SPETTROFOTOMETRIA DI FLUORESCENZA E FOSFORESCENZA

Quando gli elettroni passano da uno stato energetico superiore ad uno stato di energetico inferiore, l'energia recuperata pu venire emessa sotto forma di radiazione elettromagnetica; infatti, una volta che la molecola ha assorbito la radiazione incidente pu andare incontro a due tipi di processo: la maggior parte delle molecole trasferisce l'eccesso di energia all'intorno con un processo non radiativo: l'energia emessa, sotto forma di calore, permette alle molecole circostanti di compiere vibrazioni, rotazioni e traslazioni. una piccola parte delle molecole, invece, subisce un decadimento radiativo dove l'energia in eccesso viene liberata sotto forma di fotoni. Una molecola eccitata si trova in uno degli stati vibrazionali di un livello energetico superiore; essendo soggetta a collisioni con le molecole circostanti rilascia parte della sua energia sotto forma non radiativa e scende nella scala dei livelli vibrazionali. Il comportamento delle molecole fino a questo punto indistinto; la prima differenza dipende dalle molecole circostanti: se queste sono in grado di assorbire la restante energia in eccesso della molecola eccitata questa completa il suo rilassamento in modo non radiativo, altrimenti si possono avere i processi di fluorescenza o di fosforescenza. La fluorescenza uno dei due processi radiativi con cui si pu verificare il rilassamento di una molecola eccitata, l'altro la fosforescenza. La distinzione tra i due processi fu originariamente fatta in base al tempo di vita della radiazione: nella fluorescenza la luminescenza cessa quasi subito dopo aver eliminato la radiazione eccitante, mentre nella fosforescenza la radiazione continua ad essere emessa, almeno per un breve lasso di tempo, anche dopo aver eliminato la sorgente eccitante. Ora, invece, si possono distinguere i due processi sulla base della natura degli stati elettronici coinvolti nelle transizioni responsabili dell'emissione di radiazione. Le transizioni elettroniche che si possono verificare in una molecola organica a seguito dellassorbimento di luce sono rappresentate nella Tabella 2.

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Le energie associate ai differenti tipi di transizione sono riportate in Figura 1

Quando un elettrone viene promosso da uno stato fondamentale ad uno di eccitato, esso pu mantenere lo spin originario oppure invertirlo. Se leccitazione avviene con ritenzione dello spin, si parla di stato di singoletto e gli spin degli elettroni nello stato eccitato sono appaiati come nello stato fondamentale. Se, invece, il passaggio allo stato attivato avviene con inversione dello spin, si parla di stato di tripletto.

Allo stato di singoletto compete una energia pi alta e una vita media che va da 10--11 a 10-9 sec, mentre lo stato di tripletto ha una energia inferiore e una vita media da 10-3 a 101 sec. Lo stato di tripletto di fondamentale importanza per la fotochimica dei composti organici. Nella FLUORESCENZA la radiazione generata in virt di transizioni tra stati con la stessa molteplicit di spin (per esempio S1 S0). Nella FOSFORESCENZA, invece, la transizione coinvolta comporta variazione della molteplicit di spin: il caso pi frequente sono transizioni tripletto-singoletto. 122

Il diagramma di Jablonski riassume le trasformazioni energetiche che si verificano per assorbimento di una radiazione di sufficiente energia in una molecola.

Una molecola nello stato fondamentale (S0), a seguito dellassorbimento di luce, viene eccitata a uno dei suoi stati elettronici di singoletto (S1, S2, ). Quello che si genera in un primo momento dunque uno STATO DI SINGOLETTO in quanto le molecole nello stato fondamentale sono quasi tutte dei singoletto e leccitazione segue la legge della conservazione dello spin, cio le transizioni tra stati a diverse molteplicit sono proibite. Pertanto, la transizione di uno stato fondamentale di singoletto (S0) al primo stato di tripletto eccitato (T1) ha una scarsissima probabilit di avvenire in quanto una transizione proibita. Cosa accade ora? 1) la molecola eccitata nello stato di singoletto S2, a pi alta energia, pu ricadere nello stato di minor energia S1, senza emettere radiazioni, mediante una serie di transizioni, chiamate conversioni interne: in una conversione interna lenergia accumulata viene dissipata sotto forma di calore. 2) la molecola eccitata nello stato di singoletto S1 pu ricadere nello stato fondamentale S0 senza emettere radiazione 3) la molecola eccitata nello stato di singoletto S1 pu ricadere nello stato fondamentale S0, emettendo una radiazione in un processo che viene chiamato fluorescenza 4) la molecola eccitata nello stato di singoletto S2 o S1, pu sottostare a un interscambio senza radiazioni che richiede il disaccoppiamento di spin, passando allo stato di tripletto T1 in un processo chiamato incrocio intersistema. 123

