolisina di E. coli, che svolge un ruolo di rilievo nella patologia extraintestinale. Tossina delta di S. aureus agisce anchessa come tossina emolitica.

TOSSINE ADP-RIBOSILANTI Funzionanto staccando la nicotinamide dal NAD e trasferendo la rimanente pozione ADP-ribosile su una proteina bersaglio.

TOSSINE CHE AGISCONO SULLAMP

a) Tossina colerica; b) LT di E. coli

ESOTOSSINE CITOTOSSICHE PER AZIONE SUL CITOSCHELETRO Oltre alle tossine monomeriche A e B di C. difficile che agsciono come glicosil-trasferasi, esistono tossine binarie, costituite da componenti A (active) e B (binding), che sono secrete separatamente e si riuniscono solo alla superficie della cellula bersaglio; esse hanno come specifico bersaglio lactina del citoscheletro cellulare. Il prototipo di questa famiglia la tossina C2 di C. botulinum. Essa costituita da:

a) C2I subunit A ha attivit ADP-ribosilante in grado di catalizzare lADP ribosilazione dellactina monomerica e
dellactina F non polimerizzata, alterando il citoscheletro;

b) C2II subunit B

Un altro esempio di tossine attive sul citoscheletro costituito dal gruppo di tossine che comprendono:

1. Fattore citotossico necrotizzante prodotto in 2 variet antigeniche: a) CNF-1;

b) CNF-2 Vengono prodotte da molti stipidi di E.coli uropatogeni.

2. Tossina dermonecrotica di Bordetella: a) CNF-1 agisce deaminando la glutamina ad acido glutammico sulla proteina Rho, che una GTPasi che
controlla lattivit di proteine G coinvolte nella trasmissione del signalling allapparato citoscheletrico.

ESOTOSSINA CARBONCHIOSA prodotta dal Bacillus anthracis, ed formata da 3 componenti, nessuno dei quali tossico da solo, che sono:

1) Fattore I o EF edema factor;

2) Fattore II protective antigen; rappresenta il componente B della tossina che rende possibile lancoraggio e la penetrazione
dei fattori A nella cellula bersaglio.

3) Fattore III lethal factor

I fattori attivi responsabili della tossicit della tossina sono i fattori EF e il fattore III (LF). Distinzione dei fattori:

1. Fattore II rappresenta il componente B della tossina il quale, ancorato alla superficie cellulare, in corrispondenza di una
proteina transmembrana ATR (anthrax toxin receptor), viene attaccato da proteasi di membrana che ne distaccano un frammento di ca. 20 kD, scoprendo una porzione della molecola che rappresenta un recettore in grado di consentire lancoraggio del fattore I (EF) e/o del fattore III (LF).

2. Fattore I una adenilato ciclasi batterica che si attiva in presenza di calmodulina provocando un netto incremento della
concentrazione IC di AMPc, con conseguente risposta edematogena per laccumulo di liquidi negli spazi intercellulari (pustola carbonchiosa caratterizzata da un edema locale);

3. Fattore III una metalloproteinasi in grado di attaccare alcune chinasi che intervengono nelle cascate di segnali.

La tossina carbonchiosa sembra abbia il suo bersaglio preferenziale nelle cellule del reticolo-endotelio e in particolare nei macrofagi. La tossina carbonchiosa rappresenta insieme alla capsula il principale fattore di virulenza del Bacillus anthracis; questi 2 elementi sono codificate da 2 diversi plasmidi: a) pX01; b) pX02

ESOTOSSINA TETANICA ED ESOTOSSINA BOTULINICA (TOSSINE NEUROTROPE)

1) Lesotossina tetanica determina PARALISI SPASTICA;

2) Lesotossina botulinica determina PARALISI FLACCIDA

Distinzioni:

TOSSINA TETANICA (tetanospasmina) lo strumento essenziale del C. tetani, batterio sporigeno, anaerobio obbligato, le cui spore, praticamente ubiquitarie nel materiale fecale e nel terreno, se introdotte in tessuti traumatizzati in presenza di ridotto afflusso di ossigeno (tessuto necrotico), possono germinare dando luogo alle forme vegetative che producono una tossina attiva, che diffonde nellorganismo per via ematica e risale centripetamente lungo i nervi periferici, cos da raggiungere il SNC dove blocca gli impulsi inibitori della contrazione muscolare riflessa, provocando una serie di spasmi generalizzati, che interessano sia i flessori che estensori PARALISI SPASTICA.