La molecola dallo stato eccitato T1 pu a sua volta: a) ricadere allo stato fondamentale con emissione di energia; lenergia associata alla conversione di T1 in S0 si chiama fosforescenza. Questa conversione tripletto-singoletto analogamente a quella singoletto-tripletto ha una bassa probabilit. b) lo stato T1 pu sottostare a un interscambio senza radiazioni che richiede il disaccoppiamento di spin, passando nuovamente allo stato di singoletto in un processo di decadimento vibrazionale, che porta la molecola eccitata al pi basso livello vibrazionale del rispettivo stato elettronico S; successivamente pu ricadere nello stato di minor energia S0, senza emettere radiazioni.

FLUORESCENZA

Nella fluorescenza un elettrone molecolare viene investito da un'onda elettromagnetica della radiazione ultravioletta ed assorbendone l'energia si sposta su un'orbitale pi esterno, ma l'eccessiva energia vibrazionale improvvisamente acquisita dalla molecola viene dispersa in brevissimo tempo nell'ambiente, lasciando l'elettrone in un particolare stato instabile dal quale torner nella posizione originaria, emettendo un fotone di luce visibile, nel giro di una frazione infinitesima di secondo. Le due curve rappresentano l'energia dell'elettrone in funzione della distanza tra gli atomi della molecola, mentre le linee orizzontali all'interno delle curve sono i livelli di energia corrispondenti alle loro vibrazioni. Un elettrone, situato nel primo livello di vibrazione dell'orbitale di partenza, viene colpito da una radiazione elettromagnetica e ne assorbe l'energia grazie alla quale viene spinto su un orbitale pi esterno, in un livello di vibrazione elevato; da qui, come indicato dalle frecce piccole, perde energia fino a raggiungere lo stato di vibrazione pi bassa. Ma questo uno stato instabile, perci l'elettrone ricade nell'orbitale iniziale, provocando un'onda elettromagnetica che sar visibile come luce blu, se il salto elevato, o come luce verde o rossa, se il salto piccolo. Infatti la lunghezza d'onda della radiazione tanto pi corta quanto pi alto il salto energetico. Le radiazioni emesse possiedono, in generale, a frequenze ' minori di . In pratica la radiazione emessa ha unenergia inferiore (e frequenza maggiore) rispetto alla radiazione incidente (la cui energia maggiore ma la frequenza minore). 124

FOSFORESCENZA
In questo caso un elettrone, che si trova inizialmente nel primo livello di vibrazione dell'orbitale in basso, viene colpito dai raggi ultravioletti e, grazie all'energia assorbita, viene spinto su un orbitale pi energetico, in un livello di vibrazione pi elevato; da qui, come indicato dalle frecce piccole della figura, perde energia fino a raggiungere lo stato di vibrazione pi bassa. Ma la struttura molecolare del materiale fosforescente tale che la stessa energia corrisponde anche ad un orbitale intermedio pi stabile, e quindi l'elettrone sar costretto a spostarsi su quest'ultimo. Tale orbitale intermedio molto stabile, e ci permette all'elettrone di rimanervi per parecchio tempo, prima di ricadere nell'orbitale partenza; questo il motivo per cui la luce di fosforescenza pu essere emessa anche molto tempo dopo la fine dell'eccitazione. Inoltre, essendo la probabilit che ha lelettrone di ricadere sull'orbitale di partenza estremamente bassa (si dice che la transizione proibita), gli elettroni non decadano tutti nello stesso istante, ma in modo casuale durante un tempo ben pi lungo. Poich l'energia dell'orbitale intermedio pu variare anche di molto, a secondo della struttura cristallina del materiale, anche la luce di fosforescenza pu avere un qualsiasi colore dello spettro visibile, come abbiamo visto per la fluorescenza. Secondo linterpretazione basata sulla natura degli stati elettronici coinvolti, affinch avvenga un processo di fosforescenza, invece, la molecola deve inizialmente essere in uno stato singoletto del livello energetico fondamentale. Una volta assorbita l'energia della radiazione incidente, si viene a trovare in uno stato singoletto di un livello energetico superiore e in uno dei livelli vibrazionali. La molecola ha anche uno stato tripletto nel livello elettronico superiore, che possiede un'energia un p inferiore rispetto allo stato singoletto dello stesso livello energetico. Le curve dell'energia potenziale di questi due stati si intersecano e un livello vibrazionale dello stato tripletto e uno dello stato singoletto eccitati hanno la stessa energia. A questo punto c' un "meccanismo" che permette la conversione da singoletto a tripletto e la molecola va incontro ad un Intersystem crossing. Una volta avvenuto lo scambio la molecola cede energia all'intorno in maniera non radiativa fino allo stato vibrazionale fondamentale dello stato elettronico eccitato. 125

Questo stato pi basso del corrispondente stato singoletto e la molecola non potrebbe emettere la sua energia perch il suo ritorno allo stato fondamentale proibito essendo un passaggio da uno stato tripletto ad uno singoletto; ma l'accoppiamento spin orbitale che stato responsabile anche dell'intersistem crossing rompe di nuovo le regole di selezione e permette un passaggio, seppure molto lento. Questo spiega facilmente anche il motivo per cui l'effetto della fosforescenza non termina con il cessare della radiazione incidente.

SPETTRO DI LUMINESCENZA
Poich la fluorescenza trae origine dalla caduta dell'elettrone dal pi basso livello vibrazionale del primo stato elettronico eccitato a uno dei livelli vibrazionali dello stato fondamentale, lo spettro di fluorescenza, in genere simile allo spettro di assorbimento ma spostato a lunghezze d'onda maggiori. Anche gli spettri di fosforescenza sono spostati batocromicamente rispetto agli spettri di assorbimento ma pi di quanto osservato per la fluorescenza; infatti l'energia dello stato di tripletto T1 in genere pi bassa di quella dello stato di singoletto S1 Per i fenomeni di fluorescenza o la fosforescenza, infatti, vale la seguente legge: LEGGE DI STOKES

L'energia del fotone emesso appartiene ad una regione dello spettro spostata verso lunghezze d' onda maggiori rispetto alla lunghezza d' onda del fotone. La banda di luminescenza indipendente dalla radiazione monocromatica eccitatrice purch appartenente a una medesima banda di assorbimento (l' intera banda di emissione presente per ogni radiazione monocromatica assorbita appartenente alla banda illuminante). La banda di assorbimento ottenuta come inviluppo delle righe di eccitazione.

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SPETTROFLUORIMETRO

Diagramma di uno spettrofluorimetro. La luce prodotta dalla lampada (L) viene focalizzata sull'ingresso di un monocromatore (M1) che seleziona la lunghezza d'onda desiderata. Il fascio monocromatico colpisce il campione (S). La composizione cromatica della luce emessa viene analizzata dal secondo monocromatore (M2) e l'intensit dal fotomoltiplicatore (PM). Notare la posizione del secondo monocromatore per evitare di raccogliere la luce trasmessa. Il secondo monocromatore infatti necessario per evitare che alcune radiazioni eccitanti arrivino al rivelatore, e questo pu accadere nonostante la radiazione emessa venga misurata perpendicolarmente rispetto a quella eccitante, a causa di fenomeni di diffusione, in particolare a causa della diffusione di Rayleight e della diffusione di Tyndall. DIFFUSIONE DI RAYLEIGHT: si verifica quando la radiazione attraversa un mezzo trasparente in cui incontra particelle con diametro molto inferiore (inferiore a 1/10) della propria lunghezza donda. La luce che diffonde ha la stessa lunghezza donda di quella incidente e unintensit proporzionale alla quarta potenza della frequenza della luce incidente. In un fascio policromatico le radiazioni a bassa a bassa lunghezza donda sono quelle che vengono diffuse pi efficacemente. 127