La tossina tetanica presenta una sola configurazione antigenica ed codificata da un plasmide. La tossina sintetizzata come una singola catena peptidica che si libera in seguito alla lisi del batterio ed tagliata da una proteasi in 2 peptidi, rispettivamente:

a) Peptide H (pesante) componente B della tossina che si lega alle cellule nervose consentendo la penetrazione
nel citosol del peptide L;

b) Peptide L (leggero) componente A, una zincopeptidasi che ha il suo bersaglio nella sinaptobrevina
importante per lesocitosi del neurotrasmettitore inibitore GABA; per cui viene bloccata lesocitosi di GABA.

TOSSINA BOTULINICA lunico strumento di patogenicit del C. botulinum, batterio sporigeno, anaerobio obbligato le cui spore possono contaminare diversi alimenti nei quali, in presenza di condizioni di parziale o totale anaerobiosi (es. conserve sottolio) possono germinare, dando le forme vegetative che producono una potente tossina relativamente resistente allazione dei succhi gastrici, la quale si assorbe nellintestino (si tratta di una intossicazione alimentare e non di una infezione) e diffonde nellorganismo con un bersaglio specifico a livello del SNP impedendo il rilascio di acetilcolina a livello della sinapsi colinergica della giunzione neuromuscolare PARALISI FLACCIDA (seguita da paralisi della m. respiratoria con morte).

Della tossina botulinica si conoscono almeno 7 distinti tipi antigenici (A-G) prodotti da differenti stipiti di C. botulinum e codificati da geni a collocozione cromosomica (A) o plasmidica (G) o nel genoma integrato di un fago temperato (C e D).

Anche per la tossina botulinica vale la sintesi della tossina tetanica, con la medesima distinzione. Il blocco della normale esocitosi dellAch determina blocco della trasmissione dellimpulso nervoso alla muscolatura, con paralisi flaccida.

ESOTOSSINE CHE AGISCONO COME SUPERANTIGENI: a) Enterotossine stafilococciche;

b) Tossina dello shock tossico (sempre di S. aureus);

c) Tossine pirogene streptococciche (presenti in diversi tipi)

TOSSINA COLERICA (azione analoga ha LT di E. coli) prodotta da batteri che si localizzano nellintestino (tenue). Le tossine si legano agli enterociti attraverso linterazione con un ganglioside presente sulla superficie cellulare. Linterazione seguita dalla traslocazione della componente A, formata da 2 peptidi A1 e A2 uniti da ponti disolfurico, e alla liberazione di A1, dotato di attivit ADP-ribosilante. Il bersaglio la subunit alfa di una proteina G, che controlla lattivit dellenzima adenilato ciclasi. La ADP ribosilazione della subunit alfa ad opera della tossina colerica (o della tossina LT di E. coli ETEC) impedisce lazione della GTPasi e la ricostituzione della proteina G nel trimero originario ed il conseguente incremento patologico della concentrazione IC di cAMP. Negli enterociti ci determina una disregolazione dei canali che controllano il passaggio di ioni nel lume intestinale, determinando uno squilibrio elettrolitico e quindi leliminazione di una notevole quantit di acqua che finisce con la capacit di riassorbimento del colon, con: a) Diarrea profusa; b) Shock ipovolemico; c) Acidosi; d) Anuria

TOSSINA PERTOSSICA uno degli strumenti principali dellazione patogena di Bordetella pertussis ed costituita da una tossina di tipo A-B con una struttura esamerica (A-B5): Loligomero B serve a legare la tossina ad alcune gp di membrana per traslocare la componente A; La componente A presenta una azione ADP ribosilante, che catalizza il trasferimento di ADP-riboso ad un R cisteinico vicino al termine carbossilico della subunit alfa di una serie di proteine G, che la disaccoppia dal suo recettore con permanente alterazione nela trasduzione del segnale.

In particolare, la tossina pertossica ha come target la subunit-alfai (inibitoria) che regola negativamente lattivit delladenilato ciclasi. Una volta ADP-ribosilata, la subunit alfa(i) della proteina G non riesce a regolare negativamente lenzima, per cui vi sar una elevata concentrazione di cAMP. La tossina pertossica determina accumulo di muco a livello delle vie respiratorie.

TOSSINA A DI P. AERUGINOSA Determina ADP-ribosilazione di EF-2; Blocco della sintesi proteica