DIFFUSIONE DI TYNDALL: si verifica in presenza di sistemi colloidali nei quali le particelle hanno un diametro confrontabile con la lunghezza donda della luce visibile. Lintensit della luce diffusa proporzionale alla seconda potenza della frequenza della radiazione incidente Il secondo monocromatore sposta la banda di fluorescenza di 20 nm oltre quella di eccitazione, perch la lettura della fluorescenza avvenga senza interferenze dovute a questi fenomeni di diffusione. Vi per un altro tipo di interferenza che pu insorgere, e questa la DIFFUSIONE RAMAN: il fenomeno, che dipende dal solvente, si verifica quando viene diffusa solo una piccolissima frazione della luce che incide su un mezzo trasparente. In questo caso la lunghezza donda della radiazione pu essere spostata verso valori minori o maggiori. Se si usa MeOH spostata a maggiori di +30 nm, con CHCl3 di +10 nm. Riassumendo, la diffusione (scattering) della luce, come risultato della sua interazione con la materia, pu essere definita elastica (Rayleigh o Tyndall scattering) o anelastica (Raman scattering). Nel primo caso, la luce diffusa mantiene la stessa frequenza del raggio incidente, mentre nel caso dello scattering anelastico, le frequenze sono diverse e costituiscono lo spettro del campione. L'effetto Raman risulta dall'interazione dei movimenti vibrazionali e/o rotazionali delle molecole con una radiazione elettromagnetica. Come gi accennato, tale effetto di tipo anelastico, ovvero i fotoni che collidono hanno uno scambio energetico con le molecole, le quali possono perdere o acquistare energia, sempre rispettando le leggi della meccanica quantistica. Se la molecola guadagna energia, il fotone verr riemesso con una frequenza inferiore di quella iniziale, al contrario, se la molecola cede energia, la nuova frequenza del fotone sar maggiore. La radiazione diffusa con una frequenza pi bassa di quella del raggio incidente si definisce radiazione Stokes, mentre quella a pi alta frequenza viene chiamata radiazione anti-Stokes. Poich la prima accompagnata da un aumento dell'energia molecolare (avvenimento frequente, soprattutto a temperatura ambiente, anche se soggetto a certe regole di selezione), mentre l'altra consegue da una perdita di energia molecolare (che pu solo avvenire se la molecola, al momento della collisione, era in un uno stato vibrazionale o rotazionale eccitato), la radiazione Stokes generalmente pi intensa dell'anti Stokes. In ogni caso, comunque, la quantit di energia scambiata molto piccola: per poterla studiare necessario l'utilizzo di uno strumento molto sensibile. Purtroppo, non tutte le rotazioni o vibrazioni molecolari sono Raman attive, ovvero generano un effetto Raman: affinch ci accada occorre, innanzitutto, che le molecole siano polarizzabili. Quando una molecola viene introdotta in un campo elettrico subisce una distorsione, in quanto la carica positiva del nucleo viene attratta dal polo negativo e la carica negativa degli elettroni dal polo positivo. Questa separazione di carica comporta un momento di dipolo indotto e la molecola si definisce polarizzata. L'entit del dipolo indotto dipende dalle dimensioni del campo e dalla geometria della molecola. Se in queste condizioni la molecola soggetta ad una radiazione di una certa frequenza, il campo subito da ogni molecola varier creando delle oscillazioni nel dipolo della stessa frequenza della radiazione, sicch abbiamo subito evidenza dell'effetto Rayleigh. 128

Se, e solo se, le molecole subiscono anche dei movimenti interni, come rotazione o vibrazione, che cambiano la polarizzabilit periodicamente, all'oscillazione del dipolo si abbiner l'oscillazione rotazionale o vibrazionale, e la sua frequenza di oscillazione non sar pi uguale a quella della radiazione incidente, ma sar incrementata o decrementata della frequenza di vibrazione (o rotazione). Pertanto, affinch una sostanza possa essere Raman attiva, occorre che ci sia una vibrazione o rotazione molecolare che modifichi una componente della polarizzabilit molecolare. L'analisi di sostanze Raman-emittenti , quindi, possibile perch esse vengono eccitate dal raggio laser, producendo uno spettro che viene visualizzato sul computer. I picchi che si rilevano sono corrispondenti alle energie di vibrazione dei legami di queste sostanze e sono molto ben riproducibili: perci, uno spettro Raman come limpronta digitale della sostanza in questione, che riconoscibile anche se presente in minima quantit.
ESEMPI DI SPETTRI DI EMISSIONE

Gli spettri di fluorescenza si ottengono con lo spettrofluorimetro. La figura sottostante mostra lo spettro di assorbimento e quello di fluorescenza dellantracene disciolto in cicloesano. Lo spettro di assorbimento compreso tra 2900 e 3800 e corrisponde alle transizioni tra lo stato fondamentale e il primo stato eccitato. I picchi (bande), spesso chiamate strutture vibrazionali, corrispondono a transizioni tra il livello vibrazionale pi basso dello stato fondamentale e differenti livelli vibrazionali del primo stato elettronico eccitato. La banda centrata a 3780 corrisponde alla transizione tra il pi basso livello vibrazionale del livello fondamentale e il pi basso livello vibrazionale dello stato eccitato ed chiamata transizione 0-0. Lo spettro di fluorescenza compreso tra 3700 e 5000 . Le bande corrispondono a transizioni tra il livello vibrazionale pi basso dello stato eccitato e i vari livelli vibrazionali dello stato fondamentale. La banda che quasi si sovrappone alla banda di assorbimento centrata a 3780 corrispondente alla transizione 0-0 inversa. Notare come gli spettri di assorbimento e di fluorescenza siano simmetrici rispetto alla transizione 0-0. Spettri di fluorescenza e di assorbimento di antracene in una soluzione di cicloesano.
Lo spettro di emissione (fluorescenza) quello compreso tra 5000 e 3700 , lo spettro di assorbimento quello compreso tra 3800 e 2800 .

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Sulle ascisse sono riportati la lunghezza d'onda (scala in alto) e il numero d'onda (scala in basso). Sulle ordinate sono riportati, a destra, l'intensit di fluorescenza in una scala che prende come valore unitario il valore della intensit massima e, a sinistra, il coefficiente di estinzione molare. Lo spettro di emissione stato ottenuto eccitando con una lunghezza d'onda di 2537 .

Le caratteristiche di uno spettro di fluorescenza sono: 1) Una sostanza fluorescente in un solvente omogeneo ha un solo spettro di fluorescenza indipendente dalla lunghezza donda di eccitazione. Questo dovuto al fatto che un fluoroforo ha soltanto un livello che emette radiazioni. 2) Lo spettro di fluorescenza sempre a lunghezze donda maggiori dello spettro di assorbimento, eccetto per la transizione 0-0 per cui le transizioni hanno la stessa energia. 3) Linterazione con il solvente pu impedire questa sovrapposizione degli spettri. La forma e la posizione dei massimi sono sensibili alle propriet molecolari del solvente (o in generale del mezzo). Questo dovuto alla perturbazione di livelli energetici del fluoroforo dovuti ad interazioni dipolo-dipolo o a interazioni tra cariche nel caso v i siano presenti cariche spaziali. Queste interazioni sono maggiori in solventi polari e spostano i picchi di assorbimento e di emissione verso lunghezze donda maggiori.

TIPO DI TRANSIZIONI CHE AVVENGONO NEL PROCESSO DI FLUORESCENZA

Quelle che si osservano sono transizioni a bassa energia, la lunghezza donda inferiore ai 250 nm (al di sopra si ha fotolisi dei legami). La fluorescenza legata a transizioni * , sia perch hanno vita breve, sia perch i processi che competono con la fluorescenza avvengono con minore facilit. Le transizioni n * non danno il fenomeno della fluorescenza perch la loro assorbivit molare da 100 a 1000 volte pi piccola di quella della transizione *.

RESA QUANTICA DI FLUORESCENZA

Tutte le molecole che assorbono nel visibile/UV sono quindi potenzialmente fluorescenti, ma il fenomeno in realt rilevante solo per alcune di esse, a causa dellesistenza di fenomeni dissipativi non radiativi che competono con lemissione di radiazione. Questi comprendono: la conversione interna, cio la perdita di energia in maniera non radiativa, soprattutto a causa di urti con le molecole di solvente o con le pareti del contenitore, che sono pure alla base del fenomeno di rilassamento vibrazionale, cio del decadimento da un livello vibrazionale 130

allaltro, che spiega perch le frequenze di emissione sono pi basse di quelle di assorbimento; lintersystem crossing, in cui si ha una transizione tra uno stato di singoletto e uno di tripletto le cui curve di potenziale si incontrano in un punto, a cui generalmente fa seguito il fenomeno della fosforescenza (emissione di radiazione ritardata nel tempo); il quenching, dovuto alle collisioni con molecole di soluto capaci di interagire con lo stato elettronico eccitato, come O2 e I-. Poich questi fenomeni sono tutti del primo ordine o pseudo-primordine (nel caso del quenching), si pu definire la resa quantica di fluorescenza fF, come:

f fluorescenza =

K fluorescenza K fluorescenza + K conversione interna + K intersystem crossing + K quencing

dove le k rappresentano le costanti cinetiche dei fenomeni descritti.

Si pu dimostrare che il rendimento quantico del processo di fluorescenza si pu anche esprimere come:

f fluorescen za

numero di fotoni emessi numero di fotoni assorbiti

La resa quantica quindi un numero compreso tra 0 e 1: cos sostanze chiaramente fluorescenti, come la fluorescina hanno un rendimento pari a 1. Ricordiamo infine che la resa quantica del processo influisce sulla sensibilit del metodo, poich lintensit della radiazione emessa ad una certa lunghezza donda proporzionale ad essa.

VARIABILI CHE INFLUENZANO LA FLUORESCENZA E LA FOSFORESCENZA

Sono diversi i fattori che possono influenzare il fenomeno della fluorescenza o della fosforescenza. Consideriamo uno ad uno.
EFFETTO DELLA STRUTTURA MOLECOLARE

Sappiamo che il fenomeno della fluorescenza favorito se nella molecola sono presenti gruppi funzionali aromatici con bassi livelli di energia necessari per e transizioni *. Cos tutti gli idrocarburi non aromatici non sostituiti danno fluorescenza, e la resa quantica aumenta col numero degli anelli ed il grado di condensazione.

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In questi casi la transizione che richiede minore energia del tipo n *, lelettrone passa rapidamente allo stato di tripletto, impedendo la fluorescenza Qui invece la transizione pi facile del tipo *, e questi prodotti emettono fluorescenza.

N N N

H Invece, la presenza sullanello benzenico di un gruppo carbossilico o carbonilico riduce la fluorescenza, perch la transizione n * ha unenergia minore della *, e la resa quantitativa diminuisce.

Ricordiamo che le molecole che contengono atomi pesanti (Cl, Br, F, I) danno il fenomeno della fluorescenza meno accentuato a causa delle frequenti conversione intersistema. La presenza di gruppi carbonilici o doppi legami a elevata coniugazione in composti alifatici e aliciclici favoriscono la fluorescenza. La presenza in soluzione di molecole paramagnetiche (ad esempio O2), invece, determina una diminuzione del fenomeno.
COMPOSTO FORMULA

INTENSIT
RELATIVA

Benzene Fluorobenzene Clorobenzene Bromobenzene Iodobenzene Fenolo Anilina Acido benzoico

EFFETTO DELLA RIGIDIT STRUTTURALE

C6H6 C6H5F C6H5Cl C6H5Br C6H5I C6H5OH C6H5NH2 C6H5COOH

10 10 7 5 0 18 20 3

Molti composti organici fluorescenti sono caratterizzati da una certa rigidit nella loro struttura per cui l'energia degli stati eccitati non viene persa per vibrazione torsionale della molecola. Per esempio la fluorescina altamente fluorescente perch possiede un ponte etereo fra gli anelli aromatici, mentre la fenolftaleina non lo poich lo stato eccitato perde la sua energia per conversione interna.

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Composti rigidi sono anche quelli adsorbiti su superfici solide o che formano chelati particolarmente rigidi. Nelle molecole non rigide c maggiore probabilit di conversione interna e conseguentemente disattivazione del processo di emissione di energia radiante. EFFETTO DEL pH Questo effetto interessa soprattutto composti aromatici contenenti sostituenti acidi o basici; la possibilit, infatti, che questi esistano in pi forme di risonanza rende pi stabile il primo stato eccitato, e aumenta la fluorescenza
COMPOSTO FORMULA

INTENSIT
RELATIVA

Benzene Anilina Ione anilinio

C6H6 C6H5NH2 C6H5NH3-

10 20 --

N H H H N+ H H N+ H

FORME DI RISONANZA DELLANILINA

Questo effetto pu essere sfruttato per la rivelazione del punto finale delle titolazioni: questo perch quando la molecola passa dalla forma indissociata a quella dissociata si ha uno spostamento della lunghezza donda di fluorescenza dallUV al visibile. Cos se lanilina emette una radiazione nellUV ( = 310 405), lo ione anilinio emette invece nel visibile ( la radiazione non viene rivelata dallo spettrofluorimetro). In questo caso per il pH al quale si raggiunge il punto finale della titolazione diverso da quello teorico che si ricava dalla Ka dellelettrolita; questo perch la Ka per la molecola eccitata diversa (fino a 4 5 ordini di grandezza) da quella allo stato fondamentale.
N+ H H H

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EFFETTO DELLA TEMPERATURA E DELLA VISCOSIT DEL SOLVENTE

Un aumento della temperatura del solvente determina una diminuzione della sua viscosit, e questo influisce sulla fluorescenza dellanalita in maniera negativa. Questo perch si verifica una conversione esterna, cio il trasferimento dellenergia per collisione dallanalita al solvente o ad altri soluti in soluzione. Ricordiamo che la presenza di atomi pesanti (CBr4 , EtI) o di ossigeno molecolare (O2) disciolto nel solvente determina comunque una diminuzione della fluorescenza.

EFFETTO DELLA CONCENTRAZIONE

Lintensit della radiazione fluorescente If ci data dalla relazione: If = intensit della radiazione fluorescente

I f = K (I incidente I uscente )

Iincidente = intensit della radiazione incidente sul campione Iuscente = intensit della radiazione uscente dal campione K = costante che dipende dal rendimento quantico del processo di fluorescenza

Dalla legge di Lambert Beer, per, noi sappiamo che:

A = log

I uscente = d c I incidente

I uscente = 10 d c I incidente

I uscente = I incidente 10 d c
Sostituendo nellespressione iniziale abbiamo che lintensit della radiazione fluorescente data dallespressione:

I f = K I0 K I

= K I 0 K 10 d c = K I 0 1 10 d c

) )
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Facendo quindi lespansione in serie di Mc Laurin dellesponenziale otteniamo una relazione che mostra come lintensit della fluorescenza sia direttamente proporzionale alla concentrazione dellanalita:

I f = K I 0 (2,303 d c )
Questa relazione vale per solo per soluzioni molto diluite, la cui concentrazione sia inferiore a 10-5 M (quindi parliamo di soluzioni da 10 a 100 volte pi diluite di quelle che si usano per una determinazione UV): per questo la spettroscopia di fluorescenza adatta per la determinazione di analiti in tracce! Se infatti I0 = k e d = 1, a valori cos bassi di concentrazione il termine (2,303 ) < 0,05 e quindi trascurabile. La relazione si riduce a:

I f = K c
A concentrazioni maggiori il termine non pi trascurabile, e la linearit viene meno, essenzialmente per due fattori che sono: lautoestinzione, cio la collisione fra molecole eccitate lautoassorbimento, per cui la lunghezza donda della radiazione emessa si sovrappone a quella di assorbimento. Il risultato che la fluorescenza diminuisce man mano che il fascio attraversa la soluzione.

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